Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆPNGUYỄN THU TÂM NGHIÊN CỨU BỆNH NHIỄM ĐỘC TỐ BOTULIN CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TRÊN VỊT TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN ÁN TIẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THU TÂM

NGHIÊN CỨU BỆNH NHIỄM ĐỘC TỐ BOTULIN

CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TRÊN VỊT

TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG

SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

MÃ NGÀNH: 62.64.01.02

NGHIÊN CỨU BỆNH NHIỄM ĐỘC TỐ BOTULIN

CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TRÊN VỊT

TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU

LONG

Cán bộ hướng dẫn khoa học PGS TS NGUYỄN ĐỨC HIỀN

Nghiên cứu sinh thực hiện Nguyễn Thu Tâm

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNGLuận án đính kèm theo đây, với tên đề tài: “Nghiên cứu bệnh nhiễm

độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh

Đồng bằng Sông Cửu Long” do Nghiên cứu sinh Nguyễn Thu Tâm thực hiện

và báo cáo đã được hội đồng chấm luận án thông qua

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt quá trình học tập và làm luận án tiến sĩ, tôi đã nhận được sựquan tâm, giúp đỡ từ quý thầy cô, gia đình và bạn bè Hôm nay, tôi đã hoànthành luận án, tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn

Trước hết tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Banchủ nhiệm khoa Nông nghiệp, Ban chủ nhiệm Bộ môn Thú Y đã chấp thuận,tạo điều kiện thuận lợi và có chính sách ưu đãi cho tôi được học tập nâng caotrình độ chuyên môn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn – PGS TS.Nguyễn Đức Hiền đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điềukiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu, bổ sung kiến thức và hoànthành luận án

Xin cảm ơn đến quý thầy cô thuộc Bộ môn Thú Y, trường Đại học CầnThơ đã nhiệt tình giảng dạy và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôitrong quá trình học tập cũng như làm việc

Xin gởi lời cảm ơn đến thầy PGS TS Nguyễn Ngọc Hải – Trường Đạihọc Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh và các nhân viên phòng thí nghiệmViệt-Hàn – Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn, hỗ trợ kỹ thuậtchuyên môn cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin đặc biệt cảm ơn đến các anh chị và em là cựu sinh viên củangành Chăn nuôi, ngành Thú Y và các anh chị làm công tác thú y tại các tỉnh

An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và thành Phố Cần Thơ đã nhiệt tình giúp

đỡ, hỗ trợ tôi trong việc thu thập mẫu được kịp thời và chính xác Tôi xin chânthành cảm ơn các chủ hộ chăn nuôi vịt đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong việc lấymẫu và lấy thông tin liên quan đến đề tài nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn các cán bộ thuộc Trạm chẩn đoán xét nghiệm vàđiều trị bệnh động vật – Chi cục chăn nuôi và Thú Y thành phố Cần Thơ, Banlãnh đạo Công ty TNHH Một thành viên chăn nuôi Vemedim đã tạo điều kiệnthuận lợi và giúp đỡ cho tôi hoàn thành một số thí nghiệm trong nghiên cứu.Xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè và gia đình đã động viên,khích lệ, giúp đỡ và chia sẻ những buồn vui trong học tập, công việc và trongcuộc sống để tôi có thêm nghị lực, niềm tin và điểm tựa để phấn đấu và hoànthành luận án của mình

Xin chân thành cám ơn!

Tác giả luận án

Nguyễn Thu Tâm

TÓM TẮT

Luận án “Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium

botulinum trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long” được thực hiện từ

năm 2013 đến 2017, tại các tỉnh, thành phố gồm An Giang, Kiên Giang, Hậu Giang

và thành phố Cần Thơ (TPCT) với mục tiêu chung là đánh giá tần suất lưu hành bệnh botulism trên đàn vịt chạy đồng của Đồng bằng sông Cửu Long; xác định sự hiện diện vi khuẩn C botulinum cũng như type độc lực của botulin trên vịt bệnh và môi trường chăn nuôi; đồng thời đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng C botulinum phân lập được tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL).

Điều tra 187.505 vịt chạy đồng (VCĐ) được nuôi dưỡng tại tỉnh An Giang, Kiên Giang, Hậu Giang và thành phố Cần Thơ (TPCT), trong đó có 108.505 con vịt

đẻ và 79.000 con vịt thịt Kết quả cho thấy, 2.253 con VCĐ được nuôi dưỡng tại ĐBSCL mắc bệnh botulism chiếm 1,19 % Tỷ lệ vịt đẻ mắc bệnh 1,52% cao hơn vịt thịt (0.91%) và khác nhau có ý nghĩa thống kê Triệu chứng lâm sàng của bệnh botulism trên VCĐ là liệt cổ, liệt mí mắt - đồng tử dãn và liệt chân xuất hiện ở tần suất khá cao lần lượt là 87,92%, 90,07%, 79,78%, triệu chứng vịt giảm ăn ủ rũ, xù lông, kém vận động với tỷ lệ 68,55%; tiêu chảy phân trắng - xanh 70,96% và tiêu chảy máu là 34,30% Bệnh tích gan, phổi xuất huyết chiếm tỷ lệ cao lần lượt là 95,48%, 86,19%, bệnh tích ruột trống thức ăn và sinh hơi cũng chiếm tỷ lệ 92,14% Phân lập vi khuẩn C botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh theo Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến, kết quả cho thấy tỷ lệ hiện diện vi khuẩn C botulinum trên mẫu phân vịt bệnh chiếm tỷ lệ cao hơn trên mẫu gan với tỷ

lệ lần lượt là 50,72% và 43,13% Xác định độc tố trong 200 mẫu huyết thanh của vịt bệnh botulism bằng thử nghiệm trên chuột bạch theo tiêu chuẩn CDC - Hoa Kỳ (1998) với kết quả của huyết thanh không xử lý nhiệt xuất hiện 63% chuột chết và 37% chuột có triệu chứng bất thường Định type độc tố botulin bằng phản ứng trung hòa với huyết thanh chuẩn, kết quả thể hiện tỷ lệ mẫu huyết thanh chứa độc tố botulin type C là khá cao, chiếm 40,48%; kế đến là mẫu huyết thanh chứa độc tố botulin type E với tỷ lệ 28,57%, thấp nhất là mẫu huyết thanh chứa độc tố botulin type D với 25,40%; Đặc biệt, kết quả thí nghiệm còn có sự hiện diện kết hợp giữa type C + type D là 3,97% và giữa type C + type E là 1,59%.

Xác định các các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulism trên VCĐ ở ĐBSCL bằng cách phân lập vi khuẩn C botulinum trên đất ruộng, nước trên mặt ruộng, cua và ốc trên ruộng nuôi có vịt bệnh theo qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium

botulinum của Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến Kết quả cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn C botulinum trên đất 17,5%, nước trên mặt ruộng 19,67%; trên cua (8,33%) cao hơn trên ốc (3,00%) và sự sai khác của hai tỷ lệ này rất có ý nghĩa về mặt thống kê với P<0,01.

Đánh giá tính gây bệnh của vi khuẩn C botulinum phân lập được bằng cách xác định LD 50 trên vịt được tiêm truyền độc tố botulin vào tĩnh mạch và đường uống Sau 7 ngày theo dõi, kết quả cho thấy 23/32 mẫu làm vịt chết, chiếm 71,88% và vịt

có biểu hiện triệu chứng bất thường 28,12% Vịt xuất hiện các triệu chứng lâm sàng như ủ rủ, ít đi lại, xù lông, giảm ăn, giảm đẻ chiếm tỷ lệ 100%; triệu chứng liệt cổ chiếm 92,19%; liệt mí mắt, dãn đồng tử với tỷ lệ 76,19%; liệt chân chiếm 60,94%; tiêu chảy phân trắng - xanh chiếm 35,94% Mổ khám bệnh tích cho thấy gan xuất huyết chiếm 92,19%, bệnh tích ruột trống thức ăn, sinh hơi chiếm 89,06%, phổi tụ huyết với tỷ lệ 81,25%.

Từ khóa: Botulin, Clostridium botulinum, limberneck, đồng bằng sông Cửu Long.

The thesis named “Study on botulin poisonging disease of Clostridium

botulinum on ducks in the Mekong Delta” was conducted from 2013 to 2017 in An

Giang, Hau Giang, Kien Giang and Can Tho to clarify the frequency of the botulism disease on the free-grazing ducks of the Mekong Delta; the prevalence and botulin toxin types of C botulinum isolated from infected ducks and the environment; the evaluation of pathogenicity of isolated C botulinum strains in the Mekong Delta.

A total of 187,505 free-grazing ducks were examined in An Giang, Hau Giang, Kien Giang and Can Tho including 108,505 laying ducks and 79,000 meat ducks The results indicated that 2,253 ducks were infected with botulism disease with 1.19

% in a total of ducks Laying ducks were infected disease (1.52%) higher than meat ducks were (0.91%) with a significant statistical difference The clinical symptoms of botulism infected ducks were neck paralysis, eyelids paralysis – mydriasis, leg paralysis at high rates of 87.92%, 90.07%, 79.78% respectively; ducks were less eating, moody, ruffled feathers, less activities 68.55%; greenish diarrhea and blood diarrhea were 70.96% and 34.30% The lesions of liver and haemorrhage lung were also high at 95.48%, 86.19%; and gas in the intestine was 92.14%.

The isolation of C botulinum from duck specimens was followed the method of Lindstrom and Korkeala (2006) and had modification The prevalence of C botulinum was in feces (50.72%) higher than that in liver (43.13%) The determination of botulin toxin with 200 serum samples from infected ducks was examined on mice following the standard of CDC (1998); the result in without heat treatment Group showed that mice were died at 63% and abnormal at 37% By the neautral reaction, the sera were with botulin type C at a relatively high rate (40.48%), followed by type E (28.57%), type D (25.40%); especially, there were the combination types of type C + type D (3.97%) and type C+ type E (1.59%).

The risk factors of the botulism disease in the free-grazing ducks were determined via the isolation of C botulinum from soil, water, crabs and snails at the fields with infected ducks It was also done by following the modified method of Lindstrom and Korkeala (2006) The prevalence of C botulinum was 17.5% in soil, 19.67% in water; especially, C botulinum was present in crabs (8.33%) higher than

in snails (3.00%) (P<0,01).

The pathogenicity of isolated C botulinum strains was examined the LD 50 on ducks by injection of toxin suspension via intravenous and oral route Ater 7

observed days, it showed that 23/32 samples made ducks die (71.88%) and abnormal ducks was 28.12% Ducks exhibited the clinical symptoms such as moody, less movement, ruffled fearthers, less eating and laying (100%); neck paralysis (92.19%); eyelids paralysis and mydriasis (76.19%); leg paralysis (60.94%); greenish diarrhea (35.94%) The lesions were heamorrhage liver (92.19%), the empty and gas producing in intestine (89.06%), and haemorrhage lung (81.25%) Key words: Botulin, Clostridium botulinum, limberneck, Mekong delta.

TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quảnghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưatừng dùng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp

đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trongluận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

MỤC LỤC

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT v

TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ vii

MỤC LỤC viii

DANH SÁCH BẢNG xii

DANH SÁCH HÌNH xiv

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT xvi

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.3 Những đóng góp mới về khoa học 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum 3

2.2 Tác nhân gây bệnh nhiễm độc tố botulin 4

2.3 Đặc tính sinh học của vi khuẩn C botulinum 4

2.3.1 Phân loại, đặc điểm hình thái 4

2.3.2 Đặc tính nuôi cấy 6

2.3.3 Đặc tính sinh hóa 6

2.3.4 Khả năng hình thành bào tử của Clostridium 7

2.3.5 Sức đề kháng 8

2.3.6 Sự phân bố và ảnh hưởng của vi khuẩn C botulinum trong tự nhiên 8

2.3.7 Độc tố của vi khuẩn 10

2.3.7.1 Độc tố botulin 10

2.3.7.2 Cơ chế gây bệnh của độc tố botulin 13

2.4 Bệnh do nhiễm độc tố của Clostridum botulinum 15

2.4.1 Bệnh ở người 15

2.4.2 Bệnh ở động vật hữu nhũ 17

2.4.3 Bệnh do độc tố của Clostridium botulinum ở loài gia cầm 18

2.4.4 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên cá 24

2.4.5 Ảnh hưởng của độc tố botulin trên chuột 24

2.5 Phương pháp xác định độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum25 2.5.1 Phương pháp tiêm truyền cho chuột bạch (Mouse bioassay) 26

2.5.2 Xác định độc tố botulin bằng sinh học phân tử 29

2.5.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum 29

2.5.3.1 Phương pháp lấy mẫu 29

2.5.3.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn C botulinum 31

2.6 Những ứng dụng của độc tố botulin của vi khuẩn C botulinum 31

2.6.1 Trong y học 31

2.6.2 Trong thẩm mỹ 33

2.7 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C botulinum trong và ngoài nước 33

2.7.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C botulinum trên thế giới 33

2.7.2 Tình hình ngộ độc do độc tố của vi khuẩn C botulinum trên thế giới 41

2.7.3 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn C botulinum ở Việt Nam 43

2.8 Một số đặc điểm sinh học của vịt đẻ 44

2.8.1 Nguồn gốc, đặc điểm của vịt 44

2.8.2 Đặc điểm tiêu hóa, hấp thu thức ăn của vịt 45

2.8.3 Nuôi vịt đẻ 47

2.8.4 Những điều lưu ý khi nuôi vịt đẻ 47

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

3.1 Phương tiện nghiên cứu 49

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 49

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 49

3.1.2.1 Địa điểm thu thập mẫu 49

3.1.2.2 Phân tích mẫu và nuôi chuột thí nghiệm 49

3.1.2.3 Thí nghiệm trên thực địa 49

3.2 Trang thiết bị dụng cụ và hóa chất 49

3.3 Nội dung nghiên cứu 50

3.3.1 Nội dung 1 50

3.3.1.1 Mục tiêu 50

3.3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 50

3.3.1.3 Phương pháp nghiên cứu 51

3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi 52

3.3.2 Nội dung 2 52

3.3.2.1 Mục tiêu 52

3.3.2.2 Đối tượng nghiên cứu 52

3.3.2.3 Phương pháp tiến hành 53

3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dỏi 60

3.3.3 Nội dung 3 60

3.3.3.1 Mục tiêu 60

3.3.3.2 Đối tượng nghiên cứu: môi trường chăn nuôi: đất, nước, cua, ốc 60

3.3.3.3 Phương pháp thực hiện 60

3.3.3.4 Chỉ tiêu theo dõi 61

3.3.4 Nội dung 4 62

3.3.4.1 Mục tiêu 62

3.3.4.2 Đối tượng nghiên cứu 62

3.3.4.3 Phương pháp tiến hành 62

3.3.4.4 Chỉ tiêu theo dõi 66

3.4 Xử lý số liệu 66

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 67

4.1 Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) 67

4.1.1 Điều kiện tự nhiên của các tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và thành phố Cần Thơ 67

4.1.2 Tình hình chăn nuôi vịt chạy đồng ở ĐBSCL 70

4.1.3 Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở (ĐBSCL) 72

4.1.4 Tình hình vịt bệnh botulism theo mục đích nuôi 74

4.1.5 Triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh botulism trên vịt chạy đồng 75 4.1.6 Bệnh tích đại thể trên vịt bệnh botulism 76

4.2 Phân lập vi khuẩn C botulinum và xác định độc tố botulin trên vịt chạy

đồng mắc bệnh botulism 77

4.2.1 Phân lập vi khuẩn C botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh botulism 77 4.2.2 Xác định độc tố trong huyết thanh của vịt bệnh botulism bằng thử nghiệm trên chuột bạch 79

4.2.2.1 Kết quả gây độc trên chuột 79

4.2.2.2 Kết quả xác định type độc tố botulin 82

4.3 Xác định các các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở ĐBSCL có bệnh botulism 84

4.3.1 Tình hình nhiễm vi khuẩn C botulinum từ các mẫu đất và nước trên ruộng 84

4.3.2 Tình hình nhiễm vi khuẩn C botulinum từ mẫu cua và ốc trên ruộng 87

4.4 Tính gây bệnh của vi khuẩn C botulinum phân lập được trên vịt bệnh và môi trường 88

4.4.1 Kiểm tra độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn C botulinum 88

4.1.2 Sự đa kháng của vi khuẩn C botulinum phân lập được với một số loại kháng sinh 91

4.4.3 Thử nghiệm độc tố botulin trên vịt 93

4.4.4 Những triệu chứng lâm sàng trên vịt thử nghiệm độc tố 94

4.4.5 Khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thử nghiệm độc tố botulin 96

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 99

5.1 Kết Luận 99

5.2 Đề nghị 100

TÀI LIỆU THAM KHẢO 100

PHỤ LỤC MẪU ĐIỀU TRA DỊCH BỆNH TRÊN ĐÀN VỊT 119

KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ CÁC SỐ LIỆU 120

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Đặc trưng tổng quát hệ gen một số loài Clostridium 5

Bảng 2.2 Một số phản ứng sinh hóa của các Clostridium 6

Bảng 2.3 Sự hiện diện của vi khuẩn Clostridium trong một số loại mẫu 9

Bảng 2.4 Quan hệ giữa các nhóm của độc tố botulin và một số ký chủ 13

Bảng 2.5 Phương pháp xác định độc tố botulin bằng sinh học phân tử theo loại mẫu 29

Bảng 2.6 Bảng hướng dẫn lấy mẫu bệnh phẩm để xác định bệnh botulism 30

Bảng 3.1 Phân bố mẫu khảo sát tại 4 địa điểm lấy mẫu 51

Bảng 3.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C botulinum trong bộ API 20A 55

Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 56

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm Định type độc tố botulin 57

Bảng 3.5 Phân bố mẫu trên môi trường nuôi 60

Bảng 3.6 Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn của một số loại kháng sinh 62 Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm để xác định liều LD50 của độc tố botulin 64

Bảng 4.1 Số lượng VCĐ nuôi tại tỉnh An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và thành phố Cần Thơ 71

Bảng 4.2 Tỷ lệ vịt bệnh botulism tại Đồng bằng sông Cửu Long 72

Bảng 4.3 Tỷ lệ bệnh botulism trên vịt đẻ và vịt thịt 74

Bảng 4.4 Tần suất xuất hiện triệu chứng lâm sàng trên vịt bệnh botulism 76

Bảng 4.5 Tần suất xuất hiện bệnh tích đại thể trên vịt bệnh botulism 77

Bảng 4.6 Tỷ lệ vi khuẩn C botulinum hiện diện trên bệnh phẩm của vịt bệnh botulism 77

Bảng 4.7 Tỷ lệ chuột bị nhiễm độc botulin trong huyết thanh của vịt bệnh botulism 79

Bảng 4.8 Tần suất xuất hiện các biểu hiện bất thường trên chuột thí nghiệm 80 Bảng 4.9 Các bệnh tích đại thể trên chuột thí nghiệm 81

Bảng 4.10 Xác định type độc tố botulin 83

Bảng 4.11 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C botulinum từ các mẫu đất và nước trên ruộng 85

Bảng 4.12 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn C botulinum từ các mẫu cua và ốc ruộng 87

Bảng 4.13 Tỷ lệ độ nhậy của vi khuẩn C botulinum phân lập được với một số

loại kháng sinh 89

Bảng 4.14 Kết quả khảo sát tính đa kháng của vi khuẩn C botulinum với một

số loại kháng sinh 91

Bảng 4.15 Tỷ lệ vịt chết sau 7 ngày thử độc tố botulin 93

Bảng 4.16 Triệu chứng lâm sàng trên vịt thử nghiệm độc tố botulin 94

Bảng 4.17 Kết quả khảo sát bệnh tích đại thể trên vịt thử nghiệm độc tố

botulin 96

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn C botulinum và nha bào 5

Hình 2.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn Clostridium spp. 8

Hình 2.3 Cơ chế tác động của độc tố botulin 14

Hình 2.4 Triệu chứng ngộ độc ở cáo 18

Hình 2.5 Triệu chứng ngộ độc ở bò 18

Hình 2.6 Chu trình lan truyền botulism ở gia cầm 20

Hình 2.7 Liệt mí mắt ở vịt 22

Hình 2.8 Cổ vịt liệt 22

Hình 2.9 Vịt nhiễm độc tố botulin không nâng đầu được khỏi mặt nước 22

Hình 2.10 Vai trò của C botulinum trong một hệ sinh thái nước ngọt 41

Hình 3.1 Vịt bị liệt mềm cổ 52

Hình 3.2 Sơ đồ qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum có cải tiến 53

Hình 3.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn C botulinum trên thạch máu 54

Hình 3.4 Khuẩn lạc của vi khuẩn C botulinum trên môi trường SFP 54

Hình 3.5 Hình ảnh nha bào của vi khuẩn C botulinum dưới KHV 54

Hình 3.6 Đặc tính sinh hóa theo API 20A của vi khuẩn C botulinum 55

Hình 3.7: Kháng độc tố chuẩn 58

Hình 3.8 Sơ đồ xác định type độc tố botulin trong huyết thanh vịt 59

Hình 3.9 Sơ đồ qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum trên môi trường nuôi có cải tiến 61

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình chuẩn bị canh khuẩn chứa độc tố botulin 63

Hình 4.1 Bản đồ các tỉnh ĐBSCL 68

Hình 4.2 Vịt chạy đồng 72

Hình 4.3 Vịt chạy đồng bị liệt mềm cổ 74

Hình 4.4 Phổi chuột xuất huyết 82

Hình 4.5 Gan chuột xuất huyết 82

Hình 4.6 Mí mắt chuột sung có ghèn 82

Hình 4.7 Dạ dày, ruột chuột trồng thức ăn 82

Hình 4.8 Lông xù, rụng lông 95

Hình 4.9 Liệt mi mắt 95

Hình 4.10 Phân chảy trắng- xanh 95

Hình 4.11 Liệt mềm cổ 95

Hình 4.12 Phổi vịt tụ huyết 98

Hình 4.13 Gan vịt xuát huyết 98

Hình 4.14 Ruột vịt trống thức ăn 98

Hình 4.15 Ruột vịt sinh hơi 98

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

CDC Control of Disease Center Trung tâm kiểm soat bệnh tật

C bifermentans Clostridium bifermentans

C botulinum Clostridium botulinum

C butyticum Clostridium butyticum

C carnis Clostridium carnis

C chauvoei Clostridium chauvoei

C colinum Clostridium colinum

C difficile Clostridium difficile

C fallax Clostridium fallax

C histolyticum Clostridium histolyticum

C novji Clostridium novji

C perfringens Clostridium perfringens

C septicum Clostridium septicum

C sordellii Clostridium sordellii

C spiroforme Clostridium spiroforme

C sporogenes Clostridium sporogenes

C tetani Clostridium tetani

DPA-Ca Acid dipicolinic- calcium

MLD Minimum Lethal Dose Liều gây chết tối thiểuPCR Polemerase Chain Reaction phản ứng chuỗi polymerase

(NEM)-sensitive factorattachment protein receptorprotein family

SNAP Synaptosomal-associated

protein

Chương 1: GIỚI THIỆU1.1 Đặt vấn đề

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với hệ thống sông ngòi chằng chịt

và khí hậu nóng ẩm, diện tích trồng lúa lớn, và nguồn động thực vật thủy sinhphong phú; đây là những điều kiện thuận lợi để có thể chăn nuôi vịt quanhnăm, đặc biệt là nuôi vịt chạy đồng Số lượng vịt nuôi theo phương thức chạyđồng ở ĐBSCL khoảng 31,5 triệu con, chiếm hơn 70% đàn vịt trong vùng vàchiếm 40% trong tổng đàn vịt cả nước (Niên giám thống kê, 2019) Phươngthức chăn nuôi này có ưu điểm là tận dụng được thức ăn tự nhiên có sẵn củavùng sông nước, lúa rơi vãi sau thu hoạch của nông dân nhằm giảm đáng kểchi phí trong chăn nuôi Nhưng điều này cũng là một mối đe dọa lớn chongành thú y vì không thể kiểm soát được môi trường chăn thả dẫn đến nguy cơxảy ra dịch bệnh rất cao Một trong những bệnh phổ biến trên đàn vịt chạyđồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long hiện nay là bệnh “limberneck” hay bệnh

“cúm cần” theo cách đặt tên của địa phương Bệnh cúm cần là bệnh trên thủy

cầm do ngoại độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum gây ra; thế

nên, bệnh còn được gọi là bệnh botulism

Vi khuẩn Clostridium botulinum là vi khuẩn kị khí tuyệt đối, sinh bào tử

hình oval và có nha bào, thường tồn tại trong đất, nhất là các vùng bùn lắng trầmtích, trong xác các loài nhuyễn thể, trong ruột các loài động vật trên cạn và dướinước, sinh độc tố thần kinh botulinum neurotoxin rất mạnh, phá huỷ hoàn toànthần kinh trung ương (Todar, 2009) Vịt ăn phải độc tố này sẽ xuất hiện các triệuchứng là liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt cánh, liệt chân và tử số cao, gây thiệt hạikinh tế nặng nề cho người chăn nuôi (Rocke and Friend, 1998)

Hiện nay, những trong nhân y và thú y trên thế giới đã và đang nghiêncứu bệnh botulism trên con người và trên các loại gia cầm Tuy nhiên, nhữngnghiên cứu và thông tin về tình hình về bệnh botulism, yếu tố nguy cơ cũng

như đặc điểm sinh học của vi khuẩn Clostridium botulinum tại Việt Nam nói

chung, Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng còn khá hạn chế Với mong muốnthông qua nghiên cứu này sẽ cung cấp thông tin khá toàn diện về vi khuẩn

Clostridium botulinum và bệnh do vi khuẩn gây ra trên vịt chạy đồng ở Đồng

bằng sông Cửu Long Từ đó, đề tài “Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin

của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng

sông Cửu Long” được tiến hành.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) ở Đồng bằng sông

Cửu Long

- Xác định sự hiện diện vi khuẩn C botulinum và xác định type độc lực

của botulin trên vịt mắc bệnh botulsim

- Đánh giá sự lưu hành của vi khuẩn C botulinum trên môi trường chăn

- Kỹ thuật mouse bioassay lần đầu tiên được áp dụng để xác định bệnh

nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt ở Việt Nam.

1.4 Ý nghĩa khoa học của luận án

Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách cơ bản có hệthống về bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long Từ

đó xây dựng được quy trình khoa học trong chẩn đoán xác định bệnh, đồngthời là cơ sở khoa học trong việc xây dựng qui trình phòng trị bệnh botulismtrên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng, cả nước nói chung

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum

Botulism được báo cáo lần đầu ở gà năm 1917 (Dickson, 1917) còn ở vịtđược phát hiện lần đầu ở Hoa Kỳ vào những năm 1900 và sau đó vào năm

1923, bệnh được phát hiện ở gà khi ăn giòi (ấu trùng ruồi xanh) và đây là lần

đầu tiên C botulinum type C được phân lập từ loài thân mềm này (Bengtson,

1922) Đến năm 1930, nhiều tác giả như Giltner and Couch, Gunderson and

Hobmairer đã phân lập được C botulinum type C từ thủy cầm hoang dã bị

bệnh tại Hoa Kỳ (Shaw and Simpson, 1936)

Ở gia cầm, bệnh còn được gọi là bệnh liệt cổ (limberneck) và bệnh vịt

phương Tây (Western duck sickness) Hầu hết gia cầm bị nhiễm C botulinum type C

và trong ổ dịch thì vịt là loài cảm nhiễm nhất (Rosen, 1971) Bệnh xảy ra nhiều vào

những tháng thời tiết nóng hơn là những tháng lạnh (Rocke and Bollinger, 2007).Người không bị ảnh hưởng bởi type C, tuy nhiên thí nghiệm cho thấy khỉ chết sau khicho ăn gà nhiễm độc tố type C (Giltner and Couch, 1930)

Đối với gia cầm, C botulinum type E và C được xem là tác nhân chính

gây ra bệnh mặc dù một số type khác cũng có khả năng gây bệnh cho gia cầm(Dohms, 1987) Bình thường vi khuẩn sống cộng sinh trong đường ruột giacầm và không gây bệnh nhưng khi con vật chết thì vi khuẩn sẽ phát triển vàsản sinh độc tố Khi xác động vật phân hủy, ruồi đẻ trứng vào nở ra những ấutrùng (giòi) mang độc tố Trên mô xác gia cầm chết đã xác định được lượngđộc tố type C lớn hơn 2000 liều gây chết tối thiểu (MLD) và trong con giòichứa lượng độc tố lên đến 104 – 105 liều MLD Do đó khi gà, chim, vịt ăn giòihoặc xác động vật chết sẽ dễ dàng bộc phát bệnh

Trong môi trường nước, các động vật giáp xác nhỏ và ấu trùng côn trùng

có thể chứa Clostridium botulinum trong ruột Khi các loài động vật này chết

xác động vật phân hủy sẽ cung cấp một nguồn protein thúc đẩy việc sản xuấtcác loại độc tố botulin type C trong thịt, trầm tích hoặc vùng đất ngập nước

(Bell et al., 1955 ; Soos & Wobeser, 2006) Botulism gây ra bởi type A và E ở

gia cầm hiếm xảy ra và nó thường liên quan với việc sử dụng thức ăn hư hỏng của người để nuôi gà nhà.

Do đặc điểm trên, bệnh thường xảy ra ở những vùng ngập nước vừa rútcạn, nơi có điều kiện ấm áp, môi trường có nhiều xác động vật chết và phânhủy Các nghiên cứu cho thấy bệnh là nguyên nhân gây chết chủ yếu đối vớicác loài chim di cư trên toàn thế giới (Wobeser, 1997)

2.2 Tác nhân gây bệnh nhiễm độc tố botulin

Năm 1895, Emile Van Ermengem là người đầu tiên phát hiện người ngộđộc và chết do ăn dăm bông, gọi là bệnh ngộ độc thịt và năm 1896 tác giả đã

xác định được nguyên nhân là Clostridium botulinum, một loại vi khuẩn kỵ

khí, có nha bào, rất khó bị tiêu diệt Sau này, các nhà khoa học khác còn thấychúng trong đất, ruột cá, đồ hộp thịt cá, phân người Năm 1928, Tessmer Snipe

& Hermann Sommer chiết tách được độc tố từ C.botulinum Năm 1949, Arnold Burgen phát hiện độc tố của C botulinum làm tổn thương hệ thần kinh

trung ương (đặc biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất

là liệt cơ mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng,lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là gây liệt trung tâm hô hấp,tim dẫn đến tử vong cao Năm 1960, Alan Scott & Edward Schantz sử dụngđộc tố botulin cho các mục đích điều trị (Dressler, 2006)

2.3 Đặc tính sinh học của vi khuẩn C botulinum

2.3.1 Phân loại, đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Clostridium botulinum thuộc chi Clostridium, họ Clostridiaceae, bộ Clostridiales, lớp Clostridia, ngành Firmicutes.

Clostridium botulinum cũng được gọi với nhiều tên là Botulobacillus botulinus, Ermengemillus botulinus, Bacillus botulinus, Bacillus putrificus, Pacinia putrifica, Clostridium putrificum, Bacillus putrificus, Pacinia putrifica, Clostridium putrificum, Botulobacillus botulinus, Ermengemillus botulinus.

Clostridium botulinum có thể phân biệt với các Clostridium khác dựa vào

các đặc trưng cấu trúc phân tử theo bảng 2.1

Bảng 2.1 Đặc trưng tổng quát hệ gen một số loài Clostridium

Các loài Clostridium

Đặc điểm

botulinum difficile acetobutylicum perfringens tetani

Kích thước(bp) 3.886.916 4.290.252 3.940.880 3.031.430 2.799.250G+C (%) 28,24 29,06 30,93 28,60 28,75Chuỗi mã hoá 3650 3774 3740 2660 2368Mật độ mã hoá 0,93 0,87 0,93 0,87 0,85Kích thước gen

875 943 920 946 1011trung bình (bp)

(Mohammed Sebaihial et al., 2007)

Vi khuẩn C botulinum là một trực khuẩn thẳng hai đầu tròn, dài từ 4–6

µm, rộng từ 0,9–1.2 µm, có thể đứng riêng lẻ hay tập trung thành song trực

khuẩn, có khi thành chuỗi ngắn Trong canh khuẩn có đường glucose vi khuẩn

có dạng sợi dài, vi khuẩn có nha bào

Nha bào có tính đề kháng cao nhưng bị tiêu diệt ở nhiệt độ 1200C trong

15 phút trong khi độc tố bị phá hủy ở nhiệt độ 1000C trong 20 phút Nha bào

có hình trứng nằm ở một đầu vi khuẩn Vi khuẩn có 4 – 8 lông quanh thân,

nhưng di động không mạnh (Quinn et al, 1994).

Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn C botulinum và nha bào (mũi tên)

5

2.3.2 Đặc tính nuôi cấy

C botulinum là loại vi khuẩn yếm khí tuyệt đối Nhiệt độ nuôi cấy thích

hợp 28–30oC, độ pH 8,2–8,5 Trong nước thịt yếm khí có đường glucose: canhkhuẩn mọc đều, sản sinh nhiều hơi, có cặn lắng dưới đáy, sau đó canh khuẩntrở nên trong và có mùi butyric Thạch Vaillon hình thành những khuẩn lạctrong suốt, dần dần trở nên đục, màu nâu nhạt, vi khuẩn sản sinh nhiều hơi làmnứt thạch hoặc vỡ thạch, môi trường có mùi butyric Môi trường Gelatin cóglucose: cấy chích sâu vi khuẩn mọc tốt theo đường cấy, sản sinh nhiều hơi vàlàm tan chảy chậm Nước thịt yếm khí có óc: làm đen óc Thạch máu: dunghuyết sau khi nuôi cấy 3–4 ngày

2.3.3 Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn lên men có sinh hơi glucose, mantose, levulose, dextrin Lênmen không đều galactose, saccarose, lactose, raffinose, xylose, dunxit,maltose, arabinose, salixin Trực khuẩn hóa lỏng nhanh gelatin Không sinhindole nhưng sinh H2S (Nguyễn Như Thanh et al., 2001)

Bảng 2.2 Một số phản ứng sinh hóa của các Clostridium (Quinn et al., 1994)

2.3.4 Khả năng hình thành bào tử của Clostridium

Vào cuối thời kỳ sinh trưởng, khi chất dinh dưỡng trong môi trường cạn

kiệt, các Clostridia sẽ thay đổi điều kiện sinh trưởng bằng cách hình thành một

thể nghỉ ở bên trong tế bào có dạng hình cầu hay hình bầu dục là nội bào tử(endospore), nha bào hay gọi chung là bào tử (spore) Bào tử có tính khángnhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu Bào tử đượchình thành từ trong tế bào vi khuẩn qua nhiều giai đoạn và mỗi tế bào chỉ sinh

ra một bào tử Các tế bào có khả năng tạo bào tử gọi là tế bào sinh dưỡng.Trong tế bào này, bào tử dần được hình thành đồng thời tế bào sinh dưỡng tựtiêu hủy dần đến cuối cùng chỉ còn lại nha bào tự do Cấu tạo từ ngoài vàotrong gồm:

Màng ngoài: Là phần còn sót lại của tế bào sinh dưỡng, khi có khi

không, khi dày khi xốp và gồm 2 lớp, thành phần chủ yếu là lipoprotein, mộtlượng nhỏ acid amin, tính thẩm thấu kém

Lớp áo bào tử: Nằm dưới màng ngoài, cấu tạo chủ yếu là các protein

sừng và một ít phospholipoprotein Có sức đề kháng rất cao với lysozyme,proteinase, các chất hoạt động bề mặt

Lớp vỏ bào tử: Nằm dưới lớp áo, chứa một lượng lớn peptidoglycan,

không có acid teichoic Ngoài ra còn chứa nhiều calcium, dưới dạng muốicalcium dipicolinate Acid dipicolinic là chất đặc hiệu của nha bào và chínhnhờ calcium dipicolinate (DPA-Ca) quyết định khả năng chịu đựng của nhabào đối với sức nóng Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ này cao tới 20 atm

Hình 2.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn Clostridium spp.

(Thomas Mark Corrol II, 2008)

Lõi bào tử: Dưới lớp vỏ, được cấu tạo bởi 4 thành phần như một tế bào bình

thường của vi khuẩn: thành bào tử màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân Tuynhiên, người ta nhận thấy rằng không có sự hiện diện của acid teichoic mà lại cóDPA-Ca trong bào tử chất Tuổi thọ của bào tử gần như vô hạn Các nhà khoa học

đã phân lập được bào tử sống từ mật ong hóa thạch có tuổi 25 triệu năm và thậmchí từ một tinh thể muối 250 triệu năm tuổi (Talaro, 2002)

2.3.5 Sức đề kháng

Nha bào có sức đề kháng rất cao, ở nhiệt độ bình thường nó sống đượcnhiều năm, ở nhiệt độ 110oC trong 10 phút chưa đủ để diệt nó Nếu sấy ướt

1150C thì mới diệt được 80% nha bào, 8 phút mới diệt được 95%, phải ở nhiệt

độ 1200C trong 10 phút mới diệt được hoàn toàn nha bào, trong môi trường có10% NaCl thì khả năng ngăn cản hình thành nha bào (Lê Huy Chính, 2003)

2.3.6 Sự phân bố và ảnh hưởng của vi khuẩn C botulinum trong tự nhiên

Theo Nguyễn Như Thanh (2004), C botulinum phát triển thích hợp trong

những đất có độ ẩm tuyệt đối Chúng phát triển nhiều trong lớp đất canh tác vì

ở đó có nhiều chất hữu cơ Phospho và kali cũng là hai yếu tố cần thiết cho quá

trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Clostridium spp không quá mẫn cảm với nồng độ calci trong đất, tuy nhiên calci rất cần cho việc tạo thành bào tử Clostridium.

Haagsma (1991) nói về sự hiện diện của vi khuẩn Clostridium spp trong

một số loại mẫu như phân, đất (nước), trầm tích biển, thức ăn, cho thấy rằng vi

khuẩn Clostridium spp xuất hiện nhiều nhất trong phân, tiếp đến là trong đất

(nước), thấp nhất là trong các mẫu trầm tích biển và thức ăn

Bảng 2.3 Sự hiện diện của vi khuẩn Clostridium trong một số loại mẫu (Haagsma 1991)

đôi khi có ở ruột của cả động vật và con người Ở một số loài khác của

Clostridium có thể hiện diện trong các vật liệu mục nát, xác các loài gặm nhấm

nhỏ, xác chết chim hoặc trong phân bón Vì thế, việc phân lập vi khuẩn

Clostridium spp từ nhiều nguồn khác nhau là rất cần thiết trong chăn nuôi thú

y, nó hạn chế giảm bớt một phần ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe của vật nuôi

Sự khuếch tán oxy trong đất là điều kiện quan trong ảnh hưởng đến sự

phát triển của vi khuẩn yếm khí Đặc biệt, đối với vi khuẩn Clostridium spp.

thì lại không phát triển khi có sự hiện diện của oxy, tùy thuộc vào từng chủng

mà nồng độ oxy thay đổi khác nhau thì chúng mới có thể tăng trưởng và pháttriển Một số chủng có thể chịu được nồng độ oxy cao đến 3%.Trong các loạiđất thì sự khuếch tán oxy trong đất tốt là đất ruộng, đất phù sa

2.3.7 Độc tố của vi khuẩn

2.3.7.1 Độc tố botulin

Botulin là tên gọi chung của một loại ngoại độc tố do vi khuẩn

Clostridium botulinum sản sinh (viết tắt là BoNTs), gồm có 8 type độc tố là A,

B, C, D, E, F, G và H Các loại độc tố được phân biệt bằng đặc tính khángnguyên Trong đó 3 type gây độc đáng chú ý là A, B, E (độc nhất là A, kế làB) Botulin có độc tính mạnh nhất trong các chất độc sinh học đã biết Nó độcgấp 7 lần so với độc tố uốn ván, 1mg có thể giết chết 100 triệu chuột nhắt

(Hall et al., 1985; McCroskey et al., 1991) Trong 8 type độc tố thì đã có 6 loại độc tố có đến 05 phân nhóm Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng C botulinum đều sản sinh độc tố Độc tố được hấp thụ ở ruột vào máu đi đến các

khớp nối thần kinh cơ ngoại vi tấn công các protein dung hợp (SNAP-25,syntaxin hoặc synaptobrevin) tại điểm tiếp hợp thần kinh cơ gây ức chế sảnsinh acetylcholine từ đó gây cản trở quá trình dẫn truyền xung thần kinh gâyliệt cơ bắp, trái ngược với tình trạng co cơ trong các bệnh uốn ván (độc tố của

C botulinum tác động trên thần kinh ngoại vi gây hiện tượng “liệt mềm”, trong khi đó độc tố C tetani tác động lên hệ thần kinh trung ương gây “liệt

cứng”) (MacKenzie and Debora, 2013)

Biểu hiện của ngộ độc ở người bắt đầu 18–36 giờ sau khi nhiễm độc làchóng mặt, khô miệng, nôn ói có thể xảy ra Các thần kinh chức năng bị ức chếgây mờ mắt, mất khả năng nuốt, liệt vận động và liệt hô hấp Độc tố

botulin có thể tác động vào thần kinh trung ương, tuy nhiên triệu chứng thầnkinh trung ương rất hiếm (MacKenzie and Debora, 2013).

Miễn dịch đối với ngộ độc botulin không phát triển vì lượng độc tố cần thiết

để tạo ra một đáp ứng miễn dịch sẽ gây tử vong Dù chất độc không bền với nhiệt

nhưng các bào tử của C botulinum có thể sống sót nhiệt độ sôi (100oC) trong 1giờ cho nên để phòng chống ngộ độc thực phẩm cần có biện pháp xử lý thích hợp

Các loại độc tố có cấu trúc và đặc tính riêng: Botulin type A thì phân giảiprotein, gây ngộ độc thịt cho người (gồm ngộ độc vết thương và ngộ độc trẻ sơsinh), thường tìm thấy trong thịt cá, rau củ, thịt đóng hộp, các sản phẩm lênmen Trong khi đó botulin type B cũng phân giải protein, thường tìm thấytrong thịt, đặc biệt là thịt heo Loại độc tố này ngoài việc gây ngộ độc thịt chongười nó còn gây bệnh cho ngựa và bò Botulin type C không phân giảiprotein, gây độc cho các loài chim và gia cầm, tìm thấy trong thực vật đầm lầy,sinh vật thủy sinh Botulin type D không phân giải protein, gây ngộ độc chocác loài động vật như: bò, lừa, ngựa… có thể tìm thấy trong gia súc nhiễmđộc Botulin type E không phân giải protein, gây ngộ độc cho người, cá, chimbiển, thường tìm thấy trong thủy sản và các sản phẩm thủy sản Botulin type Fgây độc cho người đặc biệt là trẻ em, tìm thấy trong các sản phẩm thịt Riêngbotulin type G phân giải protein, hiện chưa có thông tin đầy đủ về tính gâybệnh của type này, tìm được trong đất (MacKenzie and Debora, 2013)

Năm 2013, các nhà nghiên cứu tại Khoa Y tế cộng đồng California đãphát hiện một độc tố thứ tám, đó là type H Botulin type H được coi là độc tốmạnh nhất, chỉ cần một mũi tiêm với liều 2 nanogram hoặc hít phải 13nanogram có độc tố botulin này cũng có thể giết chết một người trưởng thành(MacKenzie and Debora, 2013)

Tất cả các độc tố trên đều bị trung hoà bởi kháng độc tố tương tứng (riêngtype H hiện nay chưa có kháng độc tố) Mặc dù các botulin này có tính độc caonhưng chúng có sức đề kháng kém với nhiệt độ, chỉ cần đun 60–80oC trong 10phút thì độc tố sẽ bị phá huỷ, chúng cũng không bền khi ở ngoài môi trườngquá lâu Nhưng chúng lại có sức đề kháng mạnh với men tiêu hoá, chúng hầunhư không bị phân huỷ bởi dịch vị và men tiêu hoá trong dạ dày

Độc tố botulin là một protein và là chất độc thần kinh, botulin có thể gây ngộ

độc nghiêm trọng và đe dọa tính mạng của con người và động vật (MiiaLindstrom and Hannu Korkeala, 2006)

Vi khuẩn được chia thành 4 nhóm (I – IV) dựa trên các đặc điểm nuôicấy và 8 nhóm độc tố khác nhau (A, B, Cα, Cβ, D, E, F, và G) Bệnh ở ngườichủ yếu do các type A, B, E, F Bệnh ở loài chim thì chủ yếu do các type A, C,

E (Miia Lindstrom and Hannu Korkeala, 2006)

Nhóm I

Bao gồm các chủng độc tố type A, những biến dạng thủy phân proteincủa độc tốtype B và F và những kiểu độc tố kép AB, AF, BF Đặc điểm chínhcủa nhóm này là những trực khuẩn hơi cong với lông roi có lông rung rải rác,nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 – 40oC, sản xuất bào tử chịu nhiệt cao, độ pHtối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước là 0,94–4,6

Nhóm II

Bao gồm chủng độc tố type E và những biến dạng không thủy phânprotein nhưng phân giải đường của độc tố type B và F Đặc điểm chính củanhóm này là những trực khuẩn với lông roi rải rác, là nhóm ưa lạnh nhiệt độsinh trưởng tối ưu là 18 – 25oC, sản xuất bào tử chịu nhiệt thấp, độ pH tốithiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn là 0,97–5

Nhóm III

Bao gồm chủng độc tố type C và D và những sự biến dạng nói chung làkhông có thủy phân protein Đặc điểm chính của nhóm này là những trựckhuẩn với lông roi có lông rung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 –

40oC, sản xuất những bào tử với khả năng chịu nhiệt trung gian, độ pH tốithiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước vẫn chưa biết

Nhóm IV

Bao gồm những chủng thủy phân protein của chủng độc tố type G Đặcđiểm chính của nhóm này bao gồm: những trực khuẩn với lông roi có lôngrung rải rác, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 35 – 40oC, sản sinh những bào tửvới khả năng chịu nhiệt trung gian, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của

vi khuẩn trong nước vẫn chưa biết

Bảng 2.4 Quan hệ giữa các nhóm của độc tố botulin và một số ký chủ (Haagsma 1991)Nhóm Nhóm I Nhóm II Nhóm III Nhóm IV

Các type độc tố AB,F B,E,F C, D G

Phân giải protein + - yếu

-Phân giải đường - + -

-Bệnh chủ con người con người động vật

-Gen độc tố nhiễm sắc thể nhiễm sắc thể bacteriophage plasmid

Quan hệ gần C porogenes, C butyricum, C.haemolyticum C subterminale,

C putrificum C beijerinicki C novyi type A C aemolyticum

2.3.7.2 Cơ chế gây bệnh của độc tố botulin

Độc tố của C botulinum (botulin) được tổng hợp từ một chuỗi

polypeptid có trọng lượng phân tử khoảng 150.000 dalton Ở cấu trúc này,

độc tố có hoạt lực tương đối thấp, nhưng dưới tác động của một số enzym của

vi khuẩn và trypsin thì chuỗi này tách ra thành hai chuỗi, chuỗi nặng (100.000

dalton) và chuỗi nhẹ (50.000 dalton) nối với nhau bằng cầu nối disulfur

(Todar, 2009) Với cấu tạo này, botulin có tác dụng ức chế sự dẫn truyền thần

kinh cơ Diễn tiến tác động của botulin gồm 3 giai đoạn: kết nối, thâm nhập

và ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền thần kinh Botulin không có ảnh

hưởng đến sự tổng hợp hay dự trữ acetylcholine nhưng ảnh hưởng đến sự

phóng thích chất này ở nơi tiếp giáp giữa thần kinh và cơ Chuỗi nặng có khả

năng kết nối, còn chuỗi nhẹ là cấu trúc gây độc nội bào (Pirazzini et al.,

2013)

Khi hoạt động thần kinh vận động tạo nên sự khử cực ở đầu cuối của sợitrục (axon), acetylcholine sẽ đươc phóng thích từ tế bào chất vào khe synapse.Acetylcholine được chuỗi protein vận chuyển phóng thích Khi botulin xâmnhập vào mô thì chuỗi nặng của botulin gắn chuyên biệt với cấu trúcglycoprotein ở đầu thần kinh dẫn truyền acetylcholine và chuỗi nhẹ của botulin

sẽ gắn lên protein đích Tuỳ vào loại botulin khác nhau sẽ có các protein đíchkhác nhau Sự gắn kết chuỗi nhẹ với protein đích sẽ ngăn cản quá trình chuyểnacetylcholine ở các lỗ trên bề mặt trong của màng tế bào dẫn đến

sự khoá chặt các lỗ vận chuyển này Khi đích là cơ thì sẽ xảy ra sự liệt cơ (liệt

nặng hay nhẹ tuỳ vào lượng độc tố) do bị ức chế dẫn truyền thần kinh Khi

đích là các tuyến ngoại tiết thì sự tiết ở các tuyến này bị khoá chặt (Dickenson

and Janda, 2006) Nếu các liên kết disulfur nối hai chuỗi bị hỏng trước khi các

độc tố xâm nhập vào trong các tế bào, các chuỗi polypeptid không thể tiếp

nhận các thiết bị đầu cuối sợi trục màng, và khi đó độc tố sẽ mất hoàn toàn độc

tính (Peck et al., 2010).

tiếp hợp thần kinh cơ

điểm tiếp nối

Dẫn truyền giải phóng Hoạt động của

Thụ thể độc tố botulin

Phóng giải

độc tố

botulin thần kinh

thụ thể acetycholine

tế bào cơ

Hình 2.3 Cơ chế tác động của độc tố botulin

Khi botulin được sử dụng để điều trị tăng tiết mồ hôi (Bushara and Park,1994), sự tăng tiết nước bọt, sự tiết nước mắt, hay khi những tác động đối lậpcủa độc tố loại B như là khô mắt hay sự khô niêm mạc xuất hiện, mô tuyếnngoại tiết cũng bị ảnh hưởng bởi botulin Do đó, botulin cũng ảnh hưởng đếncác sợi thần kinh ly tâm của hệ thần kinh tự chủ.

14

2.4 Bệnh do nhiễm độc tố của Clostridum botulinum

Nghiên cứu của Sobel et al.,(2004) cho thấy ở các nước phát triển, tỷ lệ

tử vong của bệnh ngộ độc thực phẩm là từ 5 đến 10% Năm 1995, Hathewaykhảo sát về nguyên nhân các trường hợp ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới.Kết quả cho thấy hơn một nửa các trường hợp (52%) là do độc tố type B, type

A chiếm 34% và type E chiếm 12% Type F ít có liên quan đến ngộ độc thực

phẩm (Harvey et al., 2002).

Hai kháng độc tố botulin chính có sẵn để điều trị ngộ độc thực phẩm gồmmột loại có nguồn gốc từ các nguồn kháng thể ngựa (Fab và Fc) Loại khángđộc tố thứ hai là Heptavalent (A, B, C, D, E, F, G) Kháng độc tố này có sẵn từcác cơ sở y tế địa phương thông qua CDC tại Mỹ

được báo cáo ở Mỹ, các độc tố chủ yếu là type A và B Ngộ độc thường xảy ra

ở trẻ em dưới một tuổi và chủ yếu là những trẻ từ sáu tháng tuổi trở xuống Do

ruột của trẻ còn yếu chưa hoạt động mạnh, vì thế bào tử C botulinum có thể

nảy mầm và hình thành độc tố trong ruột

Trẻ em nhiễm bệnh thường thấy có những triệu chứng như: Có vẻ uể oảiyếu ớt, táo bón kinh niên, tay, chân và cổ đều yếu ớt không còn một sức cothắt nào cả Tiếng khóc yếu, nhè Mút bú rất yếu Bệnh có thể biến chuyển đưađến sự liệt tứ chi cũng như liệt các vùng khác của cơ thể để cuối cùng chết vìliệt hô hấp

Báo cáo của Johnson et al (1979) cho thấy các biểu hiện lâm sàng của

ngộ độc botulin ở trẻ sơ sinh thay đổi từ cận lâm sàng đến chết đột ngột, triệuchứng thường bắt đầu với táo bón, có thể kéo dài nhiều ngày, tiếp theo là liệtmềm, biểu hiện đặc biệt là sự giảm ăn do suy yếu cơ bắp ở miệng và cổ họng,liệt cơ mặt và liệt mí mắt

Điều trị

Không khuyến khích sử dụng thuốc kháng sinh ở trẻ sơ sinh bị ngộ độc,bởi vì như thế sẽ làm tăng hàm lượng độc tố trong máu Trong thí nghiệm mô

hình chuột và dựa trên kinh nghiệm, Wang et al (1984) cho kết quả kháng

sinh aminoglycosid sẽ làm tăng sự phong tỏa thần kinh cơ Bên cạnh đó, thuốc

có chứa magie nên tránh dùng vì nó có thể làm tăng tác động của độc tố

botulin (Shapiro et al., 1998).

Việc điều trị chủ yếu cho bệnh ngộ độc ở trẻ sơ sinh là chăm sóc hỗ trợ,đặc biệt chú ý tập trung vào dinh dưỡng của trẻ và hô hấp (CDC, 1998:Control of Disease Center)

Trong số 40 trường hợp được công bố trong các tài liệu của Mechem vàWalter, (1994) về ngộ độc botulin ở người cho thấy 78% nguyên nhân liênquan đến vết thương, trong đó có trầy xước, gãy xương hỡ, vết rách, vếtthương đâm thủng và áp- xe Khi nạn nhân bị vết thương sâu hoặc vết áp-xe,nơi vết thương sẽ hình thành môi trường yếm khí, tạo điều kiện thích hợp cho

bào tử C botulinum nảy mầm và phát triển Kết quả lâm sàng tương tự như

ngộ độc thực phẩm nhưng không có biểu hiện của đường tiêu hóa Thời gian ủbệnh trung bình là 7 ngày Khi điều trị, ngoài việc hỗ trợ hô hấp còn phải thực

hiện việc phẫu thuật mở rộng vết thương, thuốc kháng sinh và thuốc khángđộc Ước tính tỷ lệ tử vong là 15% (Hatheway, 1995) Giai đoạn phục hồichậm, kháng độc tố có thể cần phải sử dụng nhiều lần (CDC, 2008).

Trường hợp này đã được báo cáo ở những bệnh nhân đã từng có lịch sửtiêm độc tố botulin type A vào cơ thể, đặc biệt là vào các bắp thịt lớn cho tácdụng toàn thân Hơn thế, theo Cherington (1998) thì nhiều trường hợp gần đâycủa ngộ độc gây ra bởi việc sử dụng chất độc botulin để điều trị chứng loạnngôn ngữ và các rối loạn vận động khác Ở những trường hợp khi bệnh nhân

có tật vẹo cổ và có sử dụng độc tố botulin type A để điều trị, khi tiêm độc tốvào cơ bắp cổ có thể độc tố thâm nhập vào các cơ bắp hầu xung quanh

Việc sử dụng điều trị của độc tố botulin cần thận trọng đặc biệt ở nhữngbệnh nhân bị rối loạn cơ dẫn truyền thần kinh và ở những bệnh nhân được điềutrị đồng thời với aminoglycosid Các trường hợp khác của ngộ độc botulin là

do sự hít vào và có thể do khí dung của các chất độc thần kinh (Holzer, 1962)

2.4.2 Bệnh ở động vật hữu nhũ

Bệnh lâm sàng thường thấy xảy ra ở chồn, bò, cừu, ngựa Đôi khi bệnhxảy ra ở chó và heo nhưng bệnh chưa thấy nói đến bệnh ở mèo

Ủ bệnh: 2 giờ đến 2 tuần (đa số trường hợp xuất hiện sau 12 – 24 giờ)

Bệnh tích: Không có bệnh tích đặc trưng; các tổn thương thường là kết

quả của tình trạng tê liệt cơ bắp nói chung Tê liệt hô hấp có thể gây ra dấuhiệu không đặc hiệu như màng ngoài tim chứa nhiều dịch fibrin, phổi phù nề

và xung huyết

Triệu chứng: Bệnh thể hiện ở một số loài có thể quan sát được.

Ở trâu bò và ngựa: Con vật không cử động, các khớp co gập, lưỡi tê liệt,

chảy nước dãi, bí tiểu tiện, khó nuốt, cơ bắp tê liệt bắt đầu từ chân sau ra trước đến đầu

và cổ, con vật bệnh nằm úp bụng

Khi gia súc bệnh nằm nghiêng một bên là dấu hiệu sắp chết, sẽ xảy ra trong vòng 6 – 72 giờ

Ở những gia súc dưới 4 tuần tuổi nhiễm bệnh: con vật đi xiêu vẹo, runrẩy và không có khả năng đứng lâu hơn 4 – 5 phút Các triệu chứng thể hiện là: chứngkhó nuốt, táo bón, dãn đồng tử, đi tiểu thường xuyên; nhịp tim nhanh và khó thở ở cácgiai đoạn Cái chết xảy ra trong vòng 24 – 72 giờ sau khi vật thể hiện triệu chứng banđầu do tê liệt hô hấp.

Ở cừu: Triệu chứng chung là chảy nước mũi, nước dãi Thở thể bụng.

Rối loạn vận động, bước chân cứng nhắc Tê liệt 4 chân Đuôi ngoặt sang một bên

Ở heo, chó và mèo: Các loài này đề kháng bệnh tương đối tốt, đặc biệt là

mèo Các triệu chứng bệnh (ở chó và heo) là biếng ăn, biếng uống, ói mữa, cơ bắp têliệt Hầu hết chó bệnh tự hồi phục bệnh trong vòng 2 tuần

Ở cáo và chồn: Con vật thường chết do tê liệt và khó thở với các mức độ

khác nhau

Hình 2.4 Triệu chứng ngộ độc ở cáo Hình 2.5 Triệu chứng ngộ độc ở bò

(Nguồn: www.cfsph.iastate.edu ) (Nguồn: www.cfsph.iastate.edu)

2.4.3 Bệnh do độc tố của Clostridium botulinum ở loài gia cầm

Ký chủ tự nhiên và trong phòng thí nghiệm

Bệnh do C botulinum type C xảy ra ở nhiều loài bao gồm gà, gà tây, vịt,

chim trĩ, đà điểu Trong tự nhiên 117 loài thuộc 22 họ chim bị ảnh hưởng bởibệnh này (Giltner & Couch, 1930)

Các loài hữu nhũ bị tác động bởi độc tố type C bao gồm chồn, trâu bò,heo, chó, ngựa và nhiều loài khác Con người, chó và mèo thường được coi là

đề kháng với type C gây ngộ độc ở gia cầm Cá cũng ảnh hưởng bởi type C(Smith, 1987)

Trong phòng thí nghiệm, loài gậm nhấm cảm nhiễm mạnh mẽ với độc tốtype C, cho nên chuột là động vật hữu ích trong sự dò tìm sinh học để pháthiện các type độc tố Trong phòng thí nghiệm khi tiêm tĩnh mạch hay dưới dacho chuột lang liều 0,5ml canh khuẩn, chuột chết sau 3–4 ngày với các triệuchứng chảy nước dãi, khó thở, liệt chi sau

Gà 2 – 8 tuần tuổi dễ bị bệnh hơn gà lớn, gà bị bệnh thường ở lứa tuổi 6,2

± 1,7 tuần (Dohms, Allen & Rosenberger, 1982) Gà lớn hơn đôi khi cũng xảy

ra bệnh cho dù gà lớn được xác định là rất đề kháng với C1 Gà, gà tây, chimtrĩ, công cảm nhiễm với độc tố type A, B, C, D nhưng không cảm nhiễm type

F (Gross and Smith, 1971) Gà broiler ít cảm nhiễm với độc tố type C1 Ngượclại, vịt và chim trĩ rất mẫn cảm với type C1 Gà mới nở với liều LD50 quađường uống là 103 LD50/kgP, gà 8 tuần là 106.3 LD50/kgP (Dohms & Cloud,1982)

Tiêm tĩnh mạch cho vịt và ngỗng với độc tố C2 thấy có bệnh tích ở tim phổi Tuy nhiên vai trò của độc tố C2 trong các ổ dịch tự nhiên thì không rõràng (Jensen & Duncan, 1980)

-Lan truyền bệnh

Clostridium botulinum rất phổ biến trong đất bề mặt của cả trên cạn lẫn

môi trường nước Tuy nhiên độc tố chỉ được chỉ sản sinh khi vi khuẩn có điềukiện thuận lợi cho phát triển và nhân rộng Theo Locke & Friend, 1989 thì một

ổ dịch do C botulinum type C gây ra là do các chuỗi sự kiện sau:

Khi mức nước hạ thấp làm tăng nhiệt độ nên làm cho một số loài động

vật không xương sống là ký chủ của C botulinum sẽ bị chết Những xác chết

của động vật không xương sống sẽ là môi trường tốt cho sự phát triển của vikhuẩn và các vi khuẩn sẽ sản sinh nhiều độc tố Khi vịt ăn xác các động vậtkhông xương sống chết ở trong lớp bùn trầm tích sẽ bị nhiễm độc và chết