Nghiên cứu chiết tách và xác định hoạt tính sinh học của các Flavonoid từ cây an xoa (Helicteres Hirsuta Lour) Quảng Nam

NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT Kết quả cho thấy các phương pháp chiết khác nhau thì hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa thu được cũng khác nhau... Ảnh hưởng của thời g

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Người hướng dẫn khoa học:

TS LÊ LÝ THÙY TRÂM

Phản biện 1:

PGS.TS Trần Thị Xô Phản biện 2:

TS Bùi Xuân Đông

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Công nghệ Sinh học họp tại Trường Đại học Bách khoa vào ngày 13 tháng 10 năm 2018

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin – Học liệu,Đại học Đà Nẵng

- Thư viện Trường Đại học Bách Khoa Đại học Đà Nẵng

M Ở ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây An xoa (hay còn gọi là cây thâu kén cái, thâu kén lông, tổ kén cái, dó lông) có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour là một loài

thực vật thuộc họ Trôm (Sterculiaceae), là cây bụi, thân gỗ, mọc ở nơi đất ẩm, lá thường to bằng bàn tay, có lông, hoa có màu hồng hay

đỏ, quả có hình như con sâu, có lông chạm vào thì ngứa [2]; [25] Cây phân bố chủ yếu ở Nam Trung Quốc, khu vực Nam Á và các nước Đông Nam Á như Lào, Indonesia, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam Cây rất dễ trồng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiều điều kiện sinh thái Tại một số nước như Ấn Độ, Trung Quốc, cây An xoa được sử dụng như một loại thuốc truyền thống để điều trị các bệnh như sốt rét và bệnh tiểu đường Trong đó, cây An xoa chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau, do đó được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, hầu hết các bộ phận của cây đều được sử dụng để trị bệnh… Cây An xoa được dùng trong những trường hợp người hay nhức mỏi, đau lưng, mất ngủ, da xanh, kể cả những người tim hay mệt cũng có thể cải thiện sức khỏe một cách hiệu quả [2]; [6] Lá cây An xoa có thể chữa trị được một

số bệnh thường gặp như ung nhọt, sưng lở Phần rễ dùng làm dịu cơn đau, chữa kiết lỵ, đậu sởi, cảm cúm, đái dắt và làm thuốc tiêu độc [2]

Ở Campuchia và ở tỉnh Bình Phước - Việt Nam, cây cũng được sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị các bệnh về gan

Hiện nay, tại Việt Nam cây An xoa được tìm thấy nhiều nơi ở các tỉnh giáp biên giới Campuchia như Bình Phước và nhiều tỉnh miền Trung Trong đó, tỉnh Quảng Nam là một trong những nơi tìm

thấy nhiều cây An xoa, cây mọc hoang và chưa được trồng phổ biến

Tại huyện Phú Ninh cây cũng được tìm thấy nhiều nhưng chưa được trồng và sử dụng rộng rãi để làm thuốc

Trên thế giới, cũng có một số công trình nghiên cứu đã xác định được trong cây An xoa chứa các chất có hoạt tính sinh học có tác dụng chữa được một số bệnh Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu về cây An xoa vẫn còn hạn chế và chưa thực sự được quan tâm nhiều,

chỉ được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền, chưa ứng dụng nhiều vào công nghệ dược phẩm để chữa bệnh Với những tác dụng to lớn của loài cây này, đồng thời nhằm tìm hiểu để ứng dụng vào dược phẩm và các loại thực phẩm chức năng chúng tôi quyết định chọn đề

tài: “Nghiên c ứu chiết tách và xác định hoạt tính sinh học của các flavonoid từ cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) Quảng Nam”

2 M ục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng quy trình tách chiết để thu được dịch chiết và cao chiết có chứa hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất từ cây An xoa

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, và hoạt tính gây độc tế bào từ cao chiết

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

Các bộ phận của cây An xoa (thân, lá, rễ) được thu hái tại huyện Phú Ninh - tỉnh Quảng Nam, Việt Nam

- Cung cấp thông tin khoa học về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của dịch chiết và cao chiết flavonoid từ cây An xoa tại huyện Phú Ninh, tỉnh Quảng Nam

- Cung cấp thông số công nghệ của quá trình tách chiết bằng các phương pháp phân tích khoa học và hiện đại

* Ý nghĩa thực tiễn

- Xây dựng phương trình tối ưu hóa điều kiện chiết ở quy mô phòng thí nghiệm, làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng ở quy

mô sản xuất công nghiệp

- Cao chiết từ cây An xoa là nguồn sử dụng tạo ra sản phẩm mới có giá trị dược liệu cao, góp phần đa dạng hóa sản phẩm và nâng cao giá trị chữa bệnh từ cây An xoa

5 C ấu trúc luận văn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.)

Cây An xoa có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour., được

biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: Cây dó lông, tổ kén lông, thâu kén lông, thâu kén cái [6]

1.1.1 Phân lo ại

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây An xoa

1.1.3 Công d ụng của cây An xoa

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU VỀ CÂY AN XOA

1.2.1 Các nghiên c ứu trên thế giới

1.2.2 Các nghiên c ứu trong nước

1.3 T ỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID

1.3.1 Định nghĩa

1.3.2 Phân loại các hợp chất flavonoid

1.3.3 Phân b ố flavonoid trong thực vật

1.3.4 Ho ạt tính sinh học của các hợp chất flavonoid

1.3.4.1 Tác dụng của flavonoid đối với đời sống của thực vật 1.3.4.2 Tác d ụng sinh học

+ Tác dụng chống oxy hóa của flavonoid

+ Tác dụng đối với enzyme

1.4.1 Khái niệm phương pháp chiết tách

1.4.2 Phương pháp chiết tách các hợp chất flavonoid

1.4.2.1 Nguyên tắc lựa chọn dung môi

1.4.4.1 Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng

1.4.4.2 Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn

1.4.4.3 Chiết dưới áp suất cao

1.4.4.4 Phương pháp chiết hồi lưu

1.4.4.5 Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH CHIẾT

1.5.1 Dung môi

1.5.2 Những yếu tố về kỹ thuật

1.5.2.1 Nhiệt độ chiết

1.5.2.2 Thời gian chiết

1.5.2.3 Độ mịn của nguyên liệu

1.5.2.4 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

1.5.2.5 pH dung môi

C HƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Với các mục tiêu của đề tài đặt ra, chúng tôi tiến hành thực hiện các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện đề tài

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên li ệu

2.1.2 Thiết bị, hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị

2.1.2.2 Hóa chất

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xác định một số thành phần hóa học trong lá, thân

2.2.1.5 Xác định hàm lượng một số kim loại nặng [10]; [11]

2.2.2 P hương pháp tách chiết và xác định hàm lượng flavonoid toàn ph ần

2.2.2.1 Xây dựng đường chuẩn Catechin bằng phương pháp

2.2.2.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng trích ly flavonoid toàn ph ần từ cây An xoa

a) Ảnh hưởng của thời gian chiết

b) Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

c) Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm

2.2.2.6 Kh ảo sát ảnh hưởng đồng thời của một số yếu tố đến hàm lượng flavonoid toàn phần

2.2.2.7 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa từ dịch chiết và cao chiết

2.2.2.8 Phương pháp tinh sạch flavonoid từ cao chiết

2.2.2.9 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

2.2.2.10 Khảo sát khả năng gây độc tế bào

Bảng 3.1 Một số thành phần hóa học có trong bột cây An xoa

STT Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Kết quả

Ghi chú: KPH: không phát hiện

3.2 PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CHUẨN CATECHIN

Xây dựng đường chuẩn bằng cách pha loãng thành dãy dung dịch có nồng độ catechin khác nhau lần lượt là 45, 90, 180, 360, 450,

540 và 590 µg/ml dung môi Kết quả đo mật độ quang hấp thu ở bước sóng 510 nm (OD510 nm) của hàm lượng catechin qua các dung môi khác nhau thể hiện ở hình 3.1 với hệ số tương quan R2 trong 3 dung môi khác nhau dao động từ 0,992 - 0,995 đạt độ tin cậy cao, từ đó có thể tính toán hàm lượng flavonoid toàn phần dựa trên catechin thông qua phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng cho

từng loại dung môi (hình 3.1 A, B, C)

Hình 3.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn catechin A: Dung môi methanol 40%; B: Dung môi ethanol 40%; C: Dung môi chloroform 40%

3.3 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN

CÓ TRONG CÁC BỘ PHẬN KHÁC NHAU CỦA CÂY AN XOA

Kết quả thu được ở hình 3.2 cho thấy rằng, hàm lượng flavonoid toàn phần phân bố trong cây An xoa ở các bộ phận khác nhau thì có sự khác nhau Trong đó, rễ là bộ phận có chứa hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất (10,800 mgCE/g ± 0.106a), tiếp đến là thân (5,014 mgCE/g ± 0,083b) và sau đó là lá (2,502 mgCE/g ± 0,113c), sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác suất 95% Như vậy, rễ là bộ phận được chúng tôi lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (hình 3.2)

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các bộ phận khác nhau của cây

An xoa đến hàm lượng flavonoid toàn phần

3.4 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT

Kết quả cho thấy các phương pháp chiết khác nhau thì hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa thu được cũng khác nhau Phương pháp thích hợp nhất là siêu âm bằng điện cực, với hàm lượng flavonoid toàn phần thu được tương ứng là 10,662 mgCE/g ± 0,146a, tiếp đến siêu âm bể (9,569 mgCE/g ± 0,034b) và phương pháp ngâm dầm cho hiệu suất thu hồi flavonoid toàn phần thấp nhất (6,702 mgCE/g ± 0,124c) (hình 3.3), sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác suất 95%

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các phương pháp chiết khác

nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần

3.5 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT

Sau khi lựa chọn được nguyên liệu và phương pháp chiết thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát với các loại dung môi có độ phân cực tương đối khác nhau: methanol 40%, ethanol 40% và chloroform 40% Các thí nghiệm được tiến hành trong thời gian 50 phút, ở nhiệt

độ 60oC và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 g/ml

Kết quả nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết với các điều kiện được thể hiện ở và hình 3.4 cho thấy cùng một nguyên liệu khi chiết flavonoid toàn phần bằng các dung môi khác nhau thì cho kết quả khác nhau Methanol là dung môi thu được hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất (10,933 mgCE/g ± 0,101a), tiếp đến là ethanol (7,173 mgCE/g ± 0,040b) và thấp nhất là chloroform (6,596 mgCE/g ± 0,043c) (hình 3.4), sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác suất 95% Mặt khác, dựa vào nguyên tắc phân cực của dung môi, các dung môi có độ phân cực khác nhau (methanol (5,1δP), ethanol (5,2δP) và chloroform (4,1δP) thì khả năng hòa tan các hợp chất hữu

cơ có tính phân cực cũng khác nhau Do vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi là phù hợp và methanol là dung môi được sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các dung môi chiết khác nhau

đến hàm lượng flavonoid toàn phần

3.6 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN TRONG QUÁ TRÌNH CHIẾT

3.6 1 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết

Sau khi lựa chọn được nguyên liệu, dung môi chiết là methanol 40% và phương pháp chiết thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly flavonoid toàn phần phù hợp Các mức thời gian được khảo sát là 10, 30, 50 và 70 phút Kết quả ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết có trong rễ cây An xoa được thể hiện ở hình 3.5

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các thời gian chiết khác nhau

đến hàm lượng flavonoid toàn phần

Kết quả thể hiện ở hình 3.5 cho chúng ta thấy rằng, trong cùng một điều kiện, nhưng ở các thời gian chiết khác nhau thì hàm lượng flavonoid toàn phần thu được cũng khác nhau Thời gian cho hàm

lượng flavonoid toàn phần cao nhất là ở 50 phút với giá trị tương ứng

là 10,356 mgCE/g ± 0,198avà thấp nhất là ở thời gian 10 phút (6,467 mgCE/g ± 0,135d) (hình 3.5), sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác suất 95%

3.6.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết

Với thời gian chiết 50 phút, nguyên liệu là rễ cây An xoa, dung môi methanol 40%, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng flavonoid toàn phần thu được

từ rễ cây An xoa Các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi được khảo sát là 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml)

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

chi ết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần

Kết quả thể hiện ở hình 3.6 cho thấy tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp nhất để trích ly flavonoid toàn phần trong rễ cây An xoa là 1/20, tương ứng với hàm lượng flavonoid toàn phần thu được

là 10,555 mgCE/g ± 0,057a Khi chúng ta tăng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lên 1/30 và 1/40 thì hàm lượng flavonoid toàn phần thu được tăng lên không đáng kể, sai số có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức xác suất 95% Vậy xét về hiệu quả kinh tế, chúng tôi chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 cho các thí nghiệm tiếp theo

3.6.3 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết

Với nguyên liệu là rễ cây An xoa, dung môi methanol 40%, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng flavonoid toàn phần thu được Các cường độ sóng siêu âm khảo sát là 15, 20, 25 và 30 kHz Các thông số kỹ thuật khác không thay đổi Kết quả ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong rễ cây An xoa được thể hiện ở hình 3.7

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các cường độ sóng siêu

âm chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần

Kết quả cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần trong rễ cây

An xoa thu được tăng dần theo cường độ sóng siêu âm và đạt giá trị cao nhất ở cường độ 25 kHz, tương ứng với giá trị thu được là 10,942 mgCE/g ± 0,054a Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng cường độ sóng siêu

âm thì hàm lượng flavonoid toàn phần thu được có xu hướng giảm Nguyên nhân của hiện tượng này là do dưới tác động của cường độ sóng siêu âm lớn làm cho một số flavonoid có cấu trúc không ổn định

bị biến tính, dẫn đến hàm lượng flavonoid toàn phần thu được có xu hướng giảm (bảng 3.7) Do đó, cường độ sóng siêu âm thích hợp cho quá trình trích ly flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa là 25 kHz

3.7 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TRÍCH LY FLAVONOID TOÀN PHẦN TỪ RỄ CÂY AN XOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐÁP ỨNG BỀ MẶT RSM

Các thí nghiệm ở mục 3.6 nhằm khảo sát ảnh hưởng của một

số yếu tố như thời gian, cường độ sóng siêu âm, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa dưới sự hỗ trợ của phương pháp siêu âm điện cực trong dung môi methanol 40% ở nhiệt độ 60ºC Kết quả đã xác định được các điều kiện tối ưu là: thời gian (50 phút), tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/20), cường độ sóng siêu âm (25 kHz) Tuy nhiên, đây chưa phải là điều kiện tối ưu nhất để thu được hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ cây

An xoa cao nhất Với mục đích tìm ra được các điều kiện tối ưu nhất cho quá trình chiết để thu được hàm lượng flavonoid toàn phần tối

đa, sau khi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến trích ly flavonoid toàn phần, chúng tiến hành tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt RSM theo mô hình Box- behnken bằng phần mềm Minitab 17 Các yếu tố đơn biến được chúng tôi sử dụng để thục hiện tối ưu hóa là thời gian chiết (X1), cường độ sóng siêu âm (X2) và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (X3) với các mức độ khoảng biến thiên tương ứng được trình bày ở bảng 3.8 với hàm lượng flavonoid toàn phần là hàm mục tiêu Phương trình toán học ứng với mô hình thí nghiệm Box- behnken như được trình bày ở phần phương pháp

Bảng 3.2 Nhân tố và các mức độ bố trí thí nghiệm theo mô hình Box-

Bảng 3.3 Kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa

thu được qua các thí nghiệm

T ỷ lệ nguyên

li ệu/dung môi (g/ml) (X 3 )

Hàm lượng flavonoid toàn ph ần (mgCE/g)

Bố trí thí nghiệm theo mô hình thí nghiệm Box- behnken với

12 thí nghiệm nhân tố với 3 thí nghiệm tại tâm Dịch chiết thu được

từ 15 thí nghiệm được sử dụng để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần theo mô tả của Phạm Hồng Ngọc Thúy và cs [23] Kết quả được trình bày ở bảng 3.9

Từ bảng 3.9 cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần thu được

từ rễ cây An xoa có giá trị cao nhất, dao động từ 10,529 mgCE/g ± 0,128 đến 10,689 mgCE/g ± 0,109 và không sai khác nhiều giữa 3 thí nghiệm Sự sai khác nhỏ này có thể là sai khác trong tiến hành thí nghiệm Các kết quả này được sử dụng để xử lý trên phần mềm Minitab 17, kết quả thể hiện ở bảng 3.10 cho thấy, các thành phần tham gia vào mô hình đều thể hiện ở mức độ ý nghĩa cao, hầu hết các giá trị p<0,05 Hai nhân tố tuyến tính (X1 và X3) và ba giá trị bậc 2