nghiên cứu đặc điểm thực vật và so sánh thành phần hóa học bằng phươngpháp sắc ký lớp mỏng của một số loài kim ngân thu hái tại huyện quản bạ, tỉnh hà giang

Phân tích mối quan hệ giữa các mẫu Kim ngân trong nghiên cứu dựa trên đặc điểm hình thái và thành phần hoá học .... Xây dựng cây phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái của các mẫu Kim

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Người hướng dẫn:

TS Hoàng Qu ỳnh Hoa Nơi thực hiện:

B ộ môn Thực vật

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS Hoàng Quỳnh Hoa, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điềukiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này cũng nhưquá trình tham gia nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Thực Vật Cô chính là người đã độngviên và săn sóc tôi, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nhất có thể

Bên cạnh đó, trong quá trình thực hiện khóa luận tôi còn nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo của nhiều thầy cô, anh, chị, em khác Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâusắc tới:

PGS.TS Trần Văn Ơn, người thầy đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thu mẫutại huyện Quản Bạ, Hà Giang xa xôi Thầy đã tận tình chỉ bảo, góp ý và truyền kinhnghiệm quý báu cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này

ThS Nghiêm Đức Trọng, người thầy đã tận tình chỉ bảo cho tôi cách chụp ảnh,thu mẫu, cũng như những yếu tố cần chú ý khi đi thực địa đa dạng sinh học Thầy đã địnhhướng và giám định 16 mẫu nghiên cứu góp phần tăng tính khoa học và độ tin cậy chokhóa luận này

DS Phạm Thị Linh Giang, DS Lê Thiên Kim và tất cả các kỹ thuật viên Bộmôn Thực Vật đã luôn giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình, cho tôi trong suốt thời gian tham gianghiên cứu khoa học cũng như thực hiện khóa luận này

Chú Dương Phong Thương, chú Dỉ Xuân Cường, anh Lý Tà Dèn, anh Lý Tà

Giàng, anh Lý Tà Đành, anh Lý Sáng Phong, anh Nguyễn Hữu Bằng, anh Phạm Thế

Dự cùng các anh chị khóa trên và các em sinh viên Phạm Thị Vân, Trần Hương Ly,

Trần Đức Định, Bùi Đức Sơn, Kiều Hoài cùng các bạn sinh viên nghiên cứu khoa học,

thực hiện khóa luận tại Bộ môn Thực vật đã luôn hỗ trợ, động viên, giúp đỡ tôi thực hiệnkhóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng các thầy cô Trường Đại học Dược

Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm qua, cảm ơn gia đình, bạn bè luôn

là chỗ dựa và động viên tôi mỗi khi khó khăn

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2019

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Các nghiên cứu về thực vật của chi Kim ngân (Lonicera L.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Kim ngân (Lonicera L.) 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Kim ngân (Lonicera L.) 2

1.1.3 Phân bố chi Kim Ngân (Lonicera L.) 2

1.2 Tính đa dạng của các loài trong chi Lonicera L ở Việt Nam 3

1.2.1 Kim ngân trung bộ (Lonicera annamensis Fukuoka) 3

1.2.2 Kim ngân nhọn (Lonicera acuminata Wall in Roxb.) 3

1.2.3 Kim ngân rừng (Lonicera bournei Hemsl.) 3

1.2.4 Kim ngân lông (Lonicera cambodiana Pierre ex Danguy) 4

1.2.5 Kim ngân lẫn, Kim ngân núi (Lonicera confusa DC.) 4

1.2.6 Kim ngân dại, Kim ngân vòi nhám (Lonicera dasystyla Rehd.) 4

1.2.7 Kim ngân hay Nhẫn đông (Lonicera japonica Thunb.) 4

1.2.8 Kim ngân quả to, Kim ngân Hildebrandia (Lonicera hildebrandia Coll et Hemsl.) 4

1.2.9 Kim ngân lá mốc, Kim ngân mặt dưới mốc (Lonicera hypoglauca Miq.) 5

1.2.10 Kim ngân hoa to (Lonicera macrantha (D Don) Spreng.) 5

1.2.11 Kim ngân cựa (Lonicera calcarata Hemsl.) 5

1.2.12 Kim ngân mạng (Lonicera reticulata Champ.) 5

1.3 Thành phần hóa học của chi Kim ngân (Lonicera L.) 6

1.3.1 Nhóm flavonoid 6

1.3.2 Các acid phenolic carboxylic và các ester 6

1.3.3 Các iridoid glycosid 7

1.3.4 Phytosterol 7

1.3.5 Các saponin 7

1.3.6 Tinh dầu 8

Tác dụng sinh học của Kim ngân 8

1.4.4 Tác dụng trên chuyển hóa chất béo và đường 9

1.4.5 Độc tính 9

1.5 Công dụng, cách dụng của Kim ngân 9

1.5.1 Công năng - chủ trị 9

1.5.2 Cách dùng 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 11

2.1.1 Nguyên liệu 11

2.1.2 Thiết bị, hóa chất 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.1 Nghiên cứu thực vật 13

2.2.2 Nghiên cứu hóa học 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 13

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 14

2.3.3 Phương pháp xử lý kết quả 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 17

3.1 Nghiên cứu về thực vật 17

3.1.1 Đặc điểm hình thái của các mẫu Kim ngân nghiên cứu 17

3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của các mẫu Kim ngân 22

3.2 Nghiên cứu hóa học 27

3.2.1 Định tính thành phần hoá học bằng sắc ký lớp mỏng 27

3.3 Phân tích mối quan hệ giữa các mẫu Kim ngân trong nghiên cứu dựa trên đặc điểm hình thái và thành phần hoá học 35

3.3.1 Xây dựng cây phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái của các mẫu Kim ngân nghiên cứu 35

3.2.2 Xây dựng cây phân loại dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng của các mẫu Kim ngân cuộng và mẫu Kim ngân chuẩn 36

BÀN LUẬN 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CH3COOH Acid acetic DĐVN V Dược điển Việt Nam V EtOAc Ethyl acetat

CGA Acid chlorogenic HCOOH Acid formic HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu Kim ngân nghiên cứu 11 Bảng 3.1 Đặc điểm khác biệt vi phẫu thân giữa các loài Kim ngân nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Đặc điểm khác biệt vi phẫu lá giữa các loài Kim ngân nghiên cứu 25 Bảng 3.3 Sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ Kim ngân cuộng và Kim ngân chuẩn (****) 30 Bảng 3.4 Sự xuất hiện của các vết trên sắc ký đồ Kim ngân hoa (*****) 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức phân tử của Luteolin 6

Hình 1.2 Một số hợp chất được xác định trong Kim ngân 7

Hình 1.3 Công thức phân tử của acid chlorogenic 7

Hình 1.4 Công thức phân tử của Loganin 7

Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái của QB01 18

Hình 3.2: Một số đặc điểm hình thái của QB15 (Lonicrea confusa DC.) 19

Hình 3.3 Một số đặc điểm hình thái của QB16 (Lonicera hypoglauca Miq.) 20

Hình 3.4 Một số đặc điểm hình thái của QB07 (Lonicera macrantha (D Don) Spreng.) .22

Hình 3.5 Đặc điểm giải phẫu thân của các loài Kim ngân nghiên cứu 24

Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu lá của các loài Kim ngân nghiên cứu 26

Hình 3.7 Sắc ký đồ của các dịch chiết kim ngân cuộng dưới đèn UV 254nm; 27

Hình 3.8 Sắc ký đồ của các dịch chiết kim ngân cuộng dưới đèn UV 366nm; 28

Hình 3.9 Sắc ký đồ của các dịch chiết kim ngân cuộng dưới đèn UV 366nm sau khi phun thuốc thử vanilin/ acid sulfuric 28

Hình 3.10 Sắc ký đồ của các dịch chiết kim ngân cuộng dưới ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử vanilin/ acid sulfuric 29

Hình 3.11 Sắc ký đồ của dịch chiết Kim ngân hoa dưới UV 254 (A), UV 366nm (B), VIS (C) 32

Hình 3.12 Kết quả chồng phổ sắc ký HPTLC Kim ngân cuộng của nhóm 1 (L reticulata Champ.) và Kim ngân chuẩn (L japonica Thunb.) 33

Hình 3.13 Kết quả chồng phổ sắc ký HPTLC Kim ngân cuộng của nhóm 2 (L confusa DC ) và Kim ngân chuẩn (L japonica Thunb.) 34

Hình 3.14 Kết quả chồng phổ sắc ký HPTLC Kim ngân cuộng của nhóm 3 (L hypoglauca Miq.) và Kim ngân chuẩn (L japonica Thunb.) 34

Hình 3.15 Kết quả chồng phổ sắc ký HPTLC Kim ngân cuộng của nhóm 4 35

(L macrantha (D Don) Spreng.) và Kim ngân chuẩn (L japonica Thunb.) 35

Hình 3.16 Mối quan hệ gần gũi dựa trên đặc điểm hình thái của cành mang lá của 16 mẫu Kim ngân nghiên cứu và Kim ngân chuẩn (*) 36

Hình 3 17 Mối quan hệ gần gũi về thành phần hóa học giữa các mẫu Kim ngân nghiên cứu và Kim ngân chuẩn 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kim ngân là một vị thuốc được sử dụng theo kinh nghiệm trong dân gian để chữa mụn nhọt, rôm sảy, sởi, đậu, tả lỵ, giang mai Một số nơi, Kim ngân được trồng làm cảnh và dùng pha trà thay nước chè [12] Ở Trung Quốc, Kim ngân được dùng như một

vị thuốc hạ sốt, làm dễ tiêu và trị lỵ Hoa Kim ngân phơi khô dùng để lợi tiểu [5], [12]

Trong tự nhiên, chi Kim ngân (Lonicera L.) rất đa dạng với khoảng 180 loài trên

thế giới và khoảng 10 loài đã được phát hiện tại Việt Nam [35] Trong đó, Dược điểnViệt Nam V quy định Kim ngân hoa và Kim ngân cuộng là dược liệu được khai thác từ

loài Lonicera japonica Thunb có thể thay thế bằng một trong các loài sau: Lonicera

dasystyla Rehd., Lonicera confusa DC., Lonicera cambodiana Pierre ex Danguy [4]

Tuy nhiên, trên thực tế, Kim ngân được người dân sử dụng từ cành và hoa của một sốloài thuộc chi này

Huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang với địa hình núi đá vôi có độ cao trung bình 700- 1600m so với mực nước biển có độ đa dạng sinh học khá cao với 361 loài, thuộc 103 họ

và 249 chi Trong đó, có phân bố một số loài cây thuốc như Bách vàng, Kim ngân, Cốttoái bổ, Thảo quả, Quế, v.v [42] Kim ngân được người dân địa phương sử dụng làmthuốc trị mụn, nhọt, rôm sẩy hoặc dùng phối hợp trong bài thuốc xương khớp Tuy nhiên, người dân không phân biệt các loài mà đều gọi chung là Kim ngân và sử dụng lẫn lộn

mà chưa có những căn cứ khoa học cụ thể

Xuất phát từ thực tế đó, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và so sánh thành

phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng của một số loài Kim ngân thu háitại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang” được thực hiện với các mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm giải phẫu và giám định tên khoa học các mẫuKim ngân thu được ở huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang

2 Định tính thành phần hóa học từ thân, lá và hoa của các mẫu nghiên cứu bằngphương pháp sắc ký lớp mỏng

3 Phân tích mối quan hệ gần gũi về hình thái và thành phần hóa học giữa các mẫuKim ngân nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Các nghiên cứu về thực vật của chi Kim ngân (Lonicera L.)

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Kim ngân (Lonicera L.)

Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009)[16], chi Kim ngân được sắp xếp theo thứ tự phân loại như sau:

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Phân Lớp Hoa Hồng (Rosidae)

Bộ Tục Đoạn (Dipsacales)

Họ Kim ngân (Caprifoliaceae)

Chi Kim ngân (Lonicera L.)

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Kim ngân (Lonicera L.)

Cây bụi đứng hay bụi trườn, đôi khi là dạng leo, thường xanh Cành rỗng với lõimàu trắng hoặc nâu, có chồi ngủ đông với 1 hoặc vài cặp lá vảy Lá mọc đối, hiếm khimọc vòng; nguyên, hiếm khi xẻ răng cưa; lá kèm ở giữa cuống lá vắng hoặc hiếm khiphát triển tốt Cụm hoa dạng chùm mọc ở nách lá hoặc đầu cành, dày đặc hoặc thưa thớt,đôi khi cụm hoa dạng xim 1-, 2-, hoặc 3 hoa Cụm hoa dạng xim, đôi khi có cuống, đôikhi hình thành dạng hoa đầu Đài 5, hàn liền Cánh hoa màu trắng, vàng, đỏ, tím đỏ,thường xuyên thay đổi màu sắc sau khi nở hoa tùy loài, hình ống, được mở rộng dần 5thùy, chia hai môi, môi trên 4 thùy, môi dưới đơn; ống dài hay ngắn Nhị hoa 5, bao phấn đính lưng Bầu 2 hoặc 3 (-5 ngăn); có lông hoặc nhẵn Quả mọng, màu đỏ, đenhoặc màu xanh, đôi khi có phủ phấn trắng, thỉnh thoảng còn giữ lại lá bắc con cùng vớiquả Hạt từ 1 đến rất nhiều [6], [7], [10], [12], [35]

1.1.3 Phân bố chi Kim Ngân (Lonicera L.)

Trên thế giới, chi Lonicera L có khoảng 180 loài, phân bố ở châu Á, châu Âu và

Bắc Mỹ, trong đó Trung Quốc có độ đa dạng cao nhất với hơn 100 loài Các loài phổ

biến thuộc chi này gồm: Lonicera periclymenum L (Kim ngân châu Âu), Lonicera

Lonicera sempervirens L [31]

Ở Việt Nam, chi Lonicera L có khoảng 10 loài, phân bố chủ yếu trong rừng ở các

Lạng Sơn, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Tây (cũ), Hòa Bình, Thái Bình, Ninh Bình, ThừaThiên Huế, Kon Tum, Phú Yên… [6], [7], [10], [12]

1.2 Tính đa dạng của các loài trong chi Lonicera L ở Việt Nam

Theo các tài liệu về thực vật, ở Việt Nam có khoảng 12 loài thuộc chi Kim ngân

đã được xác định [1], [2], [3], [6], [7], [8], [9], [10], [12], [15] bao gồm:

· Kim ngân trung bộ (Lonicera annamensis Fukuoka)

· Kim ngân nhọn (Lonicera acuminata Wall in Roxb.)

· Kim ngân rừng (Lonicera bournei Hemsl.)

· Kim ngân lông (Lonicera cambodiana Pierre ex Danguy.)

· Kim ngân lẫn, Kim ngân núi (Lonicera confusa DC.)

· Kim ngân dại, Kim ngân vòi nhám (Lonicera dasystyla Rehd.)

· Kim ngân, Nhẫn đông (Lonicera japonica Thunb.)

· Kim ngân quả to, Kim 3 ngân Hildebrandia (Lonicera hildebrandia Coll et

Hemsl.)

· Kim ngân mốc (Lonicera hypoglauca Miq.)

· Kim ngân hoa to, Kim ngân lông (Lonicera macrantha (D Don) Spreng.)

· Kim ngân cựa (Lonicera calcarata Hemsl.)

· Kim ngân mạng (Lonicera reticulata Champ.)

1.2.1 Kim ngân trung bộ (Lonicera annamensis Fukuoka)

Cây leo cao 5-6 m Lá mọc đối; phiến xoan tròn dài đến tròn dài, to 4-8 x 2-4 cm, gốc cắt ngang hay hơi lõm, ngọn có mũi, gân phụ 3-5 cặp, không lông, cuống 5-7 mm Cụm hoa ở nách lá; cuống 4-17 mm, không lông, tím tím, lá bắc có lông Đài có 5 thùycao 2 mm có lông, tràng hoa dài 7-7,5 cm, không lông ở mặt ngoài, môi dài 2 cm Bầukhông lông, 3 ô, cao 2-2,5 mm [10]

1.2.2 Kim ngân nhọn (Lonicera acuminata Wall in Roxb.)

Cây leo, thân và lá có lông màu nâu Lá có phiến bầu dục, gốc tròn hay hình tim,ngọn có mũi, gân lồi ở mặt dưới; cuống 5-7 mm Cụm hoa ngắn ở ngọn nhánh; hoa vàng

có sọc đỏ hay cam; tràng hoa có ống, có 5 thùy đứng, thon, mặt ngoài có lông, dài 2,5cm; nhị 5; quả mọng [6], [10]

1.2.3 Kim ngân rừng (Lonicera bournei Hemsl.)

trên, nhạt hơn ở mặt dưới, gân và mép lá có lông Cụm hoa xim ở ngọn các nhánh Hoamàu vàng, ống mảnh và dài; 5 cánh hoa mà 2 cái hợp thành một môi [6]

1.2.4 Kim ngân lông (Lonicera cambodiana Pierre ex Danguy)

Cây leo, thân quấn, nhiều khi cao tới 9 m Cành có nhiều lông xù xì gồm lông đơn,cứng, hơi xám và lông tuyến có hình trái xoan, phiến lá dài 5-12 cm, rộng 3-6 cm, tròn hay gần hình tim ở gốc, nhọn ở đầu; mép nguyên, hơi cuộn xuống phía dưới, nhẵn ở mặttrên, có lông xù xì ở mặt dưới, nhất là trên các gân Cụm hoa xim hai hoa ở nách các lágần ngọn, có lông xù xì [7]

1.2.5 Kim ngân lẫn, Kim ngân núi (Lonicera confusa DC.)

Cây leo 2-4 m Cành có lông hơi xám Lá có lông, phiến lá hình trái xoan, dài 4-6

cm, rộng 1,5-3 cm, tròn hay gần hình tim ở gốc, nhọn hay gần nhọn ở đầu, nhẵn 4 ở mặttrên, có lông mặt dưới Cụm hoa xim hai hoa ở nách các lá ở ngọn Hoa dài 1,6-2 cm, lúc đầu trắng sau chuyển sang màu vàng Ra hoa tháng 6-9, quả tháng 10-11 [6], [12]

1.2.6 Kim ngân dại, Kim ngân vòi nhám (Lonicera dasystyla Rehd.)

Cây leo, thân quấn Các nhánh non có lông rồi nhẵn, màu nâu đỏ Lá mọc đối, cóphiến mỏng, hình trái xoan - ngọn giáo dài 2-8 cm, rộng 1-4 cm, tròn hay hình tim ởgốc, nhọn thành mũi ở đầu, mặt trên nhẵn, mặt dưới nhạt và hơi có lông mịn, với 3-4 cặp gân phụ Cuống lá hơi hẹp có rãnh ở trên, dài 2-8 cm Hoa trắng, thành xim 2 hoa ởnách các lá ở ngọn, cuống có lông Quả đơn, nhẵn, hình cầu, đường kính 8 mm Ra hoavào tháng 4 [6]

1.2.7 Kim ngân hay Nhẫn đông (Lonicera japonica Thunb.)

Cây leo, thân quấn Cành non có lông mịn, thân già xoắn Lá nguyên, mọc đối.Phiến lá hình trứng, dài 4-7 cm, rộng 2-4 cm, cả hai mặt lá đều có lông mịn Hoa mọctừng đôi một ở các nách lá gần ngọn Khi mới nở, cánh hoa màu trắng, sau chuyển sang vàng nhạt, mùi thơm nhẹ 5 cánh hoa dính liền nhau thành ống ở phía dưới, miệng ống

có 2 môi 5 nhị thò ra ngoài cánh hoa Bầu dưới Quả hình trứng, dài chừng 5 mm, màu đen Mùa hoa tháng 3-4, quả tháng 6-8 Cây mọc phổ biến ở các tỉnh miền Bắc Ngoài

ra còn được trồng ở một số nơi [6], [10], [12]

1.2.8 Kim ngân quả to, Kim ngân Hildebrandia (Lonicera hildebrandia

khô; cuống 2 cm Cụm hoa 2 hoa; cuống chung dài 6-8 mm, không lông; lá đài nhỏ;tràng to, màu vàng hay da cam, có ống dài 3,5- 4 cm, môi dưới to gần bằng môi trên,môi trên 2,5-3 cm; nhị 5, ngắn hơn tràng, bầu 3 ô, không lông Quả hình trái xoan, cao2,5 cm [6], [10]

1.2.9 Kim ngân lá mốc, Kim ngân mặt dưới mốc (Lonicera hypoglauca Miq.)

Cây leo, khá mảnh Thân non, cuống, mặt dưới lá có lông mịn dày vàng Lá cóphiến hình trái xoan, dài 3-10 cm, rộng 2,5-3,5 cm; gốc tròn hay hơi lõm, chóp lá tù,mặt dưới mốc, có lông mịn, gân ở gốc 3-4; cuống 1 cm Cụm hoa xim 2 hoa dài 3,5-4,5 cm; hoa màu trắng rồi chuyển sang vàng; bầu và lá dài, có lông mịn Tràng có lông dài

ở mặt ngoài, ống tràng 2,5 cm, môi dài 1,5 cm, môi dưới hẹp Quả dài 7-8 mm, màu đen[7] [10]

1.2.10 Kim ngân hoa to (Lonicera macrantha (D Don) Spreng.)

Cây leo, quấn to Nhánh có lông cứng vàng Lá có phiến bầu dục, dài 4-11 cm, rộng 3-4,5 cm, có lông Cụm hoa ở nách lá, dạng xim co, có cuống, mang 2-3 hoa Hoa

to, màu vàng; đài có 5 răng cưa nhỏ; tràng cao 5-6 cm, môi trên có thùy, môi dưới 1;bầu 3 ô; quả mọng to 7-8 mm, màu đen Ra hoa tháng 3 [12]

1.2.11 Kim ngân cựa (Lonicera calcarata Hemsl.)

Cây leo, trườn, nhẵn bóng Nụ mùa đông thường có những cặp vảy rộng Phần phụthường đính kèm Cuống lá 1-2 cm; phiến lá hình trứng hoặc hình elip tới hình thuôn,8-13 × 2,5-8 cm, có lông, gốc lá tròn đến nhọn mở rộng, ngọn lá nhọn Cụm hoa mọc ởnách lá; cuống cong lên, dài 1,7-3 cm; lá bắc hợp nhất thành 2 cặp, đỉnh tròn hoặc nhọnhình mũi mác… Hai bầu cạnh nhau thường liền nhau hơn một nửa Tràng hoa hai màu,lúc đầu màu trắng, sau màu vàng đến đỏ cam, dài khoảng 3 cm; ống tràng dài khoảng

10 mm, hình phễu, cựa ở phía gốc dài khoảng 12 mm, cong về phía trước và thường ẩntrong các lá bắc Bầu 5 ô, hai bầu cạnh nhau thường liền nhau hơn một nửa Quả mọng,màu vàng sang đỏ, đường kính khoảng 1,5 cm, bao bọc bởi các lá bắc tồn tại cùng quả

Ra hoa vào tháng 5, ra quả vào tháng 6-7 hằng năm [43] Ở Việt Nam, Kim ngân cựa đãđược phát hiện phân bố ở vùng núi đá vôi, ở độ cao khoảng 1500 m tại Phó Bảng, ĐồngVăn, tỉnh Hà Giang và Tả Phìn, Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu [15]

1.2.12 Kim ngân mạng (Lonicera reticulata Champ.)

gân hình mạng nổi lên rõ rệt Gốc lá hình tim, mép lá có lông cong theo mép lá Mặttrên lá có rải rác lông trắng, mịn, ngắn; mặt dưới lông trắng, mềm Ngọn lá nhọn Cuống

lá dài 3-5 mm, phủ lông trắng mịn Hoa không đều lưỡng tính, lúc mới nở màu trắng,sau chuyển dần sang màu vàng, có mùi thơm nhẹ Tràng hàn liền thành ống ở phía dướidài 3-4 cm; miệng ống chia 2 môi Tỷ lệ chiều dài ống tràng/ môi là: 1/1 Bộ nhị 5, rời,đều Bầu dưới 3-4 ô, hình trụ hơi bầu dục, đường kính khoảng 1 mm

● Phân bố: Huyện Quản Bạ, Hà Giang [8], [9]

Trong số các loài trên, loài Lonicera japonica Thunb (Nhẫn đông) đã được

nghiên cứu sâu về cả đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng sinh học và kỹ

thuật trồng tại Việt Nam [4], [11], [12], [44] Loài Lonicera dasystyla Rehd.,

Lonicera confusa DC., Lonicera macrantha (D Don) Spreng và Lonicera reticulata

Champ được nghiên cứu về đặc điểm thực vật, định tính thành phần hóa học bằngphương pháp sắc ký lớp mỏng [8], [9] Còn lại các loài Kim ngân phân bố tại ViệtNam mới dừng lại ở mô tả đặc điểm hình thái

1.3 Thành phần hóa học của chi Kim ngân (Lonicera L.)

1.3.1 Nhóm flavonoid

Năm 1961, một số nhà nghiên cứu Nhật Bản cho biết trong Kim ngân có mộtglucozit gọi là lonicerin có cấu tạo luteolin – 7 – rhamnose [12] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Công thức phân tử của Luteolin

Các nghiên cứu khoa học hiện đại, nhiều flavon đã được phân lập: lonicerin (luteolin-7-o-rhamnoglucoside), loniceraflavon [34]; rutin, hyperoside, quercetin- 3-o-β-d-glucoside, luteolin-7-o-β-d-glucoside, lonicerin, tricin-7-o-β-d- glucoside, luteolin, quercetin, diosmetin và cupressuflavone [27]; luteolin-7-O-β-galactoside, tetratriacontane [26]; luteolin(3’, 4’, 5,7-tetrahydroxyflavon) [37] (Hình 1.2)

Lonicerin Luteolin – 7- O - glucoside

Hình 1.2 Một số hợp chất được xác định trong Kim ngân

1.3.2 Các acid phenolic carboxylic và các ester

Trong Kim ngân có chứa acid cholorogenic và các đồng phân acidisochlorogenic a,b,c [34], acid caffeic, acid 3-O-caffeoylquinic, acid methyl ester, 3,5-di-O- caffeoylquinic, acid 3,4-di-O-caffeoylquinic, acid 3-O-caffeoylquinic và butyl ester [27] (Hình 1.3)

Hình 1.3 Công thức phân tử của acid chlorogenic

1.3.3 Các iridoid glycosid

Ngoài ra, một số iridoid glycosid cũng được tìm thấy trong Kim ngân như:Loganin, secoxyloganin, secologanin dimethylacetate, vogeloside [34], secoxyloganin, 7- epi-vogeloside, sweroside, dimethyl-secoxyloganoside, centauroside and secoxyloganin 7-butyl ester [27], serinosecologanin and threoninosecologanin [36]

Loganin

Hình 1.4 Công thức phân tử của Loganin

1.3.4 Các saponin

Các saponin đã được phân lập từ Kim ngân: Hederagenin-mono-, di-, tri-, tetraglycosid có các mạch đường như glucose, rhamnose và arabinose, acid oleanolicmono-, di, tri, tetraglycosid có các mạch đường như glucose, rhamnose và arabinose(dipsacoside B, loniceroside A, B, C; macranthoside A, B…) [23], [39]

Hình 1.5 Công thức phân tử của Hederagenin glycosides;

R1, R2 = 2 – 3 phân tử đường

1.3.5 Tinh dầu

Các nghiên cứu đã xác định thành phần hóa học của tinh dầu hoa Kim ngân

(16.31%), caryophyllene oxide (11.15%), linalool (8.61%), p-cymene (7.43%), hexadecanoic acid (6.39%), eugenol (6.13%), geraniol (5.01%), trans-linalool oxide (3.75%), globulol (2.34%), pentadecanoic acid (2.25%), veridiflorol (1.83%), benzyl alcohol (1.63%) and phenylethyl alcohol (1.25%), citronellyl acetate (0,97%), geranylacetone (0,92%), hexahydrofarnesyl acetone (0,87%), a-cadinol (0,85%), axit tetradecanoic(0,85%), dodecanal (0,83%), aromadendrene (0,82%) và 1,8-cineole (0,81%) [17], acid palmitic, acid linoleic [25]

1.4 Tác dụng sinh học của Kim ngân

1.4.1 Tác dụng kháng khuẩn và kháng virus

Nước sắc hoa Kim ngân có tác dụng mạnh đối với tụ cầu khuẩn, vi khuẩn thươnghàn, trùng lỵ Shiga Nước sắc có tác dụng mạnh hơn các dạng bào chế khác Năm 1950, Lưu Quốc Thanh (Trung Hoa tân y học báo) đã báo cáo dùng nước sắc cô đặc 100% của

hoa Kim Ngân có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với Salmonella enterica typhi A,B,

Vibrio cholerae, Streptococcus pyogenes, Shigella, E.coli, Staphynococcus aureus,

khuẩn đáng chú ý chống lại Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, B cereus,

Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, S typhimurium, Enterobacter aerogenes

và Escherichia coli Tuy nhiên, Pseudomonas aeruginosa và E coli khác chủng không

có ảnh hưởng [17]

Tác dụng kháng virus của Kim ngân thể hiện trên HIV [33], adenovirus, hepatitis

B virus [32], Influenza virus (H1N1, H3N2) [40]

1.4.2 Tác dụng chống viêm và chống oxy hoá

Năm 2002, dịch chiết flavonoid từ Kim ngân hoa đã được nghiên cứu có tác dụngchống viêm tốt [8] Năm 2010, nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng, các chất được phân lập

từ L japonica L có tác dụng ức chế 5-LOX (yếu tố tổng hợp leukotriene – tham gia

1.4.4 Tác dụng trên chuyển hóa chất béo và đường

Kim ngân có tác dụng tăng cường chuyển hóa chất béo [2] Dịch chiết methanol

từ nụ hoa L japonica L đã được nghiên cứu có tác dụng ức chế men α-glucosidase ruột

ở chuột, vì vậy có tác dụng làm giảm đường huyết sau ăn [20]

1.4.5 Độc tính

Chuột nhắt trắng sau khi được cho uống nước sắc kim ngân liên tục 7 ngày với liềugấp 150 lần liều điều trị cho người vẫn sống bình thường, giải phẫu các bộ phận khôngthấy có thay đổi gì đặc biệt [12]

Theo [5], [12], một số người uống Kim ngân bị tiêu chảy, chỉ cần giảm liều hoặcngừng uống là hết Những người tỳ vị hư hàn không thực nhiệt hoặc mồ hôi ra nhiềukhông nên dùng

1.5 Công dụng, cách dụng của Kim ngân

1.5.1 Công năng - chủ trị

Theo Y học cổ truyền, Kim ngân là dược liệu có vị ngọt, đắng, tính hàn Quy kinh:

độc, nhọt vú, nhọt trong ruột, dị ứng, mẩn ngứa, rôm sẩy Phối hợp với Bồ công anh,Cúc hoa, Sài đất tạo giác thích

· Thanh nhiệt giải biểu: dùng trong các trường hợp ngoại cảm phong nhiệt, ôn nhiệt

sơ khởi (bệnh sốt nóng ở thời kỳ đầu), thường phối hợp với Liên kiều, Bạc hà, Trúcdiệp, Cát cánh

· Thanh thấp nhiệt ở vị tràng: dùng chữa lỵ, phối hợp với Hoàng liên, rau sam…

· Giải độc sát khuẩn: dùng trong bệnh sưng đau hầu họng, viêm amidan, đau mắt

đỏ, viêm tuyến vú, viêm não, phối hợp Hoàng liên, Hoàng cầm, Bồ công anh, Hạ khôthảo

· Lương huyết chỉ huyết: Kim ngân hoa sao vàng sém cạnh, chữa đi ngoài ra máu

1.5.2 Cách dùng

Bộ phận dùng làm thuốc của Kim ngân là: Hoa (Kim ngân hoa), Thân, cành, lá(Kim ngân cuộng) Có thể dùng riêng vị Kim ngân hay phối hợp với nhiều vị thuốc khác dưới dạng thuốc sắc, hay thuốc cao hay rượu thuốc

Một số đơn thuốc có Kim ngân:

· Thuốc K1 (Đỗ Tất Lợi, 1960) chữa mụn nhọt mẩn ngứa, một số trường hợp dịứng: Kim ngân: 6g (nếu là hoa) hoặc 12g (nếu là cành và lá), nước 100 ml, sắc còn10ml, thêm đường vào cho đủ ngọt (chừng 4g) Đóng vào ống hàn kín, hấp tiệt trùng đểbảo quản Nếu dùng ngay thì không cần đóng ống và chỉ cần đun sôi giữ sôi 15 phút đếnnửa giờ là uống được Người lớn: ngày uống 2 – 4 liều trên (2 – 4 ống); trẻ em từ 1 đến

Kiêng kỵ: Những người ở thể hư hàn, hoặc ở trường hợp có mụn nhọt đã vỡ loétkhông nên dùng

Lưu ý: Kim ngân đằng thanh nhiệt giải độc kém Kim ngân hoa mà có tác dụng lưu

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu nghiên cứu về thực vật và thành phần hoá học được thu hái tại một số địađiểm thuộc các xã: Quyết Tiến, Quản Bạ, Thanh Vân, Tùng Vài và thị trấn Tam Sơnthuộc huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang Các mẫu nghiên cứu được kí hiệu lần lượt từQB01 đến QB16 Trong đó, chỉ 4 mẫu Kim ngân QB01, QB14, QB15, QB16 đã có hoa

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu Kim ngân nghiên cứu

Kí hiệu Ngày thu

QB01 24/02/2019 Nhà Lý Tà Đành, thôn Nặm Đăm, xã Quản Bạ, huyện Quản

Kí hiệu Ngày thu

QB11 03/04/2019 Vách núi ven con đường mòn gần Cổng trời Quản Bạ, xã

Quản Bạ, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang

QB12 03/04/2019 Vách núi ven con đường mòn gần Cổng trời Quản Bạ, xã

Quản Bạ, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang

QB13 03/04/2019 Vách núi ven con đường mòn gần Cổng trời Quản Bạ, xã

Quản Bạ, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang

QB14 18/04/2019 Vách núi ven con đường mòn gần Cổng trời Quản Bạ, xã

Quản Bạ, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang

QB15 18/04/2019 Nhà văn hóa thôn Nặm Đăm, xã Quản Bạ, huyện Quản Bạ,

tỉnh Hà Giang QB16 07/05/2019 Xã Tùng Vài, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang Các mẫu đã được làm tiêu bản và lưu trữ tại Phòng tiêu bản cây thuốc Trường Đạihọc Dược Hà Nội (HNIP) Mã số tiêu bản ký hiệu trong Phụ lục 1

Nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học là cành, lá và hoa (nếu có) của 16 mẫu

Kim ngân trên đã được sấy khô ở nhiệt độ 55-60oC, sau đó bảo quản trong túi kín trong túi PE, để nơi khô ráo

Kim ngân so sánh đạt theo tiêu chuẩn DĐVN V là Lonicera japonica Thunb

được thu tại thôn Năm Giai, xã Tràng Lương, thị xã Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh; được ký hiệu: QN và được giám định tên khoa học bởi chuyên gia thực vật Mã số tiêubản HINP/18586/19 (Phụ lục 1)

2.1.2 Thiết bị, hóa chất

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon, máy ảnh Canon IXY Digiatal 3000IS

- Bộ dụng cụ phân tích hoa, kính lúp soi nổi kết nối màn hình chụp trực tiếp

- Dụng cụ cắt vi phẫu, kéo, thước

- Kính hiển vi Lecica

- Cân kỹ thuật điện tử Satorious TE 412

- Dụng cụ thủy tinh: pipet, cốc có mỏ, ống đong, ống nghiệm, bình chạy sắc ký…

- Điện thoại chụp ảnh

- Bảo quản mẫu: Cồn ethanol 70 %

- Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu: Javen, cloral hydrat, acid acetic, xanh metylen, đỏson phèn, glycerin

- Nghiên cứu hóa học: methanol, butyl acetat, ethyl acetat, acid formic, acid acetic, acid sulfuric đặc, vanilin, ethanol, nước và chất chuẩn acid chlorogenic (CGA)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái, phân loại và giám định tên khoa học 16 mẫu Kim ngân thu được

- Mô tả đặc điểm vi phẫu thân và lá của các loài Kim ngân trong nghiên cứu

2.2.2 Nghiên cứu hóa học

- Khảo sát hệ dung môi pha động để tiến hành sắc ký lớp mỏng với dịch chiết cành,

lá của 16 mẫu và dịch chiết hoa của 4 mẫu Kim ngân có hoa

- Định tính thành phần hóa học của cành, lá và hoa (nếu có) của các mẫu Kim ngân thu được bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

2.2.3 Phân tích mối quan hệ giữa các mẫu Kim ngân trong nghiên cứu dựa trên đặc điểm hình thái và thành phần hoá học

- Xây dựng cây phân loại hình thái các mẫu Kim ngân thu thập được tại Quản Bạ,

Đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu được nghiên cứu theo phương pháp

mô tả phân tích [13] Các đặc điểm được mô tả bao gồm: dạng sống, thân, lá, hoa Các đặc điểm hình thái được chụp ảnh qua hệ thống tích hợp với kính lúp soi nổi và máy

So sánh, đối chiếu đặc điểm hình thái của từng nhóm mẫu đã phân loại với các bản

mô tả và khoá phân loại chi Lonicera L trong các tài liệu thực vật [6], [10], [29],[30],

[38] để giám định tên khoa học của các mẫu/nhóm mẫu nghiên cứu

Thân và lá của các được cắt, tẩy và nhuộm kép theo phương pháp làm tiêu bản vi học thực vật [13] Các tiêu bản được soi qua kính hiển vi Lecica, chụp ảnh bằng máyảnh Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu được quan sát, phân tích và mô tả bằng hình ảnh và văn bản chi tiết

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Mẫu Kim ngân đã bảo quản khô được xay nhỏ để chiết với dung môi thích hợp

Ø Đối với mẫu Kim ngân cuộng (Toàn bộ mẫu nghiên cứu và QN): Lấy 0,5 g bộtdược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 10 ml methanol vào bình nón, đậykín, lắc đều khoảng 5 phút Sau đó, tiến hành siêu âm bình nón có chứa dược liệu trêntrong 40 phút, để nguội, lọc lấy dịch đem ly tâm và tiến hành chạy sắc ký

Ø Đối với mẫu Kim ngân hoa (Các mẫu QB01, QB14, QB15, QB16): Tiến hànhtương tự như trên với 0,2 g bột dược liệu và 5 ml methanol (TT)

Cân 8,36 mg acid chlorogenic trong cốc có mỏ, hòa tan và tráng 3 lần bằngmethanol, cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung methanol tới vạch Lắc đều Bảoquản trong ngăn mát tủ lạnh

Nồng độ dung dịch acid chlorogenic chuẩn (0,836 mg/ml) (Mẫu chuẩn đã pha sẵn

do Viện Dược liệu cung cấp)

- Bản mỏng: TLC silicagel 60 F254 (Merck) được hoạt hóa ở 1050 C trong vòng 30 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký

· Kích thước bản mỏng: 10x20 cm

· Đưa mẫu lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat V Vị trí chấm mẫu cáchmép dưới bản mỏng là 8,0 mm, khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bảnmỏng là 15,0 mm Độ rộng của vết chấm: 6 mm và thể tích chấm mỗi vết chuẩn: 2 µl

· Hệ dung môi khai triển: Khảo sát một mẫu dịch chiết Kim ngân QB15 với lầnlượt các hệ dung môi sau:

Hệ 1: Butyl acetat: Acid formic: Nước (7,5: 2,5: 2,5) [4], [19]

Hệ 2: Ethyl acetat: Acid formic: Acid acetic: Nước (100:11:11:26) [9], [18]

Hệ 3: Ethyl acetat: Acid formic: Acid acetic: Nước (100:11:11:13) [9]

Hệ 4: Chloroform: Methanol: Nước (65: 35: 10) [4]

Hệ 5: Ethyl acetat: Acid acetic: Methanol (10: 2: 2)

Hệ 6: Ethyl acetat: Acid acetic: Nước (7,5: 2,5: 2,5)

· Điều kiện chạy sắc ký lớp mỏng + Điều kiện môi trường: nhiệt độ: 28oC, độ ẩm: 70 + Thể tích dung môi bão hòa: 25 ml; Thể tích dung môi khai triển: 10.0 ml + Thời gian bão hòa dung môi: 15 phút

+ Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút + Quãng đường di chuyển của dung môi pha động: 75.0 mm

· Bản mỏng được hiện vết bằng cách:

+ Soi dưới đèn UV bước sóng 254 nm và 366 nm

+ Phun thuốc thử hiện màu valinin/ H2SO4 (Pha theo DĐVN V) Sau đó sấy ở 105oC trong 10 phút và hiện màu dưới ánh sáng thường Dựa trên kếtquả quan sát được, chọn hệ dung môi có hiệu lực tách vết tốt nhất để tiến hành triển khai sắc ký đồng thời với tất cả các mẫu

· Chuẩn bị các mẫu Kim ngân theo mục 2.3.2.1 ở trên

· Triển khai sắc ký các mẫu Kim ngân theo điều kiện ở mục 2.3.2.3 với một hệdung môi khai triển được chọn có hiệu lực tách tốt nhất

· Chụp ảnh bản mỏng, xác định các vết chính trên sắc ký đồ và tính toán giá trị Rf tương ứng của từng vết

· Xác định thành phần hóa học đặc trưng của chi Lonicera L qua việc so sánh vết

chuẩn và vết thử phải có cùng Rf

· Xác định vết đặc trưng của chi và loài:

+ Vết đặc trưng của chi: Vết sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu ở cùng

+ Vết đặc trưng của loài: Vết sắc ký chỉ xuất hiện ở 1 loài nghiên cứu mà khôngxuất hiện ở các loài khác khi tiến hành cùng điều kiện sắc ký

2.3.3 Phương pháp xử lý kết quả

Sử dụng phương pháp phân tích cụm (Cluster Analysis) để xây dựng cây phân loại đặc điểm hình thái và thành phần hóa học dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng củacác mẫu nghiên cứu

Nguyên tắc: Cluster Analysis trong R sử dụng phương thức liên kết hoàn chỉnh để phân cụm theo phân cấp mặc định Phương pháp phân cụm này xác định khoảng cách cụm giữa hai cụm là khoảng cách tối đa giữa các thành phần riêng lẻ của chúng Trongquá trình kết tụ phân cấp, mỗi quan sát bắt đầu như một nhóm riêng biệt Hai cụm gầnnhất được hợp nhất thành một cụm mới Quá trình được lặp lại cho đến khi toàn bộ tập

dữ liệu được kết tụ thành một cụm duy nhất Đầu ra mang lại một cây phân loại chothấy mối quan hệ giữa các quan sát và giữa các cụm mà chúng được hợp nhất liên tiếp

- Đối với phân loại thực vật: Các đặc điểm hình thái được mã hoá và nhập dữ liệutheo các trường tương ứng với các đặc điểm hình thái như: Dạng sống; thân non (màu

sắc, đặc điểm lông trên thân, đường kính, ruột đặc hay rỗng); thân già (màu sắc, đặcđiểm trên lông thân già), lá (hình dạng lá, màu sắc lá, gốc lá, ngọn lá, cuống lá, mặt

- Đối với phân loại thành phần hoá học dựa trên định tính bằng sắc ký lớp mỏng: Các vết sắc ký hiện rõ dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử Vanilin/ H2SO4 đặccủa các mẫu nghiên cứu và mẫu chuẩn sẽ được mã hóa dựa trên sự xuất hiện vết đótrong từng mẫu (Bảng 3.4)

- Sau đó tiến hành chạy ma trận khoảng cách với hclust trong R và vẽ sơ đồdendrogram hiển thị mối quan hệ phân cấp giữa các mẫu nghiên cứu (Cây phân loại) Cây phân loại về thực vật và thành phần hoá học được xây dựng để xác định quan

hệ gần gũi giữa các mẫu nghiên cứu trong chi Lonicera L ở khu vực nghiên cứu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

3.1 Nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Đặc điểm hình thái của các mẫu Kim ngân nghiên cứu

Qua quan sát đặc điểm hình thái, các mẫu nghiên cứu được phân chia thành 4 nhóm

có đặc điểm tương đồng và từ đó xác định tên khoa học của các nhóm mẫu này Các đặcđiểm chi tiết của từng nhóm mẫu và kết quả giám định tên khoa học được trình bày dướiđây

· Đối tượng: Các mẫu QB01, QB06, QB10, QB11, QB12, QB13, QB14 (***) Cây leo, thân non màu xanh nhạt hoặc xanh hơi vàng nâu, phủ nhiều lông trắngdày đặc, đường kính 1,0-3,0 mm, đặc hoặc rỗng Thân già màu nâu đỏ đến nâu, phủ lớplông mịn, càng già lông càng rụng bớt, đường kính 3-8 mm, rỗng Lá đơn nguyên, mọcđối hình trứng dài 4 - 10 cm, rộng 2-5 cm, màu xanh lục đến xanh đậm Gốc lá hình hơitim, mép lá uốn hơi cong xuống mặt dưới lá, có lông công theo mép lá Mặt trên lá nhẵnhoặc có rải rác lông màu trắng mịn, ngắn Mặt dưới lá lông dày đặc, trắng, mềm Gân lá hình mạng nổi rõ Ngọn lá nhọn, cuống lá dài 6-8 mm, phủ lông trắng, mịn

Cụm hoa mọc thành từng cặp đối nhau ở kẽ lá, mỗi cụm có lá bắc cụm hoa, 8 - 16 bông Cuống chung 2 hoa dài từ 2-3 mm, phủ lông trắng mịn Lá bắc cặp hoa hình mũimác dài, 2 - 3 mm, phủ nhiều lông, cả mặt ngoài và mép lá Cuống hoa rất ngắn, hầunhư không có, 2 hoa có 2 lá bắc con hình gần tròn, ngọn lá nhọn, phủ nhiều lông Hoakhông đều, lưỡng tính Lúc mới nở hoa có màu trắng, sau chuyển dần sang màu vàng,

có mùi thơm nhẹ Đài 5, dính liền ở gốc, màu lục, phần rời dài 1-2 mm; hình mũi mác,phủ nhiều lông màu trắng, ở mép đài Tràng 5 hàn liền thành ống ở phía dưới, dài 3-4

cm, miệng ống chia 2 môi, cuộn ngược lại Môi trên 4 thùy ngắn, 1,5-1,7 cm; 2 thùy giữa dính nhau, xẻ 1 mm; 2 thùy bên xẻ sâu hơn 2 mm Môi dưới nguyên Tỷ lệ chiềudài ống/ môi: 1/1 Mặt ngoài ống tràng phủ lông màu trắng, ngắn; mặt trong ống tràngphủ lông màu trắng dài hơn Bộ nhị 5, rời, đều Chỉ nhị hình sợi, dài 3,8-4 cm, màu trắng, đính ở miệng ống tràng, hơi cong queo; bao phấn màu nâu, dài 2,5 mm, rộng 0,3- 0,5 mm, đính lưng, nứt dọc Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính thành bầu dưới hình bầu dụckhoảng 1,5 mm, phủ lông trắng mọc rải rác, 2 ô phát triển nhiều noãn, 1 ô kém phát

khoảng 4,3-4,5 cm, thò ra ngoài cánh hoa, nhẵn Tỷ lệ chiều dài vòi nhụy/ ống tràng là:5/2 Núm nhụy hình cầu, màu xanh (Hình 3.1)

Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái của QB01 (L reticulata Champ.)

Chú thích: a: Cành mang hoa, b: Thân, c: Lá, d: Cành mang quả, e: Mặt trước lá,

f: Mặt sau lá, g: Hoa, h: Hoa và cụm 2 hoa, k: bầu và đài, l: Lá bắc, m: ống tràng

hoa, n: Bầu và quả cắt ngang

Qua giám định [6], [10], [29], [30], [38], các mẫu nhóm 1 có tên khoa học là

Lonicera reticulata Champ

· Đối tượng: Mẫu QB15

Cây leo, thân non màu xanh nhạt hơi vàng, phủ nhiều lông trắng, dày đặc, đườngkính 2-3 mm, đặc Thân già màu nâu đỏ đến nâu, phủ lớp lông trắng, ngắn, mịn, đườngkính 3-7 mm, rỗng Thân, cành có phủ lớp mốc xanh Lá đơn nguyên, mọc đối hìnhtrứng dài 6 - 8 cm, rộng 4,0-4,5 cm, màu xanh lục đậm Khi sương giá, lá bị biến dạngquăn queo Gốc lá hình hơi tim, mép lá có lông trắng Mặt trên lá có rải rác lông màu

Hình 3.3 Một số đặc điểm hình thái của QB15 (Lonicera confusa DC.)

lá, f: Mặt sau lá, g: Lá bị biến dạng do sương giá, h: Cụm hoa và hoa, k: Giải phẫu

hoa, l: Bộ nhị, nhụy, m: Ống tràng, n: Lá bắc, bầu và đài, o: Bầu cắt ngang

Cụm hoa mọc thành từng cặp đối nhau ở kẽ lá Lá bắc cụm hoa hình mũi mácdài, hơi quăn queo, 2,5-3 cm, phủ nhiều lông, cả mặt dưới và mép lá Lá bắc cặp hoahình mũi mác, 2-3 mm, phủ nhiều lông Cuống chung 2 hoa dài từ 2-3 mm, phủ lôngtrắng mịn Cuống hoa rất ngắn, hầu như không có, 2 hoa có 2 lá bắc con hình mũi mác,1-1,5 mm, phủ nhiều lông Hoa không đều, lưỡng tính Lúc mới nở hoa có màu trắng,sau chuyển dần sang màu vàng, có mùi thơm nhẹ Đài 5, dính liền ở gốc, màu lục, phầnrời dài 1,5-2 mm; hình mũi mác, phủ nhiều lông màu trắng, ở mép đài Tràng 5 hàn liềnthành ống ở phía dưới, dài 4,5-4,8 cm, miệng ống chia 2 môi, cuộn ngược lại Môi trên

4 thùy ngắn; 2,2-2,4 cm, 2 thùy giữa dính nhau, xẻ 1 mm; 2 thùy bên xẻ sâu hơn 2 mm Môi dưới nguyên Tỷ lệ chiều dài ống/ môi: 1/1 Mặt ngoài ống tràng phủ lông màutrắng, ngắn; mặt trong ống tràng phủ lông màu trắng, dài Bộ nhị 5, rời, đều Chỉ nhịhình sợi, dài 1,8-2 cm, màu trắng, đính ở miệng ống tràng, hơi cong queo; bao phấn màu

noãn trung trụ Vòi nhụy hình sợi, màu trắng, 4,5-5,0 cm, thò ra ngoài cánh hoa, nhẵn.

Tỷ lệ chiều dài vòi nhụy/ ống tràng: 2 Núm nhụy hình cầu, màu xanh (Hình 3.2) Qua giám định [6], [10], [29], [30], [38], các mẫu nhóm 1 có tên khoa học là

Lonicera confusa DC

· Đối tượng: Mẫu QB05, QB08, QB16

· Đặc điểm chung về hình thái của các mẫu nhóm 3

Cây leo hoặc bụi đứng, thân non màu xanh nhạt hoặc xanh hơi vàng, phủ nhiềulông màu vàng, dày đặc, đường kính 1,5-3,0 mm, đặc Thân già màu nâu đỏ đến nâu,hoặc nâu vàng phủ lớp lông mịn, màu vàng đường kính 4-9 mm, rỗng Lá đơn nguyên,mọc đối, hình mũi mác dài đến hình trứng, 4-12 cm, rộng 2-7 cm, màu xanh nhạt hơivàng đến xanh đậm Gốc lá gần tròn hoặc hình tròn, mép lá uốn hơi cong xuống mặtdưới lá, có lông cong theo mép lá, phủ lông màu trắng Mặt trên lá có rải rác lông màutrắng mịn, ngắn Mặt dưới lá lông trắng, mềm, dày, có lông tiết Ngọn lá có chóp nhọn,cuống lá dài 8-10 mm, phủ lông trắng, mịn

Hình 3.3 Một số đặc điểm hình thái của QB16 (Lonicera hypoglauca Miq.)

Chú thích: a: Cành mang hoa, b: Thân, c: Lá, d: Mặt sau lá, e: Mặt trước lá,

Cụm hoa mọc thành từng cặp đối nhau ở kẽ lá Cuống chung 2 hoa dài từ 2-4

mm, phủ lông trắng, mịn Lá bắc cặp hoa hình mũi mác dài, 2-3 mm, phủ nhiều lông, cảmặt ngoài và mép lá Cuống hoa rất ngắn, hầu như không có, 2 hoa có 2 lá bắc con hình gần tròn, ngọn lá nhọn, phủ nhiều lông trắng Hoa không đều, lưỡng tính Lúc mới nởhoa có màu trắng hơi xanh, sau chuyển dần sang màu vàng, có mùi thơm nhẹ Đài 5,dính liền ở gốc, màu lục, phần rời dài 1mm; hình mũi mác, phủ nhiều lông màu trắng, ởmép đài Tràng 5 hàn liền thành ống ở phía dưới, dài 3,8-5 cm, miệng ống chia 2 môi,cuộn ngược lại Môi trên 4 thùy ngắn, 1,5-2,5 cm; 2 thùy giữa dính nhau, xẻ 1 mm; 2thùy bên xẻ sâu hơn 2 mm Môi dưới nguyên Tỷ lệ chiều dài ống/ môi: 23/15 hoặc 1/1 Mặt ngoài ống tràng phủ lông màu trắng, ngắn, lông tiết màu đỏ, nhiều; mặt trong ốngtràng phủ lông màu trắng dài hơn Bộ nhị 5, rời, đều Chỉ nhị hình sợi, dài cm, màutrắng, đính ở miệng ống tràng, hơi cong queo; bao phấn màu vàng nâu, dài 2,5 mm, rộng0,3-0,5 mm, đính lưng, nứt dọc, hạt phấn hình cầu màu trắng Bộ nhụy gồm 3 lá noãndính thành bầu dưới hình bầu dục khoảng 2,0 mm, trơn, nhẵn 3 ô, đính noãn trung trụ.Vòi nhụy hình sợi màu trắng, dài khoảng 4,2-5,2 cm, thò ra ngoài cánh hoa, nhẵn Tỷ lệchiều dài vòi nhụy/ ống tràng là: 14/5 hoặc 52/25 Núm nhụy hình cầu, màu xanh, 1 mm (Hình 3.3)

Qua giám định [6], [10], [29], [30], [38], các mẫu nhóm 1 có tên khoa học là

Lonicera hypoglauca Miq

· Đối tượng: Mẫu QB02, QB03, QB04, QB07, QB09

Cây leo, thân non màu xanh nhạt hơi vàng đôi khi màu xanh hơi tím ,phủ nhiềulông dài, nhọn, màu trắng, dày đặc, đường kính 1,5 – 3,0 mm Thân già màu nâu đỏ đếnnâu đậm, nhiều lông dài, nhọn màu trắng hoặc vàng, đường kính 2,5-5,0 mm, rỗng Láđơn, nguyên, mọc đối, phiến lá hình trứng, dài 6-8 cm, rộng 3,0 – 3,5 cm, màu xanh non đến xanh đậm Gốc lá hình tim, đôi khi gần tròn, mép lá có lông, không cong Mặt trên

và mặt dưới lá đều nhiều lông dài, màu trắng, nhọn Gân lá hình lông chim, có lôngtrắng, dài, nhọn Cuống lá dài 0,8-1,1 cm, màu xanh, phủ lông dài, màu trắng

Qua giám định [6], [10], [29], [30], [38], các mẫu nhóm 1 có tên khoa học là

Lonicera macrantha (D Don) Spreng

Hình 3.4 Một số đặc điểm hình thái của QB07 (L macrantha (D Don) Spreng.)

Chú thích: a: Cành mang lá; b: Thân; c, d: Lá; e: Mặt trước lá; f: Mặt sau lá;

(***) Hình ảnh các mẫu còn lại trong các nhóm trên được đính kèm tại phụ lục 3

3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của các mẫu Kim ngân

Mặt ngang của thân các mẫu Kim ngân đều có thiết diện tròn và mang các đặcđiểm chung như sau:

Từ ngoài vào trong cấu tạo thân bao gồm: Biểu bì (2) cấu tạo bởi hàng tế bào nhỏxếp đều đặn, mô dày gồm 2-3 lớp tế bào, thành dày xếp sát dưới lớp biểu bì, mang lông che chở (1) và lông tuyến (12) Mô dày (3) gồm 2-3 lớp tế bào thành dày xếp sát dướilớp biểu bì Kế sát mô dày là một lớp libe cấp I (4), các tế bào có hình chữ nhật bẹt rất

mềm vỏ, libe cấp II và mô mềm ruột Libe cấp II (8) gồm 5-6 lớp tế bào hình chữ nhậtnằm xếp sít nhau, khá đều Gỗ cấp II (9) gồm mạch gỗ kích thước không đều, hình đagiác, xếp thành hàng Mô mềm gỗ bao quanh mạch, hình đa giác, vách dày không đều.

Gỗ cấp I (10) bên trong gỗ cấp II (9), hình đa giác, xung quanh có các tế bào mô mềmchưa hóa gỗ hình đa giác Mô mềm ruột (11) gồm những tế bào đa giác, hình tròn haybầu dục, có thành hóa gỗ nhiều, tế bào càng ở trong kích thước càng lớn dần và thànhhóa gỗ ít hơn Thân càng già khoảng trống giữa thân càng lớn

Điểm khác biệt của đặc điểm thân giữa các loài Kim ngân trong nghiên cứu này

được trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.5

Bảng 3.1 Đặc điểm khác biệt vi phẫu thân giữa các loài Kim ngân nghiên cứu

Lông che chở

2 loại lông đơnbào, dài thẳng

và ngắn cong,mọc đơn gốchoặc mọcthành cụm

Lông đơn bào,ngắn, mọc đơngốc hoặc mọcthành cụm

2 loại: lông đơnbào, dài, thẳng

và ngắn, cong,mọc đơn gốc

Lông đơn bào,dài, hơi cong vàlông che chở đabào hình sao

Lông tiết

Không có Không có Không có Có lông tiết

Libe

Có libe cấp I,libe cấp II

- Libe cấp Igần như tiêu biến, khôngthấy

- Libe cấp IIhóa gỗ 1 phần

- Libe cấp I gầnnhư tiêu biến,không thấy

- Tế bào cứngrải rác thành dải

ở libe cấp II

Có libe cấp I,libe cấp II

Hình 3.5 Đặc điểm giải phẫu thân của các loài Kim ngân nghiên cứu

A Lonicera reticulata Champ B Lonicera confusa DC

C Lonicera hypoglauca Miq D Lonicera macrantha (D Don) Spreng

1: Lông che chở; 2: Biểu bì; 3: Mô dày; 4: Libe cấp I, 5: Mô cứng, 6: Mô mềm vỏ,

ruột; 12: Lông tiết; 13: Tế bào cứng; 14: Libe cấp II hóa gỗ

B

A

3.1.2.2 Đặc điểm giải phẫu lá của các mẫu nghiên cứu

Đặc điểm chung về cấu tạo giải phẫu lá của các mẫu nghiên cứu như sau:

Gân giữa: Mặt dưới lồi Biểu bì trên (2) và dưới (10) là lớp tế bào hình trứng hayhình tròn, không đều, mang lông che chở (1) và lông tiết (11) Mô dày (3) trên và dưới (9) gồm 4-5 lớp tế bào hình đa giác hay hình tròn, không đều, thành dày ở góc, xếp sítnhau Mô mềm trên (4) gồm 2-3 lớp tế bào hình đa giác hơi tròn hay hình trứng, thànhmỏng Libe (6) gồm nhiều lớp tế bào có kích thước nhỏ, xếp thành vòng bao quanh gỗ

Gỗ (5) gồm 5-8 lớp tế bào hình đa giác to dần từ ngoài vào trong, xếp thành vòng cung Tinh thể canxi oxalate (7) nằm rải rác trong mô mềm và libe Mô mềm dưới (8) gồmnhiều lớp tế bào hình đa giác kích thước lớn hơn mô mềm trên, thành mỏng

Phiến lá: Biểu bì trên (12) và dưới (13) tế bào hình chữ nhật, biểu bì trên lớn gấp3-4 lần biểu bì dưới Mô giậu (14) gồm 1-2 lớp tế bào hình chữ nhật đứng xếp sít nhau,vuông góc với biểu bì trên Dưới mô giậu là mô khuyết (15) gồm những tế bào xếp rờirạc để lại nhiều khoảng gian bào, có tinh thể canxi oxalat hình cầu gia nằm rải rác Các đặc điểm riêng biệt về cấu tạo giải phẫu lá các loài Kim ngân nghiên cứu đượctrình bày trong Bảng 3.2 và Hình 3.6

Bảng 3.2 Đặc điểm khác biệt vi phẫu lá giữa các loài Kim ngân nghiên cứu

Đặc điểm

2 loại lông đơnbào, dài thẳng vàngắn cong, mọcđơn gốc hoặc mọc thành cụm

Lông đơn bào,ngắn, mọc đơngốc hoặc mọcthành cụm

2 loại: lôngđơn bào, dài,thẳng vàngắn, cong, mọc đơn gốc

Lông che chởđơn bào, dài,hơi cong và

lông che chở đa bào hình sao Lông

tiết Lông tiết có chân

Lông tiết cóchân rất ngắn hoặc không chân

Không có Lông tiết có

chân Mặt trên

gân lá Lồi Lõm hơi sâu Lồi Hơi lõm

Mật độ

tinh thể

canxi oxalat

Rải rác ở mômềm, libe gângiữa, phiến

Rất nhiều ở mô mềm, libe vàphiến, đặc biệt

mô giậu

Rất nhiều ở

mô mềm, libe

và phiến, đặcbiệt mô giậu

Rải rác ở mômềm, libe gângiữa, phiến

Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu lá của các loài Kim ngân nghiên cứu

A: Lonicera reticulata Champ B: Lonicera confusa DC

C: Lonicera hypoglauca Miq D: Lonicera macrantha (D Don) Spreng

1: Lông che chở; 2: Biểu bì trên; 3: Mô dày; 4: Mô mềm trên; 5: Gỗ; 6: Libe;

7: Canxi oxalate; 8: Mô mềm dưới; 9: Mô dày dưới; 10: Biểu bì dưới; 11; Lông tiết 12: Biểu bì trên phiến; 13: Biểu bì dưới phiến; 14: Mô giậu; 15: Mô khuyết

B

A

3.2 Nghiên cứu hóa học

3.2.1 Định tính thành phần hoá học bằng sắc ký lớp mỏng

Sau khi khảo sát các hệ dung môi pha động (Mục 2.3.2.3), pha động ổn định và có hiệu lực tách tốt nhất là hệ 2: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước (100: 11: 11: 26) (viết tắt pha động: EtOAc: CH3COOH: HCOOH: H2O = 100: 11: 11: 26) Dịch chiết methanol của các mẫu nghiên cứu sau khi khai triển tách được khá nhiều vết sắc

ký Sắc ký đồ phát hiện được nhiều vết xuất hiện ở các bước sóng 254 nm và 366 nm Tuy nhiên, nhiều vết sau khi phun thuốc thử vanilin/ H2SO4 đặc mới xuất hiện và quan sát được bằng mắt thường Có những vết xuất hiện ở tất cả các mẫu và có những vết chỉxuất hiện ở một loài

Tiến hành định tính bằng SKLM dịch chiết methanol của các mẫu Kim ngân thu

hái tại Quản Bạ, Hà Giang và so sánh với dịch chiết methanol của loài Lonicera

sắc ký đồ của các dịch chiết Kim ngân cuộng trước và sau khi phun thuốc thửvanilin/H2SO4 đặc, quan sát ở ánh sáng thường và UV ở các bước sóng 254 và 366 nm

Hình 3.7 Sắc ký đồ của các dịch chiết kim ngân cuộng dưới đèn UV 254nm;

Hình 3.8 Sắc ký đồ của các dịch chiết kim ngân cuộng dưới đèn UV 366nm;

Chú thích: CGA: acid chlorogenic; QN: dịch chiết L japonica Thunb.;

Hình 3.9 Sắc ký đồ của các dịch chiết kim ngân cuộng dưới đèn UV 366nm sau khi

phun thuốc thử vanilin/ acid sulfuric

Chú thích: CGA: acid chlorogenic; QN: dịch chiết L japonica Thunb.;

Hình 3.10 Sắc ký đồ của các dịch chiết kim ngân cuộng dưới ánh sáng trắng sau khi

phun thuốc thử vanilin/ acid sulfuric

Chú thích: CGA: acid chlorogenic; KNC: dịch chiết Kim ngân chuẩn;

Lựa chọn sắc ký đồ của các dịch chiết Kim ngân cuộng sau phun thuốc thử và quan sát dưới ánh sáng thường để tiến hành chồng các phổ sắc ký của các mẫu theotừng nhóm loài đã xác định Kết quả được trình bày trong các Hình 3.12 – 3.15

Kết quả các vết sắc ký trên sắc ký đồ của Kim ngân cuộng sau khi phun thuốcthử và quan sát dưới ánh sáng thường (****) được và tổng hợp trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ Kim ngân cuộng và Kim ngân L japonica Thunb

Chú thích: 1: Có xuất hiện; 0: Không xuất hiện

Các vết có cùng vị trí Rf với vết chất chuẩn CGA Các vết tương đồng xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên

cứu chi Lonicera

Từ bảng phân tích trên cho kết quả quan sát bản mỏng dưới ánh sáng trắng sauphun thuốc thử như sau:

Các mẫu Kim ngân cuộng có vết cùng Rf và màu sắc với chất chuẩn CGA baogồm: QN, QB01, QB04, QB09, QB12, QB14, QB15, QB16 (Phần đóng khung Hình 3.8)

Các vết tương đồng trong các mẫu Kim ngân cuộng của chi Lonicera và mẫu

chuẩn có cùng giá trị Rf và màu sắc : Rf = 0,68; 0,90; 0,97

Các vết tương đồng trong Kim ngân cuộng cho loài: Các vết chỉ xuất hiện tại 1nhóm thuộc loài có cùng giá trị Rf và màu sắc:

· QB01 và QB14: Rf = 0.55 (L reticulata Champ.)

· QB05 và QB08: Rf = 0.70 (L hypoglauca Miq.)

Ngoài ra, quan sát sắc ký đồ tại bước sóng 254nm trước khi phun thuốc thử thấy rõ

2 vết sắc ký màu xanh dương, cùng vị trí Rf xuất hiện tại mẫu QB05 và QB08 (Phầnđóng khung trong Hình 3.7) Tại bước sóng 366 nm, trước và sau phun thuốc thử đềukhông hiện vết Sau khi phun thuốc thử và quan sát dưới ánh sáng thường hai vết này

có màu vàng (Phần đóng khung trong Hình 3.10) Điều này cho thấy, vết sắc ký có

Rf = 0.70 tương đối đặc trưng cho loài L hypoglauca Miq

Tiến hành định tính bằng SKLM dịch chiết methanol của các mẫu Kim ngân cóhoa thu hái tại Quản Bạ, Hà Giang và so sánh với acid chlorogenic chuẩn Hình 3.12 thểhiện hình ảnh các sắc ký đồ của các dịch chiết Kim ngân hoa trước và sau khi phunthuốc thử vanilin/ H2SO4 đặckhi quan sát ở ánh sáng thường và UV ở các bước sóng254nm và 366 nm Hệ dung môi khai triển là EtOAc: CH3COOH: HCOOH: H2O (100: 11: 11: 26)

Kết quả các vết sắc ký trên sắc ký đồ của Kim ngân hoa sau khi phun thuốc thử và quan sát dưới ánh sáng thường được phân tích và tổng hợp trong Hình 3.11 và Bảng 3.4

A B C Hình 3.11 Sắc ký đồ của dịch chiết Kim ngân hoa dưới UV 254 (A), UV 366nm (B), VIS

(C) CGA: acid chlorogenic; QB01; QB14; QB15; QB16: Các dịch chiết Kim ngân

hoa thu tại Quản Bạ, Hà Giang

Bảng 3.4 Sự xuất hiện của các vết trên sắc ký đồ Kim ngân hoa (*****)

Chú thích: 1: Có xuất hiện; 0: Không xuất hiện

Các vết có cùng vị trí Rf với vết chất chuẩn CGA

Các vết tương đồng xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu chi Lonicera