THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ DNA CLUB

THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ DNA CLUB... Mục tiêu của bài học Thiết kế được những trình tự primer cho những trình tự DNA khuôn vi sinh vật, virus và các độn

THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR

BẰNG FASTPCR VÀ

DNA CLUB

Mục tiêu của bài học

 Thiết kế được những trình tự primer cho những trình tự DNA khuôn (vi sinh vật, virus và các động vật khác)

 Phân tích được những thông số của primer qua các phần mềm

Quá trình sao chép DNA trong tế bào

Qui trình phản ứng PCR

Các vi sinh vật,

động vật

Thu nhận mẫu

Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô tả vào năm 1986 và cũng do chính phát minh này Mullis đã được trao giải nobel vào năm 1993

MÁY PCR

PCR là một kỹ thuật duy nhất để

khuếch đại một mẫu DNA mong muốn

khuếch đại (ví dụ những đoạn gene

của vi sinh vật, vi khuẩn hay những

đoạn gene của người và những động

vật khác)

Nguyên tắc trong phản ứng PCR

Biến tính

Bắt cặp Kéo dài

Nguyên tắc trong phản ứng PCR

Phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn:

• Biến tính DNA mẫu T=94 0 C

• Bắt cặp mồi Tm = 55 0 C-65 0 C

• Giai đoạn kéo dài, tổng hợp DNA mới T kéo dài =70 0 C

Mục đích, nguyên tắc

 Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5' hay đầu 3' của mạch DNA khuôn mẫu Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại.

Forward primer

Reverse primer

 Thành phần (G+C) trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt độ lai

Tính chuyên biệt

Tỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt

độ lai thích hợp

Nhiệt độ của primer

Tính ổn định

 Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm và nhiệt độ bắt cặp của mồi T anneal là hai yếu tố quan trọng để đảm bảo phản ứng PCR thành công và thu được sản phẩm khuếch đại (một số lượng lớn bản sao của đoạn DNA dùng làm khuôn ban đầu).

 Việc tính toán bằng phương pháp thủ công để kiểm tra các yêu cầu trên cho mỗi đoạn mồi dự định thiết kế là rất tốn thưòi gian và công sức Công việc này trở nên dễ dàng và nhanh chóng nhờ các phần mềm thiết kế mồi.

Tính ổn định

Cấu trúc kẹp tóc

1 Lấy các thông

số từ phần mềm

2 Kiểm tra đặc hiệu của Primer bằng blast

Làm thế nào để biết trình tự khuôn

 Giải trình tự DNA hoặc RNA của các sinh vật (chúng

ta sẽ biết tự nucleotide của sinh vật) từ đó thiết kế phản ứng mồi theo trình tự đã giải

 Chúng ta có thể lấy trình tự nucleotide của các sinh vật trên cơ sở dữ liệu NCBI rồi từ đó thiết kế những primer qua những phần mềm thiết kế PCR

Trình tự DNA khuôn

- Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật

- Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi sinh vật

và vừa có vùng biến động đặc trưng cho từng loài riêng biệt

Ví dụ 1: Các loài Ecoli co gen mã hóa ngoại độc tố: ST (heat stable)

và heat labile (LT) bảo tồn cao

Ví dụ 2: Enterotoxigenic E coli (ETEC), Enteropathogenic E coli

(EPEC), Enteroinvasive E coli (EIEC), Enterohemorrhagic E

coli (EHEC), Enteroaggregative E coli (EAEC) chọn ra những

gene đặc trưng cho từng loài ETEC, EPEC, EIEC và EHEC.

Tính tương thích

 Mồi làm việc theo cặp, mồi xuôi và mồi ngược Chúng

sử được sử dụng trong cùng điều kiện của phản ứng PCR.

 Một đặc điểm phải chú ý nhất về sự hòa hợp này là

nhiệt độ bắt cặp (Tanneal)

 Nhiệt độ này thể hiện sự tương thích giữa mồi xuôi và

mồi ngược

DNA

Nhập mã số truy cập

Thu nhận Gene PMWAV qua mã số truy cập

DNA club

Bước 1: Nhập trình tự

DNA club

Bước 2: Chọn start primer selection

Những điều kiện của phản ứng PCR

Danh sách những đoạn mồi do DNAclub tìm được

Danh sách những đoạn mồi

Chức năng đánh giá

Chọn những đoạn mồi tốt nhất

Chức năng đánh giá

Sử dụng PDA (primer Design Assistnat)

http://dbb.nhri.org.tw/primer/

Sử dụng phần mềm FastPCR

Kết quả phản ứng của Tm của mồi xuôi

Kết quả phân tích mồi ngược

Chức năng đánh giá độ đặc hiệu mồi

Kết quả của độ đặc hiệu mồi

Kiểm tra độ đặc hiệu mồi bằng blast

Nucleotide blast

Nhập trình tự mồi

agtggcttgccgctacgactccactgtctgaaaacagccgac

Primer blast

Tính tương đồng của của các primer

Độ đặc hiệu của mồi

Độ đặc hiệu của mồi

10R1_13785-13806

-Hệ số Expect: Xác suất

của các trình tự tương đồng E càng nhỏ độ đặc hiệu càng cao.

- Score và Excpect tỷ lệ nghịch.

Primer blast-Chức năng đánh giá mồi

Kết quả phản ứng đánh giá mồi

3 Hãy phát hiện Salmonella enterica bằng phương

pháp PCR Hãy kiểm tra lại bằng blast và kiểm tra khả năng hình thành dimer, hairpin…