xây dựng phương pháp định lượng natri hyaluronat trong dung dịch thuốc nhỏ mắt bằng quang phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG VINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NATRI HYALURONAT TRONG DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MẮT BẰNG QUANG PHỔ VÀ SẮC KÝ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG VINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NATRI HYALURONAT TRONG DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MẮT BẰNG QUANG PHỔ VÀ

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG VINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NATRI HYALURONAT TRONG DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MẮT BẰNG QUANG PHỔ VÀ

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI – 2019

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

LỜI CẢM ƠN

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I 3

TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3

1.1.1 Công thức cấu tạo và đặc tính hóa lý của natri hyaluronat 3

1.1.2 Tác dụng của natri hyaluronat 4

1.1.3 Công thức bào chế của thuốc nhỏ mắt chứa SH 6

1.1.4 Công thức một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt chứa SH trên thị trường 8

1.1.5 Tình hình nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng natri hyaluronat…… 9

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 12

1.2.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS 12

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 15

CHƯƠNG II 22

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Dung môi, hóa chất 22

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 23

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.3.1 Phương pháp HPLC 24

2.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV - VIS 25

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 27

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 29

CHƯƠNG III 31

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31

3.1 KHẢO SÁT VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH 31

3.1.1 Sắc ký lọc gel (GFC) 31

3.1.2 Sắc ký pha đảo (RP – HPLC) 33

3.1.3 Quang phổ hấp thụ UV – VIS 38

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SH TRONG THUỐC NHỎ MẮT ESKAR TEAR 42

3.2.1 Sắc ký lọc gel (GFC) 42

3.2.2 Sắc ký pha đảo (RP – HPLC) 49

3.2.3 Quang phổ hấp thụ UV - VIS 55

3.3 ÁP DỤNG CÁC QUY TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG SH TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM DUNG DỊCH THUỐC NHỎ MẮT 59

3.3.1 Xác định hàm lượng SH bằng GFC 59

3.3.2 Xác định hàm lượng SH bằng RP - HPLC 61

CHƯƠNG IV 63

BÀN LUẬN 63

4.1 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV - VIS 63

4.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 63

4.3 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG SH TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM 66

4.4 KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG 66

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 68

KẾT LUẬN 68

ĐỀ XUẤT 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

Tiếng Việt 70

Tiếng Anh 70

Trang Web 72

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ana-lytical chemists cs: Cộng sự

chromato-graphy) ICH: Tổ chức hòa hợp quốc tế (international conference on

harmonisation)

inflamm-tory drugs)

PA: Tinh khiết dùng để phân tích (Purity analysis)

Quang phổ Quang phổ hấp thụ hấp thụ UV – VIS

RP - HPLC Sắc ký pha đảo (Reversed – phase high performance liquid

chromatography)

SEC: Sắc ký rây phân tử (Size exclusion chromatography)

TLTK: Tài liệu tham khảo

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số chế phẩm dung dịch thuốc nhỏ mắt trên thị trường 8

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch natri perclorat tới thời gian lưu và hệ số As của pic SH 36

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian Carbazol phản ứng đến độ hấp thụ của dung dịch chuẩn 39

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung dịch Carbazol phản ứng đến độ hấp thụ của dung dịch chuẩn 40

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống GFC 44

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính bằng GFC 45

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng bằng GFC 47

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ chính xác bằng GFC 48

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống RP - HPLC 51

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính bằng RP - HPLC 52

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ đúng bằng RP - HPLC 53

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ chính xác bằng RP - HPLC 55

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống quang phổ UV - VIS 56

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu bằng quang phổ UV – VIS 57

Bảng 3.15 Kết quả so sánh giá trị trung bình hàm lượng SH trong thuốc nhỏ mắt Eskar tears bằng GFC và RP – HPLC 58

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát hàm lượng SH bằng GFC 59

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát hàm lượng SH bằng RP - HPLC 61

Bảng 4.18 So sánh phương pháp xây dựng với phương pháp công bố 64

Bảng 4.19 Kết quả khảo sát định lượng SH trong một số chế phẩm bằng GFC và RP - HPLC 66

DANH MỤC HÌNH

Trang Hình 1.1 Cấu tạo phân tử của acid hyaluronic 3Hình 2.2 Cơ chế phản ứng trong quy trình định lượng SH bằng phương pháp quang phổ UV – VIS 26Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa pH pha động với hệ số kéo đuôi As của pic SH 31Hình 3.4 Phổ UV – VIS với detector DAD của pic SH tách bằng cột gel 32Hình 3.5 SKĐ của SH trong dung dịch mẫu chuẩn (a) và dung dịch mẫu thử (b) tách bằng phương pháp GFC 33Hình 3.6 SKĐ của natri hyaluronat khảo sát bằng cột C8 34Hình 3.7 SKĐ của natri hyaluronat khảo sát bằng cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) 35Hình 3.8 SKĐ của natri hyaluronat khảo sát bằng cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) với hệ pha động 1 và hệ pha động 2 36Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ pha động với hệ số

As của pic SH 36Hình 3.10 SKĐ của dung dịch mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b) sử dụng cột C18 38Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa thời gian phản ứng của Carbazol đến độ hấp thụ của dung dịch chuẩn 39Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa thể tích Carbazol phản ứng đến độ hấp thụ của dung dịch chuẩn 40Hình 3.13 SKĐ của dung dịch chuẩn (a), thử (b), thử thêm chuẩn (c) và placebo (d) trong GFC 44Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic SH bằng GFC 46Hình 3.15 SKĐ của dung dịch chuẩn (a), thử (b), thử thêm chuẩn (c) và

placebo (d) trong RP - HPLC 51Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic SH bằng RP - HPLC 53Hình 3.17 Sắc ký đồ Sanlein (a), Hylene (b) và Samca (c) trong GFC 60Hình 3.18 Sắc ký đồ Sanlein (a), Hylene (b) và Samca (c) trong RP - HPLC 62

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng natri hyaluronat trong dung dịch thuốc nhỏ mắt bằng quang phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự khích lệ từ phía gia đình, thầy

cô, đồng nghiệp, bạn bè và nhà trường

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh – người thầy đã tận tình dìu dắt chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

ThS Trần Thúy Hạnh – người đã tận tình chỉ bảo và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các anh chị em khoa Dược lý, ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Từ đáy lòng mình, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình thân yêu của tôi, cảm ơn những người bạn thân thiết đã khích lệ, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Với vốn kiến thức còn hạn chế của bản thân, chắc chắn luận văn còn nhiều thiếu sót Vì vậy, rất mong các thầy cô bỏ qua Tôi hy vọng sẽ nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô nhằm nâng cao kiến thức của bản thân và phục vụ tốt cho quá trình công tác của tôi sau này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 03 năm 2019

Nguyễn Thị Hồng Vinh

1

ĐẶT VẤN ĐỀ Natri hyaluronat (SH) là muối natri của acid hyaluronic, có bản chất là một glycosaminoglycan bao gồm nhiều phân tử disaccharid của D – glucuron-

ic acid và N – acetyl – D – Glucosamine liên kết với nhau [20],[24] SH được chiết xuất từ vi khuẩn và mào gà Trong cơ thể, SH được hình thành bởi nguyên bào sợi và được phân bố rộng rãi trong các mô liên kết, biểu mô và thần kinh Nồng độ SH trong cơ thể tăng cao trong trường hợp viêm hoạt dịch

và giảm sự dị hóa do suy thận [20]

Trong mỹ phẩm, SH giúp làm giảm nếp nhăn và tăng cường độ ẩm cho

da do có khả năng giữ nước Trong y học, SH được dùng làm thuốc bôi ngoài

để làm tăng khả năng hấp thu qua da của các hoạt chất phối hợp [15], dùng điều trị chứng đau trong thoái hóa khớp gối cho người dùng liệu pháp không dùng thuốc và các trường hợp dùng thuốc giảm đau thông thường khác không

có hiệu quả [5] Đặc biệt SH ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các bệnh

lý về mắt như phẫu thuật cấy ghép giác mạc, đục thủy tinh thể, tăng nhãn áp

và bong võng mạc, điều trị triệu chứng khô mắt, làm dịu và bôi trơn bề mặt mắt, tăng cường độ ẩm cho mắt…[15] Hiện nay, đã có một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt chứa SH đã được đăng ký lưu hành tại Việt Nam như: Hylene, Unihy, Salein …Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng các chế phẩm chứa SH, đặc biệt là chế phẩm thuốc nhỏ mắt còn gặp nhiều khó khăn do ảnh hưởng bởi

sự có mặt của các protein, enzym [21] Mặt khác do cấu trúc của SH là một polymer có phân tử lượng lớn nên việc chia tách các phân tử trong dung dịch gặp nhiều khó khăn hơn so với các hợp chất khác Xuất phát từ những lý do trên nhằm mục đích tìm ra phương pháp định lượng SH trong thuốc nhỏ mắt

có độ chính xác cao, ổn định và phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của nhiều phòng thí nghiệm nên chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng natri hyaluronat trong dung dịch thuốc nhỏ mắt bằng quang phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao “ Mục tiêu của đề tài bao gồm:

3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1 Công thức cấu tạo và đặc tính hóa lý của natri hyaluronat

Natri hyaluronat (hyaluronan) là muối natri của acid hyaluronic có công thức phân tử là (C14H20NNaO11)n [22, 24] HA thuộc nhóm glycosaminoglycan, mạch thẳng không phân nhánh bao gồm nhiều phân tử disaccharid lặp đi lặp lại với nhau Các disaccharid được tạo thành bởi các monosaccharid gồm D – glucuronic acid và N – acetyl – D – Glucosamine, các monosaccharid này được liên kết với nhau thông qua liên kết glucosid ở

vị trí β - (1→4) của phân tử D – glucuronic acid và vị trí β - (1→3) của N – acetyl – D – Glucosamine [18, 27] Cả hai loại đường đều liên quan đến cấu trúc không gian của glucose, trong cấu hình beta cho phép tất cả các nhóm cồng kềnh bao gồm: nhóm hydroxyl, nhóm carboxylate, và cacbon anomer nằm ở vị trí xích đạo thuận lợi về mặt kỹ thuật trong khi tất cả các nguyên tử hydro đều chiếm giữ vị trí ít thuận lợi hơn Do đó, cấu trúc của disaccharide

có năng lượng rất ổn định [18]

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử của acid hyaluronic Một chuỗi đại phân tử SH có trọng lượng phân tử khoảng 10 triệu Da chứa 25.000 đơn vị disaccharid, được liên kết với nhau bằng liên kết kỵ nước Các chuỗi polysaccharid thẳng, không phân nhánh và có cấu trúc xoắn

4

Các liên kết hydro nội phân tử có một vai trò lớn trong sự hình thành của

HA Trong dung dịch, các phân tử nước xung quanh HA hình thành các liên kết hydro khác Trong điều kiện sinh lý, HA với anion carboxyl có khả năng liên kết một lượng nước lớn vì vậy dung dịch HA 2% có thể liên kết 98% nước bằng cách tạo thành gel Chiều dài chuỗi polysaccharid và trọng lượng phân tử của HA rất khác nhau trong các mô khác nhau Trong các mô bình thường, một phân tử HA (10 triệu Da) có độ dày 1nm và chiều dài 25 µm Trong tử cung, HA có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 6 đến 12 triệu

Da Trọng lượng phân tử của HA là khoảng 7 triệu Da ở các khớp khỏe mạnh

SH tinh khiết khoảng từ 500.000 đến 3.900.000 [24] Dung dịch SH 0,5% trong nước có pH khoảng 5,0 đến 8,5 [23] Khi pH < 3, các nhóm carboxyl bị proton hóa và HA tạo thành một loại gel không tan trong nước [17] SH là chất duy nhất thuộc nhóm glycosaminoglycan không có nhóm sulfat [20, 27]

HA là một phân tử rất không ổn định và nhạy cảm với nhiệt Nếu dung dịch

HA được đun nóng lên đến 100ºC thì liên kết giữa các chuỗi sẽ bị hỏng do đó

Mw và độ nhớt của dung dịch giảm HA bị thủy phân bởi enzyme hyaluronidase [17, 18]

SH là bột hay hạt kết tinh màu trắng hoặc nhiều sợi Tan ít trong nước, tan nhiều hơn khi đun nóng, không tan trong ethanol và acetone Nhiệt độ nóng chảy trên 209oC [2, 3, 24]

1.1.2 Tác dụng của natri hyaluronat

Năm 1934, lần đẩu tiên Karl Meyer và John Palmer đã phân lập HA từ thủy tinh thể của mắt bò Năm 1942, Endre Balazs xin cấp bằng sáng chế để

sử dụng HA thay thế cho lòng trắng trứng trong các sản phẩm bánh Đến cuối những năm 1950, ứng dụng y tế đầu tiên của hyaluronan cho con người dùng

để thay thế thủy tinh thể trong phẫu thuật mắt [18] Cuối những năm 1970 đầu những năm 1980, SH được tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng

5

trong điều trị viêm xương khớp trên ngựa và người với thương phẩm là tin và Hylartin Vertused Năm 1980, biệt dược đầu tiên được bán ra ngoài thị trường là Healon do công ty Endre Alexander Balazs phát triển và được sản xuất bởi công ty Dược AB ở Thụy Điển Năm 1986, SH ở dạng thuốc tiêm dùng để điều trị viêm xương khớp đầu gối với biệt dược là Hyalart/Hyalgan của Fidia (Ý) được ra đời [29], từ đó đến nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành Dược, nhiều biệt dược của SH đã ra đời với nhiều dạng bào chế khác nhau như: gel, kem, thuốc viên, thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt

Hylar-Trong cơ thể, HA được phân bố trong các mô mềm và dịch nội bào bao gồm thủy dịch và thủy tinh dịch, hoạt dịch Nó là một thành phần cơ bản của chất nền hoặc chất kết dính xung quanh tế bào [19] Do đó tác dụng của SH cũng ngày càng được mở rộng trên nhiều cơ quan khác nhau cụ thể như sau:

Tác dụng trên mắt: SH được dùng hỗ trợ trong phẫu thuật đục thủy tinh thể, phẫu thuật khúc xạ (kính nội nhãn), phẫu thuật ghép giác mạc và tăng nhãn áp [15] Một dung dịch nhớt của SH được sử dụng trong quá trình phẫu thuật mắt bằng cách cho dung dịch này trước hoặc sau một cái khoang thông qua một ống thông nhỏ hoặc một đầu kim để các mô mềm có thể tách ra trong quá trình phẫu thuật nhằm tránh bị tổn thương Dung dịch nhỏ mắt SH 0,1% hoặc 0,2% thông thường được sử dụng trong bệnh khô mắt, một nghiên cứu cho thấy dung dịch SH này có tác dụng làm giảm nhẹ các triệu chứng và tăng

ổn định màng nước mắt so với dung dịch muối – dung dịch placebo Tuy nhiên, ở một nghiên cứu khác lại không chứng minh được tính vượt trội hơn của dung dịch SH với dung dịch muối, mặc dù nghiên cứu cũng cho thấy rằng

SH có thể đóng vai trò trong việc duy trì thể trạng tốt của biểu mô giác mạc [19]

Tác dụng trên xương khớp: Trong bệnh thoái hóa khớp, nồng độ và kích thước của HA tự nhiên trong dịch khớp giảm, để điều trị bệnh này người

ta tiêm vào khớp gối dung dịch nhớt HA hoặc dẫn chất của chúng, dung dịch

6

này đóng vai trò như một dung dịch thẩm thấu tạm thời thay thế hoạt dịch, liều dùng thay đổi, tuy nhiên thường tiêm liều 20 – 25 mg một lần 1 tuần, trong vòng 5 tuần hoặc 30 mg một tuần trong 3 – 4 tuần Liệu trình điều trị thông thường không nên nhắc lại trong vòng 6 tháng, tác dụng giảm đau có thể kéo dài từ 1 đến 6 tháng nhưng có thể kèm theo việc tăng viêm khớp trong thời gian ngắn [5, 15] Một vài nghiên cứu đã cho thấy việc tiêm dung dịch thẩm thấu nhớt có thể hiệu quả đối với bệnh nhân không thể uống NSAIDs hoặc thường xuyên tiêm corticosteroid vào khớp và những người không phù hợp trong việc thay khớp mặc dù cần phải xem xét tới sự thay đổi trong đáp ứng lâm sàng giữa các sản phẩm cũng như sự thay đổi, đánh giá và thời gian điều trị [19]

Tác dụng làm lành vết thương: SH có thể kích thích sự di chuyển và tăng sinh tế bào biểu mô giác mạc dẫn đến làm lành nhanh chóng v`ết thương giác mạc Kết quả từ nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng SH làm tăng tỷ lệ làm lành, giảm diện tích vết thương và cải thiện tổn thương bề mặt nhãn cầu [28] Tác dụng thúc đẩy quá trình làm lành vết thương của HA còn được dùng tại chỗ để chữa trị các tổn thương ở niêm mạc miệng, một màng mỏng chứa

SH và Carmellose được sử dụng để ngăn cản sự bám dính sau phẫu thuật [19]

Tác dụng trên bàng quang: SH được đưa vào bàng quang để thay thế tạm thời lớp glycosaminoglycan trong bàng quang để chữa trị các triệu chứng của viêm kẽ bọng đái [19]

Tác dụng trên da: HA được sử dụng làm mờ đi các nếp nhăn trên mặt [15,19, 20], tiêm dưới da nhằm điều chỉnh thiếu hụt thể tích liên quan đến tuổi tác ở má, nâng cơ mặt giữa ở người lớn trên 21 tuổi [15] Ngoài ra, HA còn được kết hợp với diclofenac ở dạng thuốc gel dùng bôi ngoài để chữa bệnh dày sừng quang hóa [19]

1.1.3 Công thức bào chế của thuốc nhỏ mắt chứa SH

Một số thành phần chính của thuốc nhỏ mắt bao gồm:

7

Làm tăng độ nhớt của các thuốc nhỏ mắt bằng các polymer tan trong nước có tác dụng cản trở tốc độ rút và rửa trôi liều thuốc đã nhỏ vào mắt, kéo dài thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc, giữ nước, tăng cường độ nhớt và duy trì độ ẩm trên bề mặt nhãn cầu, tránh tình trạng khô mắt [2] Ngoài ra, các chất làm tăng độ nhớt còn có tác dụng thúc đẩy quá trình lành vết thương biểu

mô giác mạc và phòng ngừa bệnh khô giác mạc Một số chất tăng độ nhớt thường gặp là: Hydroxypropyl methylcellulose (HPMC), carboxymethylcellu-lose (CMC), polyethylen glycol, propylen glycol, hyaluronic acid, carbomer, glycerin…[2]

Chất sát khuẩn

Mặc dù nước mắt có men Lysozym có tác dụng sát khuẩn nhẹ, nhưng khả năng ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn từ môi trường vào mắt cũng rất hạn chế Nếu nhỏ vào mắt một chế phẩm thuốc nhỏ mắt không vô khuẩn thì có thể gây ra nhiều nhiễm khuẩn nghiêm trọng ở mắt Để đảm bảo an toàn trong sử dụng, các thuốc nhỏ mắt phải là các chế phẩm vô khuẩn, tuy nhiên do thuốc nhỏ mắt thường được đóng gói với thể tích dùng nhiều lần mới hết một đơn vị đóng gói Chính do cách sử dụng đặc biệt này nên nguy cơ thuốc nhỏ mắt bị nhiễm khuẩn từ môi trường sau mỗi lần nhỏ thuốc rất cao Để giữ cho thuốc luôn vô khuẩn, trong thành phần thuốc nhỏ mắt bao giờ cũng có thêm một hay nhiều chất sát khuẩn (trừ các trường hợp chống chỉ định), chất sát khuẩn trong thuốc

có tác dụng diệt ngay các vi sinh vật ngẫu nhiên rơi vào thuốc sau mỗi lần nhỏ thuốc [2] Xét theo sự có mặt của chất sát khuẩn thì nước mắt nhân tạo có 3 loại: Nước mắt nhân tạo có chất sát khuẩn, nước mắt nhân tạo có chất sát khuẩn có thể tự phân hủy thành các chất không độc với bề mặt nhãn cầu khi nhỏ vào mắt và nước mắt nhân tạo không có chất sát khuẩn Các chất sát khuẩn thường gặp trong nước mắt nhân tạo là: Benzalkonium chloride (BAC) 0,005% - 0,01% (là chất bảo quản rất thông dụng)

8

Chất điều chỉnh pH: Có hai hệ hay được sử dụng trong nước mắt nhân tạo chứa SH là hê đệm phosphate hay còn gọi là hệ đệm Sorensen được pha từ muối natri dihydro phosphate và dinatri hydro phosphate hoặc được pha từ muối natri dihydro phosphate và natri hydroxyd theo những tỷ lệ khác nhau

để tạo ra các dung dịch đệm có pH khác nhau (pH có thể thay đổi từ 5,9 – 8,0)

và hệ đệm citric – citrat được pha từ acid citric và muối citrat hoặc từ acid tric và natri hydroxyd với tỷ lệ khác nhau Riêng với hệ đệm citric – citrat ngoài tác dụng điều chỉnh pH, hệ đệm này còn có tác dụng khóa các ion kim loại nặng nên thích hợp cho các thuốc nhỏ mắt có dược chất dễ bị oxy hóa [2]

ci-Chất đẳng trương: Các chất đẳng trương thường dùng trong dung dịch thuốc nhỏ mắt là: natri clorid, kali clorid [2]

Chất chống oxy hóa: Trong nước mắt nhân tạo chất chống oxy hóa hay được dùng là muối dinatri edetat với nồng độ 0,01 – 0,3% Dinatri edetat có tác dụng khóa các ion kim loại hóa trị 2 hay 3 dưới dạng phức chelat, làm mất tác dụng xúc tác của các ion này đối với quá trình oxy hóa dược chất Ngoài

ra, sự phối hợp edetat trong thuốc nhỏ mắt còn có tác dụng tăng cường hiệu quả sát khuẩn của các chất sát khuẩn như benzalkonium clorid [2]

1.1.4 Công thức một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt chứa SH trên thị trường

Hiện nay, trên thị trường dược phẩm nước ta đang lưu hành một số chế phẩm chứa SH với công thức bào chế khác nhau:

Bảng 1.1 Một số chế phẩm dung dịch thuốc nhỏ mắt trên thị trường

xuất

Hàm lượng

Tá dược

0.1

Santen pharmaceut-ical co.,Ltd

(Nhật Bản)

1,0 mg/ml

Acid Ɛ- Aminocaproic, dinatri edetat hydrat, propylen glycol, natri clorid, benzalkonium clo-rid, natri hydroxyd, acid hy-

Acid Ɛ- Aminocaproic, dinatri edetat, benzalkonium clorid, di-natri hydrophosphat, natri dihy-drophosphat, natri clorid, kali clorid, natri hydroxyd, acid hy-drocloric và nước vô khuẩn Thành phần tá dược chủ yếu có trong thuốc nhỏ mắt chứa SH là các hệ đệm phosphate, hoặc hệ đệm citric- citrate, chất chống oxy hóa edetat, chất sát khuẩn benzalkionium clorid, các chất đẳng trương natri clorid, kali clorid

vì vậy trong phương pháp định lượng SH phải lựa chọn phương pháp, hóa chất, dung môi không tương tác với các thành phần có trong chế phẩm

Hiện nay, một số công ty Dược Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu phát triển sản phẩm nước mắt nhân tạo chứa SH như công ty Cổ phần Traphaco đang nghiên cứu xây dựng công thức thuốc nhỏ mắt Samca với hàm lượng hoạt chất SH là 5mg SH/5ml, tá dược bao gồm: Benzalkonium clorid, natri clorid, Acid boric, natri borat, dinatri edetat, borneol, menthol, ethanol 96%, nước cất) Thuốc nhỏ mắt Eskar tear do công ty Cổ phần Dược khoa nghiên cứu với công thức: hoạt chất: SH (5mg/5ml), tá dược: Acid Ɛ- Aminocaproic, dinatri edetat, acid boric, natri borat, benzalkonium clorid, natri clorid, kali clorid, glycerin, natri hydroxyd hoặc acid hydrochloric (để điều chỉnh pH về 6,0 – 8,0) và nước tinh khiết vừa đủ

1.1.5 Tình hình nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng natri

hyaluronat

Tình hình nghiên cứu trong nước

Võ Hoài Bắc và cộng sự đã xác định hàm lượng acid Hyaluronic trong một số phế phụ liệu ba loại cá theo phương pháp của Reissig et al (1955) HA

10

tách chiết từ các nguồn khác nhau được thủy phân bằng hyaluronidase Dịch màu sau phản ứng được đo quang phổ ở bước sóng 585 nm [8]

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Dược điển Anh 2018 [22], dược điển Châu Âu 2016 [23], Dược điển Hàn Quốc X năm 2012 [25] chỉ có chuyên luận nguyên liệu SH, phương pháp định lượng SH bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS, sản phẩm tạo thành sau khi phản ứng với Carbazol ở bước sóng 530 nm

Dược điển Nhật XVII năm 2016 [24] định lượng SH trong chuyên luận nguyên liệu và thuốc tiêm cũng thông qua phản ứng giữa acid D - glucuronic với carbazol, sản phẩm tạo thành đo độ hấp thụ ở bước sóng 530 nm Tuy nhiên, trong chuyên luận thuốc nhỏ mắt thì sử dụng phương pháp GFC với cột kích thước 300 x 7,8 mm, cột nhồi porous polymethacrylat, thể tích tiêm 20

µl, detector UV ở 210 nm, nhiệt độ cột 40oC, pha động là 32,3g Na2

SO-4.10H2O trong 1000 ml nước, tốc độ dòng điều chỉnh để thời gian lưu của SH khoảng 5 phút

Trong Dược điển Mỹ 41 năm 2018 chưa có chuyên luận nào về SH [26]

Năm 2017, Zanelle viktor đã nghiên cứu định lượng SH bằng cột

amoni acetat 0,02 M Mẫu thử được pha trong pha động để được nồng độ 1mg/ml [27] Ngoài ra, tác giả cũng đưa ra phương pháp định lượng SH bằng phương pháp RP - HPLC sử dụng cột Agilent Zorbax C8-RX (150 x 2,1mm

gra-dient trong 22,5 phút, mẫu thử cũng được pha trong dung dịch ACN : H2O (40:60) với amoni acetat 0,02 M để được nồng độ 2mg/ml, thể tích tiêm 30 µl [27]

Năm 2015, Kaisa Altaonen và cộng sự cũng sử dụng cột Zorbax eclipse XDB-C18 (4,6nm x 25mm, 5µm) tốc độ dòng 1ml/phút, chương trình chạy

Năm 2014, Lianhui Chen , Shaopu Liu , Hongqun Luo and Xiaoli Hu

đã đưa ra phương pháp định lượng SH bằng cách cho SH phản ứng với các chất nhuộm thuộc nhóm bisphenylnaphthylmethan như night blue (NB), Victoria blue B (VBB) and Victoria blue 4R (VB4R) trong môi trường acid yếu để tạo ra các phức hợp làm thay đổi độ hấp thụ ở bước sóng 612 nm (NB), 616 nm (VBB), 585 nm (VB4R) từ đó xác định được lượng SH trong mẫu thử Nồng độ dung dịch mẫu thử đưa vào thử nghiệm là 0,5~2,0 mg/l (NB) 0,1~2,5 mg/l (VBB), 0,1~0,6 mg/l (VB4R) [12]

Năm 2013, K Ruckmani và cộng sự đã đưa ra phương pháp xác định bằng cột BioSep SEC S2000, 300 mm x 7,8 mm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, bước sóng 205 nm, thể tích tiêm 10 µL, pha động: KH2PO4 0,05 M điều chỉnh

pH 7,0 bằng dung dịch KOH 10 % [21]

Năm 1993, N Gassier và cộng sự đã xác định các hợp chất noglycans không có nhóm sulfat bằng cột trao đổi ion âm Hypersil APS (4,6 x

glycosami-250 mm, kích thước hạt 5 µm) nối với cột Hypersil ODS RP - C18, tốc độ

điều chỉnh pH 3,0, detector: 232 nm [13]

Năm 1962, T Bitter và H.M.Muir tiến hành định lượng hyaluronat bằng cách cho phản ứng với natri tetraborat trong acid sulfuric đặc, sau đó cho phản ứng tiếp với carbazol, sản phẩm tạo thành đo quang ở bước sóng 530 nm

12

[9]

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đang lưu hành một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt chứa SH của các công ty Dược nước ngoài và một số công ty Dược phẩm trong nước cũng bắt đầu nghiên cứu sản xuất dung dịch thuốc nhỏ mắt chứa SH Vì vậy, để đánh giá chất lượng sản phẩm trong phát triển công thức, hoàn thiện hồ sơ đăng ký thuốc đồng thời giám sát chất lượng sản phẩm trên thị trường đòi hỏi cần có phương pháp định lượng SH có độ chính xác cao, độ nhạy tốt, đơn giản, thời gian phân tích ngắn, tốn ít hóa chất dung môi, và phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của nhiều phòng thí nghiệm Qua tham khảo các kết quả nghiên cứu đã công bố, chúng tôi tiến hành khảo sát phương pháp định lượng SH bằng kỹ thuật sắc ký (bao gồm GFC và RP - HPLC sử dụng cột C8 và C18) và kỹ thuật đo quang sản phẩm tạo thành sau khi phản ứng với Carbazol

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

1.2.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS

Nguyên tắc

chiều dày l (cm) Sau khi bị dung dịch hấp thụ, cường độ chùm tia còn lại là I

Độ truyền qua T được tính theo công thức:

T = I/I0 x 100 (%)

Độ hấp thụ A được tính bằng công thức: A = lg (1/T) = lg (I0/I)

Giả sử tồn tại một môi trường đồng nhất có chiều dày là l cm chứa chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng Cho tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ I0 đi qua môi trường đó và tia sáng này không bị phản xạ, khúc xạ

và tán xạ Sau khi bị môi trường hấp thụ, dòng ánh sáng có cường độ I thì lg (I0/I) = ε.l.C

Trong đó: ε là hệ số hấp thụ chỉ phụ thuộc vào bản chất chất màu và

13

bước sóng ánh sáng hấp thụ Nếu nồng độ C tính bằng mol/lít thì ε là hệ số hấp thụ phân tử gam Nếu C tính bằng nồng độ % thì ε là hệ số hấp thụ % Như vậy độ hấp thụ quang của dung dịch hấp thụ màu tỷ lệ thuận với chiều dày của tầng hấp thụ màu và nồng độ chất màu có trong tầng đó

Điều kiện áp dụng định luật lambert – Berr

- Ánh sáng phải đơn sắc: Khi bước sóng thay đổi các hệ số hấp thụ cũng thay đổi Độ đơn sắc càng cao càng tốt

- Khoảng nồng độ phải thích hợp: Do nhiều nguyên nhân vật lý (sự phản xạ,

sự khuếch tán ánh sang), hóa học (sự phân ly, ảnh hưởng của lực ion) mà định luật lambert – Berr chỉ đúng trong một giới hạn nồng độ Vì vậy, khi xây dựng phương pháp định lượng cần phải khảo sát kỹ để tìm khoảng nồng

độ đó

- Dung dịch phải trong suốt: Để hạn chế các hiện tượng quang học khác

- Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của ánh sáng UV – VIS [1, 3]

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ UV – VIS

- Các yếu tố thuộc về cấu trúc phân tử của chất tan: ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hấp thụ UV – VIS của phân tử Các yếu tố ảnh hưởng của cấu trúc lên độ hấp thụ của phân tử có thể là các hiệu ứng cảm ứng, liên hợp và cả hiệu ứng không gian Cấu trúc phân tử chất tan có nhóm mang màu (alken, dien, carbonyl đơn giản, hợp chất enol và polyenon, dẫn chất thế hai lần của benzene, dẫn chất carbonyl thơm, dẫn chất thơm đa vòng, và các dị vònglàm cho phân tử có thể hấp thụ các bức xạ có bước sóng dài hơn trong UV – VIS (>200nm) Các nhóm trợ màu ít có khả năng hấp thụ UV – VIS nhưng lại có thể làm ảnh hưởng tới cường độ hấp thụ, nhóm trợ màu thường là các nguyên

tử hay nhóm mà có nhiều cặp electron tự do như: -OH, -OR, -NR2, các halogen…Sự thay đổi cấu trúc phân tử của chất tan có thể làm dịch chuyển cực đại hấp thụ Ngoài ra, vị trí không gian của các liên kết bội đặc biệt là các

14

hệ liên hợp cũng ảnh hưởng nhiều đến sự hấp thụ phân tử, và cũng có thể làm thay đổi vị trí cực đại hấp thụ

- Các yếu tố thuộc về môi trường:

+ Các dung môi được dùng để đo phổ UV – VIS có những bước sóng giới hạn (λcutout) khác nhau mà dưới bước sóng đó dung môi hấp thụ đa phần các bức xạ chiếu qua nó Do đó, khi chọn dung môi để chuẩn bị dung dịch đo phổ UV – VIS cần phải tính đến khả năng hấp thụ của chính dung môi Sử dụng các dung môi khác nhau có thể làm sai khác vị trí cực đại trên phổ hấp thụ của các chất

+ pH: pH của môi trường có thể gây hỗ biến làm thay đổi cấu trúc phân

tử do đó kéo theo sự thay đổi khả năng hấp thu của chất đó

+ Nồng độ và các tương tác khác trong dung dịch: Khả năng hấp thụ

UV – VIS của dung dịch chỉ tỷ lệ tuyến tính với nồng độ trong một khoảng thích hợp, do đó cần nghiên cứu xác định khoảng nồng độ mà khả năng hấp thụ phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ

- Các yếu tố thuộc về thiết bị: Với một chất ở các bước sóng khác nhau các

hệ số hấp thụ thường khác nhau, vì vậy khả năng tạo chùm tia đơn sắc của thiết bị ảnh hưởng đến độ hấp thụ của dung dịch, bước sóng càng đơn sắc thì định luật càng đúng

- Các hiện tượng quang học khác: Nếu dung dịch không đồng nhất về mặt quang học thì sẽ xảy ra các hiện tượng quang học khác như phản xạ, khuếch tán, tán xạ … do đó để hạn chế các hiện tượng quang học trên dung dịch đo phải trong suốt [1]

Ứng dụng của kỹ thuật quang phổ hấp thụ UV - VIS

Định tính: Dựa vào bước sóng cực đại (λ max) và cực tiểu (λ min) hoặc tỷ lệ mật độ quang giữa cực đại và cực tiểu [1]

Định lượng: Dựa vào độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử để xác định hàm lượng của hoạt chất có trong mẫu thử Có nhiều phương pháp để xác định

15

hàm lượng chất phân tích bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ Tuy nhiên, trong phạm vị đề tài này xin chỉ trình bày đến ứng dụng định lượng dung dịch có một thành phần bằng kỹ thuật đường chuẩn Để xây dựng đường chuẩn người

ta chuẩn bị một số dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, thường 5 - 8 dung dịch chuẩn Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn và vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch chuẩn Từ độ hấp thụ của dung dịch thử, dựa vào phương trình đường chuẩn thiết lập được

có thể tính được nồng độ của chất phân tích trong dung dịch [1]

Đo so sánh với một dung dịch chuẩn là trường hợp riêng của đường chuẩn: xác định hằng số K từ một dung dịch Với việc xác định mật độ quang của dung dịch thử chưa biết nồng độ và dung dịch chuẩn đã biết nồng độ trong điều kiện thỏa mãn định luật lambert – Berr thì mật độ quang tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch nên

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ (pha thuận) Pha tĩnh là các chất đã được liên kết với một nhóm chức khác ta có sắc ký pha liên kết (pha thuận, pha đảo, trao đổi ion) Nếu pha tĩnh là gel thì

ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử Cùng với pha tĩnh, để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột cần có một pha động

16

Nếu mẫu phân tích gồm các chất A, B, C …vào cột tách thì xảy ra 3 tương tác: tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh (lực giữ chất phân tích trên cột), tương tác giữa chất phân tích với pha động (lực kéo nó ra khỏi cột), tương tác giữa pha động và pha tĩnh Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại Do tương tác giữa pha tĩnh và pha động là yếu tố ảnh hưởng không lớn nên các chất phân tích khác nhau thì lực tương tác giữa chất phân tích với pha động và pha tĩnh khác nhau nên kết quả là các chất di chuyển trong cột với tốc

độ khác nhau và tách hẳn nhau ra khi ra khỏi cột [3]

+ Sắc ký pha thuận (NP-HPLC): Các nhóm OH của silicagel được thay

pha động không phân cực hoặc ít phân cực hơn so với pha tĩnh

+ Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC): Nhóm OH của silicagel được thay thế bởi các nhóm chức ion hóa như: Sulfonic acid, tetramonium… hoặc trao đổi ion Sự tách ở đây nhờ sự trao đổi ion giữa mẫu phân tích và các ion pha tĩnh Các tính chất của cân bằng trao đổi ion quyết định khẳ năng tách hỗn hợp Sắc ký rây phân tử (SEC): Sự tách sắc ký dựa theo kích thước của phân tử các chất phân tích được phân bố khác nhau vào trong các lỗ xốp của pha tĩnh Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui sâu bên trong lỗ xốp nên được rửa giải

ra sau và ngược lại Loại này được dùng để tách các chất có khối lượng phân

tử lớn (M>2000) và không có khả năng phân ly thành ion như các protein, acid béo…Pha tĩnh trong sắc ký rây phân tử là gel polysaccharid: cellulose, dextran… để tạo lỗ xốp có kích thước khác nhau, người ta dùng các chất khác nhau để liên kết các chuỗi polysaccarid Loại pha tĩnh khác cũng hay được sử dụng trong sắc ký rây phân tử là polyacrylamide: các chuỗi polyacrylamide được liên kết với nhau bằng phân tử N, N’- methylenbisacrylamid [1] Trong SEC người ta phân biệt:

+ Sắc ký thấm gel (GPC): là sắc ký dùng gel để tách các polymer hòa tan trong dung môi Dùng pha động kỵ nước

+ Sắc ký lọc gel (GFC): Sắc ký dùng gel để tách các polymer sinh học Pha động ưa nước [1]

Một số đại lượng đặc trưng của sắc ký

- Thời gian lưu (tR): là thời gian cần để chất đó di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua

Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và

B Thường chọn α dao động từ 1,05 – 2 Nếu α quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài

- Độ phân giải (Rs): là đại lượng biểu thị khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký:

Độ phân giải giữa 2 pic được tính theo công thức:

Trong đó: RS: độ phân giải

(tR)1, (tR)2: thời gian lưu chất 1, 2

W1, W2: lần lượt là độ rộng pic 1, 2 ở các đáy pic

W1/2 1, W1/2 2: lần lượt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

RS ≥ 1,5 thì 2 pic coi như tách được hoàn toàn

- Hệ số bất đối xứng T: cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc ký

đồ T được tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao pic

19

T nằm trong khoảng từ 0,8 – 2,0 là chấp nhận được

- Số đĩa lý thuyết (N): Mỗi cột sắc ký có thể được coi gồm nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý thuyết Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký

Trong đó: W là chiều rộng pic ở đáy pic

W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic [1, 3, 6] Ứng dụng của kỹ thuật HPLC

Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phuơng pháp thêm chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

20

Trong luận văn này phương pháp chuẩn ngoại được chọn sử dụng Đây

là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùng điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm

Chuẩn hóa 1 điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

CX = CS ( ) Trong đó: CX: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

CS: nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn

SX: diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu thử

SS: diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C) Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính theo 2 cách:

- Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó

- Xây dựng đường hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định

S  a C  b S: Diện tích pic

21

a: Độ dốc của đường chuẩn

b: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung

22

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thử (dùng trong xây dựng và thẩm định phương pháp): Thuốc nhỏ mắt Eskar tear: lô sản xuất: 280417 do Công ty dược phẩm Dược khoa nghiên cứu phát triển sản phẩm với công thức bào chế như sau:

Mẫu placebo: Dung dịch có thành phần giống công thức bào chế nhưng không

23

- Hóa chất tinh khiết phân tích:

Kali dihydrophosphat PA- Scharlau (Tây Ban Nha), lô: 15051902, HD: 01/2021

Natri perclorat PA – Merck (Đức), lô: A0300164206

Kali hydroxyd PA – Scharlau (Tây Ban Nha), lô: 93240, HD: 07/2021 Carbazole PA – Sigma (Mỹ), lô: C5132-STBD3610V

Acid sulfuric PA – Merck (Đức), lô: 16480603, HD: 07/2020 (Đức) Natri tetraborat PA – Scharlau (Tây Ban Nha), lô: 73177, HD: 06/2019 Cồn tuyệt đối PA - Công ty cổ phần Hóa dược Việt Nam, lô: 0022, HD: 27/08/2023

Nước cất hai lần – VKNTTW

- Chất chuẩn: sử dụng làm chất đối chiếu

+ Natri hyaluronat RS: nguồn gốc: Châu Âu, số lô: 2, hàm lượng 100,0% (tính theo nguyên trạng), Catalog code: S0780000

+ D – Glucuronic acid ᵧ lacton: nguồn gốc: Sigma (Mỹ), Số lô: BCBM5358V, hàm lượng: 99,9% (nguyên trạng)

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị

Sử dụng các thiết bị của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã được hiệu chuẩn theo quy định của ISO/IEC 17025

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC – 20A detector DAD (Nhật)

 Máy sắc ký lỏng Merck – Hitachi detector DAD (Nhật)

 Máy sắc ký lỏng Acquity Arc (Water) detector DAD (Mỹ)

 Máy quang phổ UV – VIS Shimadzu 2600 (Nhật)

24

 Máy lắc xoáy Vortex mixer (Velp scientifica - Ý )

 Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45µm (Đức)

 Bể ổn nhiệt Labec (Đức)

 Cân kỹ thuật Sartorius TE 412 (Đức)

 Cân phân tích Mettler Toledo MS 105 (Thụy Sỹ) (độ chính xác 0,01 mg )

 Cân phân tích Mettler Toledo XPE 26 (Thụy Sỹ) (độ chính xác 0,001 mg )

 Cân kỹ thuật MRC BWLC – 06 – B1 (Israel)

 Bể cách thủy ổn nhiệt WNB14 – Memmert (Đức)

 Máy đo pH Metrohm 691 (Thụy Sỹ)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Lựa chọn cột sắc ký

25

Dựa trên tính chất của SH và qua tham khảo tài liệu nghiên cứu [13, 21,

24, 27] về phương pháp định lượng SH Chúng tôi lựa chọn phương pháp RP

- HPLC và GFC để khảo sát định lượng SH trong thuốc nhỏ mắt Eskar tear

Tiến hành khảo sát trên các cột C18, và C8 có kích thước hạt nhồi là 5

µm, với chiều dài cột là 25 cm, và cột sắc ký TSK – G3000SWXL (7,8 mm 

Lựa chọn bước sóng phát hiện

Quét phổ UV – VIS của các hợp chất nghiên cứu để xác định bước sóng thích hợp nhất mà tại đó các chất phân tích đều có độ hấp thụ đủ lớn và tín hiệu ổn định

2.3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV - VIS

Quy trình định lượng

Qua tham khảo chuyên luận nguyên liệu và thuốc tiêm natri hyaluronat trong

Giai đoạn 2: Tiếp tục cho phản ứng với carbazol ở nhiệt độ 100oC trong khoảng thời gian nhất định sau đó làm lạnh Tiến hành đo quang dung dịch tạo thành sau phản ứng ở bước sóng 530 nm Từ độ hấp thụ của dung dịch chất đối chiếu, dung dịch mẫu thử xác định được nồng độ SH trong chế phẩm

Cơ chế của phản ứng

Cơ chế của quá trình định lượng SH được trình bày trong hình 2.2 [16]

Hình 2.2 Cơ chế phản ứng trong quy trình định lượng SH bằng phương pháp

quang phổ UV – VIS Giai đoạn 1, trong môi trường natri tetraborat – acid sulfuric ở nhiệt độ 100oC

SH và D – glucuronic ᵧ lacton sẽ tạo thành chất A Giai đoạn 2, chất A sẽ phản ứng với Carbazol tạo hợp chất có màu hồng tím – chất B Chất này hấp thụ quang ở bước sóng 530 nm Như vậy, giai đoạn phản ứng với Carbazol đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hàm lượng SH trong chế phẩm và phụ thuộc vào nhiều yếu tố vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều

Chất A

Chất B