Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ (Luận văn thạc sĩ)

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Thơm

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CÓ HOẠT TÍNH

CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, 2020

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Thơm

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG Trichoderma CÓ HOẠT TÍNH

CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: PGS TS Đỗ Thị Huyền Hướng dẫn 2: ThS Trần Băng Diệp

Hà Nội, 2020

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần

đã đƣợc công bố tại hội nghị khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Thị Thơm

Lời cảm ơn

Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc

nhất tới hai người thầy: PGS TS Đỗ Thị Huyền, Trưởng phòng Kỹ thuật di

truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam đã cho tôi những kiến thức quí báu, chia sẻ kinh nghiệm và giúp đỡ tôi

trong quá trình hoàn thiện luận văn; ThS Trần Băng Diệp, Trưởng phòng

Công nghệ Bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện năng lượng Nguyên tử

Việt Nam - người thầy luôn bên cạnh tôi, truyền cho tôi cảm hứng nghiên cứu

khoa học, cho tôi những ý tưởng những định hướng đúng đắn, chỉ bảo tôi các

kỹ năng cần thiết và luôn tận tình, gần gũi, tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt

quá trình tôi thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các anh chị trong Phòng Công nghệ

Bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện năng lượng Nguyên tử Việt Nam đã

giúp đỡ nhiệt tình và đóng góp những ý kiến quý báu cũng như tận tình chỉ dạy,

tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến

Ban lãnh đạo Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội, Viện năng lượng Nguyên tử Việt Nam

đã tạo điều kiện cho tôi có thời gian để học tập trong thời gian công tác ở Viện

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa

học và Công nghệ cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi được

học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài KHCN cấp bộ, mã số

ĐTCB 01/18/TTCX: “Ứng dụng bức xạ gamma gây đột biến Trichoderma để

tạo chế phẩm phân giải nhanh rơm rạ trên đồng ruộng” do ThS Trần Băng

Diệp làm chủ nhiệm

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân

trong gia đình và những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên và

khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tác giả

Nguyễn Thị Thơm

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Chữ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng việt

CBD Cellulose binding domain Vùng liên kết cellulose

CMC Carboxyl methyl cellulose Cơ chất CMC

DNS Axit 3,5- dinitrosalicylic Thuốc thử DNS

FPase Filter paper activity Hoạt độ thủy phân giấy lọc

LET Linear Energy Transfer Hệ số truyền năng lƣợng

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 Giá trị của LET trong MT nước (nguồn: ICRU 1995) 17

Bảng 2.1 Các chủng Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp cellulase 21 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc các chủng Trichoderma sau 5 ngày nuôi cấy

trên MT PDA 28

Bảng 3.2 Khả năng sinh cellulase của các chủng Trichoderma 32 Bảng 3.3 Giá trị HC của chủng T koningiopsis VTCC 31435 sau nuôi cấy

28oC trong 24 giờ và ủ ở 37oC trong 5 ngày 34

Bảng 3.4 Khả năng thủy phân cellulose ở các khuẩn lạc T koningiopsis xử lý

chiếu xạ liều khác nhau 40

Bảng 3.5 Giá trị HC của 05 khuẩn lạc T koningiopsis có khả năng sinh

cellulase cao tạo được bằng chiếu xạ 43Bảng 3.6 Hoạt độ CMCase của 2 chủng sau chiếu xạ VTCC I-1 và VTCC I-3 sau 4 lần cấy truyền 50

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1 Cấu trúc không gian các loại cellulase 5

Hình 1.2 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose và phức hệ cellulosome 6

Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc Trichoderma trên môi trường PDA 11

Hình 1.4 Bào tử của Trichoderma 13

Hình 1.5 Tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa tới ADN 16

Hình 3.1 Vòng phân giải CMC của một số chủng Trichoderma sau nuôi cấy 28oC trong 24 giờ và ủ ở 37o C trong 3 ngày 34

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc của chủng T koningiopsis VTCC 31435 trên MT PDA sau 5 ngày nuôi cấy 35

Hình 3.3 Hình thái cơ quan sinh sản của chủng T koningiopsis VTCC 31435 36

Hình 3.4 Mối tương quan giữa số lượng bào tử T koningiopsis VTCC 31435 sống sót trong dịch bào tử và liều xạ 37

Hình 3.5 Mối tương quan giữa số lượng lượng bào tử T koningiopsis VTCC 31435 sống sót và liều xạ 38

Hình 3.6 Sàng lọc các khuẩn lạc sinh cellulase cao từ dung dịch bào tử T koningiopsis VTCC 31435 chiếu xạ liều 700 và 1500 Gy 42

Hình 3.7 Vòng phân giải CMC của một số khuẩn lạc T koningiopsis sau nuôi cấy 28o C trong 24 giờ và ủ ở 37oC trong 5 ngày 43

Hình 3.8 Hoạt độ CMCase và FPase của 05 khuẩn lạc T koningiopsis có khả năng sinh cellulase cao tạo được bằng chiếu xạ 44

Hình 3.9 Chủng thuần T koningiopsis và 02 thể đột biến nuôi cấy trên MT PDA ở 28o C 48

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

1.1 CELLULASE 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Phân loại 4

1.1.3 Cơ chế tác động của cellulase 5

1.1.4 Nguồn thu nhận cellulase 6

1.1.4.1 Vi khuẩn 7

1.1.4.2 Xạ khuẩn 7

1.1.4.3 Nấm 8

1.1.5 Các ứng dụng của nhóm cellulase 8

1.1.5.1 Ứng dụng trong công nghiệp 8

1.1.5.2 Ứng dụng trong xử lí môi trường 9

1.1.5.3 Ứng dụng trong sản xuất phân bón 10

1.1.5.4 Ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học 10

1.1.5.5 Ứng dụng trong kĩ thuật di truyền 10

1.2 SƠ LƯỢC VỀ NẤM Trichoderma VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE CỦA Trichoderma 10

1.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo Trichoderma 10

1.2.2 Hình thức sinh sản của Trichoderma 12

1.2.3 Khả năng thủy phân cellulose của Trichoderma 13

1.3 BỨC XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VSV - TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA Trichoderma 14

1.3.1 Đột biến ngẫu nhiên tăng hoạt độ cellulase ở chi nấm Trichoderma 14

1.3.1 Bức xạ gamma 15

1.3.2 Ứng dụng bức xạ ion hóa trong gây tạo đột biến ở VSV 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT TƯ, THIẾT BỊ 21

2.1.1 Nguyên vật liệu 21

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Thiết bị 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Bảo quản và giữ giống 23

2.2.2 Xử lý chiếu xạ 23

2.2.2.1 Thu dung dịch bào tử nấm 23

2.2.2.2 Chiếu xạ dung dịch bào tử 23

2.2.2.3 Chiếu xạ thạch đĩa 24

2.2.3 Xác định số lượng tế bào 24

2.2.4 Định tính và định lượng cellulase 24

2.2.4.1 Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch 24

2.2.4.2 Phương pháp DNS (axit 3,5 dinitrosalicylic) 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1.TUYỂN CHỌN CHỦNG Trichoderma CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN 28

3.1.1 Tốc độ phát triền và hình thái khuẩn lạc các chủng Trichoderma 28

3.1.2 Tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt tính cellulase cao và ổn định 31 3.1.2.1 Khả năng sinh cellulase của các chủng Trichoderma 31

3.1.2.2 Một số đặc điểm của chủng T koningiopsis VTCC 31435 34

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ CHIẾU XẠ TỚI CHỦNG NẤM T koningiopsis VTCC 31435 36

3.2.1 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sống sót của chủng nấm T koningiopsis VTCC 31435 36

3.2.2 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ tới khả năng sinh cellulase của chủng nấm T koningiopsis VTCC 31435 39

3.3 CÁC CHỦNG Trichoderma ĐỘT BIẾN PHÓNG XẠ CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO 42

3.3.1 Sàng lọc các khuẩn lạc Trichoderma kháng xạ có khả năng sinh cellulase cao 42

3.3.2 Hoạt độ cellulase của các khuẩn lạc tiềm năng 44

3.3.2.1 Hoạt độ CMCase 44

3.3.2.2 Hoạt độ FPase 46

3.3.2.3 Hình thái chủng sau chiếu xạ có khả năng sinh cellulase cao 47

3.3.2.3 Tính ổn định của chủng sau chiếu xạ có khả năng sinh cellulase cao 49

KẾT LUẬN 51

KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC PHỤ LỤC 59

PHỤ LỤC 60

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nông nghiệp có sản lượng lúa gạo đứng hàng đầu thế giới với hàng triệu tấn rơm rạ để lại sau thu hoạch mỗi năm Đốt rơm rạ

đã trở thành thói quen từ lâu của nông dân nhiều nước Đông Nam Á trong

đó có Việt Nam Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng đốt rơm rạ ngay trên đồng ruộng sẽ làm mất chất dinh dưỡng của đất Đốt đồng nhiều lần và lâu dài sẽ làm cho đất biến chất và trở nên chai cứng, dẫn đến phát sinh

nhiều bệnh dịch hại lúa [1] Ngoài ra, khói đốt rơm rạ gây nguy hại tới sức

khỏe do ô nhiễm bụi mịn - một loại bụi độc hại khi chui sâu vào phổi gây các bệnh về hô hấp, thậm chí ung thư [2] Không những thế, việc đốt rơm rạ còn khiến Việt Nam đang phải đối mặt với hiện tượng sương mù quang hóa

- một loại ô nhiễm không khí đặc biệt do sự tương tác giữa bức xạ tia cực tím của mặt trời với khí thải từ động cơ xe máy, khí thải công nghiệp, khói

từ cháy rừng, đốt nương rẫy, rơm rạ theo mùa vụ… [2] Để giải quyết vấn đề này, đồng thời giảm được lượng phân bón sử dụng trong nông nghiệp thì thủy phân rơm rạ ngay trên đồng ruộng theo cách tự nhiên là một lựa chọn Việc bổ sung thêm các loài vi sinh vật (VSV) có khả năng thủy phân cellulose mạnh như một số loài nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn… vào nguyên liệu chứa cellulose hay rơm rạ trên đồng sau thu hoạch giúp việc thủy phân được nhanh chóng, triệt để, mang lại hiệu quả lâu dài và không gây ô nhiễm

cho môi trường mà các thuốc hóa học không thể sánh kịp

Trichoderma spp là loại nấm sợi hiện diện gần như trong tất cả các

loại đất và trong nhiều môi trường sống khác nhau Nhờ việc nuôi cấy dễ dàng, không tốn kém cùng với khả năng tiết enzyme cellulase hoạt độ cao

gấp vài trăm lần so với vi khuẩn [3], Trichoderma đã thu hút được sự quan tâm đặc biệt Cellulase ngoại bào từ một số chủng Trichoderma thường tồn

tại dưới dạng phức hệ enzyme (cellulosome) nhờ vậy mà chúng thủy phân hiệu quả ở cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose [4]

Các tia X, , tia notron có bước sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và

khả năng xuyên sâu cao Các tia phóng xạ này có thể gây đột biến bằng cách

làm đứt gãy ADN, thay đổi cấu trúc của ADN hoặc hình thành các hợp chất

có hoạt tính không ổn định làm biến đổi ADN Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhờ đó hoạt tính của VSV được cải thiện [5] Ngoài ra, gây đột biến bằng bức xạ có nhiều ưu điểm như phổ đột biến rộng, tần suất đột biến cao… do đó sẽ làm tăng khả năng chọn được đột biến mong muốn và rút ngắn thời gian sàng lọc [6]

Để cải thiện khả năng sinh cellulase của Trichoderma nhiều nghiên

cứu gây đột biến chủng nấm này bởi bức xạ tia gamma đã được thực hiện

Trong nghiên cứu của Shahbazi và cộng sự, hoạt tính cellulase của T reesei

đã được cải thiện tăng 1,5-1,99 lần nhờ tác nhân đột biến tia gamma [4] Khả

năng tiết cellulase của T reesei cũng tăng lên 1,8 lần bởi xử lý chiếu xạ

gamma liều 2 kGy trong khảo sát của Tamada và cộng sự [7] Trên cơ chất là

bã mía, chủng T viride được xử lý chiếu xạ liều 20 krad 2 lần liên tiếp có

hoạt tính sinh cellulase tăng 253,5% thay vì chỉ tăng 134,5% khi xử lý một lần ở cùng liều chiếu [8]

Với mục đích sử dụng bức xạ gamma tạo chủng Trichoderma đột biến

có khả năng sinh cellulase cao dùng làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm phân giải nhanh rơm rạ ngay trên đồng ruộng, chúng tôi đã tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng Trichoderma có hoạt tính sinh

cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ” với các nội dung chính sau:

1 Tuyển chọn một số chủng Trichoderma có hoạt tính sinh cellulase

cao (từ bộ chủng giống của các phòng thí nghiệm và ngân hàng giống trong nước);

2 Đánh giá mối tương quan giữa liều chiếu xạ tới tỷ lệ sống sót đối với

chủng nấm Trichoderma tiềm năng trong dung dịch bào tử và thạch đĩa;

3 Khảo sát ảnh hưởng của liều chiếu xạ tới tỷ lệ đột biến sinh cellulase

cao ở chủng nấm Trichoderma;

4 Sàng lọc các chủng Trichoderma sau chiếu xạ có hoạt tính sinh

cellulase cao;

5 Đánh giá tính ổn định của chủng sau chiếu xạ có khả năng sinh

cellulase cao Trichoderma

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 CELLULASE

1.1.1 Giới thiệu chung

Cellulase là một phức hệ enzyme có khối lượng phân tử khoảng 30 đến

110 kDa [9], có khả năng phân cắt cellulose và một số loại polysaccharide tương tự thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glucoside thành các oligosaccharide và đường đơn [3, 10] Cellulase có bản chất là protein, được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin được nối với nhau bằng liên kết peptide -CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúc còn có các thành phần phụ khác tùy thuộc vào vị trí phân bố và chức năng của mỗi loại cellulase Cellulase từ các nguồn khác nhau có khối lượng phân tử, thành phần cấu tạo, cấu trúc và trật tự sắp xếp các axit amin khác nhau dẫn đến sự khác nhau về tính đặc hiệu cơ chất, nhiệt độ và pH tối ưu

Nhiệt độ và pH ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính xúc tác của enzyme, mỗi enzyme có nhiệt độ và pH thích hợp riêng Nhiệt độ và pH tối ưu cho

hoạt động của cellulase ở chủng Trichoderma IS-5 trong nghiên cứu của

Nascimento và cộng sự là 60o

C và 3,0 [11], các giá trị này trên chủng T

hướng nghiên cứu, Vân và cộng sự khi đánh giá hoạt tính CMCase trên chủng

enzyme bền ở nhiệt độ thấp 10-30oC và chỉ hoạt động ở vùng pH axit 3,5-4,5

[13] pH tối ưu của một số chủng Trichoderma trong nghiên cứu của Singh và

cộng sự nằm trong khoảng 5,5-7,5, nhiệt độ tối ưu 25-30oC Môi trường pH axit được chứng minh là tối ưu hơn cho sinh trưởng và phát triển của hầu hết

các chủng Trichoderma [14] Ngoài ra, hoạt độ CMCase được đánh giá chính

xác trong môi trường pH axit, điều này đã được chứng minh bởi Singh và

cộng sự trên chủng một số chủng Trichoderma điển hình [14]

Trong giới hạn nhiệt độ chưa làm biến tính enzyme, hoạt tính của chúng tăng khi nhiệt độ tăng Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá giới hạn thì hoạt tính của enzyme lại giảm Nguyên nhân có thể do khi nhiệt độ tăng cao, một số liên kết yếu trong phân tử protein enzyme bị đứt gãy làm thay đổi cấu

trúc của phân tử này, đặc biệt là trung tâm hoạt động của enzyme, từ đó ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác của chúng [12]

Các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc định hình cấu trúc

và không gian của phân tử enzyme hoặc nó có thể là nhân tố cần thiết trong trung tâm hoạt động của enzyme Các ion kim loại Cu2+,

1.1.2 Phân loại

Dựa vào tính đặc hiệu cơ chất và cơ chế phân cắt, cellulase được chia thành 3 loại: β-1,4- D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), β-1,4- D-glucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) và β-D-glucoside glucohydrolase (EC

3.2.1.21) [10]

β-1,4-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) có nhiều tên gọi khác như exoglucanase, exo- β-glucanase cellobiohydrolase, exo- cellobiohydrolase, exo-β-1,4- glucan cellobiohydrolase, 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase, cellobiohydrolase, CBH 1, C1 cellulase, avicelase Chúng thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose

β-1,4-D-Glucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) còn có tên gọi khác như endoglucanase, endo-β-1,4-D-glucanase, endo-1,4-endoglucan hydrolase, carboxymethyl cellulase, celludextrinase, cellulase A, cellulosin AP, alka cellulase, cellulase A3, 9,5 cellulase, avicelase, pancellase SS Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của chuỗi cellulose, chenin và các β-D-glucan của ngũ cốc

D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có tên gọi khác như là glucosidase, β-D-glucosidase, β-1,6- glucosidase, β- glucoside glucohydrolase, p-nitrophenyl, aryl-β-glucosidase, gentiobiase, cellobiase, emulsion, elaterase, arbutinase, amygdanase, primeeverosidase, amygdalase,

β-marase, sacinase Enzyme này thủy phân gốc β-D-glucoside không khử ở đầu tận cùng để giải phóng ra β-D-glucose

Hình 1.1 Cấu trúc không gian các loại cellulase [10]

Các loại enzyme này phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể thu nhận từ

nhiều nguồn các nhau như động vật, thực vật và vi sinh vật (VSV) [16] Tuy

nhiên enzyme từ động vật và thực vật thường không được sử dụng nhiều bởi quá trình thu nhận và bảo quản phức tạp Nguồn thu cellulase phong phú và

hiệu quả nhất từ VSV như Bacillus, Trichoderma, Aspergillus…

1.1.3 Cơ chế tác động của cellulase

Để quá trình thủy phân cellulose nhanh và triệt để phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulase (endoglucanases, exoglucanases và β-glucosidases) Nếu thiếu một trong ba enzyme trên, quá trình thủy phân không thể đến cùng Từ những nghiên cứu riêng rẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme này, nhiều nhà khoa học đưa ra kết luận chung là các loại enzyme sẽ thay phiên nhau thủy phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối là glucose Có nhiều cách giải thích khác

nhau về cơ chế tác động của cellulase, trong đó cách giải thích của Singh và cộng sự được nhiều người công nhận hơn cả Theo các tác giả, cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulase như sau: đầu tiên endoglucanases tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4-glucoside

và tạo ra các đầu tự do Tiếp đó, exoglucanases tấn công cắt từng đoạn cellobiose từ đầu mạch được tạo thành Kết quả tác động của endoglucanases

và exoglucanases tạo ra các celloligosaccharide mạch ngắn, cellobiose, glucose β-glucosidases thủy phân tiếp và tạo thành glucose [14]

Hình 1.2 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose và phức hệ cellulosome (A Cơ

chế tác động riêng rẽ từng loại enzyme; B Cơ chế tác động hiệp đồng của

cellulosome [16]

Cellulase từ một số chủng Trichoderma thường tồn tại dưới dạng phức

hệ đa enzyme (cellulosome) Các cellulosome phân cắt đồng thời và triệt để

cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose tạo sản phẩm cuối cùng

trong khoảng thời gian ngắn hơn so với tác động riêng rẽ từng loại enzyme

1.1.4 Nguồn thu nhận cellulase

Cellulase là loại enzyme phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng,

từ động vật, thực vật, tới VSV Ở động vật, cellulase thường có trong dịch tiết dạ dày bò, động vật thân mềm [19] Ở thực vật, cellulase có thể tìm thấy trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen [9] Nhờ những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng và phát triển của VSV mà nguồn enzyme của chúng được quan tâm đặc biệt Mặt khác, đối

với VSV, việc cơ giới và tự động hóa quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy có thể kiểm soát mà không phụ thuộc vào các yếu tố bên ngoài [20] nên hầu hết các cellulase thương mại đều có nguồn gốc VSV

Không ít chủng VSV sinh cellulase đã được phân lập và khả năng phân giải cellulose của chúng cũng được nghiên cứu đánh giá Các VSV phân giải cellulose chủ yếu được phân lập từ hệ tiêu hóa của động vật ăn

cỏ như bò, cừu, dê hay từ côn trùng như bọ cánh cứng, mối Ngoài ra chúng còn được tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nước thải… [21]

1.1.4.1 Vi khuẩn

Vi khuẩn phân giải cellulose bao gồm nhiều loài khác nhau, điển hình

như Clostridium, Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens,

Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter

Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, and Pseudomonas nitroreducens Các

loài này phần lớn thuộc nhóm VSV kị khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn [22]

Các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí sinh cellulase như Brevibacllus,

Paenibacillus, Bacillus và Geobacillus thường được phân lập từ lòng đất

Đối với các dòng ưa ấm thì pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase (CMCase) của chúng hoạt động là 5,5 và 55oC, với các dòng ưa nhiệt thì các giá trị này là 5,0 và 75o

C [23]

1.1.4.2 Xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) dạng sợi như nấm

Chúng là VSV hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên ADN của xạ khuẩn rất giàu G+C chiếm 57-75 %, chúng chiếm ưu thế trong đất phèn

khô [24] Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là VSV

sinh cellulase được đặc biệt quan tâm Một số loài đáng chú ý thuộc giống

này như Streptomyces reticu, Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces

vidans [25] Xạ khuẩn Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích

đại dương, hay Streptosporangium có trong quặng apatit cũng là những

loài thủy phân cellulose mạnh [26]

1.1.4.3 Nấm

Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực thủy phân cellulose [27] Sản phẩm cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạp

như enzyme thu nhận từ vi khuẩn Acremonium spp., Chaetomium spp.,

Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Penicilum pinophilum, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii,

Aspergillus terreus và Rhizopus oryzae đều có vai trò quan trọng trong

quy trình thủy phân cellulose ở nhiều môi trường khác nhau [27]

Cellulase được sản xuất từ các chủng nấm thường có sản lượng cao hơn

so với vi khuẩn [13] Hầu hết các sản phẩm cellulase thương mại được sản

xuất bởi các loài nấm thuộc chi Trichoderma và Aspergillus Điều này cho

thấy nấm mốc là nguồn VSV tiết enzyme mạnh và có thể nghiên cứu ứng dụng để sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp [8, 21] Việc phân lập, xác

định các tính chất lý - hóa của các loại cellulase từ nấm Trichoderma đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu chẳng hạn CMCase từ T reesei [4, 7, 17],

từ T viride [3, 8] hay từ T asperellum [28]

Ở Việt Nam, các enzyme thủy phân cellulose hoạt tính cao thu được từ

nhiều nguồn khác nhau như các loại nấm Trichoderma, A awamori,

Penicilum hay từ các loại xạ khuẩn… [1, 13]

1.1.5 Các ứng dụng của nhóm cellulase

1.1.5.1 Ứng dụng trong công nghiệp

Trong công nghiệp sản xuất giấy, các loại enzyme được bổ sung trong khâu nghiền bột và tẩy trắng Enzyme endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Ngoài ra, người ta còn sử dụng endoglucanase và hemicellulase để tẩy trắng mực in trên giấy thay vì sử dụng

axit HCl Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng phương pháp này giữ cho sợi giấy không bị ăn mòn nhiều, không ảnh hưởng đến môi trường và gây hại đối với sức khỏe con người khi thải ra môi trường trong quá trình sản xuất [28]

Trong công nghiệp dệt, cellulase được sử dụng để giữ màu vải sáng, bền và không bị sờn cũ Đối với vải jean, cellulase được sử dụng thay cho việc sử dụng đá bọt chà lên vải tạo các vệt “stone washed” Độ đậm nhạt của các vệt “stone washed” được thay đổi bằng cách tăng hay giảm lượng cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt [29]

Cellulase được bổ sung vào trong bột giặt và chất tẩy rửa để làm mềm vải cotton; đồng thời, tẩy sạch một số các vết bẩn khó giặt như vết mực, vết bẩn có nguồn gốc protein, các vết loang dầu mỡ,… [30]

Phế phụ phẩm nông và lâm nghiệp có bản chất lignocellulose là nguồn nguyên liệu dồi dào cho sản xuất ethanol sinh học bằng cách phối trộn chúng với các enzyme như: cellulase, hemicellulase,… có được từ quá trình nuôi cấy

các chủng nấm mốc A niger, T reesei, A tereus… [31]

Cellulase được ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm như công nghệ sản xuất bia, nước hoa quả, agar agar, cà phê…Nghiên

cứu Thuần và cộng sự, sử dụng lên men vỏ cà phê bằng T.viride và A niger

cho thấy hệ enzyme pectinase và cellulase từ hai chủng nấm mốc này có khả năng thủy phân cao pectin và cellulose trong vỏ cà phê Nghiên cứu này mở

ra hướng ứng dụng lên men phế phụ phẩm bằng các chủng nấm giúp tận dụng nguồn phụ phế phẩm trong nông nghiệp, giảm khả năng ô nhiễm môi trường

do các chất thải gây ra như vỏ cà phê, hèm bia sau khi lên men bia, mật rỉ đường, các loại trấu nhà máy xay xát,… [32]

1.1.5.2 Ứng dụng trong xử lí môi trường

Các chất thải hữu cơ chiếm khối lượng lớn trong tổng số chất thải hiện nay ở các đô thị và khu công nghiệp; trong đó cellulose chiếm khoảng 50% các chất thải hữu cơ có nguồn gốc thực vật Các chất thải này rất khó thủy phân trong điều kiện tự nhiên Tuy nhiên, khi bổ sung VSV giàu cellulase vào phân giải rác sẽ rút ngắn thời gian thủy phân chỉ còn khoảng 1 tháng so với khoảng 8 tháng trong điều kiện tự nhiên [33]

VSV được sử dụng khá phổ biến hiện nay trong xử lí môi trường ví dụ như xử lí nước thải từ các nhà máy giấy, xí nghiệp xay xát,… Các chế phẩm vi sinh có chứa các VSV sinh cellulase đã được nghiên cứu, phát triển và sản xuất đại trà như chế phẩm sinh học cellulase (Công ty Cổ phần Xử lí Môi trường Việt Nam), chế phẩm Emuniv (Công ty Cổ phần Vi sinh Ứng dụng)… [31]

1.1.5.3 Ứng dụng trong sản xuất phân bón

Việc sử dụng chế phẩm enzyme cellulase xử lý rơm rạ tạo thành phân bón hữu cơ đã được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi và chuyển giao công nghệ cho nhiều địa phương như; Hòa Bình, Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Thái

Bình, Nam Ðịnh, Bạc Liêu [31]

1.1.5.4 Ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học

Nhiên liệu sinh học là loại nhiên liệu tái tạo, được tạo ra từ sản phẩm của ngành nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm hay quá trình tái chế các sản phẩm dầu ăn và dầu thực vật Bioethanol và biodiesel là hai loại nhiên liệu sinh học được sử dụng rộng rãi nhất cho ngành giao thông vận tải; trong đó, biodiesel là một ester của axit béo và ankyl, được tạo ra từ dầu mỡ thực vật, động vật hoặc mỡ tái chế, còn bioethanol được sản xuất nhờ cellulase thủy phân sinh khối cellulose

1.1.5.5 Ứng dụng trong kĩ thuật di truyền

Việc sử dụng các chế phẩm cellulase tinh khiết trong kĩ thuật di truyền

có xu hướng ngày càng tăng thay thế phương pháp cơ học và hóa học do enzyme này có thể phá vỡ thành tế bào thực vật mà không gây tổn thương tới các cơ quan bên trong tế bào, nhờ đó sự nguyên vẹn của các nhân tố di truyền được đảm bảo [34]

1.2 SƠ LƯỢC VỀ NẤM Trichoderma VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CELLULOSE CỦA Trichoderma

1.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo Trichoderma

Trichoderma spp thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp

Euascormycete, bộ Hypocreales, họ Hyporealease

Trichoderma spp là loại vi nấm xuất hiện nhiều trong các loại đất

nông nghiệp, đồng ruộng, đất rừng, gỗ đang phân rã, trong nguồn nước bị ô nhiễm, đầm lầy, đầm nước mặn, các phế thải giàu hữu cơ đặc biệt trong đất

nông nghiệp Trichoderma phân bố rất nhiều ở vùng rễ cây

Trichoderma có đặc điểm hệ sợi phát triển nhanh, phân nhánh trong suốt tạo hệ sợi điển hình có đường kính 5-10 m [35] Trichoderma cũng sinh sắc tố nhưng sắc tố của Trichoderma không biến đổi nhiều Những chủng liên quan đến nhóm T longibrachiatum có sắc tố điển hình nhất là màu vàng xanh

nhạt, màu vàng nhạt đục là sắc tố thường gặp chủ yếu ở nhiều chủng [36]

Trichoderma thuộc nhóm nấm đa bào, sợi nấm có vách ngăn và trên

vách ngăn có một hoặc nhiều lỗ thông để cho nhân và tế bào chất đi qua

Hình 1.3 Hình thái Trichoderma trên môi trường PDA (7 ngày), (T

atroviride; T longibrachiatum; T virens; T harzianum từ trái sang phải trừ

trên xuống dưới [37]

Khuẩn lạc Trichoderma spp có dạng vòng tròn đồng tâm, đường kính

> 5 cm sau 5 ngày nuôi cấy (T hamatum > 7 cm, T haziatum > 9 cm, T

koningii > 5 cm) Khuẩn lạc có dạng như len xốp, hệ sợi dày đặc Ban đầu hệ

sợi có màu trắng, khi bào tử hình thành (khoảng sau 5 ngày) hệ sợi chuyển màu xanh ánh vàng sang màu xanh lá cây Môi trường thích hợp cho sự phát

triển của Trichoderma là glucoza, agar, pepton, belgan rose B [38], nhiệt độ

thích hợp là 20- 30oC, pH từ 3-6,5 Ở những chủng nuôi cấy lâu ngày thì dịch trong thường tồn tại trong hệ sợi của chủng [38]

Hiện nay, có khoảng 86 loài Trichoderma spp đã được phân loại Các

chủng khác nhau thì khác nhau về số lượng và kích thước nhiễm sắc thể [36]

Trong tự nhiên, nấm Trichoderma spp là một loại vi nấm có lợi cho

cây trồng Chúng không những có khả năng phân giải các chất hữu cơ, cung cấp dinh dưỡng mà còn là tác nhân sinh học đối kháng, kháng lại nhiều loại

nấm gây bệnh cho cây tồn tại trong đất như các loài thuộc chi Rhizoctonia

solani, Fusarium, Sclecrotium rolfsii, Verticilum, Botrytis [39]

Việc nuôi cấy dễ dàng, không tốn kém cùng với những đặc tính quý như khả năng kích thích tăng trưởng cho cây trồng, khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh [39], khả năng tiết ra các loại enzyme thủy phân [4], các loài

Trichoderma spp đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học

Ở Việt Nam, chi nấm Trichoderma hiện xác định có ít nhất 33 loài

Những nghiên cứu về ứng dụng loài nấm này đặc biệt trong sản xuất nông nghiệp đang ngày càng phát triển Trong các hướng nghiên cứu khác nhau

về chi Trichoderma thì khả năng phân giải cellulose của chúng được quan

tâm đặc biệt

1.2.2 Hình thức sinh sản của Trichoderma

Phần lớn các chủng của Trichoderma spp không có giai đoạn sinh sản

hữu tính mà chỉ sinh sản bằng bào tử vô tính Các bào tử có cuống đính thành khóm vào nhánh sợi nấm Bào tử trong suốt hoặc xanh xám thành phẳng, nhẵn hoặc xù xì [38] Bào tử đính có kích thước trung bình từ 3 đến 5 m hình tròn hoặc hình bầu dục, vỏ trơn hoặc sần tập trung ở đầu đính của đỉnh thể bình (dạng bình phồng lên ở gốc) Thể bình có thể sắp xếp đều thành các vòng tròn hoặc kết đôi, so le hoặc bố trí không đều Dạng thể bình là đặc

trưng cho từng loài Loài T pachybasium có thể bình ngắn còn loài T

longibrachiatum có thể bình thuôn dài và bầu nậm tới gần hình trụ tròn [36]

Bào tử đính được phóng ra với số lượng lớn, xen kẽ các bào tử đính là các bào tử nghỉ có vách dày (bào tử áo) Chúng có dạng đơn bào Tuy nhiên,

có thể có hai hoặc nhiều bào tử vách dày kết hợp với nhau [40] Bào tử có

vách dày thường gặp ở loài T longibrachiatum và T viride

Hình 1.4 Bào tử của Trichoderma spp [40]

1.2.3 Khả năng thủy phân cellulose của Trichoderma

Cellulose "kháng" mạnh với các enzyme thủy phân chúng tuy nhiên một số loài VSV lại có khả năng thủy phân cellulose mạnh mẽ nhờ phức hệ enzyme cellulase hoạt tính cao mà chúng tạo ra trong quá trình sinh trưởng, gọi là celullosome Cellulosome là tổ hợp đa enzyme (gổm cả 3 loại endo, exo và β-glucanase), được phát hiện thấy ở nhiều chủng vi nấm như

Aspergillus (A niger, A fumigatus), Chaetomium (Ch thermophilum), Fusarium (F oxysporum, F solani), Humicola (H insolens, H grisea var thermoidea), Melanocarpus (M albomyces), Penicillium (P echinulatum, P purpurogenum, P pinophilum), Rhizopus (R oryzae), Scytalidium (S thermophillum), Talaromyces (T Emersonii, Thermoascus (T aurantiacus)

và Trichoderma spp

Trichoderma được xem là một trong các chi nấm mốc có khả năng sinh

hệ enzyme ngoại bào lớn nhất, đặc biệt là loài T reesei [41] Ngoài T reesei, một số loài khác thuộc chi nấm này như T harzianum, T koningii, T

longibrachiatum và T viride đều được chứng minh có khả năng sinh phức hệ

cellulosome Thành phần các enzyme thuộc phức hệ cellulosome khác nhau phụ thuộc từng loài có số lượng cũng như loại gen mã hóa tương ứng Chẳng

hạn, hệ thống cellulase ngoại bào của T reesei bao gồm 60-80%

cellobiohydrolases hoặc exoglucanases, 20-36% endoglucanases và 1% glucosidases, tất cả đều hoạt động đồng bộ trong việc chuyển đổi cellulose thành glucose [4].Tỉ lệ % các enzyme thành phần trong phức hệ cellulosome

β-ở các loài thuộc chi nấm Trichoderma cũng có sự khác nhau đáng kể Theo nghiên cứu Li và cộng sự, tỉ lệ enzyme β-glucosidases ở loài T viride cao hơn nhiều so với ở loài T reesei Khi đánh giá và định lượng các enzyme thành phần trong phức hệ cellulosome ở chủng T viride GSICC 62010 các

tác giả nhận thấy phức hệ cellulosome của chủng này gồm 14,15 % exoglucanases, 26,07% endoglucanases và 59,77% β-glucosidases [8] Nhờ

vậy, phức hệ cellulase ngoại bào của nấm Trichoderma thủy phân hiệu quả

cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của cellulose Trong khi đó, các enzyme đơn lẻ hoặc kể cả hỗn hợp của chúng không thực hiện đồng thời cả hai chức năng trên [4]

Ở Việt Nam, tập quán đốt bỏ rơm rạ và dùng phân hóa học để bổ sung những thứ lấy từ đất vừa bị đốt đi để chuẩn bị đất cho vụ mùa tiếp theo Trong khi đó, theo ước tính nếu đốt 1 tấn rơm thì sẽ thải ra 36,32 kg khí CO, 4,54 kg hydrocarbon, 3,18 kg bụi tro và 56,00 kg CO2 [34], đây là các chất gây ô nhiễm, ảnh hưởng xấu đến môi trường sống Để hạn chế sự bất lợi này, rơm rạ trước khi hoàn trả lại cho vụ mùa tiếp theo cần được trải qua quá trình thủy phân của những VSV thích hợp nhằm rút ngắn thời gian thủy

phân Nấm Trichoderma với phức hệ enzyme cellulase hoạt tính cao có khả

năng thủy phân cellulose nhanh [34], đồng thời hạn chế được sự phát triển của nấm bệnh khô vằn lưu tồn trong rơm rạ [42] do vậy ngoài việc sử dụng

trực tiếp chế phẩm Trichoderma để thủy phân nhanh cellulose ngay trên

đồng cũng có thể sử dụng chúng để tạo phân rơm hữu cơ giúp cung cấp dinh dưỡng cho cây, cải tạo độ phì của đất

1.3 BỨC XẠ ION HÓA TRONG GÂY TẠO ĐỘT BIẾN VSV - TĂNG

CƯỜNG KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA Trichoderma

1.3.1 Đột biến ngẫu nhiên tăng hoạt độ cellulase ở chi nấm Trichoderma

Mặc dù có khả năng tiết cellulase hoạt tính cao gấp vài trăm lần so với

vi khuẩn [3] song sản lượng cellulase tạo ra từ các chủng Trichoderma trong

tự nhiên không đủ đáp ứng nhu cầu hiện nay Vì vậy, tạo ra các thể đột biến

có khả năng sinh cellulase cao là yêu cầu cấp thiết đối với ngành công nghiệp sản xuất enzyme Có hai loại đột biến thực nghiệm là đột biến ngẫu nhiên và đột biến định hướng Đột biến ngẫu nhiên thường được tạo ra bằng các phương pháp vật lý và hóa học như tia UV, N – methyl – N – nitro – N – nitrosoguanidine, ethyl ethanesulphonate,…

Đột biến ngẫu nhiên cho phép sàng lọc được các thể đột biến ưu việt hơn so với chủng thuần về một thuộc tính nào đó Phương pháp này khá đơn giản, không yêu cầu trang thiết bị hiện đại, hạn chế thao tác kỹ thuật phức tạp tuy nhiên rất tốn thời gian, công sức và khó bền [6] Để khắc phục hạn chế này, nhiều nghiên cứu đã thành công khi sử dụng các tác nhân đột biến phổ rộng (ví dụ như bức xạ ion hóa) hoặc kết hợp nhiều tác nhân gây đột

biến làm tăng sản lượng và hoạt độ cellulase trên chi nấm Trichoderma Nghiên cứu của Gadgil và cộng sự tạo ra chủng đột biến T reesei QM9414 có

khả năng sinh cellulase cao hơn chủng gốc 1,5 đến 1,75 lần bằng xử lí UV kết

hợp hóa chất sodium nitrite (45 phút, 0,5mg/ml) [43] Chủng T reesei sau xử

lý UV và gamma trong nghiên cứu của Shabazi và cộng sự có khả năng sinh

cellulase cao hơn chủng ban đầu 30% [4] Trên một loài khác T viride thuộc chi Trichoderma, Li và cộng sự kết hợp hai tác nhân bức xạ electron và ion

beam 12C6+ đã tạo ra chủng đột biến có khả năng phân hủy mùn cưa tăng 40% so với chủng ban đầu; đồng thời, phát hiện sự sai khác trên các gen mã hóa enzyme cellulase [8] Kết quả này tương đồng nghiên cứu của Nascimento và cộng sự khi sử dụng UV và hóa chất NTG tạo ra chủng đột biến có khả năng sinh cellulase cao hơn 70-83% so với chủng ban đầu Giải trình tự genome cho thấy chủng sau xử lí sai khác 184 vị trí đơn nucleotide trên gen, 40 đột biến mất và thêm đoạn so với chủng ban đầu [11] So sánh hiệu quả giữa các tác nhân đột biến, Shabazi và cộng sự cho rằng gamma ưu việt hơn UV và là một trong những tác nhân đột biến đơn giản, hiệu quả cao

đặc biệt tăng khả năng sinh cellulase trên chi nấm Trichoderma [4]

1.3.2 Bức xạ gamma

Các tác nhân vật lý như: các tia X, tia , neutron có bước sóng ngắn nên

có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao Các loại bức xạ ion hóa này

có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định giúp cải thiện hoạt tính của

VSV [5] Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn gamma là tác nhân gây đột biến Gamma là một dạng bức xạ ion hóa mang năng lượng cao, truyền cho các electron của vật chất một năng lượng đủ lớn để bứt chúng ra khỏi nguyên tử, gây ra sự ion hóa trong vật chất mà nó đi qua [ 44]

Hình 1.5 Tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa tới ADN

Đối với hệ thống tế bào, cấu trúc chịu ảnh hưởng của bức xạ ion hóa gồm

tế bào, DNA, RNA, enzyme và protein [45] Ở cấp độ tế bào, bức xạ ion hóa

có thể tác dụng ở các mức độ khác nhau tùy vào liều lượng, bản chất bức xạ

và loại tế bào chịu tác dụng Trường hợp bị tổn thương nặng, tế bào sẽ bị chết:

có thể chết giữa phase (interphase death) - tế bào ngừng tất cả mọi hoạt động sống, có thể mất khả năng phân chia (reproductive death) hoặc có thể được truyền cho thế hệ tiếp theo nếu xảy ra ở tế bào sinh dục [46, 47] Các phân tử ADN có thể bị ion hóa trực tiếp tiếp hoặc gián Các electron sau khi bị bứt ra

sẽ tác động trực tiếp lên phân tử sợi đôi DNA gây ra hiệu ứng trực tiếp Đối với hiệu ứng gián tiếp, bức xạ ion hóa các phân tử nước trong vùng lân cận phân tử ADN, các phân tử nước sẽ bị phân ly hình thành các gốc tự do, trực tiếp tác động gây tổn thương phân tử ADN [43, 48] Tế bào chứa khoảng 70 -

80% nước và dưới 1% ADN nên cơ chế gián tiếp có ý nghĩa nhất định đối với

việc gây tổn thương phân tử ADN

Ảnh hưởng của bức xạ ion hóa lên tế bào được đánh giá dựa trên hệ số truyền năng lượng tuyến tính LET (LET- Linear Energy Transfer) được tính bằng số năng lượng trung bình mà hạt truyền cho vật chất (qua quá trình ion hóa

và kích thích) trên một đơn vị chiều dài quãng đường đi của hạt Đơn vị của LET

là keV/µm [44, 49] Mỗi loại bức xạ có hệ số LET khác nhau Bảng 1.1

Bảng 1.1 Giá trị của LET trong MT nước (nguồn: ICRU 1995)

LET (Kev/µm) Loại bức xạ ion hóa

Theo Bauchinger và cộng sự, đối với bức xạ LET thấp như tia gamma thì tác dụng trực tiếp gây nên khoảng 1/3 tổng số các thương tổn, phần còn lại

là do hiệu ứng gián tiếp [48] Tuy nhiên vì cơ chế gián tiếp diễn ra phức tạp hơn nên nếu xét trong cùng một khoảng thời gian nhất định, những tổ chức sinh học có hàm lượng nước cao sẽ có mức độ tổn thương do bức xạ ion hóa thấp hơn so với những tổ chức có hàm lượng nước thấp [45, 50]

1.3.2 Ứng dụng bức xạ ion hóa trong gây tạo đột biến ở VSV

Trong tự nhiên, tỉ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của VSV và nằm trong khoảng từ 10-10

đến 10-6 [51] Tỉ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực

tế có thể lên đến 10-5

đến 10-1 [52] Các tác nhân vật lý như: các tia X, tia ,

neutron có bước sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao Các tia phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy ADN, thay đổi cấu trúc của ADN hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi ADN Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhằm cải thiện hoạt tính của VSV [5] Ngoài ra, gây đột biến bằng bức xạ có nhiều ưu điểm như phổ đột biến rộng, tần suất đột biến cao… do đó

sẽ làm tăng khả năng chọn được đột biến mong muốn và rút ngắn thời gian sàng lọc [6]

Các VSV có khả năng kháng với các đột biến cao hơn so với động vật

và thực vật Điều này có thể được giải thích bởi kích thước cùng nhân TB nhỏ

bé của VSV khó bị tác động bởi quá trình chiếu xạ Các đột biến ở VSV thường phức tạp hơn các sinh vật khác Hơn thế, VSV có khả năng tự bảo vệ

và sửa chữa phân tử ADN khi bị chiếu xạ Phân tử ADN của VSV được bảo

vệ nhờ quá trình hình thành bào tử và khả năng sử dụng các chất „bắt” gốc tự

do như catalase, superoxide dismutase, và carotenoid Một số loài hình thành

bào tử như Bacillus sp và Clostridium sp là các vi khuẩn kháng xạ Tuy

nhiên, khi có đầy đủ chất dinh dưỡng, bào tử nảy mầm sẽ tạo ra các tế bào sinh dưỡng nhạy cảm hơn nhiều với bức xạ [53] Prokaryote (VSV nhân sơ)

và sinh vật nhân chuẩn (nấm mốc và nấm men) đều có thể sửa chữa nhiều loại đứt gẫy trên phân tử ADN Ngoài ra, điều kiện MT trong quá trình chiếu xạ bao gồm nhiệt độ, hàm lượng nước, MT nuôi cấy và oxy đều có thể ảnh hưởng đến khả năng kháng xạ của VSV Tăng nhiệt độ (trên 45°C) cũng làm tăng hiệu quả của xử lý chiếu xạ tới các TB sinh dưỡng Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ MT xung quanh, các VSV sinh dưỡng kháng bức xạ mạnh hơn Sự hiện diện của oxy cũng tăng tác động gây chết của bức xạ với VSV Ngoài ra, tăng hàm lượng nước cũng làm tăng ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ lên VSV

do sự gia tăng quá trình hình thành các gốc tự do từ các phân tử nước gây ra bởi bức xạ Hơn nữa, khác thành phần của MT xung quanh các vi sinh cũng gây ra các hiệu ứng khác nhau của chiếu xạ [54] Do đó, việc áp dụng chiếu

xạ gamma để gây đột biến ở VSV là không đơn giản

Trong những năm gần đây, nghiên cứu sử dụng bức xạ γ làm tác nhân gây đột đột biến làm tăng khả năng sinh các sản phẩm thứ cấp ở nhiều loại

VSV như Trichoderma [4], Streptomyces [55], Aspergillus niger [15],

Bacillus [26] được nhiều tác giả quan tâm

Trong nghiên cứu của Abbasi, chủng nấm T harzianum sau xử lý chiếu

xạ gamma có tốc độ sinh trưởng lớn hơn, khả năng đối kháng với các chủng

nấm gây bệnh thực vật (Macrophomina phaseona và Rhizoctonia solani AG4)

cao hơn so với chủng thuần Ở liều chiếu 250 Gy, các chủng đột biến xuất hiện sự sai khác ở mức độ sinh học phân tử so với chủng thuần và có liên quan tới khả năng sinh sản phẩm thứ cấp [39]

Tamada và cộng sự khi đánh giá ảnh hưởng của bức xạ gamma lên

chủng T reesei nhận thấy tỷ lệ sống sót của chủng nấm giảm dần theo sự tăng

dần của liều chiếu Đồng thời, chủng đột biến thu được ở liều chiếu 2000 Gy

có khả năng sinh cellulase cao hơn chủng thuần 1,8 lần [7]

Trong một nghiên cứu khác với chủng nấm T viride, Farangis và cộng

sự cũng chỉ ra rằng chiếu xạ gamma có ảnh hưởng tích cực đến khả năng sinh cellulase, chủng đột biến sau chiếu xạ có khả năng sinh cellulase cao hơn chủng thuần 38% [56]

Cùng với hướng nghiên cứu này, Darabzadeh và cộng sự cũng chứng minh được ảnh hưởng của bức xạ gamma tới khả năng sinh cellulase của

chủng nấm T reesei 2414 Chủng đột biến có khả năng sinh cellulase tổng số

và endocellulase cao hơn chủng thuần tương ứng 30% và 23% Trong điều kiện nhiệt độ 50oC, hoạt độ cellulase của chủng đột biến cao hơn chủng ban đầu 47% [57]

Shahbazi và cộng sự đã chứng minh bức xạ gamma là tác nhân tạo đột

biến ưu việt hơn so với chiếu xạ UV trên chủng nấm T reesei (PTCC 5142)

Sau xử lí chiếu xạ, các chủng đột biến được tạo ra ở liều tối ưu 250 Gy có khả năng sinh CCase, CMCase, avicellase và FPase cao hơn so với chủng thuần từ 1,5 đến 1,99 lần [4]

Rõ ràng, xử lý chiếu xạ có thể dẫn đến những thay đổi về hình thái cũng như quá trình chuyển hóa ở VSV Những thay đổi do chiếu xạ tạo ra là các thay đổi ngẫu nhiên có thể di truyền được và sự ổn định của chúng phụ thuộc vào sự tổn thương ở mức độ phân tử của TB sau khi chiếu xạ cũng như

khả năng kháng xạ của VSV Loại bức xạ, khoảng cách của nguồn bức xạ, thời gian chiếu xạ…cũng là các yếu tố ảnh hưởng tới sự ổn định của các đột biến VSV [6]

Như vậy, để tạo ra các đột biến VSV bằng bức xạ gamma, các phương pháp với liều lượng bức xạ và điều kiện chiếu xạ khác nhau đã được công bố Tuy nhiên, không có bất kỳ một khuyến cáo chung nào về khoảng liều tối ưu

để đạt được tỷ lệ đột biến cao do ảnh hưởng của bức xạ tới mỗi loài hay chủng VSV là không giống nhau Việc xây dựng đường cong sống sót phụ thuộc liều, cũng như tổng hợp các nghiên cứu có liên quan để có được thông tin về hiệu quả của liều xử lý, điều kiện chiếu xạ,…là cần thiết để xác định khoảng liều phù hợp cho các đột biến mong muốn

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT TƯ, THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên vật liệu

Các chủng nấm Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp cellulase

được thu thập từ các phòng thí nghiệm và ngân hàng giống VSV trong nước

như liệt kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chủng Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp cellulase

VTCC 31435

Trung tâm giống,Viện Vi sinh

và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội

VTCC

31435

Viện Di truyền Nông nghiệp

Các chủng Trichoderma được bảo quản theo phương pháp cấy truyền

trên ống thạch nghiêng chứa môi trường PDA Sau khi cấy trên thạch, chủng

nấm được nuôi trong tủ ấm 28o

C, trong 3 -5 ngày và bảo quản tối đa 30 ngày

ở 4oC trước khi cấy chuyền đợt tiếp theo

2.1.2 Hóa chất

 Hóa chất và MT nuôi cấy VSV:

- CMC (carborxyl methyl cellulose) - Sigma - Mỹ

- Congo đỏ - Sigma - Mỹ

- Streptomycin - Sigma - Mỹ

- Sodium chloride (NaCl ) - Merck - Đức

- Sodium hydroxide (NaOH) - Merck - Đức

- Axit hydrochloric (HCl) - Merck - Đức

- Glucose - Nhật Quang Pharma Co Ltd - Việt Nam

- Agar - Việt Nam

- PDA (Potato Dextrose Agar ) - Merck - Đức

- Môi trường nuôi cấy lỏng: 4 g KH2PO4; 13,6 g (NH4)2SO4; 0,8 g CaCl2; 0,6 g MgSO4; 0,1 g pepton; 0,1 g cao nấm men; 1 mg FeSO4.H2O; 0,32

mg MnSO4.2H2O; 0,28 mg ZnSO4.7H2O; 0,4 mg CoCl2.6H2O; 0,25 mg CuSO4.5H2O; 2 g CMC dẫn nước tới 1000 ml

 Hóa chất dùng cho định tính và định lượng cellulase:

- Axit citric ngậm một phân tử nước (C6H8O7.H2O) - Merck - Đức

- Axit 3,5- dinitrosacyc (DNS) (C7H4N2O7) - Merck - Đức

- Muối Rochelle (Na-K tartarate) (C4H4KNaO6) - Merck - Đức

- Phenol (C6H6O) - Merck - Đức

- Sodium metabisulfite (Na2O5S2) - Merck - Đức

- Phenolphtalein (C20H14O4)

2.1.3 Thiết bị

 Nguồn Co-60 – Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội

 Các máy móc, thiết bị phục vụ cho thực hiện các nội dung nghiên cứu thuộc Phòng Nghiên cứu Công nghệ Bức xạ, Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội (Viện năng lượng Nguyên tử Việt Nam):

- Máy ổn nhiệt JSR Model JSIB - 22T, Hàn Quốc

- Máy quang phổ UV - 2450 Shimadzu, Nhật bản

- Máy lắc gia nhiệt BIOSAN ES - 20, Latvia

- Máy li tâm lạnh-Velocity 18R - Dynamica- Austraa

- Máy cất nước hai lần - A4000D - Bibby – Anh

- Máy đo pH model 3310 - Jeway

- Tủ sấy chân không Shel Lab, Mỹ

- Cân phân tích độ chính xác 10-4- EP320A - Precisa - Thụy Sỹ

- Buồng cấy vô trùng - AVC - 4D1- ESCO - Singapore

- Tủ ấm nuôi cấy VSV JSGI - 250T- Hàn Quốc

- Kính hiển vi huỳnh quang kĩ thuật số CELENAS-Logos Bio - Hàn Quốc 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Bảo quản và giữ giống

Chủng giống Trichoderma (chủng thuần và chủng ứng viên mang đột

biến có khả năng tổng hợp cellulase cao) được bảo quản theo phương pháp cấy truyền trên ống thạch nghiêng chứa MT PDA Sau khi cấy trên ống thạch, nấm được nuôi trong tủ ấm 28oC trong 3 ngày và bảo quản tối đa 30 ngày ở

4oC trước khi cấy truyền đợt tiếp theo

2.2.2 Xử lý chiếu xạ

2.2.2.1 Thu dung dịch bào tử nấm

Chủng Trichoderma thuần được nuôi cấy điểm trên đĩa thạch chứa

MT PDA Sau 7 ngày nuôi cấy, toàn bộ bào tử trên bề mặt thạch được gạt vào 100 ml nước muối sinh lý NaCl 0,9% [57] Dung dịch bào tử sẽ được pha loãng sao cho mật độ TB khoảng 108

- 109 CFU/ml và được chuyển sang các ống nghiệm vô trùng (10 ml/ống) Các ống này được dán nhãn (ghi liều

dự kiến) và được xử lý chiếu xạ trên thiết bị gamma Co-60 tại Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội

2.2.2.2 Chiếu xạ dung dịch bào tử

Các ống nghiệm có chứa dung dịch bào tử nấm được xử lý chiếu xạ trên nguồn Co-60 ở dải liều 0-2500 Gy (3 ống nghiệm lặp lại cho mỗi liều)

2.2.2.3 Chiếu xạ thạch đĩa

Dung dịch bào tử nấm được pha loãng (theo dãy thập phân) tới nồng độ thích hợp và cấy trải trên đĩa petri chứa MT PDA và PDA có bổ sung CMC

và Congo đỏ Các đĩa petri này được đem chiếu xạ trên nguồn gamma Co-60

ở dải liều 0 đến 2500 Gy (3 đĩa lặp lại cho mỗi liều)

Sau chiếu xạ, các đĩa petri chứa MT PDA được ủ ở 28oC trong 72 giờ

để đánh giá số lượng TB nấm sống sót sau chiếu xạ

Trong khi đó, các đĩa PDA có bổ sung CMC và Congo đỏ được nuôi cấy

ở 28oC trong 24 giờ Sau 24 giờ, nhiệt độ nuôi cấy được đưa lên 37o

C trong 4 đến 7 ngày để đánh giá khả năng sinh cellulase của các chúng đột biến ở mỗi liều chiếu xạ

Liều kế Gammachrome YR được sử dụng để đo liều hấp thụ trong tất

cả các mẫu chiếu xạ

2.2.3 Xác định số lượng TB

Số lượng TB Trichoderma trước và sau xử lý chiếu xạ được xác định

thông qua đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên MT PDA

Dịch bào tử nấm (trước và sau chiếu xạ) được pha loãng theo dãy thập phân Sau đó, thể tích 0,1 ml mẫu ở các độ pha loãng thích hợp được cấy vào đĩa petri chưa MT PDA (3 đĩa petri/độ pha loãng) Sử dụng que gạt vô trùng dàn đều các bào tử nấm trên bề mặt thạch Tiến hành đếm số khuẩn lạc sau 72 giờ nuôi cấy ở 28oC và tính số lượng TB trong 1 ml mẫu (Mi) theo công thức:

Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V

Trong đó : Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa ; Di là độ pha loãng và

V là thể tích dịch bào tử cấy vào mỗi đĩa (ml)

2.2.4 Định tính và định lượng cellulase

2.2.4.1 Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Hoạt tính cellulase do các chủng Trichoderma sinh ra được xác định

định tính bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa cơ chất là CMC và chất nhuộm màu Congo đỏ Phương pháp này dựa theo nghiên cứu

Li và cộng sự [8] được cải tiến phù hợp với cơ chất và chủng giống thí nghiệm của chúng tôi, gồm các bước tiến hành như sau:

Bước 1: Hoạt hóa cơ chất CMC (carboxymethyl cellulose)

CMC là một polymer có khả năng tan trong nước và tan tốt ở điều kiện 40-50oC Do vậy, 2 g CMC được ngâm trong 100 ml nước nóng 70-80oC để các hạt CMC được phân tán trong nước Khi nhiệt độ giảm xuống, sử dụng khuấy từ để các hạt tan ra hoàn toàn Bổ sung thêm nước cất để thể tích cuối cùng 400 ml

Bước 2: Chuẩn bị chất nhuộm màu Congo đỏ

0,2 gam Congo đỏ được pha tan trong 100 ml nước cất đun sôi 100o

C

để đảm bảo Congo tan hết, không bị vón cục trong môi trường

Hòa tan 400 ml dung dịch CMC đã hoạt hóa cùng với 100 ml dung dịch Congo đỏ và thêm 500 ml nước cất cho đủ 1lít Bổ sung MT PDA theo chỉ dẫn của nhà sản xuất (39 g/l) và hấp 121oC, 1 atm Sau khử trùng, làm nguội

MT tới khoảng 45-55oC và bổ sung kháng sinh (nồng độ 50 mg/l) trước khi

đổ đĩa petri

Bước 3: Thử hoạt tính cellulase

Dùng que cấy nhọn, chấm 1 điểm trên ống giống gốc (phần rìa ít bào tử nhất) sau đó chấm lên chính giữa của đĩa PDA có chứa CMC và Congo đỏ Đĩa sau khi cấy được giữ ở 28oC trong 24 giờ Sau 24 giờ nuôi cấy, nhiệt độ ủ

sẽ được nâng lên 37o

C trong 3-5 ngày nhằm hạn chế sự lan rộng của khuẩn lạc và thu vòng phân giải CMC tối đa Tiến hành đo kích thước khuẩn lạc và kích thước vòng phân giải bao quang nó bằng thước kẹp điện tử Mitutoyo (Nhật bản), độ chính xác ±0,02mm Tiến hành đo đạc trên 03 đĩa petri cho mỗi mẫu

Khả năng thủy phân cellulose được đánh giá thông qua chỉ số HC (Hydrolysis Capacity) HC được tính theo công thức sau [57]:

HC= Đường kính vòng phân giải/ Đường kính khuẩn lạc

2.2.4.2 Phương pháp DNS (axit 3,5 dinitrosalicylic)

Hoạt độ cellulase do các chủng Trichoderma sinh ra trong quá trình

nuôi cấy được định lượng theo TCVN 12104:2018 [58] bằng phương pháp

DNS Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá hai loại hoạt độ enzyme endoglucanase - CMCase (thủy phân cơ chất CMC) và hoạt độ enzyme tổng số-FPase (thủy phân giấy lọc Whatman số 1)

Phương pháp DNS dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định

Xác định hoạt độ thủy phân CMC và giấy lọc (What man số 1) bằng cách xác định lượng đường khử được tạo thành khi cho 0,1 ml cellulase tác dụng với cơ chất CMC và giấy lọc ở pH 4,8 và nhiệt độ 50o

C trong thời gian 20 phút đối với CMC và 60 phút với giấy lọc Lượng đường khử sinh ra phản ứng với thuốc thử DNS, cường độ màu (màu lục) của hợp chất tạo thành sau phản ứng được đo quang phổ ở bước sóng 540 nm

Một đơn vị hoạt độ của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa 1 µmol glucose trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [58]

 Công thức tính hoạt độ enzyme CMCase:

I (U/ml)=

Trong đó:

T: Độ hấp phụ của mẫu thí nghiệm

C: Độ hấp phụ của mẫu đối chứng

 Hoạt độ cellulase tính theo đơn vị giấy lọc (FPA) được tính theo công thức sau:

FPA (U/ml) =

Trong đó:

FPA: Hoạt độ cellulase, tính bằng đơn vị giấy lọc trên mililit (U/ml);

C: Nồng độ cellulase thích hợp để giải phóng 2 mg glucose, tính bằng miligram trên mililit (mg/mL);

d: Hệ số pha loãng cellulase thích hợp để giải phóng 2 mg glulose;

0,37: Nồng độ cellulase giải phóng 2 mg glucose ở điều kiện tiêu chuẩn

2.2.5 Sàng lọc các đột biến Trichoderma sinh cellulase cao bằng xử

C trong 4-7 ngày nhằn hạn chế sự lan rộng của khuẩn lạc và thu vòng phân giải CMC tối

đa Tiến hành đo kích thước khuẩn lạc và kích thước vòng phân giải bao quanh nó Khả năng thủy phân cellulose được đánh giá thông qua giá trị HC (xem 2.2.4.1) Những khuẩn lạc sinh cellulase có giá trị HC lớn hơn 10% so với chủng thuần được xem là các đột biến sinh cellulase cao Tần số đột biến sinh cellulase cao ở mỗi liều chiếu xạ được tính theo công thức:

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.TUYỂN CHỌN CHỦNG Trichoderma CÓ KHẢ NĂNG SINH

CELLULASE CAO LÀM NGUYÊN LIỆU GÂY TẠO ĐỘT BIẾN

3.1.1 Tốc độ phát triền và hình thái khuẩn lạc các chủng Trichoderma

Mười (10) chủng thuần Trichoderma có khả năng sinh cellulase đã

thu thập được nuôi cấy riêng rẽ trên MT PDA, quan sát tốc độ phát triển, hình thái khuẩn lạc của chúng trong 5 ngày Trong quá trình nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy phần lớn các khuẩn lạc phát triển nhanh, sau 3 ngày ở nhiệt độ

28oC±1 hệ sợi đã lan kín mặt đĩa petri, đường kính đạt 9 cm Khuẩn lạc có

xu hướng tạo thành các vòng tròn đồng tâm, số lượng và màu sắc các vòng nhiều hay ít phụ thuộc từng chủng Riêng chủng LPH 028 khuẩn lạc phát triển chậm hơn so với các chủng khác, đường kính khuẩn lạc chỉ đạt 7,7 cm

sau 5 ngày Hình thái các chủng Trichoderma được mô tả trong Bảng 3.1 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc các chủng Trichoderma sau 5 ngày nuôi cấy

- Bào tử tạo thành từng đám nhỏ màu trắng Bào tử già ở tâm đĩa có màu xanh lá

- Mặt sau của đĩa thạch có sắc

tố vàng

2 DT1 - Khuẩn lạc màu xanh, đậm dần

về phía tâm đĩa, rìa bao quanh màu trắng

- Bào tử tạo thành từng đám, bào tử non màu trắng, khi già

có màu xanh lá

- Mặt sau của đĩa thạch không

có sắc tố

3 DT2 - Khuẩn lạc màu xanh, đậm dần

về phía tâm đĩa, rìa bao quanh lớn, màu trắng

- Bào tử tạo thành từng đám có màu xanh lá và trắng đan xen, bào tử non phía ngoài màu trắng, bào tử già ở tâm đĩa có màu xanh lá

- Mặt sau khuẩn lạc không có sắc tố

4 DT3 - Khuẩn lạc là các vòng đồng

tâm màu trắng và xanh (hơi vàng) xen kẽ, tâm màu xanh sẫm

- Bào tử có màu xanh (hơi vàng), xen kẽ các vòng bào tử xanh là bào tử trắng

- Mặt sau khuẩn lạc không có sắc tố

- Mặt sau khuẩn lạc không có sắc tố

028

- Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng, tâm màu xanh lá nhạt

- Phát triển chậm hơn so với các chủng khác

- Bào tử không nhiều, có màu vàng xanh ở giữa lan dần từ tâm đĩa ra ngoài

- Mặt sau khuẩn lạc không có sắc tố

- Mặt sau khuẩn lạc có sắc tố vàng