Cải tạo giống cy trồng bằng phương pháp nuôi cấy

Cải tạo giống cy trồng bằng phương pháp nuôi cấy

Trường Đại Học Bách Khoa Tp HCM KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

Đề tài: Cải tạo giống cây trồng bằng phương pháp nuôi

cấy và dung hợp tế bào trần

GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN

Tp HCM Ngày 8 Tháng 6 Năm 2011

Mục lục Trang

1 Mở đầu:

1.1 Đặt vấn đề: 3

1.2 Mục đích nghiên cứu: 4

2 Tổng quan tài liệu: 2.1 Tế bào trân: 4

2.2 Lịch sử nghiên cứu tế bào trần: 4

3 Kỹ thuật thu nhận tế bào trần: 7

4 Xác định mật độ tế bào trần và khả năng sống sót: 10

5 Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần: 5.1 Môi trường nuôi cấy: 11

5.2 Sự tái sinh cây: 14

6 Dung hợp tế bào trần và sự lai soma: 6.1 Nguyên tắc: 15

6.2 Các phương pháp dung hợp tế bào trần: 15

6.3 Dung hợp tế bào trần bao gồm 3 pha: 16

6.4 Phương pháp nuôi cấy và mật độ tế bào lai: 17

6.5 Sự phát triển của tế bào lai: 17

6.6 Những thuận lợi và khó khăn của dung hợp tế bào trần: 18

7 Tài liệu tham khảo: 19

1 Mở đầu:

1.1 Đặt vấn đề:

Màng nguyên sinh chất cho phép các tế bào trần có thể hấp thu các tế bào đại phân tử (nucleic acid, protein), thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể, nhân bào…theo cơ chế của amip

Nếu để các tế bào trần cạnh nhau, chúng có thể dễ dàng hòa làm một Đây là hiện tượng dung hợp (protoplast fusion) hay còn gọi là lai vô tính tế bào (cell somatic hybridization) Khi 2 hoặc nhiều tế bào trần dung hợp ngẫu nhiên sẽ tạo một khối tế bào trần, trong đó nhân của chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ Nếu hai nhân khác nhau sẽ tạo ra thể lai dị nhân ngược lại có thể lai đồng nhân Sự kết hợp nhân trong thể dị nhân hình thành tế bào trần lai thực sự gọi là thể dị nhân Nếu 1 trong 2 nhân bị đào thải, nguyên sinh chất của 2 tế bào trần sẽ dung hợp tạo ra thể lai tế bào chất cybrid (Cytoplasmid hybrid) Sự liên kết và dung hợp tế bào trần để tạo thành các tế bào lai heterocaryon giữa các mô cùng một loài hoặc thuộc các loài khác nhau tùy thuộc vào nồng độ các ion như natri, kali, canxi, cũng như độ pH của môi trương nuôi cấy Đồng thời phụ thuộc vào một số chất có tác dụng tăng cường liên kết tế bào như lysozym, và đặc biệt là polyethylen glycol do cấu trúc phân tử của chúng có thể tạo nên các liên kết ion với các chất có mặt ở màng sinh chất của tế bào Sử dụng polyethylen glycol (với nồng độ từ 0,2- 0,3M)

có thể tạo ra các tế bào lai đạt từ 25- 50% và các tế bào lai có thể tồn tại qua nhiều thế hệ Sự tạo thành mô sẹo (callus) và tái sinh cây từ tế bào lai syncaryon không phụ thuộc vào phương pháp tạo tế bào lai

Kỹ thuật này cho phép mở rộng nguồn gene của các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ.[1] Bằng phương pháp dung hợp tế bào trần, ta có thể chuyển những gene hữu ích như đề kháng sâu bệnh, cố định đảm, giúp tốc độ sinh trưởng nhanh hơn, tốc độ hình thành sản phầm cao hơn (chấ lượng Protein), chống chịu được sương giá, chịu hạn, kháng thuốc diệt cỏ, … Dung hợp tế bào trần là một công cụ quan trọng giúp cho sự cải tiến giống để đem đến thay đổi đặc tính di truyền và phát triển trong chủng nấm sợi lai Dung hợp tế bào trần thường được dùng để kết hợp các gene của các loài sinh vật khác nhau để tạo ra các chủng với đặc tính mong muốn đây chính là công nghệ mạnh mẽ cho việc nhân giống VSV mang tính chất công nghiệp Công nghệ dung hợp tế bào trần sẽ tiếp tục được nghiên cứu và phát triển cho nền công nghệ sinh học hiện đại Kĩ thuật này trong tương lai sẽ là công cụ được sử dụng thường xuyên nhất trong nuôi cấy mô, sinh học phân tử, cho các nhà hóa sinh và công nghệ sinh học.[2]

1.2 Nội dung nghiên cứu:

 Tìm hiểu kỹ thuật thu nhận và nuôi cấy tế bào trần

 Xác định mật độ tế bào trần và khả năng sống sót

 Tìm hiểu các phương pháp nuôi cấy và tái sinh tế bào trần

 Tìm hiểu các phương pháp dung hợp tế bào trần

2 Tổng quan tài liệu:

2.1 Tế bào trần:

Tế bào trần là những tế bào mà vách tế bào của nó được loại bỏ và được bao phủ bằng màng nguyên sinh chất Tế bào trần được thu được bằng cách sử dụng các emzyme loại bỏ vách tế bào Dung hợp tế bào trần là một quá trình vật lý, bằng cách hợp nhất hai hay nhiều tế bào tiếp xúc và hòa hợp với nhau, hay chúng

tự phát trong các phản ứng sinh tồng hợp [2]

Đặc điểm của tế bào trần:

 Có khả năng tiếp nhận một đoạn/toàn bộ DNA lạ hoặc cả một bào quan

để cải tạo bộ máy di truyền

 Có thể dung hợp với tế bào cùng loài hay khác loài

 Có khả năng tái tạo vách cellulose và phục hổi toàn bộ chức năng của tế bào nguyên thuỷ (2-6 ngày);

 Có thể tái sinh thành cây nguyên vẹn

 Dễ dàng nghiên cứu ở mức độ phân tử.[3]

2.2 Lịch sử nghiên cứu tế bào trần:

Các nghiên cứu về tế bào trần trong thời kỳ 1960 và 1970

- Cooking 1960: Quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực vật

- Ruesink 1973: Nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất

- Willison et al 1971: Nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan (Potrykus 1975) và vi sinh vật (Davey và Power 1975)

- Howland et al 1975: Phương pháp phá vỡ tế bào để nhanh chóng thâu nhận các bào quan và các đại phân tử mà không gặp phải sự biến dạng hư hỏng như các phương pháp ly trích thông thường

- Nickell và Torey 1969: Tạo ra tế bào lai sinh dưỡng liên quan đến sự cải thiện năng suất thu hoạch mùa vụ

- Takebe 1975: Do mỗi một tế bào cách ly với tế bào khác trong quần thể tế bào trần và là một hệ thống đơn bào nên có thể thao tác tương tự như quần thể vi sinh vật Tính chất này được khai thác thành công trong thí nghiệm cho nhiễm

đồng loạt bởi virus, nuôi cấy nhân giống vô tính tế bào và phân lập các tế bào đột biến

- Pojnar et al 1967: Tế bào trần phân lập từ mô quả cà chua được khảo sát chi tiết đầu tiên quá trình cung cấp enzym để phục hồi trở lại vách tế bào

- Nagata và Takebe 1970: Nghiên cứu sự phân chia tế bào đầu tiên từ tế bào trần

- Grout and Coutts 1974 : Nghiên cứu bằng điện di có thể xác định bề mặt tế bào có tích điện và có thể trong một số điều kiện thông thường nào đó điện tích này là âm

- Power et al 1970: Tìm ra hợp chất gây ra sự tan rã là nitrate sodium chúng làm giảm điện tích âm xuống làm cho màng tế bào sát lại gần nhau

- Kao và Michayluk 1974, Wallin et al 1974: tìm ra chất Polyethylene glycol (PEG) được chấp nhận rộng rãi như một tác nhân gây ra sự tan rã

- Power et al 1976: Thực vật lai sinh dưỡng của Petunia hybrida và P

parodii đã được tạo ra thành công.

- Cocking (1989): thành công khi sử dụng các đối tượng của họ cà Solanaceae để dung hợp tế bào trần

- Abdullah et al 1986: tái tạo cây nguyên vẹn từ tế bào trần lúa, cô lập không phải từ lá nhưng từ dịch treo nuôi cấy tế bào

Các nghiên cứu về tế bào trần trong thời kỳ 1980 và 1990

- Petunia parodii và Petunia parviflora (Powder et al 1980) : nhìn thấy

được phương pháp tinh vi mở rộng trong tái tạo lại cây nguyên vẹn từ gia tăng vững chắc số các loài cây và trong sản xuất tế bào lai sinh dưỡng và cybrids

- Bajaj 1989: Các quy trình được phát triển xa hơn cho các kỹ thuật vi tiêm, dung hợp bằng điện, flow cytometry, hấp thu và tích hợp DNA, cô lập nhân và nhiễm sắc thể từ tế bào trần

- Cocking and Pojnar 1969: khám phá ra tế bào trần có thể bị nhiễm bởi virus khảm thuốc lá

- kích thích sự quan tâm về vấn đề hấp thu vào hệ thống tế bào trần, mà

đỉnh điểm là sự biểu hiện của plasmid Ti trong vi khuẩn Agrobacterium gây khối

u, được đưa và tế bào trần để biến đổi tế bào trần, cung cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò độc lập của plasmid Ti ở khía cạnh này (Davey et al 1980)

- Zang et al 1988: thành công trong lúa chuyển gen có khả năng sinh sản theo phương cách chuyển nạp bằng điện xung vào tế bào trần lúa plasmids chimaeric

- Davey và Kumar 1983: xác nhận rằng PEG cũng gia tăng sự thu hút virus

và acid nhân của virus vào trong tế bào trần

- Những năm cuối thập niên 1970 đầu thập niên 1980 đây là thời gian phối hợp giữa các kỹ thuật xác định plasmid Ti có thể chuyển nạp hay không vào tế bào trần thực vật

- Guerche et al 1987: Chuyển nạp gen hữu thụ cho Brassica napus được

chuyển gen bởi pABD1 vào trong tế bào trần thịt lá bằng phương pháp xung điện

- Kưhler et al 1987: Chuyển gen trực tiếp cũng chứng minh khả năng tạo hạt

rau Vigna aconitifolia kháng kanamycin mô sẹo tái tạo từ tế bào trần sốc nhiệt xử

lý bởi PEG và pLGV NEO 2103

- Các nghiên cứu chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần thực vật cũng cung cấp một hệ thống để quan sát sự biểu hiện gen trong khoảng thời gian vài giờ xử lý chuyển nạp Các nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời (ngắn ngủi) như vậy có ích trong việc đánh giá cấu trúc và gen khởi động khi gen reporter sẵn sàng có thể thử nghiệm ví dụ như CAT và b-glucurionidase

- Allshire et al 1987: chứng chứng tỏ rằng các mẫu DNA lớn có thể đưa vào

và biểu hiện ở tế bào động vật

Viễn cảnh hiện nay

- Davey et al 1974: chứng minh rằng tế bào trần có thể cô lập bằng enzyme

từ một số nhóm tế bào ví dụ như từ tế bào biểu bì lá của thuốc lá rồi có thể tái tạo lại thành cây nguyên vẹn

- Cooking 1985: chứng minh rằng lông hút của rễ là sản phẩm tự nhiên của

tế bào biểu bì rễ, và nó đã được chứng minh xử lý bằng enzyme có thể làm tiêu hủy đỉnh sinh trưởng của lông hút và phóng thích tế bào trần

- Ahuja et al 1983: Tế bào trần cô lập từ rễ cây con, thân lá mầm, và lá mầm

của Lotus corniculatus (sen) sẵn sàng phân chia trong môi trường nuôi cấy để tạo

ra mô sẹo và từ đó có thể sinh ra tế bào trần

- Abdullah et al 1986: phát hiện sự phát sinh phôi dưỡng trong các tế bào trần cô lập từ dịch nuôi cấy để tái tạo cây nguyên vẹn

- Chand et al (1988): quan sát thấy sự sự bóc trần tế bào cây dược liệu thân

gỗ Solanum dulcamara ở điện áp 250 đến 1250 vol/cm2 trong ba xung điện kế tiếp nhau mỗi xung kéo dài 10 – 50 ms đã kích thích sự tăng trưởng của mô dẫn suất từ

tế bào trần và cho thấy có gia tăng khả năng biệt hóa (Chand et al 1988)

- Sẽ rất quan trọng để mở rộng các nghiên cứu này trên hệ thống tế bào trần

Sẽ có ích khi tế bào trần Physcomitrella tái tạo chỉ sản sinh một khối u khi đáp

ứng với ánh sáng đơn cực, và tế bào phân cực này phân chia sau 24 giờ từ tế bào trần cô lập, từ hai tế bào con có hai mặt phát triển khác nhau (Jenkin và Cove 1983) Biến đổi con đường phát triển có thể cung cấp đầu mối giải mã về sự phát triển tế bào thực vật, tế bào của nó và điều khiển phân tử

- Al-Mallah et al 1989 và 1990: đã quan sát cấu trúc nốt sần tạo ra ở rễ lúa,

rễ cây con của cây cải cho dầu khi xử lý rễ với hỗn hợp enzyme cellulase và

pectinase và cho nhiễm Rhizobium hay Bradyrhizobium

- Cooking và Davey 1991: Các nghiên cứu này bao gồm sự phân hủy một phần vách tế bào làm lộ ra một phần màng sinh chất của tế bào biểu mô có ý nghĩa

quan trọng cho việc nghiên cứu sự cộng sinh của Rhizobium đối với các cây trồng

không phải họ đậu.[4]

3 Kỹ thuật thu nhận tế bào trần:

Nguyên tắc xử lý vách tế bào: Sử dụng enzyme để phân huỷ vách tế bào

Các phương pháp tách tế bào trần:

Trước khi thành tế bào bị phá bỏ, các tế bào cần được ngâm trong dung dịch làm ổn định áp suất thẩm thấu và được điều chỉnh cẩn thận liên quan đến khả năng thẩm thấu tế bào Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12-14% (W/v) để duy trì tính ổn định màng sinh chất Có ba phương pháp tách:

 Phương pháp tách bằng cơ học:

Cắt nhỏ nhu mô thịt lá rồi nghiền nhỏ cho vào dung dịch co nguyên sinh nên cả

tế bào chất bị co nhỏ lại ngay lập tức cho vào dung dịch phản nguyên sinh, làm giãn nở 1 cách đột ngột đẩy phần nguyên sinh chất qua thành tế bào Ta thu được

tế bào trần

- Ưu điểm: Dụng cụ đơn giản

- Nhược điểm: Khá phức tạp, hiệu quả thấp

 Phương pháp tách bằng enzyme:

Dùng enzym pectinase, hemicelolase, cellulase Để phá vỡ thành tế bào có thể dùng riêng lẻ hoặc kết hợp tuỳ vào từng loại tế bào Enzym sử dụng phải tinh khiết, nếu còn chứa ít nhiều protease hoặc peroxidase sẽ làm hỏng tế bào trần Hiệu quả của việc tạo tế bào trần còn phụ thuộc vào loại mô và cây được sử dụng

- Ưu điểm: Thu được lượng lớn các tế bào trần

- Các bước tiến hành như sau:

 Thu mẫu và vô trùng bề mặt lá

 Ngâm trong dung dịch có áp suất thẩm thấu cao -> hiện tượng co nguyên sinh chất, tế bào bị mất nước, nội dung tế bào nhỏ lại, màng nguyên sinh chất tách khỏi tế bào

 Loại bỏ biểu bì mặt dưới hoặc cắt mẫu lá thành các lát mỏng, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của các enzym

 Xử lý hỗn hợp enzym

 Tinh sạch và thu nhận các tế bào trần

 Chuyển tế bào trần vào các môi trường nuôi cấy thích hợp

 Phương pháp hỗn hợp:

Sử dụng phương pháp cơ học để thu được 1 lượng lớn các tế bào tự do sau đó dùng enzyme thường được sử dụng để tách thu được tế bào trần Thành tế bào cấu tạo gồm cellulose, hemicellulose, pectin và một lượng ít hơn là protein và lipit Vì vậy cần một lượng hỗn hợp cả 3 loại enzym cellulaza, pectinaza hemicellulaza ở những tỷ lệ khác nhau.[1]

 Theo nghiên cứu mới của TS Nguyễn Thị Phương Thảo đã xác định được quy trình tách tế bảo trần cho 8 dòng khoai tây nhị bội trong đó:

Nồng độ dung dịch co nguyên sinh:

 Manitol: 0.5M

 CaCl2: 0.01%

 ES: 0.06M Nồng độ enzyme:

− .

; .

 Thời gian ủ enzyme (14-16h), tốc độ và thời gian ly tâm: từ 150-200 vòng/phút trong thời gian 20 phút ở ly tâm lần 1; và 250-300 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở ly tâm lần 2 và 3 [5]

Thu nhận tế bào trần từ lá cây:

Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, do nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất (relatively uniform cells)

Phương pháp cơ bản để tách tế bào trần từ lá cây

1 Khử trùng mẫu lá

2 Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất

3 Tách lớp mặt dưới lá

4 Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzym

5 Tinh sạch tế bào trần

6 Nuôi cấy tế bào trần trong môi trường thích hợp

Hình 1 Các bước phân lập tế bào trần từ lá cây

Thu nhận tế bào trần từ mô sẹo:

Các mô sẹo non nuôi cấy in vitro cũng là nguyên liệu lý tưởng để thu được một

lượng lớn tế bào trần Nuôi cấy các mô sẹo già hơn thường cho các tế bào có kích thước lớn hơn và vách tế bào dày, điều này sẽ gây khó khăn cho sự thủy phân bằng enzyme Vì thế, người ta thường sử dụng các mô sẹo non sau hai tuần cấy chuyển để phân lập tế bào trần

Nồng độ enzyme đặc biệt là cellulose có thể thấp hơn so với lá

Hình 2 Tạo mô sẹo, Tái sinh cây và sự phát triển của cây con từ tế bào

trần

Thu nhận tế bào trần từ huyền phù tế bào:

Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào (cell suspension cultures) cũng cung cấp nguồn nguyên liệu rất tốt cho phân lập tế bào trần Dịch huyền phù tế bào có mật

độ cao được ly tâm, sau đó loại bỏ thể nổi (supernatants) Các tế bào được ủ trong hỗn hợp enzyme (cellulase + pectinase) và lắc từ 6 giờ tới qua đêm tùy thuộc vào nồng độ của các enzyme Sử dụng nồng độ thấp của các enzyme mục đích ngăn cản sự kết dính trong dịch huyền phù tế bào để thu được hiệu suất phân lập tế bào trần cao hơn Các protoplast có nguồn gốc từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có tiềm năng tái sinh cây hơn hẳn ở các loài mà trước đó đã không thành công khi thử tái sinh từ các protoplast có nguồn gốc tế bào thịt lá Những thành công gần đây

khi tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh từ protoplast của các loài ngũ cốc (kê, lúa

miến, lúa mạch giống Golden Promise) đã chứng minh nuôi cấy dịch huyền phù tế bào là nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp các tế bào trần toàn vẹn.[6]

4 Xác định mật độ tế bào trần và khả năng sống sót:

Các tế bào trần đều có dạng hình tròn khi quan sát dưới kính hiển vi Để xác định chất lượng của tế bào trần cần trải qua ba bước:

- Bước 1: Xác định xem còn thành tế bào hay không?

Dùng calcofour để xác định Calcofour bám vào các phân tử cellulose và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang mầu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím Nếu các tế