Thiết kế quy trình phân tích Alpha Lipoic Acid trong một số thực phẩm chức năng

Tuy nhiên chất lượng của các sản phẩm là vấn đề cần quan tâm chính vì vậy cần có phương pháp tối ưu để phân tích định lượng hàm lượng hoạt chất trên trong sản phẩm.. tại chưa thấy có quy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

BÙI MINH ĐỨC

THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chuyên ngành : Kỹ thuật hóa học

Mã số : 8520301

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Đà Nẵng 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Diệu Hằng

Phản biện 1: PGS.TS Phạm Cẩm Nam

Phản biện 2: PGS.TS Lê Minh Đức

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Kỹ thuật hóa học, họp tại Đại học Bách khoa vào ngày 30 tháng 08 năm 2019

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chất lượng thực phẩm chức năng là một vấn đề cần phải được quan tâm bởi vì được sử dụng trực tiếp vào trong cơ thể con người Nếu thực phẩm chức năng giả, kém chất lượng, không đảm bảo nguồn gốc thì có khả năng ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người Trong khi “Thuốc” có những quy định rất chặt chẽ như cần phải ghi rõ nguyên liệu, công dụng và luật định, sự chuyển hóa trong cơ thể, đào thải ra sao, tác dụng phụ, hàm lượng… thì thực phẩm chức năng lại không có những yêu cầu khắt khe Do vậy, việc sản xuất thực phẩm chức năng trở nên dễ dàng hơn, nhất là trong khâu đăng ký sản xuất hay các khâu kiểm định chất lượng

Trong thời gian qua, việc sản xuất, kinh doanh thực phẩm chức năng không đảm bảo chất lượng, không rõ nguồn gốc xuất xứ, chưa đăng ký bản công bố với cơ quan quản lý, đặc biệt kinh doanh qua mạng điện tử có chiều hướng diễn biến phức tạp, ảnh hưởng đến quyền lợi và sức khỏe người tiêu dùng, gây bức xúc với xã hội Ngày 19/06/2018, Thử tướng Chính phủ đã ban hành Chỉ thị

số 17/CT-TTg về việc “Tăng cường đấu tranh chống buôn lậu, gian lận thương mại, sản xuất, kinh doanh hàng giả, hàng kém chất lượng thuộc nhóm hàng dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng, dược liệu và vị thuốc y học cổ truyển”

Hiện nay trong thị trường có nhiều loại thực phẩm chức năng

có thành phần chính là Alpha Lipoic Acid (ALA) Tuy nhiên chất lượng của các sản phẩm là vấn đề cần quan tâm chính vì vậy cần có phương pháp tối ưu để phân tích định lượng hàm lượng hoạt chất trên trong sản phẩm Trong đó hầu như các quy trình phân tích chỉ được tham khảo từ các tiêu chuẩn và các kênh nước ngoài Các hệ thống TCVN; QCVN; Dược Điển Việt Nam; Dược Điển Anh… hiện

tại chưa thấy có quy trình chính thức về phân tích chất lượng Alpha Lipoic Acid và chưa tìm ra các bài báo khoa học ở Việt Nam nói về việc xây dựng quy trình và tối ưu điều kiện chiết xuất phân tích ALA trong thực phẩm chức năng Các quy trình phân tích ở Việt nam chỉ

là các quy trình nội bộ cho nên điều kiện phân tích thiết bị hóa chất khác nhau, và chưa được đánh giá tối ưu theo điều kiện phân tích Chính vì vậy cần xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá và tối ưu để hoàn thiện quy trình phân tích này

Ngoài ra thực trạng nhu cầu về quản lý trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi cần tìm hiểu về chất lượng các sản phẩm thực phẩm chức năng, đặc biệt là những hoạt chất mới, những hoạt chất đáng quan tâm và được sử dụng nhiều như ALA

Với những lý do và các vấn đề thực tiễn trên tôi xin được lựa

chọn đề tài “Thiết kế quy trình phân tích Alpha Lipoic Acid trong

một số thực phẩm chức năng”

2 Mục tiêu nghiên cứu:

1 Xây dựng và đánh giá được quy trình phân tích ALA trong một số thực phẩm chức năng, quy trình này phải tối ưu và phân tích được hầu hết các mẫu thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường

2 Từ quy trình đã xây dựng lập hướng dẫn phương pháp ở cơ quan đơn vị để phân tích các mẫu nghiên cứu có trên địa bàn

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

- Thực phẩm chức năng có chứa ALA trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi

- Sắc ký lỏng cao áp HPLC

4 Phương pháp nghiên cứu:

- Nghiên cứu lý thuyết

- Phân tích dữ liệu

- Xây dựng quy trình

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

- Xây dựng và lựa chọn quy trình phân tích, lựa chọn các thông số và điều kiện quy trình phân tích

- Xây dựng và tối ưu được quy trình xử lý mẫu phân tích

- Xây đựng quy trình và đánh giá quy trình phân tích Sau đó tiến hành thực hiện phân tích đối chứng về quy trình với các phòng thí nghiệm khác nhau

- Phân tích một số mẫu đối chứng trên địa bàn

6 Cấu trúc của luận văn:

Cấu trúc luận văn gồm các Chương sau:

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về thực phẩm chức năng

1.2 Tổng quan về Alpha Lipoic Acid

Cấu tạo và tính chất lý hóa

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu và đặc điểm của đối tượng 2.1.1.

nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các mẫu thực phẩm chức năng bao gồm: các nền mẫu tự tạo, các nền mẫu dùng để xây dựng quy trình thẩm định và các mẫu lưu hành trên thị trường có thành phần và thể chất phức tạp, tiêu chí phân tích đa dạng

Nền mẫu 1: Dung dịch tiêm truyền Thiotic acid 300mg/12ml



(nền mẫu ALA dạng lỏng)

Nền mẫu 2: Viên nén Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ Alpha



Lipoic Acid 600mg (nền mẫu ALA dạng rắn)

Nền mẫu 3: Thực phẩm chức năng Omega 3-4-6, Alpha



Lipoic Acid 780mg (nền mẫu ALA ưa dầu)

Nội dung nghiên cứu

2.1.2.

Để thực hiện nghiên cứu phân tích ALA trong thực phẩm chức năng, quy trình nghiên cứu được thực hiện như sau:

Sử dụng hệ thống phân tích Sắc ký lỏng tiến hành nghiên



cứu Khảo sát các thông số HPLC, đưa ra quy trình và tiến hành xác định ALA bằng HPLC Lựa chọn quy trình phân tích, lựa chọn các thông số và điều kiện quy trình phù hợp nhất Mục đích sao cho pic sắc ký lỏng tách tốt nhất, có độ phân giải cao nhất

Thực hiện mô hình quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm



trên nền mẫu thêm chuẩn, từ đó đưa ra các thông số tối ưu nhất cho quá trình chiết tách ALA trên các nền mẫu thực phẩm Nhằm mục đích chiết tách sản phẩm được tối đa và mức độ chiết cao nhất

Xây đựng quy trình và đánh giá quy trình phân tích Sau đó

từ đó được đưa vào quy chuẩn trong phòng thí nghiệm

Chất chuẩn, dung môi, hóa chất

2.1.4.

2.1.4.1 Chất chuẩn

Chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu gồm có:

Alpha Lipoic Acid (Hàm lượng: 99,0 %; Nơi sản xuất:

Sinh Thực Phẩm Quốc Gia)

2.1.4.2 Dung môi, hóa chất

Một số dung môi, hóa chất khác được sử dụng trong nghiên cứu gồm có:

Acetonitrile (Merck; Lô: K49707491; Hạn dùng:

Các thiết bị dụng cụ theo quy định và yêu cầu của ISO

17025 – 2017 và được Viện kiểm nghiệm thuốc TW và các công ty

hiệu chuẩn và bảo trì gồm:

Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao (Model: U-3000; Nơi sản

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Xác định nồng độ ALA trong các mẫu bằng phương 2.2.1.

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm

2.2.2.

2.2.2.1 Khái niệm về quy hoạch thực nghiệm

2.2.2.2 Khái niệm về tối ưu hóa

2.2.2.3 Các bước quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm [9]

Xác nhận giá trị của phương pháp

2.2.3.

2.2.3.1 Độ đặc hiệu

2.2.3.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

2.2.3.3 Giới hạn phát hiện và iới hạn đ nh ư n

2.2.3.4 Đánh iá độ chụm của phươn pháp

2.2.3.5 Đánh iá độ đún của phươn pháp

2.2.3.6 Đánh iá độ khôn đảm bảo đo

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện đo sắc ký lỏng

Các thông số và điều kiện khảo sát

3.1.1.

3.1.1.1 Kết quả khảo sát cột sắc ký lỏng

Khi chạy trên chạy mẫu thuốc và thực phẩm chức năng tại nơi nghiên cứu thấy cột C18 tách tốt hơn C8 nên ta chọn cột các loại cột C18 để khảo sát

Trong quá trình nghiên cứu và thực nghiệm lâu dài, nhận thấy Cột Purospher Star RP-18e (5μm; 250 x 4.6mm) thích hợp để nghiên cứu các hoạt chất mới và khả năng đáp ứng pic, tách của cột tốt Ngoài ra quá trình nghiên cứu trên thực phẩm chức năng nhiều thành phần nên ưu tiên chọn cột dài để thời gian rửa giải lâu hơn và khả năng tách được nhiều chất hơn

3.1.1.2 Kết quả khảo sát pha động sắc ký lỏng

sắc ký đồ pic ALA ở nồng độ H3PO4 0,025M cho các nghiên cứu tiếp theo vì tại nồng độ này nằm trong khoảng giới hạn cho phép của cột, pic sắc ký rõ nét, cân đối, ít tốn thời gian phân tích và dung môi pha động

Lựa chọn thành phần pha động: Tỷ lệ ACN càng lớn thì thời



gian lưu càng ngắn, hệ số tách càng nhỏ, pic đẹp cân đối, hiện tượng kéo đuôi giảm dần Tuy nhiên nếu tỷ lệ ACN từ 50% trở lên thì hệ số tách quá nhỏ, các pic không rời nhau Trong khi đó tỷ lệ ACN từ 30% trở xuống pic tách chậm, chân đường nền bị giãn dễ gây sai số

và thời gian phân tích kéo dài không lợi ích về kinh tế Thường trong thực phẩm, thực phẩm chức năng hay có các tạp chất nên chọn hỗn hợp dung môi pha động sao cho thời gian lưu tương đối để tách tốt

và pic sắc ký đẹp Trong các điều kiện pha động trên nhận thấy tỉ lệ ACN: 0,025M HPO (40:60), (v/v) là phù hợp nhất Khi đó pic

chuẩn có hệ số đối xứng là 1,13; số đĩa lý thuyết là 3474 là phù hợp

3.1.1.3 Kết quả khảo sát bước sóng

Qua thực nghiệm nhận thấy ở bước sóng 208nm cho tín hiệu phân tích tốt nhất, kết quả phân tích từ đường chuẩn ở trong khoảng nồng độ chuẩn làm việc đạt có hệ số slope lớn nhất (Hệ số này càng cao thì giới hạn định lượng và khả năng phát hiện càng tốt) và hệ số tương quan R2

cao nhất so với các bước sóng còn lại

Đường chuẩn của ALA ở 208nm: Y = 77,6744X + 0,4220;

Quy trình và kết quả lựa chọn điều kiện HPLC sau 3.1.2.

khảo sát

Quá trình khảo sát và nghiên cứu trên đây cho được các thông số về quy trình sắc ký HPLC để xác định nồng độ ALA là như sau:

độ phòng nhằm tạo sự ổn định cho quá trình phân tích mẫu)

3.2 Kết quả khảo sát và tối ƣu điều kiện xử lý mẫu trên Modde 5

Tổ chức thí nghiệm trực giao cấp 2 [9]

3.2.2.

Phươn án thí n hiệm và kết quả phân tích mẫu Modde 5 Hình 3.16.

Đánh giá thông số quy hoạch thực nghiệm

Tối ưu hóa thực nghiệm

Thời gian siêu âm (Min)

(mg/g) ALA trong mẫu

% Thu hồi

Kết quả trên cho thấy quá trình quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm là phù hợp và đạt yêu cầu Toàn bộ 3 kết quả chiết xuất đều cho thấy hàm lượng ALA trong mẫu đã được chiết xuất hoàn toàn Kết quả thu hồi đáp ứng được yêu cầu phụ lục F của AOAC là đối hàm lượng mẫu phân tích của phương pháp từ 10% đến 100%; thu hồi phải nằm trong khoảng 98  102%

Từ kết quả trên, có thể kết luận điều kiện xử lý tối ưu là: Tỷ

lệ dung môi ACN:H2O 63:37 (v/v), nhiệt độ là 43oC và thời gian siêu

âm là 52 phút

Và quy trình xử lý mẫu phù hợp là: Cân lượng mẫu thử tương ứng khoảng 100mg ALA vào bình nón 250ml, thêm khoảng 5ml NaOH 0,1N, lắc đều Thêm khoảng 70ml ACN:H2O (63:37) (v/v), điều chỉnh nhiệt độ bể siêu âm 43o

C và siêu âm trong 52 phút Sau đó chuyển toàn bộ mẫu vào bình định mức 100ml, định mức bằng dung dịch ACN:H2O (63:37); (v/v) tương ứng, lắc đều và lọc Hút chính xác 5,0ml dung dịch này cho vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất và lắc đều

3.3 Đánh giá quy trình phân tích Ala

Kết quả tính đặc hiệu

3.3.1.

ắc k đồ nền ẫu trắn Hình 3.21.

ắc k đồ nền ẫu chuẩn nồn độ 0,1mg/ml Hình 3.22.

ắc k đồ nền ẫu Hình 3.23.

ắc k đồ nền ẫu Hình 3.24.

ắc k đồ nền ẫu 3 Hình 3.25.

Ph -Vis của dun d ch chuẩn và các nền ẫu th Hình 3.26.

Qua các kết quả trên nhận thấy:

Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn xuất hiện pic rõ ràng cho ra



thời gian lưu của ALA: 8,740min Sắc ký đồ của các mẫu nền 1, 2, 3 cho thời gian lưu của ALA lần lượt là: 8,623min, 8,683min; 8,703min Như vậy, độ lệch thời gian lưu giữa các nền mẫu thử so với chuẩn không quá 5% là đạt yêu cầu cho phép ở các máy phân tích HPLC

Trên sắc ký đồ của mẫu thử pic của ALA tách hoàn toàn



khỏi các pic khác có trên nền mẫu thử 1,2,3

Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không xuất hiện pic ở

Các kết quả trên cho thấy độ đặc hiệu của phương pháp phân tích ALA là phù hợp

Ct (Cobs)

% Δi (Bias)

Phương trình đường chuẩn: Y = 77,9660X + 0,0494

Phươn trình hồi qu tu ến tính ALA Hình 3.27.

Kết quả khảo sát độ tuyến tính ta được phương trình hồi quy:

Y 77,9660X 0,0494 với hệ số tương quan R2

= 1,000 (0,99 ≤ R2

≤ 1) Nhận thấy phương trình có tính tương quan rõ rệt

Phương trình hồi quy có độ chệch từng điểm chuẩn nằm trong khoảng từ -0,25% đến 0,39% nằm trong khoảng 15%, nên phương trình hồi quy này đạt yêu cầu trong phương pháp phân tích

Kết quả giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định 3.3.3.

Chiều cao nhiễu (h = 2N)

Từ bảng trên cho thấy:

Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp: 0,50ppm với hệ

Sắc kí đồ ALA ở nồn độ 1,50ppm Hình 3.28.

Kết quả độ chụm

3.3.4.

3.3.4.1 Kết quả độ lặp lại

Kết quả thu được cho thấy:

1,3 đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp

1,3 đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp

1,3 đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại của phương pháp

3.3.4.2 Kết quả Độ tái lặp nội bộ :

Kết quả thu được cho thấy:

3,4817 nên phương pháp đạt yêu cầu của độ tái lặp nội bộ

2,0634 nên phương pháp đạt yêu cầu của độ tái lặp nội bộ

1,5727 nên phương pháp đạt yêu cầu của độ tái lặp nội bộ

Kết quả độ đúng

3.3.5.

Đạt yêu cầu phụ lục F AOAC

Kết quả đánh giá độ không đảm bảo đo

3.3.6.

Kết quả thu được cho thấy độ không đảm bảo đo này là phù hợp, thông thường đối với các mẫu thuốc các phòng thí nghiệm thường thì độ không đảm bảo đo < 2% thì được cho là tốt

3.4 Đánh giá phương pháp bằng so sánh liên phòng

Kết quả ở bảng dưới cho thấy: Phòng thí nghiệm số 42 phân tích mẫu cho ra kết quả 21,4g/100g (Hệ số Z’- score = 1,56) nên phương pháp phân tích xây dựng trên đạt yêu cầu của chương trình thử nghiệm thành thạo và không có sự khác biệt giữa các phòng thí nghiệm

3.5 Phân tích một số mẫu lấy trên địa bàn

Bản 3 0 Kết quả phân tích ALA trong các mẫu lấ trên đ a bàn

tỉnh Quảng Ngãi

STT Mẫu phân tích Kết quả

(mg/viên)

Kết quả so với hàm lượng nhãn (%)

100,67

STT Mẫu phân tích Kết quả

(mg/viên)

Kết quả so với hàm lƣợng nhãn (%)

86,74

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Trong quá trình thực nghiệm đã đạt được các kết quả sau: Xây dựng thiết kế quy trình xác định Alpha Lipoic Acid và



lựa chọn được các thông số tối ưu về điều kiện sắc kí lỏng Quy trình được xây dựng được đánh giá theo yêu cầu của hệ thống ISO 17025:2017

Quy trình xây dựng được có thể phân tích hầu hết các mẫu



thực phẩm chức năng ALA có trên địa bàn

Quy trình trên đã được xây dựng và đưa vào tài liệu hướng



dẫn phương pháp ở cơ quan đơn vị

Với các kết quả thu được, tác giả nghiên cứu có một số kiến nghị sau:

Phương pháp xây dựng thể hiện đặc trưng trên 03 nền mẫu



chính theo hướng dẫn của AGL 03, phương pháp này có thể dùng ở hầu hết các dạng thực phẩm chức năng có trên thị trường hiện nay Tuy nhiên đối với mẫu lạ có thành phần phức tạp thì chưa chắc quy trình đã phân tích được Chính vì vậy sau khi phương pháp đã được xây dựng cần phải định kỳ 1 tháng lấy mẫu có hàm lượng hoạt chất trên (ALA) về kiểm tra và cứ mỗi năm một lần tham gia đánh giá so sánh liên phòng Nhằm nâng cao tay nghề cho nhân viên và trong trường hợp gặp những mẫu lạ có hàm lượng hoạt chất quá phức tạp,

có thể nghiên cứu để xây dựng và bổ sung vào quy trình

Sau khi đã thiết kế quy trình xong cần phải xây dựng hướng



dẫn phương pháp, phổ biến cho các nhân viên tại nơi làm việc

Quy trình xây dựng và đánh giá phương pháp trên được áp



dụng và tham khảo nhiều tài liệu có uy tín khác nhau Chính vì vậy

có thể sử dụng để áp dụng cho các mẫu hoạt chất khác cần nghiên cứu sau này