nâng o giá trị ủ rừng trồng Bạ h n uro ặ biệt l ung ấp gỗ lớn ở nƣớ t . B n ạnh ó, một số tổ hợp l i giữ Bạ h n uro v một số lo i bạ h n khá ã ƣợ l i tạo ể ƣ v o khảo nghiệm giống tại B V - H Nội, Đ ng H - Quảng Trị v Bầu B ng - B nh Dƣơng. Một số òng Bạ h n l i UP o Viện Nghi n ứu Giống v C ng nghệ Sinh h Lâm nghiệp h n tạo ũng ho năng suất ạt tới 25-35m 3 /h /năm tr n á lập ị thoái hó , nghèo inh ƣỡng ở B V , H Nội v Đ ng H , Quảng Trị (H Huy Thịnh v ộng s 2015; Mai Trung Kiên, 2014) [23], [15]. Tuy nhiên, giống l i UG (E. urophylla x E. grandis) l giống l i ó triển v ng hƣ ƣợ nghi n ứu một á h rộng rãi, mặt khá á khảo nghiệm giống l i giữ Bạ h n uro v một số lo i khá mới hỉ theo õi sinh trƣởng ến gi i oạn 3 năm tuổi, v thế việ tiếp tụ theo dõi sinh trƣởng ủ húng ở gi i oạn s u 3 tuổi ũng nhƣ nghi n ứu một số tính hất gỗ l ần thiết trong việ ánh giá một á h ầy ủ hơn khả năng phát triển giống bạ h n l i trong trồng rừng gỗ lớn. Trong khu n khổ kết quả á ề t i “Nghiên cứu chọn tạo giống có năng suất và chất lượng cao cho một số loài cây trồng rừng chủ yếu”giai oạn 2001 - 2005, ề t i “Nghiên cứu chọn tạo giống Bạch đàn lai mới giữa Bạch đàn pelita và các giống Bạch đàn khác” gi i oạn 2011- 2015, án “Phát triển giống cây lấy gỗ phục vụ trồng rừng rừng kinh tế”gi i oạn 2006 - 2010 ã xây ng á khảo nghiệm hậu thế thế hệ h i v khảo nghiệm tổ hợp l i khá lo i giữ Bạ h n uro v á lo i bạ h n khá . Để tiếp tụ ánh giá ịnh hƣớng nghi n ứu Bạ h n uro v á giống l i Bạ h n uro với á lo i bạ h n khá qu ó góp phần v o hiến lƣợ ải thiện giống nhằm nâng năng suất v hất lƣợng o phụ vụ mụ í h gỗ xẻ, luận án “Nghiên cứu đặc điểm biến dị và khả năng di truyền về sinh trưởng và một số tính chất gỗ của Bạch đàn uro và giống lai giữa Bạch đàn uro với các loài bạch đàn khác” ƣợ th hiện. thấp gần đây được nhiều tác giả trên thế giới quan tâm, gồm: thủy phân bằng enzym [13,14,23], [15–22], enzym kết hợp với chiếu xạ [24], thủy phân bằng axit HCl [14,25], axit HCl kết hợp sử dụng sóng siêu âm [26] hay chiếu xạ tia gamma kết hợp etanol [27], bằng kiềm kết hợp nhiệt [28]...Tuy nhiên các nghiên cứu trên thế giới mới chỉ tập trung nhiều vào các phương pháp điều chế glucomannan khối lượng phân tử thấp mà chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết về tính chất, cấu trúc hóa học, về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng, đặc biệt khả năng giảm hấp thu đường huyết và cơ chế tác dụng chưa được nghiên cứu. Những nghiên cứu như vậy về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam lại càng ít và hầu như chưa có. Để đóng góp nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học cơ bản về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam, đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của loại hợp chất này nhằm đưa ra những sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng có giá trị thực tiễn cao từ cây Nưa Amorphophalus konjac K.Koch ở Việt Nam chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây Amorphophalus konjac K.Koch ở Lâm Đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết”. Các mục tiêu cụ thể cho luận án như sau: 1. Tách, xác định tính chất và chứng minh cấu trúc của glucomannan từ củ (thân củ) cây Amorphophallus konjac K.Koch (A.konjac) thu nhận tại Việt Nam. 2. Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân glucomannan từ cây A.konjac để chế tạo các loại glucomannan với khối lượng phân tử thấp bằng các phương pháp khác nhau. 3. Thăm dò hoạt tính hạ đường huyết và cơ chế hạ đường huyết của sản thấp gần đây được nhiều tác giả trên thế giới quan tâm, gồm: thủy phân bằng enzym [13,14,23], [15–22], enzym kết hợp với chiếu xạ [24], thủy phân bằng axit HCl [14,25], axit HCl kết hợp sử dụng sóng siêu âm [26] hay chiếu xạ tia gamma kết hợp etanol [27], bằng kiềm kết hợp nhiệt [28]...Tuy nhiên các nghiên cứu trên thế giới mới chỉ tập trung nhiều vào các phương pháp điều chế glucomannan khối lượng phân tử thấp mà chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết về tính chất, cấu trúc hóa học, về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng, đặc biệt khả năng giảm hấp thu đường huyết và cơ chế tác dụng chưa được nghiên cứu. Những nghiên cứu như vậy về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam lại càng ít và hầu như chưa có. Để đóng góp nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học cơ bản về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam, đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của loại hợp chất này nhằm đưa ra những sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng có giá trị thực tiễn cao từ cây Nưa Amorphophalus konjac K.Koch ở Việt Nam chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây Amorphophalus konjac K.Koch ở Lâm Đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết”. Các mục tiêu cụ thể cho luận án như sau: 1. Tách, xác định tính chất và chứng minh cấu trúc của glucomannan từ củ (thân củ) cây Amorphophallus konjac K.Koch (A.konjac) thu nhận tại Việt Nam. 2. Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân glucomannan từ cây A.konjac để chế tạo các loại glucomannan với khối lượng phân tử thấp bằng các phương pháp khác nhau. 3. Thăm dò hoạt tính hạ đường huyết và cơ chế hạ đường huyết của sản
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-TRẦN THỊ NỮ
NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN
TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K KOCH Ở LÂM ĐỒNG
VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT
DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC
Hà Nội, 2020
Trang 2MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 TỔNG QUAN 3
1.1 Giới thiệu chung về glucomannan 3
1.1.1.Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan 3
1.1.2 Tính chất vật lý của glucomannan 3
1.1.3 Tính chất hóa học của glucomannan 5
1.1.4 Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của glucomannan 7
1.2 Cây nưa A.konjac K.Koch và quy trình tách chiết glucomannang 9
1.2.1 Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch 9
1.2.2 Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac 12
1.3 Phản ứng cắt mạch glucomannan 15
1.3.1 Cắt mạch bằng các phương pháp lý -hóa học 15
1.3.2 Thủy phân với xúc tác enzym 17
1.3.2.1 Đặc điểm của xúc tác enzym 17
1.3.2.2.Các hệ enzym thủy phân mannan 19
1.3.2.3 Nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng enzym 26
1.3.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác enzym 28
1.3.2.5 Phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện phản ứng tối ưu 30
1.4 Enzym AMPK và vai trò của nó trong hạ đường huyết 31
1.4.1 Quá trình chuyển hóa glucose trong cơ thể 31
1.4.1.1 Quá trình hấp thu glucose 31
1.4.1.2 Quá trình chuyển hóa glucose 32
Trang 31.4.2 Khái quát về enzym Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase
(AMPK) 34
1.4.3 Các phương pháp hoạt hóa AMPK 36
1.4.3.1 hoạt hóa AMPK bằng vận động 36
1.4.3.2 hoạt hóa AMPK bằng hoạt chất 38
1.5 Tính hình nghiên cứu glucomannan từ cây nưa A.konjac tại Việt Nam 40
Chương 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43
2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 43
2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất 43
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 44
2.2 Thực nghiệm 45
2.2.1 Tách, tinh chế và xác định cấu trúc, tính chất của glucomannan từ cây A.konjac 45
2.2.1.1 Tách glucomannan từ cây A.konjac K.Koch 45
2.2.1.2 Xác định hàm lượng glucomannan trong bột konjac glucomannan 47
2.2.1.3 Xác định cấu trúc và đặc trưng của glucomannan 49
2.2.2 Thủy phân glucomannan 52
2.2.2.1 Thủy phân bằng axit 52
2.2.2.2 Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym 53
2.2.3 Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của LKGM-E trên in vitro 57
2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vivo.59 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61
3.1 Nghiên cứu tách, tinh chế và đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannan trong củ nưa A.konjac 61
3.1.1 Tách và tinh chế glucomannan từ củ Nưa A.konjac 61
3.1.1.1 Hàm lượng glucomannan trong củ Nưa A.konjac 61
3.1.1.2.Tách glucomannan từ củ Nưa A.konjac 63
3.1.1.3 Tinh chế glucomannan 65
3.1.2 Đặc trưng cấu trúc, tính chất của glucomannan từ củ A.konjac 65
3.1.2.1 Phổ IR của glucomannan 65
3.1.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 66
Trang 43.1.2.3 Tính chất nhiệt của KGM 72
3.1.2.4 Độ kết tinh 73
3.1.2.5 Khối lượng phân tử của KGM 73
3.1.2.6 Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM 75
3.2 Thủy phân glucomannan bằng xúc tác axit HCl 76
3.2.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp của phản ứng thủy phân xúc tác axit 76
3.2.2 Cấu trúc và tính chất của sản phẩm thủy phân 82
3.2.2.1 Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-1 82
3.2.2.2 Phổ IR của LKGM-1 83
3.2.2.3 Phổ NMR của LKGM-1 84
3.2.2.4 Tính chất nhiệt của LKGM-1 87
3.2.2.5 Khối lượng trung bình của LKGM-1 88
3.3 Thủy phân konjac glucomannan bằng enzym 89
3.3.1 Định tính khả năng phân huỷ glucomannan của các enzym từ vi khuẩn 89
3.3.2 Xác định điều kiện tối ưu của phản ứng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng90 3.3.2.1 Kết quả theo mô hình thực nghiệm 90
3.3.2.2 Phân tích thống kê 92
3.3.2.3 Tìm chế độ thủy phân tối ưu 96
3.3.3 Đặc điểm cấu trúc và tính chất của LKGM-E 97
3.3.3.1 Phổ IR của LKGM-E 97
3.3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của LKGM-E 99
3.3.3.3 Tính chất nhiệt của LKGM-E 102
3.3.3.4 Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thủy phân 103
3.3.3.5 Độ tan và hiệu suất thu hồi LKGM-E 104
3.4 Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E 106
3.4.1 Hoạt tính hạ đường huyết của LKGM-E trên mô hình in vitro 106
3.4.2 Tác dụng ức chế dung nạp glucose huyết của LKGM-E trên mô hình in vivo109 KẾT LUẬN CHUNG 114
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ 116
TÀI LIỆU THAM KHẢO 117
Trang 5DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A konjac Amorphophallus konjac K Koch
AMPK Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein
kinase
DMEM Môi trường cơ bản nuôi cấy tế bào
DLS Thiết bị phân tích kích thước hạt
HPGPC Sắc kí thẩm thấu gel hiệu năng cao
Trang 6LKGM-1 Konjac glucomannan thủy phân bằng axitLKGM-E Konjac glucomannan thủy phân bằng enzymNAD Nicotinamid adenin dinucleotid
NADH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid
NADP Nicotinamid adenin dinucleotid photphatNADPH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid photphat
OGTT Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống
TBS-T Tri Buffer saline T Ween 20
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Hệ sinh vật phân huỷ mannan 21
Bảng 1.2 Đặc điểm của β-mannanase sinh ra từ một số vi sinh vật 25
Bảng 1.3 Số thí nghiệm của kế hoạch bậc hai Box – Behnken 30
Bảng 2.1 Các mức của các yếu tố ảnh hưởng 55
Bảng 2.2 Ma trận kế hoạch bậc 2 Box – Behnken cho trường hợp k = 4 56
Bảng 3.1 Hàm lượng nước trong củ Nưa A.konjac 61
Bảng 3.2 Phương trình hồi quy và hệ số tương quan của đường chuẩn glucose 62
Bảng 3.3 Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A.konjac khô 63
Bảng 3.4 Hàm lượng glucomannan trong củ nưa A konjac 64
Bảng 3.5 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) của KGM 69
Bảng 3.6 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) của KGM 70
Bảng 3.7 Kết quả phân tích TGA của KGM 72
Bảng 3.8 Kết quả đo áp suất thẩm thấu của KGM 74
Bảng 3.9 Hàm lượng tro và kim loại nặng trong bột KGM 75
Bảng 3.10 Tổng hợp đặc điểm cấu trúc, tính chất của glucomannnan từ củ A.konjac76 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ axit đến hiệu suất và độ nhớt của sản phẩm 76
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của tỉ lệ KGM/dd axít đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng và độ thu hồi sản phẩm 81
Bảng 3.13 Độ tan và hiệu suất thu hồi sản phẩm 82
Bảng 3.14 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của proton (1H) trong LKGM-1 85
Bảng 3.15 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của cacbon (13C) trong LKGM-1 85
Bảng 3.16 Kết quả phân tích TGA của LKGM-1 87
Bảng 3.17 Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân 88
Trang 8Bảng 3.18 Đường kính vòng phân giải glucomannan 90Bảng 3.19 Kết quả thực nghiệm theo kế hoạch Box Behnken 91Bảng 3.20 Kết quả phân tích ANOVA tối ưu hóa điều kiện phản ứng thủy phân 92Bảng 3.21 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 93Bảng 3.22 Kết quả tính tìm điều kiện tối ưu 96Bảng 3.23.1H NMR độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) của LKGM-E 99
Bảng 3.24 Độ dịch chuyển hóa học13C - NMR (δ ppm) của LKGM-E trong D2O101
Bảng 3.25 Kết quả phân tích TGA của LKGM-E 103Bảng 3.26 Áp suất thẩm thấu của các dung dịch sau thủy phân bằng enzym 103Bảng 3.27 Độ tan và các tính chất của Konjac glucomannan và sản phẩm thủy phân105Bảng 3.28 Tỷ lệ biểu hiện p-AMPK/ β-actin 107Bảng 3.29 Glucose huyết ban đầu và sau khi uống glucose 110
Trang 9DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của glucomannan 3
Hình 1.2 Hình ảnh cây và củ Nưa A.konjac được trồng thử nghiệm tại Lâm Đồng12 Hình 1.3 Cấu trúc của một số loại β,1–4 mannan/heteromannan 20
Hình 1.4 Cấu trúc phân tử ATP và AMP 35
Hình 3.1 Hình ảnh củ Konjac được gọt vỏ và thái lát 61
Hình 3.2 Đường chuẩn glucose 63
Hình 3.3 Hình ảnh bột glucomannan thu được sau khi sấy 64
Hình 3.4 Quá trình tách tinh bột và tạp chất trong bột KGM 65
Hình 3.5 Phổ IR của KGM 66
Hình 3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân1HNMR của KGM 67
Hình 3.7 Phổ13C-NMR của KGM 69
Hình 3.8 Phổ13C-NMR của KGM 70
Hình 3.9 phổ HSQC của KGM 71
Hình 3.10 Giản đồ phân tích nhiệt của KGM 72
Hình 3.11 Giản đồ nhiễu xạ tia X của KGM 73
Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ C và Π/C của KGM 74
Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ axit đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng 77
Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng thủy phân glucomannan 79
Hình 3.15 Ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng thủy phân glucomannan 80
Hình 3.16 Phổ IR của LKGM-1 83
Hình 3.17 Phổ1H -NMR của LKGM-1 84
Hình 3.18 Phổ13C-NMR của LKGM-1 84
Hình 3.19 Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-1 87
Trang 10Hình 3.20 Mối quan hệ giữa nồng độ và áp suất thẩm thấu của LKGM-1 88
Hình 3.21 Vòng phân giải glucomannan của vi khuẩn Bacillus subtilis (A) và mẫu chứng (B) 90
Hình 3.22 Biến đổi độ nhớt của hỗn hợp phản ứng theo thời gian 90
Hình 3.23 Đường mức và đáp ứng bề mặt 3D ảnh hưởng của các cặp yếu tố đến độ nhớt của hỗn hợp phản ứng 95
Hình 3.24 Phổ IR của LKGM-E 98
Hình 3.25 Phổ1H-NMR của LKGM-E ở 80oC trong D2O 99
Hình 3.26 Phổ13C-NMR của LKGM-E ở 80oC trong D2O 100
Hình 3.27 Phổ1H-13C-NMR-HSQC của LKGM-E ở 80oC trong D2O 101
Hình 3.28 Giản đồ phân tích nhiệt của LKGM-E 102
Hình 3.29 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ (C) và Π/C của LKGM-E 104 Hình 3.30 Số lần tăng mức độ biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ với mẫu thử so với lô chứng 108
Hình 3.31 Hình ảnh mức độ biểu hiện p-AMPK và actin 108
Hình 3.32 Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước và sau cho uống glucose so với thời điểm ban đầu 110
Hình 3.33 Glucose huyết trước và sau khi cho uống LKGM-E và KGM 112
Trang 11DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1 Phản ứng tổng hợp hydrogel trên cơ sở glucomannan ghép với axit
acrylic (AA) 7
Sơ đồ 1.2 Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khô 13
Sơ đồ 1.3 Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khô- ướt 14
Sơ đồ 1.4 Quá trình hấp thu glucose trong cơ thể 32
Sơ đồ 1.5 Cân bằng glucose máu trong cơ thể 34
Sơ đồ 1.6 Phản ứng chuyển hóa từ ATP tạo AMP 35
Sơ đồ 1.7 Tác dụng của meformin trong điều trị tiểu đường 38
Sơ đồ 2.1 Quy trình tách glucomannan từ củ A.konjac 46
Sơ đồ 2.2 Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống 59
Sơ đồ 3.1 Cơ chế phản ứng thủy phân glucomannan xúc tác axit 78
Sơ đồ: 3.2 Giả thiết cơ chế thủy phân glucomannan bằng endo-1,4-mannanase 105
Trang 12ăn của người ăn kiêng để giảm cân, làm giảm cholesterol trong máu, mỡ máu, giảmhấp thu glucose Ngoài ra glucomannan còn có nhiều tính chất quý như có khả nănghấp thụ nước trương nở tốt tạo dung dịch có độ nhớt cao nên được ứng dụng trongnhiều lĩnh vực tạo độ ổn định cho thực phẩm, tạo gel, tạo màng [2–5].
Glucomannan có trong nhiều loài nưa, ở mỗi loài cấu trúc và tính chất khác
nhau, trong đó Nưa Konjac (Amorphophalus konjac K.Koch) là loài có hàm lượng
glucomannan cao và là cây trồng chủ lực để phát triển ngành Nưa ở một số nướcĐông Á và Đông Nam Á như: Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Việt Nam cókhoảng trên 25 loài Nưa phân bố rải rác khắp các vùng miền trong cả nước Cây
Nưa Amorphophallus konjac K.Koch mới được tìm thấy vào năm 2012 tại một số
tỉnh miền núi phía Bắc [6]
Do khối lượng phân tử lớn (khối lượng phân tử trung bình của glucomannandao động trong khoảng 1,9 106÷ 2 106Da) [7], độ nhớt cao nên khả năng tantrong nước của glucomannan kém (độ tan khoảng 30%), do đó làm hạn chế mộtphần hiệu quả và phạm vi ứng dụng của glucomannan trong một số lĩnh vực Đểkhắc phục hạn chế đó, quá trình thủy phân glucomannan để thu được glucomannan
có khối lượng phân tử nhỏ hơn mà vẫn giữ được những tính chất quý củaglucomannan thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học Ngoàitính chất chung của glucomannan (KGM), glucomannan thủy phân (LKGM) còn cónhiều hoạt tính sinh học như lợi khuẩn,chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch…[8–11].Glucomannan thủy phân còn được sử dụng để vận chuyển thuốc [12]
Với các tiềm năng ứng dụng của LKGM trong lĩnh vực thực phẩm và dược
Trang 13thấp gần đây được nhiều tác giả trên thế giới quan tâm, gồm: thủy phân bằng enzym[13,14,23], [15–22], enzym kết hợp với chiếu xạ [24], thủy phân bằng axit HCl[14,25], axit HCl kết hợp sử dụng sóng siêu âm [26] hay chiếu xạ tia gamma kếthợp etanol [27], bằng kiềm kết hợp nhiệt [28] Tuy nhiên các nghiên cứu trên thếgiới mới chỉ tập trung nhiều vào các phương pháp điều chế glucomannan khốilượng phân tử thấp mà chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết về tính chất, cấu trúc hóahọc, về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng, đặc biệt khảnăng giảm hấp thu đường huyết và cơ chế tác dụng chưa được nghiên cứu Nhữngnghiên cứu như vậy về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam lại càng ít và hầunhư chưa có.
Để đóng góp nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học cơ bản về glucomannan cónguồn gốc tại Việt Nam, đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của loại hợpchất này nhằm đưa ra những sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng có giá trị
thực tiễn cao từ cây Nưa Amorphophalus konjac K.Koch ở Việt Nam chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây Amorphophalus konjac K.Koch ở Lâm Đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết” Các mục tiêu cụ thể cho luận án như sau:
1 Tách, xác định tính chất và chứng minh cấu trúc của glucomannan từ củ
(thân củ) cây Amorphophallus konjac K.Koch (A.konjac) thu nhận tại Việt Nam.
2 Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân glucomannan từ cây
A.konjac để chế tạo các loại glucomannan với khối lượng phân tử thấp bằng các
phương pháp khác nhau
3 Thăm dò hoạt tính hạ đường huyết và cơ chế hạ đường huyết của sảnphẩm thủy phân
Trang 14Chương 1 TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu chung về glucomannan
1.1.1 Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan
Glucomannan là một polysacarit mạch thẳng gồm các mắt xích D-mannose
và D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-(1→ 4) glycosid, được tách từ củ
(thân củ) của một số loài Nưa (Amorphophallus sp - họ Ráy), cây lô hội (Aloe vera)
và trong một số loại rong biển Các mạch nhánh có thể chiếm khoảng 8% thông qualiên kết β-1,3-glycosid và β-1,6-glycosid Trên một số nguyên tử C6, nhóm OHđược axetyl hóa với độ axetyl hóa (degree of acetylation) khoảng 5÷10% Tỷ lệmannose/glucose phụ thuộc vào nguồn gốc glucomannan và thường dao động từ1,6/1 đến 3,6/1 Glucomannan là một polysacarit với nhiều tính chất quý như khảnăng tương hợp và phân hủy sinh học, có khả năng hình thành gel thuận nghịch vàkhông thuận nghịch, khối lượng phân tử khoảng 200÷2000 kDa [2-9]
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của glucomannan
1.1.2 Tính chất vật lý của glucomannan
Dạng tồn tại: Ở điều kiện thường, tùy thuộc vào phương pháp tách chiết,
glucomannan tồn tại ở dạng bột màu trắng đến vàng
Tính tan: Khi tồn tại ở dạng tinh thể, trật tự sắp xếp của polyme không phải
là của ion, nguyên tử, phân tử như ở các nhóm vật liệu khác mà là của mạch phân tử.Trong polyme tinh thể các mạch sẽ sắp xếp sao cho các nguyên tử ở trong một trật
Trang 15như hoàn toàn (95%) phụ thuộc vào tốc độ làm nguội khi đông rắn và hình thái cấutạo của mạch Để có sắp xếp trật tự, polyme phải được làm nguội chậm để các mạch
có thời gian chuyển động và sắp xếp lại theo trật tự
Đặc điểm chung của các polysacarit là trong mạch phân tử chứa nhóm chứchydroxyl có khả năng tạo liên kết hydro chặt chẽ Đây là nguyên nhân chính tạo nêntính chất kết tinh của polyme Khi tồn tại ở trạng thái kết tinh, polysacarit khó hòatan, khó tham gia phản ứng hóa học nên khả năng ứng dụng bị hạn chế Khi ở dạngcấu trúc vô định hình, polyme có diện tích bề mặt riêng lớn, dễ tan trong nước vàtrong một số hệ dung môi, dễ tham gia các phản ứng hóa học…[29]
Tùy thuộc vào nguồn gốc cấu trúc khác nhau mà glucomannan có độ tan
khác nhau Glucomannan tách từ cây A.konjac tan tốt trong nước trong khi glucomannan tách từ cây A.paeoniifolius không tan trong nước Yếu tố quyết định
tính tan của glucomannan chính là khối lượng phân tử và độ axetyl hóa.Glucomannan có độ axetyl hóa thấp, liên kết hydro trong mạch phân tử mạnh sẽkhông tan trong nước, trong khi đó glucomannan có độ axetyl hóa cao, khả nănghình thành liên kết hydro nội và ngoại phân tử kém nên có khả năng tan trong nước.Glucomannan có DA≈0 hầu như không tan trong nước lạnh mà chỉ trương trongnước nóng hình thành dạng hồ hóa [30,31]
Glucomannan từ cây A.konjac có khả năng hấp thụ nước từ 100 - 200 lần, tạo
ra dung dịch dạng dẻo nhớt, độ nhớt của dung dịch glucomannan 1% vào khoảng
5000 - 40000 mpas, cao nhất trong các tác nhân làm đặc có nguồn gốc tự nhiên [30,31] Glucomannan có độ axetyl hóa càng cao, khả năng hình thành gel càng giảm.Glucomannan có độ axetyl hóa thấp, gel có thể hình thành khi được gia nhiệt.Glucomannan có khả năng tạo gel ổn định trong môi trường kiềm loãng như NaOH,Ca(OH)2hay Na2CO3có pH=9 10 Trong môi trường kiềm, quá trình hình thànhgel xảy ra do sự deaxetyl hóa nhóm axetyl trong mạch đại phân tử Sự thay đổi cấutrúc này tạo điều kiện cho việc thiết lập các liên kết hydro, hình thành các tương tác
kỵ nước giữa các phân tử glucomannan Kết quả của quá trình này là hình thành cấutrúc mạng lưới không gian hay cấu trúc gel của glucomannan [32–36]
Trang 16Dung dịch konjac glucomannan loãng không tạo gel ở nhiệt độ thường.Konjac glucomannan còn có khả năng tạo gel tốt khi sử dụng phối hợp với các tácnhân tạo gel khác như alginat, carrageenan, xanthan…[37,38]
Khối lượng phân tử: Khối lượng phân tử của polyme là một đại lượng quan
trọng ảnh hưởng đến tính chất cơ-lý-hóa của polyme như: độ bền cơ học, tính chấtđàn hồi, độ mềm dẻo, khả năng hòa tan…Khối lượng phân tử trung bình củapolyme là đại lượng mang tính chất thống kê trung bình và được biểu diễn qua 3 giátrị: Khối lượng phân tử trung bình số Mn, khối lượng phân tử trung bình khối Mwvàkhối lượng phân tử trung bình nhớt Mv Để xác định khối lượng phân tử trung bìnhcủa polyme người ta có thể dùng phương pháp trực tiếp như: đo độ thẩm thấu hoặcphương pháp gián tiếp như: đo độ nhớt Theo các nghiên cứu, glucomannan có khốilượng phân tử trung bình từ 200 2000 kDa tùy thuộc vào nguồn gốc và phươngpháp tách chiết [39–41]
1.1.3 Tính chất hóa học của glucomannan
Trong mạch đại phân tử glucomannan có chứa các nhóm chức có khả năngtham gia các phản ứng hoá học khác nhau, gồm: phản ứng thủy phân liên kết β-(14) glycosid, phản ứng ở nhóm hydroxyl (-OH) và nhóm axetyl (CH3CO-)
Phản ứng thủy phân cắt liên kết β-(14) glycosid
Glucomannan bị đề polyme hóa với sự cắt đứt các liên kết β-(14) glycosidtrong phân tử tạo ra các oligoglucomannan và cuối cùng là D-mannose và D-glucose, tác nhân thủy phân có thể là axit hoặc enzym Trong số các phương phápthủy phân hợp chất cao phân tử thì phương pháp sử dụng tác nhân axit kết hợp tiền
xử lý mẫu bằng rung siêu âm (sonication) cho phép nhận được sản phẩm có sự phân
bố khối lượng phân tử đồng đều hơn so với các phương pháp khác Sử dụng rungsiêu âm đơn thuần cũng có thể thủy phân mạch glucomannan mà không gây ra bất
kỳ thay đổi nào đến cấu trúc hóa học của nó
Một số hệ enzym như: β-mananase, β-manosidase, β-glucosidase có thểphân cắt chọn lọc liên kết β-(14) glycosid của glucomannan tạo ra oligome có
Trang 17khối lượng phân tử thấp mà vẫn giữ được các đặc tính và tác dụng sinh học quý củaglucomannan ban đầu [23,25].
Phản ứng deaxetyl hoặc axetyl hóa
Tác giả Chen và các cộng sự đã thực hiện phản ứng đề axetyl hóa glucomannanbằng các tác nhân khác nhau như NaOH, Na2CO3, Na3PO4, Ca(OH)2 và sử dụngglucomannan đã đề axetyl hóa làm chất tạo màng Kết quả cho thấy, độ đề axetylhóa có ảnh hưởng đến các tính chất cơ lý của màng glucomannan Phản ứng nàycũng được Lui và cộng sự đã thực hiện tạo sản phẩm không tan trong nước hấp phụtanin [42] Nhiều tác giả đã sử dụng NaOH để thủy phân nhóm acetyl củaglucomannan ở pH >10 Feng Liu (2010) và cộng sự đã thực hiện phản ứng đềacetyl hóa bằng NaOH với tỷ lệ NaOH/glucomannan là 0,7/40 trong 240ml dungdịch etanol (100/140 v/v) ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 12giờ thu được sản phẩm
có DA =0 [43] Năm 2014, B Solo-de-Zaldívar và cộng sự đã thủy phânglucomannan bằng KOH ở pH = 10,7 nhiệt độ 30oC trong thời gian 3 giờ thu đượcsản phẩm glucomannan đề acetyl hóa có khả năng tạo màng có khả năng hấp thụnước tốt [44]
Phản ứng đồng trùng hợp ghép
Konjac Glucomannan có khả năng tham gia phản ứng đồng trùng hợp ghépvới một số monome khác nhau như: metylmetacrylat, axit acrylic, acrylamit dướitác dụng của chất khơi mào gốc như hidropeoxit, KMnO4/axit oxalic Phản ứng xảy
ra theo cơ chế gốc Tác giả Li-Gui Chen và cộng sự đã tổng hợp hydrogel trên cơ sởglucomannan ghép với axit acrylic (AA) [47] (Sơ đồ 1.1)
Trang 18Sơ đồ 1.1 Phản ứng tổng hợp hydrogel trên cơ sở glucomannan ghép với axit
acrylic (AA)
1.1.4 Hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của glucomannan
Vai trò của các chất xơ hòa tan đối với sức khỏe ngày càng được nhắc đếnnhiều với các bằng chứng khoa học Chất xơ nghèo năng lượng cho cơ thể, bản thân
nó không cung cấp chất dinh dưỡng cũng như không được tiêu hóa tại ruột nhưng
sự hiện diện của nó đã đem lại nhiều lợi ích đối với sức khỏe, phòng chống nhiềubệnh chuyển hóa Chất xơ hòa tan khi vào trong ruột có tác dụng như chiếc chổiquét các chất béo không có lợi như cholesterol ra khỏi ruột, hạn chế hấp thu chúngvào máu do đó làm giảm đáng kể các chất béo trong máu, giảm được nguy cơ mắcbệnh tim mạch Chất xơ có vai trò điều hòa sự hấp thu đường vào máu, nhờ vậy rất
có lợi đối với bệnh nhân tiểu đường [48,49]
Theo nghiên cứu của Chearskul và cộng sự, glucomannan có tác dụng thỗ trợđiều trị bệnh tiểu đường tuyp 2 nhờ kìm hãm hormon ghrelin kích thích thèm ăn, vàhormon leptin giúp điều hòa cảm giác đói và cân nặng[50]
Theo nghiên cứu của Chen và cộng sự bổ sung 3,6 g glucomannan/ngàytrong 28 ngày có tác dụng hỗ trợ giảm đường huyết sau ăn, choleserol máu, lipit
Trang 19Theo một số công bố khác, glucomannan còn có thể hỗ trợ làm tăng độ nhạycủa insulin, kiểm soát hội chứng kháng insulin, giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch ởbệnh nhân tiểu đường tuyp 2, giảm nồng độ lipit huyết tương và glucose máu, giảmcân và hỗ trợ điều trị cao huyết áp với liều sử dụng 1 ÷ 13 g/ngày[11,52].
Việc bổ sung KGM làm cải thiện nồng độ lipit máu bởi sự tăng bài tiết quaphân của các sterol trung tính, axit mật và làm giảm mức glucose tăng cao trongbệnh tiểu đường KGM có thể là chất bổ sung cho chữa trị bệnh tiểu đường kèmtăng lipit máu [51–55]
Do khả năng phân huỷ sinh học và tạo dạng gel, konjac glucomannan được
sử dụng trong sản xuất mỹ phẩm, dược phẩm Theo Kang Wang và cộng sự, vật liệudạng hạt của alginat-KG-chitosan có thể được sử dụng làm chất mang để kiểm soát
sự phân giải của thuốc [38]
KGM có khả năng tan trong nước tạo dung dịch có độ nhớt cao, tăng cườngtính bám dính sinh học (bio-adhesive) Peter và các cộng sự đã phát minh ra mộthợp chất dược học có khả năng tăng cường khả năng bám dính sinh học, được làmbằng tổ hợp alginate, xanthan gum với glucomannan Các hợp chất này có thể đápứng được cả hiệu quả bảo vệ và chữa lành tổn thương trên bề mặt màng nhày choviệc xử lý các rối loạn thực quản [56]
Chen và cộng sự đã công bố một phương pháp sử dụng carrageenan vàglucomannan để cố định tế bào Hỗn hợp bao gồm 4090% carrageenan và 6010%konjac glucomannan được phủ lên hạt gạo để thu được ngũ cốc dùng cho người ănkiêng Sản phẩm có thể được nấu theo cách thông thường [51]
Hơn nữa, với các đặc tính giá thành thấp, khả năng tạo màng tốt, khả nănghoà hợp và phân huỷ sinh học cao, cũng như là khả năng tạo dạng gel làm choKGM trở thành một loại vật liệu polyme mới có nhiều triển vọng trong nhiều lĩnhvực bao gói và vật liệu bảo quản, vật liệu nhả chậm [57]
Sản phẩm konjac glucomannan thủy phân (LKGM) có nhiều hoạt tính sinhhọc quý đã được nghiên cứu Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng LKGM có giá
Trang 20có chọn lọc Lactobacillus và Bifidobacterium trong ruột già bằng cách ngăn chặn sự
bám dính của chúng trên bề mặt niêm mạc ruột của động vật, LKGM có thể ngăn
chặn sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh như Coliforms, Enterococci, Staphylococcus aureus [10].
Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng LKGM có tiềm năng lớn như mộtchất chống oxy hóa tự nhiên LKGM có thể hoạt động trực tiếp như một chất chốngoxy hóa hoặc hoạt hóa các enzym chống oxy hóa nội bào [80]
Tác giả Yu-Heng Mao và cộng sự đã nghiên cứu khả năng bảo vệ các vếtthương hở khỏi nhiễm trùng của konjac glucomannan thủy phân Kết quả nghiêncứu cho thấy KGM (≈8,8.108Da) bị suy giảm một phần với siêu âm cường độ caođến KGM-US (≈1,8.106) và sau đó thủy phân bằng axit trifloaxetic (TFA) tạo sảnphẩm thủy phân có khối lượng phân tử trung bình đạt 1369Da Sản phẩm có tácdụng với hầu hết các chủng vi khuẩn chống lại penicillin và ức chế streptomycin,làm tăng nồng độ ức chế và diệt khuẩn tối thiểu (MIC và MBC) một cách đáng kể,
và KGM thủy phân cũng cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc tăng cường MBC củaenrofloxacin, penicillin, tetracyclin và streptomycin Kết quả cho thấy KGM tựnhiên và KGM thủy phân có tác dụng bảo vệ đối với vi khuẩn probiotic trong ruộtcủa người chống lại những tổn thương do thuốc kháng sinh đặc hiệu gây ra [67]
1.2 Cây nưa A.konjac K.Koch và quy trình tách chiết glucomannan
1.2.1 Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch
Việt Nam có khoảng 25 loài Nưa phân bố từ Bắc vào Nam Năm 1942,Ganepain biên soạn họ Ráy ở Đông Dương trong cuốn “Thực vật chí Đông Dương”
ông đã mô tả 4 loài Nưa có ở Việt Nam là: Nưa chuông – A.paeoniifolius, Nưa Bắc
Bộ - A tonkinensis, Nưa mekong – A mekongensis, Nưa đứt đoạn – A interruptus.
Năm 1994, trong một số bài báo khoa học, Hetterscheid công bố một số các loài
Nưa phát hiện ở Việt Nam như Nưa hoa vòng – A verticillatus từ mẫu thu ở Cúc Phương, Nưa lông – A lanuginosus từ mẫu thu ở Hòn Tre (Nha Trang), Nưa trạm trổ - A scaber từ mẫu thu ở Nam Bộ v.v Sau đó, Nguyễn Văn Dư cùng với Hetterscheid công bố thêm một số loài Nưa mới như Nưa phong nha – A.
Trang 21tuberculatus từ mẫu ở Phong Nha – Kẻ Bàng, Nưa hoa đực khối – A synandrifer ở Ninh Thuận, Nưa Kiên lương – A.kienluongensis Trong các chuyến khảo sát thực
địa ở Việt Nam năm 2012, Nguyễn Văn Dư đã phát hiện ra một số loài như Nưa vân
nam – A yunnanensis, Nưa đầu nhăn – A corrugatus, Nưa krausei – A krausei, Nưa konjac – A Konjac [6].
Định danh khoa học Nưa konjac – A Konjac [58]
Tên Khoa học: Amorphophallus konjac K Koch, Wochenschr Gärtnerei
Pflanzenk 1: 262 1858
Tên đồng nghĩa: Amorphophallus mairei H Léveillé; A nanus H Li & C L Long; A rivieri Durieu ex Riviere; Brachyspatha konjac (K Koch) K Koch; Hydrosme rivieri (Durieu ex Riviere) Engler; Proteinophallus rivieri (Durieu
ex Riviere) J D Hooker
Tên địa phương: Nưa konjac (Vie.), Hua mo yu (Tr.)
Nưa A.konjac là loại cây thảo thân củ Củ hình cầu dẹp, đường kính tới
2030 cm, ngoài mầu nâu hay nâu nhạt, hơi bóng, theo mùa mọc ra nhiều thân chồithân dạng thân rễ có phần đỉnh mập, kích thước tới 50 3 cm Lá đơn độc, cuống lá
có màu sắc rất biến đổi, thường màu trắng xỉn hoặc màu kem xỉn, gần như toàn bộ
có các đốm hình vạch hay hình đường mầu xanh đen và các chấm trắng nhỏ hơnhoặc có nhiều đốm xanh đen nhỏ, kích thước 100 8 cm, nhẵn, hơi có sáp ở gốc;Phiến lá xẻ thùy nhiều, đường kính tới 200 cm, sống có cánh hẹp; phiến chét hìnhbầu dục, xanh đục, kích thước 210 26 cm, có mũi nhọn ở đỉnh Bông mo cócuống dài, cuống có màu sắc giống cuống lá, kích thước 110 x 5 cm Mo hình bầudục tới mác, có khi hình trứng tới tam giác rộng, kích thước 1060 1055 cm,ống mo và phiến mo phân biệt, mép của phiến lượn sóng, đỉnh nhọn; có nhiều mụncơm ở mặt trong gốc ống mo, mụn cơm nhỏ, dạng chấm; phiến thẳng, màu nâu đenđều ở mặt trong, bóng, lượn sóng và cong gập theo chiều dọc, mép ở gốc trải rộng;mặt ngoài mo nâu nhạt xỉn với các đốm xanh đen, hay xám trắng xỉn có các chấmxanh đen thưa thớt Bông nạc có mùi thối trong thời gian thụ phấn, tiết ra nhiều giọt
Trang 22dài 211 cm, rộng 14 cm ở gốc và tới 6 cm ở đỉnh, các hoa xếp dày đặc hoặc thưathớt; bầu trắng hoặc hơi hồng, đỉnh tía, hình cầu dẹp, hình bầu dục hoặc có thiếtdiện gần tròn, dài 22,5 mm, rộng 24 mm, 23 ô; vòi nhụy tía, mảnh, dài 15 mm,rộng 0,71 mm, thường phân nhánh ở đỉnh; núm nhụy màu nâu vàng xỉn, dẹp, lượnsóng ở mép, thường lõm ở giữa, 23 (4 thùy), mặt cắt hình bầu dục hay hình tamgiác, cao 0,5 mm, rộng 1,52 mm, bề mặt xù xì; giữa phần đực và cái thường cóphần bất thụ; phần đực hình trụ, hơi hình thoi, hoặc hình nón, kích thước 212 16 cm, hoa dày đặc; hoa đực gồm 35 nhị; bao phấn dài 22,5 mm; chỉ nhị màuvàng cam hoặc hơi trắng, rộng 0,51; bao phấn màu xám trắng hay màu kem, cụthoặc gần cụt, kích thước 11,5 0,82 mm; trung đới màu tía, sau thành xám khithụ phấn, hơi nhô; mở lỗ ở đỉnh, lỗ hình bầu dục hay hình thận; phần phụ hình nónhay hình thoi hẹp, thường dẹp ở phía bên và có nhiều rãnh nông không đều, dài1085 cm, đường kính 56 cm, nhọn, màu nâu tía hay đậm hay nhạt, nếp nhănnhiều (Hình 1.2).
Sinh học và sinh thái: Cây mọc dưới tán rừng núi đá vôi ở độ cao 15002000
m Ra hoa tháng 4, quả tháng 6
Nưa A Konjac là loài Nưa được quy hoạch thành cây công nghiệp với quy
mô hàng nghìn ha tại các nước Trung Quốc, Nhật Bản [4],[59],[60] Hiện nay TrungQuốc là nước trồng và sản xuất bột konjac glucomannan lớn nhất trên thế giới, kế
đến là Nhật Bản Diện tích canh tác cây A.konjac của Trung Quốc lên tới gần 200
km2và có khoảng 400 nhà máy sản xuất bột konjac glucomannan Có cả một hiệp
hội và nhiều trung tâm mang tên Nưa konjac như Hiệp hội Konjac (Konjac
Association), “Konjac Research Centre” thuộc Đại học Tây Nam Trung Quốc hay
“Globle Wholesale and Distribution Centre” Hàng năm họ xuất khẩu hàng trămngàn tấn bột konjac glucomannan và nhiều sản phẩm khác từ củ Nưa sang các nướcphát triển [59,61]
Trang 23Hình 1.2 Hình ảnh cây và củ Nưa A.konjac được trồng thử nghiệm tại Lâm Đồng
Ở Nhật Bản, chỉ 2 vùng Jinnejo và Uedama, ngay từ những năm 70 của thập
kỷ trước, hàng năm khoảng hơn 15 ngàn ha Nưa được trồng và sản lượng lên tớihàng trăm tấn [4, 58, 59]
1.2.2 Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac
Trong những năm qua, công nghệ tách chiết và tinh chế glucomannan luônđược quan tâm nghiên cứu, cải tiến nhằm nhận được glucomannan có độ sạch cao.Hàm lượng glucomannan thay đổi trong suốt mùa sinh trưởng và đạt cao nhất ở thờiđiểm trước khi rụng lá Ngoài ra, hàm lượng và chất lượng của glucomannan cònphụ thuộc rất nhiều yếu tố như phương pháp tách chiết, điều kiện canh tác, thờiđiểm thu hoạch…Cho tới nay có 3 phương pháp chủ yếu được áp dụng để tách chiếtglucomannan: phương pháp khô (cơ học), phương pháp ướt (hóa học) và phươngpháp kết hợp ướt –khô [59,62,63]
Trang 24Củ Amophophalus Konjac tươi
Lát Amophophalus Konjac tươi
Lát Amophophalus Konjac khô
Bột Amophophalus Konjac thô
Bột KGM
Rửa sạch, bỏ vỏThái lát
Sấy khôphơi khô
Nghiền nhỏ
Sàng lọcThổi, tách
Sơ đồ 1.2 Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khôTheo phương pháp khô (sơ đồ 1.2) [63], củ cây Nưa được thái lát, phơi khô
tự nhiên bằng ánh nắng mặt trời hoặc sấy khô bằng khí nóng, sau đó nguyên liệuđược nghiền mịn và tách tạp chất bằng phương pháp thổi khí nóng có bổ sung khí
SO2để ngăn các quá trình oxi hóa gây ra màu cho sản sản phẩm (khi đó các hạt tinhbột nhẹ hơn sẽ bị tách ra khỏi glucomannan) Tuy nhiên, nhược điểm của phươngpháp khô là tạp chất và glucomannan có xu hướng bó chặt lại với nhau do đó rấtkhó để tách glucomannan ra khỏi tạp chất, một lượng không nhỏ glucomannan cóthể lẫn vào tạp chất bị tách loại, dẫn đến hiệu suất tách thấp Do vậy, sản phẩm nhậnđược bằng phương pháp khô thường có độ sạch không cao, tồn dư hàm lượng nhấtđịnh lưu huỳnh trong sản phẩm và do đó không được ứng dụng trong một số lĩnh
Trang 25vực thực phẩm, dược phẩm và chỉ bán được với giá thành thấp Theo một số kết quảnghiên cứu trước đây của các tác giả, sản phẩm tách được theo phương pháp khôchỉ đạt cấp độ 3, có màu nâu, không đáp ứng Tiêu chuẩn NY/T494-2002 (Bộ Nôngnghiệp Trung Quốc, 2002) [64].
Thái lát
Củ Amophophalus Konjac
Lát Amophophalus Konjac
Hỗn dich bột Nưa Konjac trong etanol
Bột Amophophalus Konjac thô
Tái sử dụng
Rửa sạch, bỏ vỏ
Bổ sung etanol tỉ lệ etanol/H2O1,5/1
Ly tâm, thu tủa, sấy
NghiềnSàng lọcNghiền
Bột KGM
Sơ đồ 1.3 Quy trình chiết tách bột glucomannan theo phương pháp khô- ướt
Theo phương pháp ướt, củ A.konjac được rửa sạch, nghiền thành bột konjac
trong môi trường dung môi etanol có bổ sung tác nhân chống nâu hóa, ly tâm và sấykhô Do konjac glucomannan có khả năng tạo gel tạo dung dịch có độ nhớt cao.Hỗn hợp được ly tâm tách glucomannan ở dạng tủa nổi Rửa bột konjacglucomannan thô bằng dung môi hữu cơ, sấy khô sản phẩm [63]
Trang 26Ưu điểm của việc sử dụng etanol là sản phẩm thu được có chất lượng cao đápứng được lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm Tuy nhiên, nhược điểm của phươngpháp này là chi phí cao do phải dùng lượng dung môi lớn, hiệu suất thu hồi sảnphẩm không cao.
Hiện nay để tăng chất lượng của bột konjac glucomannan, một số tác giả đãtiến hành nghiên cứu kết hợp hai phương pháp trên Quá trình sản xuất bột konjacglucomannan được thực hiện theo sơ đồ 1.3
Theo phương pháp này vừa giảm chi phí, thời gian sản xuất, mà sản phẩmthu được có chất lượng cao đáp ứng tiêu chuẩn trong sản xuất dược phẩm, thựcphẩm
1.3 Phản ứng cắt mạch glucomannan
Do glucomannan khối lượng phân tử thấp (LKGM) có nhiều tiềm năng ứngdụng trong các lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm, trong thời gian qua, nhiều nhómtác giả nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm tìm ra phương pháp cắt mạchglucomanan hiệu quả Về cơ bản, phản ứng cắt mạch glucomannan được chia thànhhai nhóm phương pháp chính: bằng phương pháp lý-hóa (physicochemicaldegradation) và bằng enzym (biodegradation)
1.3.1 Cắt mạch bằng các phương pháp lý -hóa học
Tương tự như các loại polysacarit, glucomannan có thể bị phân cắt liên kếtglycosid bằng axit vô cơ và hữu cơ như: H3PO4, HCl, axit citric, axit tartaric tạo racác oligosacarit và cuối cùng là các monosacarit
Trong môi trường axit HCl, phản ứng thủy phân xảy ra theo cơ chế thế SN1.Mặc dù dùng axit HCl cho hiệu quả cắt mạch nhanh, sản phẩm có khối lượng phân
tử giảm, độ acetyl hóa thấp hơn nhưng phản ứng khó kiểm soát, sự phân bố khốilượng phân tử của sản phẩm không đồng đều
Hsiao-Ling Chen (2005) nghiên cứu về tác dụng lợi khuẩn của glucomannan
và glucomannan thủy phân bằng axit HCl đến hệ vi sinh vật đại tràng của chuột.Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy glucomanan khối lượng phân tử thấp hơn có tác
Trang 27dụng lợi khuẩn (prebiotic) nhanh và tốt hơn đối với hệ vi sinh vật đại tràng so vớiglucomannan chưa thủy phân [25].
Cheng và cộng sự (2010) đã dùng axit HCl kết hợp với sóng siêu âm để thủyphân glucomannan thu được sản phẩm glucomannan có khối lượng 5,6105Da [26]
Jiangyun Liu (2011) đã thủy phân glucomannan Bletillla striata (Bletillan)
với mức độ thủy phân và độ axetyl hóa mong muốn Sản phẩm thủy phân được ứngdụng để vận chuyển thuốc Phản ứng được thực hiện ở 90 °C tại các nồng độ HCl0,10 M Để tăng tính tan, glucomannan được acetyl hóa bằng phản ứng với aceticanhydride trong dung môi DMF Khối lượng phân tử, cấu trúc hóa học của sảnphẩm thủy phân được nghiên cứu bằng các phương pháp hóa lý hiện đại nhưHPGPC, IR, NMR Dược động học của quá trình vận chuyển thuốc được nghiêncứu bằng cách tiêm vào tĩnh mạch thỏ [12]
Shu-Lan Yeh (2010) và cộng sự nghiên cứu về tác dụng bảo vệ tế bào Caco-2của glucomannan và glucomannan thủy phân bằng 0,2 N HCl (25 g/l) trong 40 phút,
có độ trùng hợp DP8 và DP4 Kết quả nghiên cứu cho thấy sản phẩm thủy phân cótác dụng tốt hơn so với glucomannan chưa thủy phân [65]
Tingtiao Pan và cộng sự (2013) nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng tiagamma kết hợp với H2O2 Nghiên cứu này chỉ ra rằng khi chỉ sử dụng H2O2 chohiệu quả cắt mạch không cao (480 kDa) trong khi hiệu quả cắt mạch được cải thiện
rõ rệt khi kết hợp đồng thời với chiếu xạ tia gamma (64,8 kDa) Sản phẩm có độ tantrong nước lên đến 97,17% Cấu trúc của các sản phẩm thủy phân và glucomannanban đầu được khảo sát bằng quang phổ tử ngoại nhìn thấy (UV), hồng ngoại biếnđổi Fourier (FT-IR) và nhiễu xạ tia X (XRD) Kết quả cho thấy không có sự thayđổi đáng kể trong cấu trúc của sản phẩm sau khi depolyme hóa, mặc dù độ kết tinhcủa KGM giảm [66]
W Jin và cộng sự (2014) đã chiếu xạ glucomannan bằng 60Co khi có mặtcủa etanol nhận được sản phẩm có khối lượng phân tử giảm từ 1.4 106 Da xuốngcòn 6105Da với liều chiếu xạ 3.6 kGy, 50% etanol Với liều chiếu xạ tăng lên 6,0kGy, độ nhớt của sản phẩm giảm từ 139,8 Pas xuống còn 2,928 Pas Các tính chất
Trang 28Yu-Heng Mao và cộng sự (2018) đã thủy phân glucomannan có khối lượngphân tử ban đầu là ~ 8,8 × 108Da bằng phương pháp siêu âm cường độ cao (20 kHz,750W) nhận được glucomannan sản phẩm có khối lượng phân tử giảm xuống còn
~1,8×106Da Sau đó được thủy phân tiếp bằng axit trifluoroactetic (trifloacetic axid2M, 70°C, 4 giờ) nhận được sản phẩm thủy phân khối lượng phân tử 1369 Da Sảnphẩm sau thủy phân (5g/lít) có tác dụng bảo vệ lợi khuẩn đường ruột (ruột kết) củacon người khi sử dụng một số kháng sinh đặc hiệu như penicilin streptomycin [67]
Weiping Jin (2014) nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng kiềm kết hợpnhiệt pH của phản ứng được điều chỉnh ở 7,2; 8,2;9,2, nhiệt độ thay đổi từ 25 đến
80oC Độ nhớt của sản phẩm được đánh giá bằng nhớt kế Ubbelodhe Khối lượngphân tử của sản phẩm thủy phân được tính toán dựa trên phương trình Mark–Houwink với k và α lần lượt là 5,96×10−2và 0,73 Tại pH 5,6, sau 2 giờ, khối lượngphân tử glucomannan giảm nhẹ từ 8,54×105 xuống còn 5,68×105ở nhiệt độ 80oC Ở
pH 9,2, nhiệt độ 80oC sau 2 giờ khối lượng phân tử glucomannan giảm từ 8,54 ×
1.3.2 Thủy phân với xúc tác enzym
1.3.2.1 Đặc điểm của xúc tác enzym
Enzym là các hợp chất protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa họcnhất là các phản ứng xảy ra trong quá trình trao đổi chất của các cơ thể sống Chúng
có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định, có tính chọn lọc cao
và cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với các xúc tác thông thường Sỡ dĩ phản
Trang 29enzym được hạ xuống rất thấp so với trường hợp không có xúc tác và cũng nhỏ hơnrất nhiều so với các xúc tác khác Vì có tính đặc hiệu cao nên phản ứng thủy phâncủa enzym ít tạo thành sản phẩm phụ hơn so với các phương pháp hóa học [69–75].
Bản chất của enzym là protein nên các tác nhân gây biến tính protein nhưnhiệt độ, axit, kiềm, tác động cơ học…đều có thể làm enzym biến tính thuận nghịchhoặc không thuận nghịch Trong cấu tạo của enzym một cấu trúc rất đặc biệt gọi làtrung tâm hoạt động Không phải tất cả các phần của enzym đều tham gia vào hoạtđộng xúc tác mà chỉ có trung tâm hoạt động mang tính đặc hiệu trong phân tửenzym mới tham gia xúc tác phản ứng [69,70]
Enzym có nhiều ưu điểm so với các chất xúc tác hoá học truyền thống Nổibật nhất là tính hiệu quả, tính đặc hiệu và tính chọn lọc của chúng Enzym chỉ xúctác các phản ứng với một phổ cơ chất rất hẹp, một nhóm chất duy nhất, điều này cónghĩa là phản ứng đã lựa chọn có thể được xúc tác để loại trừ các phản ứng phụ, loại
bỏ các sản phẩm phụ không mong muốn [69] Như vậy, có thể đạt được hiệu suấtcao nhờ giảm các chi phí về vật chất Tính hiệu quả của xúc tác sinh học được thểhiện là làm tăng tốc độ các phản ứng hóa học Nhiều phản ứng khi không có enzymxúc tác, xảy ra rất chậm hoặc hầu như không xảy ra Các phản ứng trong cơ thểsống thường xảy ra rất nhanh từ 10 tới 30 giây và hầu như không xảy ra nếu đưa rangoài cơ thể
Tốc độ phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa tức
là mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để cắt đứt liên kết cầnthiết và hình thành các liên kết mới Năng lượng hoạt hóa càng lớn thì vận tốc phảnứng càng chậm và ngược lại Do làm giảm năng lượng hoạt hóa phản ứng, các chấtxúc tác có tác dụng thúc đẩy vận tốc phản ứng hóa học Trong phản ứng thủy phân
có xúc tác enzym, các enzym có tác dụng làm giảm năng lượng hoạt hóa cho phảnứng bằng cách tạo sản phẩm trung gian, nghĩa là nó không đóng vai trò là chất thamgia phản ứng Sau phản ứng, chất xúc tác lại phục hồi về trạng thái ban đầu Hầunhư tất cả các biến đổi hóa sinh trong tế bào và cơ thể sống đều được xúc tác bởienzym ở pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường trong khi đa số các chất xúctác hóa học khác lại chỉ xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao Chính nhờ việc tạo được
Trang 30nhất về mặt năng lượng để thực hiện phản ứng mà enzym có được những khả năngđặc biệt đã nêu trên [69,70].
Trong phản ứng có sự xúc tác của enzym, nhờ sự tạo thành phức hợp trunggian enzym - cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa Cơ chất kết hợp vào enzym, do kếtquả của sự phân cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của cácliên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động năng cũng nhưthế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham giaphản ứng dễ dàng Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tác enzym không những nhỏhơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trườnghợp có chất xúc tác thông thường Nhiều dẫn liệu thực nghiệm đã cho thấy quá trìnhtạo thành phức hợp enzym cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm,giải phóng enzym tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau
- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡcác liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng
- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzym được giải phóng ra dướidạng tự do Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ESlà: tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals Mỗi loại liênkết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước
1.3.2.2.Các hệ enzym thủy phân mannan
Mannan, một hemicellulose quan trọng, là thành phần chính trong nhiều loàithực vật Mannan đa dạng về cấu trúc và được chia thành bốn loại chính dựa trênthành phần đường ở mạch chính, bao gồm: mannan mạch thẳng, glucomannan,galactomannan và galactoglucomannan Nhờ có nhiều đặc tính dược lý, trị liệu, y
Trang 31sinh ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm nên các nghiên cứu vềpolysacarit trên cơ sở các mannan hiện nay rất được quan tâm nghiên cứu [76].
Hình 1.3 Cấu trúc của một số loại β,1–4 mannan/heteromannan
Các nhóm enzym chính có khả năng phân hủy mannan bao gồm: 1,4-β-Dmannan mannohydrolase (β-mannanase, EC 3.2.1.78), 1,4-β-D- mannopyranosidehydrolase (β-mannosidase, EC 3.2.1.25) và 1,4-β-D glucoside glucohydrolase ( β-glucosidase, EC 3.2.1.21) [72] Để thủy phân các mạch nhánh cần có các enzym
Trang 32như α-galactosidase và acetyl mannan esterase Enzym mannanase tham gia phânhuỷ mannan rất phong phú Chúng có nguồn gốc từ nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn,thậm chí cả nấm men và động thực vật [71–77].
Bảng 1.1 Hệ sinh vật phân huỷ mannan [76]
1 Bacteria Bacillus
licheniformis DSM13 Aspergillus niger BK01
Arabidopsis thaliana
Antarctic springtail (Cryptopygus)
Germinating Coffea arabica grains
Germinating Lilium testaceum bulbs
Lactuca sativa Common sea
Trang 33β-mannanse (EC 3.2.1.78)
Enzym 1,4-β-D mannan mannohydrolases (còn gọi là β-mannanases EC3.2.1.78) thuỷ phân các liên kết bên trong mạch glucomannan một cách ngẫu nhiên,dẫn đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và tăng các nhóm khử Enzym này hoạtđộng mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh củapolysacarit [78,79]
Có hai phương pháp chính để nuôi cấy hệ vi sinh sinh endo-β-mannanase làlên men chìm và lên men ở trạng thái rắn [76] Hai nguồn chính để sinh Endo-β-
mannanse: từ các nguồn vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Bacillus megaterium, Brevibacillus brevis, Pichia pastoris và Kluyveromyces cicerisporus;
từ nguồn nấm chủ yếu từ P pastoris và Aspergillus sp.
Lượng enzym cao nhất thu được sau khi nuôi cấy và tinh chế
endo-β-mannanase thu được từ Chaetomium sp CQ3 là 150030 U/ml và Bacillus sp.
CFR1601 là 8406 U/ml
Trên cơ sở trình tự amino axit, endo-β-mannanases từ các sinh vật khác nhau
đã được phân loại trong họ glycoside hydrolase (GH) 5, 26 và 113 GH 5 mannanase chủ yếu được tạo ra bởi các sinh vật nhân chuẩn như nấm, thực vật và
endo-β-động vật Tuy nhiên, một số ít vi khuẩn như Cellulosimicrobium sp, Petrophila Thermotoga, và Bacillus licheniformis cũng đã sản sinh ra GH5 endo-β-mannanase.
GH 26 endo-β- mannanase được tìm thấy chủ yếu trong vi khuẩn như Bacillus sp CFR1601, Bacillus subtilis WL-3, Clostridium cellulovorans, Paenibacillus polymyxa, Pantoea agglomerans, Pseudomonas fluorescens [71, 72], [76–78].
β-mannosidases ( EC 3.2.1.25)
β-mannosidases (EC 3.2.1.25) giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầukhông khử của polysacarit Enzym này tác động yếu lên vùng vô định hình ở phíabên trong của mạch, nhưng tác động mạnh lên mạch bên ngoài của polysacarit kếttinh hoặc polysacarit đã bị phân giải một phần Hai enzym β-mannanases (EC3.2.1.78) và exo-β- mannosidase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu quả rõ rệt
Trang 34Enzym β-mannosidases có khối lượng phân tử 64.000 Da, pI 5,9 và ổn định
ở pH từ 5,0 ÷ 8,5 và ở nhiệt độ dưới 45oC Enzym này không tác động lênmannobiose, p-nitrophenyl-beta-D-mannoside, hoặc galactomannan
Vi khuẩn thường không sản sinh β-mannosidases, enzym này thường được
tổng hợp từ một số loài nấm như Trichodemar, Aspergillus [78,79]….Bên cạnh đó
người ta cũng đã phân lập được Exo-1,4/1,3- manosidase từ rong biển nâu và lúamạch Enzym thu được từ hai nguồn này không ổn định nhiệt và bất hoạt ở nhiệt độtrên 30oC [71,72]
* β- glucosidases (EC 3.2.1.21)
Enzym 1,4-glucosidase (EC 3.2.1.21) còn gọi là cellobiase Enzym này thuỷ
phân cellobiose và các cellodextrin hoà tan, chúng có hoạt tính thấp và giảm khi
chiều dài của mạch tăng lên Tuỳ theo vị trí mà 1-4-glucosidase được coi là nội bào,
ngoại bào hoặc liên kết với thành tế bào
Một loạt các sinh vật bao gồm trực khuẩn, vi khuẩn, thực vật, nấm và độngvật có thể sản xuất mannosidase Các enzym này thực hiện các chức năng trao đổichất quan trọng trong các sinh vật khác nhau [77]
Ngoài sản xuất mannosidase ngoại bào các vi sinh vật còn sản xuất một sốmannosidase nội bào Mannosidase nhìn chung được sản xuất bởi vi khuẩn Gram
dương đặc biệt là Bacillus sp Tuy nhiên, một số vi khuẩn Gram âm như Arthrobacter sp và Aeromonas aerophila cũng có thể sản sinh
mannosidase Trong số các loại nấm, các nguồn mannosidase phổ biến là từ
chi Aspergillus, trong khi Thermoascus aurantiacus, Polyporussulfureus, Trichosporon cutaneum, Rhizopusniveus cũng sản sinh các enzym mannosidase.
Sản lượng enzym ảnh hưởng bởi nguồn dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy
và các yếu tố hóa lý khác Thời gian nuôi cấy cho năng suất tối ưu sản xuất
mannosidase từ vi khuẩn (Bacillus sp AM-001) là 24 giờ đến 72 giờ, đối với nấm
từ 3 ngày (Aspergillus niger) đến 22 ngày (Phelinus abietis) Tương tự như các
enzym chuyển hóa khác, sản xuất mannosidase tối ưu trong vi khuẩn nằm trong dảitrung tính và trong phạm vi có tính axit yếu [78,79]
Trang 35Quá trình sản xuất mannosidase có thể thực hiện bằng lên men dung dịchhoặc lên men ở trạng thái rắn (SSF) Nguyên liệu sản xuất bằng phương pháp lênmen trạng thái rắn có thể dùng các chất thải nông nghiệp cho năng suất tối đa.Mannosidases từ vi sinh vật có thể hoạt động trong một phạm vi nhiệt độ rộng (37 -
87oC) Hầu hết trong số đó có nhiệt độ từ 45 đến 50oC Độ pH tối ưu cho hoạt độngcủa chúng thay đổi từ 2,5 đến 7,0 với mannosidase từ
Cellulomonas sp và T neapolitana 5068 có hoạt tính tối ưu trong điều kiện kiềm nhẹ pH 8,0 và 7,7, tương ứng Mannosidase từ T neapolitana 5068 có hoạt tính tối
ưu ở 87○C và độ pH 7,7 rất hữu ích cho các ứng dụng mà các enzym ổn định nhiệtkiềm được sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy [78,79]
Đặc tính sinh hóa của β-mannanase [67,68],[72–74].
* pH
GH 5 endo-β-mannanase từ các nguồn nấm hoạt động trong môi trường axit:
A sulphureus (pH 2.4), A aculeatus (pH 2.5), Penicillium oxalicum GZ2, và Trichoderma reesi (pH 3.5) Tuy nhiên, một số endo-β-mannanase thuộc họ GH mới từ A nidulans hoạt động tối ưu ở pH gần trung tính Endo-β-mannanase thu
được từ một số loài nấm giữ được khoảng 80% hoạt tính ở pH axit đến trung tính(4÷7) Các enzym thu được từ nguồn vi khuẩn lại có hoạt tính tốt nhất ở pH trung
tính đến kiềm Ví dụ, endo-β-mannanase (GH5) từ Bacillus nealsonii PN11 và Bacillus N16–5 (GH 26) hoạt động tối ưu ở pH 8 và 9.6, endo-β- mannanase (GH 26) từ Bacillus sp CFR1601 hoạt động tối ưu ở pH 7 Mannanase vi khuẩn ổn định bền vững trong khoảng pH 6÷9 Đặc biệt endo-β- mannanase từ Acinetobacter sp.
ST 1–1 lại hoạt động trong phạm vi pH rộng 3÷10
* Nhiệt độ
Hầu hết các endo-β-mannanase hoạt động tối đa trong phạm vi nhiệt độ
40÷65°C Tuy nhiên, GH 5 endo-β-mannanase từ Cryptopygus antarcticus hoạt động tối đa ở 30°C, Thermotoga neapolitana 5068 và P oxalicum GZ2 GH 5 endo- β-mannanase có hoạt tính tốt nhất ở nhiệt độ 92°C và 80°C.
* Khối lượng phân tử và điểm đẳng điện
Trang 36Khối lượng phân tử của endo-β-mannanase khác nhau nằm trong phạm vi
30 80 kDa (Bảng 1.2) Tuy nhiên, endo-β- mannanase thuộc họ GH 26 từ C thermocellum có khối lượng phân tử thấp: 15 kDa và 18 kDa, tương ứng Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum sinh ra -β-mannanase có khối lượng
phân tử cao (120 kDa) Điểm đẳng điện (pI) của hầu hết các β-mannanase trongkhoảng 48 Trong một số trường hợp, nhiều dạng enzym là đồng dạng, được tạo ra
từ cùng một gen nhưng cấu trúc khác nhau
Bảng 1.2 Đặc điểm của β-mannanase sinh ra từ một số vi sinh vật
Trang 371.3.2.3 Nghiên cứu thủy phân glucomannan bằng enzym
Các nghiên cứu thủy phân glucomannan ban đầu được thực hiện chủ yếu vớimục đích nghiên cứu cấu trúc hóa học của glucomanan
Năm 1961, Perila và cộng sự nghiên cứu thủy phân glucomannan từ câythông (Jack Pine) bằng hemicellulase thương mại, nhận được các monosaccarit,đisaccarit và trisaccarit [13]
Năm 1969, nghiên cứu cấu trúc của glucomannan tách từ cây
Amorphophallus konjac bằng cách thủy phân glucomannan bằng enzym cellulase và
nhận được các oligosacharide: (a) ( 1-4)-D-mannopyranosyl-D-mannose (b) D-mannose-D-glucose (c) (1-4)D-glucose-D-mannose [14]
(l-4)-Năm 2004, Guanji Li và cộng sự [16] nghiên cứu động học phản ứng thủy
phân konjac glucomannan bằng β-mannanase từ Bacillus sp ở pH9, 30oC
Năm 2012, Xuegang Luo và cộng sự thủy phân Konjac glucomannan khốilượng phân tử từ trung bình đến cao sử dụng xúc tác enzym β-mannanase 3290 U/g
và khảo sát tính chất của sản phẩm thủy phân bằng SEC, FTIR, UV, XRD và TGA.Phản ứng được thực hiện bằng đệm phosphat pH7, 50oC, trong 10 phút Theo kếtquả nghiên cứu của công trình này, glucomannan thủy phân có khối lượng phân tử
Mw giảm xuống 1,721×104Da, có cấu trúc giống như glucomannan ban đầu Kếtquả khảo sát bằng IR cho thấy phổ của glucomannan ban đầu và sản phẩm thủyphân hầu như giống nhau Liên kết O–H dao động trong khoảng 3600 ÷ 3300 cm−1.Pic 2923 cm−1 được quy kết cho dao động C–H của –CH3 Pic ở 1734 cm−1đặctrưng cho dao động của nhóm carbonyl, 1024 cm−1đặc trưng cho dao động C–Otrong KGM Các mẫu glucomannan thủy phân được nghiên cứu đều có cấu trúc vôđịnh hình, tuy mức độ kết tinh thay đổi không đáng kể Kết quả phân tích nhiệt chothấy tính chất nhiệt của sản phẩm thủy phân không chỉ phụ thuộc vào khối lượngphân tử mà còn phụ thuộc vào sự sắp xếp cấu trúc trong mạch đại phân tử Các kếtquả nghiên cứu này có ý nghĩa tham khảo hữu ích để sản xuất các loại glucomannan
có khối lượng phân tử khác nhau với tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm và phụgia thực phẩm [18]
Trang 38Năm 2013, Atte Mikkelson và cộng sự điều chế glucomanno oligosacarit
bằng cách thủy phân glucomannan bởi mannanase từ Trichoderma reesei,
endoglucanases EGI (Tr Cel7b) và EGII (Tr Cel5a) Kết quả cho thấy mỗi loạienzym tạo ra một loại oligosacarit khác nhau Trong ba loại enzym này, mannanase
là enzym chọn lọc nhất trong quá trình thủy phân konjac glucomannan, hơn 99%các oligosaccarit hình thành có mannose là đơn vị pyranosyl cuối cùng trong khi sửdụng endoglucanase, sản phẩm có cả manose và glucose là đơn vị pyranosyl cuốicùng [22]
Năm 2013, Junfan Chen và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phảnứng thủy phân glucomannan bởi β-mannanase bằng phương pháp đáp ứng bề mặt
Mô hình kế hoạch thực nghiệm bậc 2 của Box- Behnken đã được sử dụng để tối ưuhoá các điều kiện phản ứng như: độ pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng và nồng độE/S Hàm đầu ra được tác giả lựa chọn là tổng hàm lượng đường khử DRS Sử dụngphần mềm Disgn expert 7.0 đã đưa ra được phương trình hồi quy biểu diễn mốiquan hệ giữa các biến khảo sát Theo kết quả nghiên cứu của công trình này, điềukiện tối ưu cho hàm hiệu suất có giá trị cao nhất 3,709 mg/ml ở điều kiện nhiệt độ41◦C, pH 7,1, thời gian 4giờ, tỷ lệ enzym/cơ chất là E/S 0,49 Tuy nhiên công trìnhnày chưa nghiên cứu cấu trúc và tính chất cũng như hoạt tính của sản phẩm nhậnđược [20]
Wenjie Jian và cộng sự (2013) nghiên cứu phản ứng thuỷ phân konjacglucomannan bằng tia γ kết hợp với enzym β-mannanase Liều chiếu xạ an toàn chophép sử dụng trong thực phẩm là 10kGy Khi chỉ sử dụng tia gamma thu được sảnphẩm có khối lượng giảm không đáng kể, từ khối lượng phân tử ban đầu là1,68×106 Da xuống 1,27 × 106và 1,45 × 106Da với liều chiếu xạ lần lượt là 10 và
20 kGy Hiệu quả thủy phân cải thiện rõ rệt khi sử dụng kết hợp enzym mannanase và chiếu xạ Với liều chiếu 10 kGy nhận được glucomannan có khốilượng phân tử 6200 Da, với liều chiếu xạ 20 kGy khối lượng phân tử giảm xuốngchỉ còn 2100 Da, DP ~14 [24]
β-Năm 2016, Cheng-Yu Chen và cộng sự nghiên cứu thủy phân glucomannan
từ β-mannanase sinh ra từ xạ khuẩn Thermobifida fusca BCRC19214 Công trình
Trang 39đã công bố phương pháp nuôi cấy vi khuẩn để lên men vi sinh enzym β-mannanas
và phương pháp tinh chế để nhận được enzym sạch Sau thời gian 24 giờ ủ với 8U/ml β-mannanase ở nhiệt độ 50oC, độ trùng hợp (DPw) của glucomannan giảm từ6435,139 xuống còn 3089 Độ nhớt của sản phẩm (đo bằng máy đo độ nhớtBrookfield DV-III ở 50oC) giảm nhanh trong khoảng 10 phút đầu ủ với enzym (từkhoảng 2300 cPs xuống còn khoảng 800cPs, sau 1 giờ độ nhớt giảm xuống cònkhoảng 100 cPs Sự giảm độ nhớt đồng thời với giảm lượng đường khử cũng đãđược công bố trong báo cáo [23]
Konjac glucomannan cũng được Jianhua Liu và cộng sự thực hiện phản ứngthủy phân bằng mannanase, quá trình thủy phân được theo dõi bằng sự biến đổi độnhớt của sản phẩm thủy phân Kết quả nghiên cứu cho thấy, điều kiện tối ưu để thựchiện phản ứng thủy phân glucomannan với xúc tác mannanase là: thời gian 2 giờ;nhiệt độ 50 ◦C; pH 6.0; và nồng độ enzym 150 U/g Sản phẩm thủy phân có độtrùng hợp trung bình (DP) xấp xỉ 5,2 [21]
1.3.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác enzym
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của các enzym đều theo một quyluật như nhau Vận tốc xúc tác của enzym chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạnxác định mà ở đó phân tử enzym chưa bị biến tính Thông thường đối với đa sốenzym thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40oC ÷ 50oC Trong phạm vi nhiệt
độ thích hợp, khi nhiệt độ tăng thì hoạt tính của enzym cũng tăng theo Khi tăng đếnnhiệt độ tới hạn thì hoạt tính xúc tác sẽ giảm và nếu nhiệt độ tiếp tục tăng thì enzym
bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác Thông thường đối với đa số enzym bị biến tínhhoàn toàn ở nhiệt độ lớn hơn hoặc bằng 70oC Khi nhiệt độ thấp hơn 0oC thì enzymgiảm hoạt tính xúc tác hoặc không thể hiện hoạt tính xúc tác
Mỗi loại enzym có nhiệt độ tối thích mà tại đó nó thể hiện hoạt tính xúc táccao nhất Nhiệt độ thích hợp này phụ thuộc vào loại enzym, nguồn thu enzym, pH,chất bảo vệ
- Ảnh hưởng của pH
Trang 40pH ảnh hưởng tương tự như nhiệt độ pH làm thay đổi trạng thái ion hóa củaenzym và cả cơ chất Mỗi enzym chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác địnhgọi là pH tối ưu của enzym, pH thích hợp cho enzym hoạt động là giá trị pH mà tại
đó enzym và cơ chất tích điện trái dấu do đó mà kết hợp với nhau dễ dàng
Đại đa số enzym thích hợp với pH từ 5 đến 9, nhưng cũng có loại hoạt động
ở pH thấp (3,5) hoặc cao (11) pH thích hợp của mỗi loại enzym còn phụ thuộc vàonguồn thu enzym, bản chất enzym và có thể thay đổi tùy thuộc vào nhiệt độ, cơ chất
- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất và enzym
Nồng độ cơ chất, enzym ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzym Enzym và cơchất sẽ kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzym – cơ chất (ES) Phức hợp ES sẽlại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzym (E).Enzym được giải phóng lại thực hiện những phản ứng mới
Từ phương trình xác định nồng độ cơ chất và enzym thích hợp để đạt đượcvận tốc phản ứng cao nhất
Khi tăng lượng chế phẩm enzym sử dụng thì phản ứng thủy phân xảy ranhanh hơn, đồng thời, lượng sản phẩm tạo thành cũng nhiều hơn Khi cơ chất cònthừa, nếu nồng độ enzym tăng thì vận tốc phản ứng tăng Khi hết cơ chất, nếu tăngnồng độ enzym vận tốc phản ứng vẫn không tăng Khi nồng độ cơ chất giảm thìmức độ tiếp xúc giữa enzym và cơ chất giảm nên phản ứng enzym cũng giảm
- Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và ức chế
Chất hoạt hóa là chất khi thêm vào phản ứng enzym sẽ làm tăng hoạt tínhxúc tác của enzym hoặc chuyển enzym từ dạng không hoạt động sang dạng hoạtđộng Do vậy khi có mặt chất hoạt hóa vận tốc phản ứng enzym tăng
Chất ức chế khi có mặt trong các phản ứng enzym sẽ làm giảm hoạt tínhhoặc mất hoạt tính xúc tác của enzym Các chất kìm hãm hoạt động của enzymthường là các ion kim loại nặng, các phần tử vô cơ, các chất hữu cơ, cũng có thể làcác protein và cả cơ chất hay chính sản phẩm của phản ứng
- Ảnh hưởng của thời gian