Nghiên cứu định lượng một số kháng sinh beta lactam bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc

Một số phương pháp được dùng để phân tích riêng rẽ hoặc đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong mẫu thuốc như: Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, phương pháp điện h

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGÔ HỮU TUỆ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN

KHÔNG TIẾP XÚC (CE-C 4

D)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGÔ HỮU TUỆ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN

KHÔNG TIẾP XÚC (CE-C 4

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hường đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo tại bộ môn Hóa Phân tích, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã giảng dạy, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức để em hoàn thành các môn học trong khóa học

Em rất cảm ơn NCS Lê Thái Bình và CN Trần Thị Thanh Phương khóa K59D Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và phối hợp thực hiện nghiên cứu này

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 104.04-2018.305 và sự hỗ trợ thiết bị CE-C4D của công ty 3SAnalysis (www.3sanalysis.vn)

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên em trong suốt quá trình học và quá trình hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Ngô Hữu Tuệ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về kháng sinh 3

1.2 Tổng quan về các kháng sinh nhóm β-lactam 3

1.2.1 Phân loại, cấu trúc của các kháng sinh nhóm β-lactam 4

1.2.2 Tính chất, cơ chế, độc tính và phạm vi điều trị của các kháng sinh β-lactam 6

1.3 Giới thiệu về các kháng sinh trong nghiên cứu 7

1.4 Các phương pháp phân tích riêng rẽ, đồng thời các hoạt chất kháng sinh 12

1.4.1 Các phương pháp phân tích riêng rẽ các hoạt chất kháng sinh 12

1.4.1.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) 12

1.4.1.2 Phương pháp điện hoá 13

1.4.2 Các phương pháp phân tích đồng thời các hoạt chất kháng sinh 14

1.4.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

1.4.2.2 Phương pháp điện di mao quản (CE) 17

1.4.2.2.1 Tổng quan một số nghiên cứu xác định hàm lượng các hoạt chất trong một số dạng mẫu dược phẩm 17

1.4.2.2.2 Nguyên tắc chung của phương pháp điện di mao quản CE-C4D 19

1.4.2.2.3 Cấu tạo của một hệ CE cơ bản 19

1.4.2.2.4 Các kỹ thuật bơm mẫu trong CE 21

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 23

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 23

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 23

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 24

2.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ 24

2.2.1.1 Thiết bị 24

2.2.1.2 Dụng cụ: 24

2.2.2 Hoá chất: 25

2.2.2.1 Chất chuẩn: 25

2.2.2.2 Hóa chất dung môi: 25

2.2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 25

2.3 Thông tin mẫu và phương pháp xử lý mẫu thuốc 26

2.3.1 Thông tin các mẫu thuốc 26

2.3.2 Phương pháp xử lí mẫu 27

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 28

2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích 28

2.4.2 Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp 28

2.4.3 Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp 28

CHƯƠNG 3: K T QUẢ VÀ THẢO LU N 31

3.1 Nghiên cứu khảo sát phân tích đồng thời bốn hoạt chất kháng sinh nhóm 1 b ng phương pháp điện di mao quản CE-C4D 31

3.1.1 Tối ưu hoá các điều kiện phân tích 31

3.1.1.1 Khảo sát loại đệm và pH của dung dịch đệm điện di 31

3.1.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ hệ đệm điện di 33

3.1.1.3 Khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản 34

3.1.1.4 Khảo sát thời gian bơm mẫu 36

3.1.1.5 Khảo sát chiều cao bơm mẫu 37

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn và đánh giá phương pháp phân tích 38

3.1.2.1 Đường chuẩn xác định bốn hoạt chất kháng sinh Cefalexin, Cefotaxime Natri, Sulbactam và Cefixime 38

3.1.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 40

3.1.2.3 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) 41

3.2 Nghiên cứu khảo sát phân tích đồng thời bốn hoạt chất kháng sinh nhóm 2 b ng phương pháp điện di mao quản CE-C4 D 41

3.2.1 Tối ưu hoá điều kiện phân tích 41

3.2.1.1 Khảo sát loại đệm và pH của dung dịch đệm 41

3.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm điện di 43

3.2.1.3 Khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản 44

3.2.1.4 Khảo sát thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu 45

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn và đánh giá phương pháp phân tích 46

3.2.2.1 Đường chuẩn xác định bốn hoạt chất kháng sinh Amoxcillin, Ampicillin, Cefoperazone và Sulbactam 46

3.2.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 48

3.2.2.3 Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp 48

3.3 Phân tích mẫu thực tế 49

3.3.1 Các mẫu dược phẩm chứa hoạt chất nhóm 1 49

3.3.2 Các mẫu dược phẩm chứa hoạt chất nhóm 2 51

3.4 Phân tích đối chứng phương pháp CE-C4 D với phương pháp LC-MS/MS 54

K T LU N 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin 6

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản 19

Hình 1.4 Mặt cắt ngang bề mặt mao quản 20

Hình 1.5 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản 20

Hình 1.6 Các phương pháp bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản 22

Hình 2.1 Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D 24

Hình 3.1 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Arg/Ascobic ở các pH khác nhau 32

Hình 3.2 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Arg/Ace ở các pH khác nhau 32

Hình 3.3 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Tris/Ace ở các pH khác nhau 32

Hình 3.4 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Tris trong hệ đệm điện di 34

Hình 3.5 Kết quả khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản 35

Hình 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu 36

Hình 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu 38

Hình 3.8 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Arg/Ascobic ở các pH khác nhau 42

Hình 3.9 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Arg/Ace ở các pH khác nhau 42

Hình 3.10 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Tris/Ascobic ở các pH khác nhau 43 Hình 3.11 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của đệm Tris/Ace ở các pH khác nhau 43

Hình 3.12 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Tris trong hệ đệm điện di 44

Hình 3.13 Kết quả khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản 45

Hình 3.14 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu 45

Hình 3.15 Kết quả khảo sát ảnh hưởng chiều cao bơm mẫu 46

Hình 3.16 Điện di đồ phân tích mẫu CFX1 50

Hình 3.17 Điện di đồ phân tích mẫu CFL4 50

Hình 3.18 Điện di đồ phân tích mẫu CFT2 ống tiêm 50

Hình 3.19 Điện di đồ phân tích mẫu thuốc AM1 52

Hình 3.20 Điện di đồ phân tích mẫu thuốc AP1 52

Hình 3.21 Điện di đồ phân tích mẫu thuốc APvSB1 ống tiêm 53

Hình 3.22 Điện di đồ phân tích mẫu thuốc AMvSB1 53

Hình 3.23 Điện di đồ phân tích mẫu thuốc AMvSB3 53

Hình 3.24 Đồ thị tương quan kết quả phân tích một số mẫu dược phẩm b ng phương pháp CE-C4D và LC-MS/MS 55

Hình PL.1 Đường chuẩn Cefalexine theo diện tích pic 70

Hình PL.2 Đường chuẩn Cefotaxime Natri theo diện tích pic 70

Hình PL.3 Đường chuẩn Sulbactam theo diện tích pic 71

Hình PL.4 Đường chuẩn Cefixime theo diện tích pic 71

Hình PL.5 Đường chuẩn Amoxcillin theo diện tích pic 73

Hình PL.6 Đường chuẩn Ampicillin theo diện tích pic 73

Hình PL.7 Đường chuẩn Cefoperazone theo diện tích pic 74

Hình PL.8 Đường chuẩn Sulbactam theo diện tích pic 74

Hình PL.9 Điện di đồ phân tích mẫu CFX2 75

Hình PL.10 Điện di đồ phân tích mẫu CFX3 76

Hình PL.11 Điện di đồ phân tích mẫu CFL5 76

Hình PL.12 Điện di đồ phân tích mẫu CFL-CH1 76

Hình PL.13 Điện di đồ phân tích mẫu CFX-QT1 77

Hình PL.14 Điện di đồ phân tích mẫu CFL-QT1 77

Hình PL.15 Điện di đồ phân tích mẫu CFL-QD1 77

Hình PL.16 Điện di đồ phân tích mẫu CFX-KD1 78

Hình PL.17 Điện di đồ phân tích mẫu CFL-KD1 78

Hình PL.18 Điện di đồ phân tích mẫu AM2 78

Hình PL.19 Điện di đồ phân tích mẫu AM3 79

Hình PL.20 Điện di đồ phân tích mẫu AM4 79

Hình PL.21 Điện di đồ phân tích mẫu AP2 79

Hình PL.22 Điện di đồ phân tích mẫu AM-CH1 80

Hình PL.23 Điện di đồ phân tích mẫu AM-CH2 80

Hình PL.24 Điện di đồ phân tích mẫu AP-QT1 80

Hình PL.25 Điện di đồ phân tích mẫu AM-QD1 81

Hình PL.26 Điện di đồ phân tích mẫu AP-QD1 81

Hình PL.27 Điện di đồ phân tích mẫu AM-KD1 81

Hình PL.28 Điện di đồ phân tích mẫu AP-KD1 82

Hình PL.29 Điện di đồ phân tích mẫu CPvSB ống tiêm 82

Hình PL.30 Điện di đồ phân tích mẫu AMvSB2 ống tiêm 82

Hình PL.31 Điện di đồ phân tích mẫu APvSB2 ống tiêm 83

Hình PL.32 Sắc kí đồ phân tích mẫu AM2 và AM3 b ng pp LC-MS/MS 83

Hình PL.33 Sắc kí đồ phân tích mẫu AM4 và Amoxcillin của (AMvSB1, AMvSB2) b ng pp LC-MS/MS 84

Hình PL.34 Sắc kí đồ phân tích mẫu AP1, AP2 và Ampicillin (APvSB1) b ng pp 84

Hình PL.35 Sắc kí đồ phân tích mẫu CPvSB (Cefoperazone) b ng pp LC-MS 85 Hình PL.36 Sắc kí đồ phân tích hoạt chất Sulbactam của (ABvSB1, CPvSB, 85

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại, cấu trúc một số penicillin 5

Bảng 1.2 Công thức, đặc điểm và tác dụng của các kháng sinh nghiên cứu 8

Bảng 1.3 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam b ng phương 12

Bảng 1.4 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam b ng 13

Bảng 1.5 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam b ng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 15

Bảng 1.6 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam b ng phương pháp điện di mao quản 17

Bảng 2.1 Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 1 26

Bảng 2.2 Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 2 26

Bảng 3.1 Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) 33

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của Spic và tdc của bốn chất vào chiều 35

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của Spic và tdc của 4 chất vào thời 36

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của Spic và tdc của 4 chất vào chiều 37

Bảng 3.5 Điều kiện tối ưu cho phân tích bốn chất b ng phương pháp CE-C4D 38

Bảng 3.6 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ các chất 39

Bảng 3.7 Phương trình đường chuẩn, hệ số tương quan của 4 chất nhóm 1 39

Bảng 3.8 Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của đường chuẩn nhóm 1 40

Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của bốn chất 40

Bảng 3.10 Sự phụ thuộc Spic và tdc của bốn chất vào nồng độ đệm điện di 43

Bảng 3.11 Sự phụ thuộc Spic và tdc của các chất vào chiều dài hiệu dụng của mao quản 44

Bảng 3.12 Điều kiện tối ưu cho phân tích nhóm 2 (Amoxcillin, Ampicillin, Cefoperazone và Sulbactam) b ng phương pháp CE-C4D 46

Bảng 3.13 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ các chất 47

Bảng 3.14 Phương trình đường chuẩn, hệ số tương quan của 4 chất nhóm 2 47

Bảng 3.15 Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của đường chuẩn nhóm 2 48

Bảng 3.16 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của 4 chất 48

Bảng 3.17 Hàm lượng hoạt chất Cefalexine, Cefotaxime, Sulbactam và Cefixime 49

Bảng 3.18 Hàm lượng các hoạt chất Amoxcillin, Ampicillin, Cefaperazone và Sulbactam trong các mẫu dược phẩm 51

Bảng 3.19 Kết quả phân tích hàm lượng một số mẫu thuốc b ng phương 54

Bảng PL.1 Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 1 63 Bảng PL.2 Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 2 65 Bảng PL.3 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng bốn chất thuộc nhóm 1 72 Bảng PL.4 Độ thu hồi của nhóm 1 (Cefalexine, Cefotaxime Natri, Cefixime và Sulbactam) 72 Bảng PL.5 Độ thu hồi của nhóm 2 (Amoxcillin; Ampicillin; Cefoperazone và Sulbactam) 75

C4D Detector độ dẫn không tiếp xúc

CRM Vật liệu chuẩn đối chứng

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ID Đường kính trong (của mao quản)

LC-MS/MS Sắc kí lỏng khối phổ hai lần

MEKC Điện di mao quản điện động học Mixen

Tris 2 – Amino – 2 - (hydroxymethyl) propan – 1,3 – diol UV-Vis Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

MỞ ĐẦU

Kháng sinh là những chất kháng khuẩn được chiết xuất từ các chủng vi sinh vật,

nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng ức chế vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn khác một cách đặc hiệu Nhờ có thuốc kháng sinh đã giúp kiểm soát được nhiều dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn gây ra Kháng sinh là nhóm thuốc thiết yếu trong y học, quan trọng nhất là nhóm β-lactam gồm các kháng sinh có cấu trúc hóa học chứa vòng β-lactam Sự liên kết của vòng này với các cấu trúc khác sẽ hình thành các phân nhóm khác nhau như: penicilin, cephalosporin và các β-lactam khác Lượng kháng sinh β-lactam đang sử dụng trong y học là rất lớn và phổ biến với nhiều chế phẩm khác nhau trên thị trường Trên thế giới, nhu cầu sử dụng thuốc kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt ở các nước đang phát triển, vì nhiễm khuẩn n m trong số những bệnh lý hàng đầu cả về tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong Theo tổ chức y tế Thế giới (WHO), Việt Nam được xếp vào nhóm các nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất và thuộc nhóm sử dụng nhiều kháng sinh nhất [3,8,20]

Yếu tố chính quyết định đến chất lượng thuốc kháng sinh là hàm lượng các hoạt chất chính có trong thuốc Nếu hàm lượng vượt quá mức cho phép sẽ gây ra tình trạng nhờn thuốc, kháng thuốc và làm mất tác dụng của thuốc Nếu hàm lượng hoạt chất chính bị thiếu so với quy định sẽ không đủ hiệu lực để có thể kháng lại các vi khuẩn gây bệnh và cũng làm giảm hoặc mất tác dụng của thuốc Do đó, việc kiểm nghiệm hàm lượng các hoạt chất trong mẫu thuốc đóng vai trò rất quan trọng

Một số phương pháp được dùng để phân tích riêng rẽ hoặc đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong mẫu thuốc như: Phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), phương pháp điện hóa, phương pháp sắc ký (HPLC), phương pháp điện di mao quản (CE) Để giảm chi phí và tiết kiệm thời gian phân tích thì việc xây dựng các phương pháp định lượng đồng thời nhiều kháng sinh nhóm β-lactam là rất cần thiết Nhận thấy phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) có tiềm năng trong việc kiểm nghiệm thuốc, nguyên liệu và bán thành phẩm thuốc, cũng như các hoạt chất kháng sinh trong thuốc Do có nhiều ưu điểm như thời gian phân tích nhanh, chính xác, xử lý mẫu đơn giản, thiết bị nhỏ gọn phù hợp để phân

tích ngay tại hiện trường Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu định lượng một số kháng sinh

β-lactam bằng phương pháp diện di mao quản sử dụng detector (CE-C 4

D)” được lựa

chọn, với hi vọng sẽ góp một phần nhỏ vào việc xây dựng quy trình kiểm nghiệm các hoạt chất kháng sinh trong một số mẫu thuốc đang lưu hành trên thị trường hiện nay

Ngoài ra, cũng hướng đến mục tiêu áp dụng một cách linh hoạt, hiệu quả quy trình phân tích này vào các phòng kiểm nghiệm và/ hoặc ở các nhà máy sản xuất đồng thời nhiều loại kháng sinh, gồm các thuốc đơn hoạt chất và thuốc kết hợp các hoạt chất khác nhau

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về kháng sinh

Kháng sinh từ khi ra đời đã trở thành một loại thuốc thiết yếu, một công cụ hỗ trợ cho sức khỏe con người, góp phần đẩy lùi nhiều loại bệnh tật và cứu sống hàng trăm

triệu người trên khắp thế giới Sự kiện Alexander Fleming phát hiện ra penicillin

(1928) được đánh giá là một trong những thành tựu vĩ đại nhất trong lịch sử y học hiện đại và mở ra một kỉ nguyên mới trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn [22]

Waksman năm 1942 đã phát hiện ra streptomycin và đưa ra định nghĩa: “Một chất kháng sinh hay một chất có tính kháng sinh là một chất do các vi sinh vật sản xuất ra, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác”

Baron năm 1950 đã bổ sung như sau: “Kháng sinh là những chất được tạo ra bởi những cơ thể sống, có khả năng ức chế sự phát triển hay tồn tại của một hay nhiều chủng vi sinh vật ở nồng độ thấp”

Hiện nay quan niệm về kháng sinh đã mở rộng hơn: “Kháng sinh là các chất có

nguồn gốc tự nhiên từ vi sinh vật, bán tổng hợp hoặc tổng hợp, ở liều điều trị có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật ở nồng độ thấp”

Kháng sinh được chia làm ba loại: Kháng sinh phổ rộng (có hoạt tính trên nhiều loại vi khuẩn khác nhau), kháng sinh phổ hẹp (có hoạt tính trên một số ít vi khuẩn), kháng sinh đặc hiệu (chỉ tác dụng trên một loại hoặc một nhóm vi khuẩn nhất định)

Chia theo nhóm gồm nhiều nhóm khác nhau như: β-lactam, Aminosid, Macrolid, Tetracyclin, Peptid … Trong số các nhóm chính được chia ra các phân nhóm nhỏ hơn như: β-lactam (penicillin, cephalosporin, carbapenem, monobactam), Peptid (glycopeptid, lipopeptid,…), … Trong đó nhóm quan trọng nhất là β-lactam

1.2 Tổng quan về các kháng sinh nhóm β-lactam

Kháng sinh nhóm β-lactam là các kháng sinh mà phân tử chứa các dạng vòng β-lactam Gồm các phân nhóm: Vòng có 5 cạnh bão hòa gồm các penicillin, vòng có 6 cạnh không bão hòa gồm các cephalosporin, vòng có 5 cạnh không bão hòa gồm các imipenem và ertapene, các monobactam không có vòng Trong đó hai phân nhóm được

sử dụng nhiều và phổ biến nhất là phân nhóm penicillin và cephalosporin

+ Phân nhóm penicillin (penicillin G, procaine penicillin, benzathine penicillin, penicillin V), được Fleming tìm ra từ năm 1928 thu được từ nấm Penicillium hay được điều chế bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA)

+ Phân nhóm cephalosporin được chiết xuất từ nấm Cephalosporium acremonium hoặc bán tổng hợp, đều là dẫn xuất của axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) có mang vòng β-lactam, tùy theo tác dụng kháng khuẩn chia thành 4 thế hệ [1,2,12]

Các kháng sinh này là các hoạt chất chính trong trong các mẫu dược phẩm, có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, nhờ đó

mà ta điều trị và loại bỏ được nhiều dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn gây ra, các hoạt chất chính này được công bố trên nhãn sản phẩm Vì vậy, cần thiết phải định lượng các hoạt chất này nh m kiểm chứng chất lượng của sản phẩm kháng sinh, làm căn cứ cho việc điều trị

1.2.1 Phân loại, cấu trúc của các kháng sinh nhóm β-lactam

a) Các penicillin

Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: Vòng β-lactam gắn kết với vòng thiazolidin và quyết định hoạt tính của kháng sinh, có 5 nhóm khác nhau Sự kết hợp này làm cho vòng β-lactam hoạt động hơn so với từng vòng β-lactam riêng biệt

O

COR

COOM

2 3 4

1

5 6

7

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Tên gọi chung của các penicillin khi chưa có gốc R là:

(2S,5R,6R3)3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid

Khi thay thế gốc R b ng các gốc khác nhau, thường là các cation (K, Na, H), thì thu được các penicilin khác nhau có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau [1,2] Dựa vào nguần gốc có thể sắp xếp các penicillin thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau và được trình bày ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại, cấu trúc một số penicillin

Vi khuẩn gram (+), đại diện Penicillin G và Penicillin V

C-CH3

6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4-carbonyl)amino]

Gồm các Penicillin bán tổng hợp Phổ kháng khuẩn hẹp hơn Penicillin G, nhƣng có khả năng kháng Penicilliiase, không tác động vào vòng β-lactam

CH- phenylacetyl]amino)

6-([(2R)-2-amino-2-Gồm các Penicillin bán tổng hợp phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+)

và (-) mà các Penicillin nhóm II ít tác dụng Không kháng

Amoxicillin

(AMO)

NH2 NH2

CH-HO

6-{[(2R)-2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)-acetyl]amino}

β-lactamase và penicilliiase

và có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng 1 dị vòng 6 cạnh và vòng β-lactam 4 cạnh

N H

O

CO R1

N S

R3 R2

COOM

1 2 3 4 5

6 7 8

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chƣa có gốc R là: (6R,7R)

Các kháng sinh β-lactam nhóm axit (–COOH) có pKa= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc phân tử Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác nhau làm cho dạng phổ thay đổi khác nhau

b) Cơ chế:

Các penicillin diệt khuẩn b ng cách can thiệp vào sự phát triển của vi khuẩn, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện Khi vi khuẩn phân chia phát triển, chúng phải tạo ra màng tế bào nhờ một enzym xúc tác đặc biệt Enzym này là một chuỗi amino axit và penicillin cắt đứt tiến trình hình thành, sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại Do đó, penicillin đã tranh mất các vị trí phản ứng của tiền chất tạo enzym nên enzym sẽ không hình thành, có nghĩa là màng tế bào không được tái tạo, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt

c) Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam có độc tính thấp, nhưng so với thuốc khác tỷ lệ dị ứng khá cao (1 – 10)%, từ phản ứng rất nhẹ đến từ vong do choáng phản vệ, có dị ứng chéo với mọi β-lactam và cephalosporin, gây ra một số dị ứng thuốc như: Mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…

Khuyến cáo thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc

d) Phạm vi điều trị:

Kháng sinh là thuốc có khả năng ức chế vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, nhờ các thuốc kháng sinh mà y học có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm đối với con người và động vật như dịch hạch, dịch tả, thương hàn và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi vi khuẩn Đối với các nước đang phát triển như ở Việt Nam

ta thuốc kháng sinh giữ một vị trí rất quan trọng và được dùng phổ biến, do mức sống còn thấp và điều kiện vệ sinh kém nên thường xảy ra các dịch tả, kiết lị, nhiễm khuẩn đường hô hấp, các bệnh nhiễm trùng,.…

1.3 Giới thiệu về các kháng sinh trong nghiên cứu

Các kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu thuộc nhóm β-lactam (Cephalexin, Cefotaxime Natri, Cefixime, Cefoperazone, Amoxcillin, Ampicillin và Sulbactam) Các kháng sinh này đang được sử dụng rất phổ biến trong y học và có nhiều chế phẩm khác nhau rất đa dạng trên thị trường, giúp điều trị hiệu quả các dịch bệnh nguy hiểm như dịch tả, thương hàn và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh nhiễm trùng gây ra do vi khuẩn Thông thường trong sản xuất dược phẩm (trong nước và trên thế giới), các kháng sinh được phối hợp đồng thời thuộc cùng một nhóm hoặc có cấu trúc tương tự Ngoài ra trong các chế phẩm khác nhau kháng sinh nhóm β-lactam thường được sử dụng ở dạng đơn hoạt chất hoặc kết hợp với một tác nhân làm tăng hiệu quả điều trị, trong đó Sulbactam là một tác nhân được sử dụng rất phổ biến Sulbactam là một chất ức chế

β-lactam, nên chất này thường được dùng kết hợp với các hoạt chất như Amoxcillin, Ampicillin hay Cefaperazone theo một tỉ lệ nhất định để ức chế β-lactam

Đề tài nh m nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích b ng phương pháp CE-C4

D

để định lượng các kháng sinh nhóm β-lactam trong chế phẩm, để có thể áp dụng một cách linh hoạt, hiệu quả quy trình phân tích này vào các phòng kiểm nghiệm và/hoặc các nhà máy sản xuất đồng thời nhiều loại kháng sinh (gồm các thuốc đơn hoạt chất và thuốc kết hợp các hoạt chất khác nhau) Các hoạt chất nghiên cứu được chia theo hai

- Cefalexine trong dung dịch, có các

h ng số phân li pKa1=2,38;

pKa2=7,08 [14]

- Thuốc được dùng để chống lại vi khuẩn gram (+) và một

số vi khuẩn gram (-), dùng

để trị một số bệnh nhiễm khuẩn gồm: Nhiễm trùng tai giữa, viêm họng do streptococcus, nhiễm trùng xương và khớp, viêm phổi, các nhiễm trùng da và các nhiễm trùng đường tiểu

- Thuốc có thể dùng để ngừa viêm nội tâm mạc nhiễm trùng [53]

- Cefotaxime phù hợp sử dụng làm chế phẩm tiêm, các chế phẩm của Cefotaxime được

sử dụng phổ biến hơn

- Được sử dụng để điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn do

vi khuẩn nhạy cảm với Cefotaxime như: Nhiễm trùng khớp, viêm vùng chậu, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng trong tim, viêm phổi, viêm

mô tế bào, bệnh lậu, bệnh thương hàn, nhiễm khuẩn nặng trong ổ bụng (phối hợp với Metronidazol)

- Ngoài ra còn được dùng để

dự phòng nhiễm khuẩn sau

mổ tuyến tiền liệt, kể cả mổ nội soi [51]

- Trong dung dịch nước, Cefixime có pKa = 2,75 và rất

ổn định khi có các enzyme β-lactam

- Được sử dụng để điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn Hoạt động b ng cách ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn

- Được dùng điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn như: Viêm họng, viêm tai giữa, viêm phổi, nhiễm khuẩn đường tiểu, bệnh lậu và bệnh Lyme [52]

- Thuốc sẽ không có hiệu quả đối với các bệnh nhiễm trùng do vi rút như bệnh cảm, cúm thông thường

- Amoxicillin ở dạng bột kết tinh màu trắng, khó tan trong nước và ethanol, nhưng tan trong các dung dịch acid và kiềm loãng

- Amoxicillin có tác dụng diệt khuẩn, đặc biệt có tác dụng chống trực khuẩn gram (-)

- Amoxicillin là thuốc kháng sinh cùng họ với penicilin, nó ngăn chặn

và diệt các loại vi khuẩn gram (+) Dùng điều trị các bệnh như: Viêm họng, da tấy

mủ hay nhiễm trùng da, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm phổi, viêm xoang, viêm tai giữa, …[50]

vi khuẩn gram (-)

- Ampicillin được sản xuất ở dạng bột kết tinh màu trắng [17]

- Tác dụng chống lại những

vi khuẩn mẫn cảm gây nhiễm khuẩn đường hô hấp,

ức chế sự hình thành mucopeptid của màng tế bào

vi khuẩn, tác động vào quá trình nhân lên của vi khuẩn

- Thường dùng để điều trị trong các trường hợp: Nhiễm khuẩn đường tiết niệu, viêm màng não do trực khuẩn Gram (-), viêm đường dẫn mật, thương hàn, viêm phế quản mãn tính

Cephalosporins thế

hệ thứ ba có phổ kháng khuẩn rộng

- Cefoperazone là bột màu trắng, dễ tan trong nước Độ

pH của dung dịch pha 25% thay đổi giữa 4,5-6,5

- Được dùng dưới dạng chế phẩm là muối Natri

- Được sử dụng để điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gram (+) nhạy cảm và các vi khuẩn đã kháng với các kháng sinh nhóm β-lactam khác

- Cefoperazone khi kết hợp với sulbactam giúp tăng khả năng diệt khuẩn nhất là với những vi khuẩn có thể sản xuất β-lactamase [39]

ức chế β-lactamase

- Sulbactam là một chất ức chế

β-lactamase (một loại enzyme sinh ra bởi vi khuẩn tiêu diệt kháng sinh) [55]

- Sulbactam là hoạt chất dùng để kết hợp với một số hoạt chất như Amoxicillin, Ampicillin, Cefoperazone,…

để tăng khả năng ức chế lactamase

- Được dùng để điều trị các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, ổ bụng, niệu đạo, mô mềm, gây ra bởi các vi khuẩn, nhất là các chủng sinh β-lactamase

1.4 Các phương pháp phân tích riêng rẽ, đồng thời các hoạt chất kháng sinh

1.4.1 Các phương pháp phân tích riêng rẽ các hoạt chất kháng sinh

1.4.1.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử là phương pháp phân tích dựa trên cơ sở mật độ quang của dung dịch tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích (chất phân tích có tính chất quang học như tính hấp thụ quang, tính phát quang…) Các phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử khá đơn giản, dễ tiến hành, được ứng dụng nhiều trong phân tích dược phẩm nói chung và xác định các kháng sinh β-lactam nói riêng Một số công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp này đề xác định các hoạt chất kháng sinh được tóm tắt trong Bảng 1.3

Bảng 1.3 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam bằng phương

pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)

Tác giả Chất phân

Alaa S Amin, Gamal

H Ragab và cộng sự

[16]

cefotaxime, cefuroxime, ceftriaxone

Mẫu dược phẩm

Metol được oxi hóa b ng kalidicromat

0,04; 0,03; 0,05 (µg/ml)

A Fernández-González

và cộng sự [20] ampicillin

Thuốc uống, huyết thanh,…

Cu2+ tạo phức, kết hợp với phương pháp dòng chảy

4.10-7M (0,16 mg/l)

C Pasha and B

Narayana [24]

cefotaxime, ceftriaxone, cefadroxil, cephalexin

Mẫu dược phẩm

iodate (IO3-) tạo iodine (I2)

F Belal và cộng sự

[31]

amoxicllin, ampicillin

Thuốc uống

Pb2+ tạo phức mầu vàng

0,76; 0,73 (µg/ml)

Hoda Mahgoub, Fatma

Ahmed Aly [34]

ampicillin, sulbactam

Mẫu dược phẩm kết hợp và mẫu thuốc tiêm

Nkeoma N Okoye và

cộng sự [44]

ceftriaxone, cefotaxime, cefuroxime

Mẫu dược phẩm ở dạng bào chế

hỗn hợp Fe3+ và ion hexacyanoferate

0,369; 0,35; 0,322 (µg/ml)

Mẫu dung dịch muối

ăn

Cu2+ (tạo phức)

Syed Najmul Hejaz

Azmia, Bashir Iqbal

[48]

cefixime Mẫu dược

phẩm Pb2+ (tạo phức)

0,175 (mg/l)

Wei Liu và cộng sự

[57]

penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP

Sữa

luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn

0,5; 0,04; 0,08; 0,1 (mg/l)

Yong Nian Ni, Wei

Qiang Xiao [61]

cephalexin, trimethoprim

Chế phẩm dược phẩm, nước tiểu người

Ce(NH4)4(SO4)4

·2H2O

0,16; 0,12 (mg/l)

Do phương pháp chỉ được dùng chủ yếu để xác định riêng rẽ từng hoạt chất kháng sinh và còn bị ảnh hưởng nhiều bởi các yếu tố cản nên đôi khi cho kết quả không chính xác, đồng thời gây tốn thời gian và chi phí phân tích Vì vậy để cho kết quả phân tích chính xác hơn, phân tích được đồng thời các kháng sinh β-lactam thì mẫu phải được xử

lý qua chiết pha rắn trước Ngoài ra một số trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này

1.4.1.2 Phương pháp điện hoá

Phương pháp điện hóa là phương pháp phân tích dựa trên các phản ứng điện hóa xảy ra trên bề mặt các điện cực khi có dòng điện chạy qua, được ứng dụng trong xác định các kháng sinh β-lactam ở một số dạng mẫu dược phẩm nhưng không nhiều Dưới đây là một số công trình nghiên cứu của các tác giả khác nhau sử dụng phương pháp này để xác đinh và được tóm tắt trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam bằng

phương pháp điện hóa

Điện cực cacbon biến tính

b ng hạt nano vàng

(CH3COOH + H3BO3 +

H3PO4)

pH = 3,0

3,0×

10−9(mol/l)

acetate,

pH = 5,2

0,92 (µmol/l)

Điện cực kim cương pha tạp

Điện cực than chì kết hợp nano vàng

1,21×

10−10  (mol/l)

1.4.2 Các phương pháp phân tích đồng thời các hoạt chất kháng sinh

1.4.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng, được sử dụng phổ biến trong việc tách, nhận biết và định lượng các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các loại mẫu dược phẩm khác nhau do có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng … để có thể định lượng riêng rẽ hoặc đồng thời các hoạt chất này trong mẫu

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là quá trình tách chất xảy ra trên cột với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Vì vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [4,6] Đã có nhiều công trình nghiên cứu phân tích các chất kháng sinh β-lactam khác nhau sử dụng phương pháp này, dưới đây

là một số công trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng các hoạt chất kháng sinh, được tóm tắt trong Bảng 1.5

Bảng 1.5 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam bằng phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nước thải bệnh viện khu vực

Hà Nội

Supelcosil ODS 250 mm

x 4,6 mm, 5

µm

Axetat 12 mM

pH 4,7; ACN 20%, MeOH 10%

mm x 4,6

mm, 5 μm)

CAN, đệm photphat 10 mM (pH 5,6) 24:76(v:v)

Huyết tương người

C18, đường kính trong (10 µm)

Axetat 0,01 M;

pH 4,7;

methanol;

Acetonitrile (87:11:2) (v:v:v)

Huyết tương

và nước

ối người

C18 pha đảo (4,6×250 mm; 5,0 µm)

Phosphate 40 mM: MeOH (pH 3,2) 55:45(v:v)

0,1 µg/ml; 0,2 µg/ml

F Péhourcq

và các cộng

sự [30]

cefotaxime, cefixime

Chất lỏng sinh học

C18

Dung dịch ACN

10 mM/đệm acetat

0,12 ppm; 0,3 ppm

Genowefa

Pajchel và

cộng sự [33]

cephalexine, cephadroxil, cefaclor, cefotaxim

Dược phẩm, huyết tương người

Nước mặt và nước thải đô thị

Cột Xterra

MS C18 (2,1

mm × 50 mm), kích thước hạt 2,5 µm

0,1% formic acid - nước

nước mặt (8-10) ng/l, nước thải (13-18) ng/l

Nước sông và nước thải

Cột Xterra

MS C18 (2,1 mm×50 mm, 2,5 μm)

Axit focmic 0,1%, Metanol (MeOH), Acetonitril (ACN)

(8-10) ng/l; (13-18) ng/l

Matthias

Becker và

công sự [38]

các penicillin, cephalospori

n

Cơ bắp, thận và sữa trâu

bò

Chiết dung môi acetonitril/

Môi trường, thực phẩm

(0,04 đến 0,06) µg/l

Qi Pei và

các cộng sự

[47]

amoxicillin, sulbactam

Huyết tương người

C18

Nước (có chứa

30 mM kali dihydrogen phosphate, pH 7,8) và acetonitrile

(0,163 đến 14,7) μg/mL; (0,250 đến 15,0) μg/mL

Somnath D

Bhinge và

cộng sự [49]

cefixime và dicloxacillin

Dược phẩm

Pha đảo Capcell Pak C18 DDS5 (4,6 mm ×

250 mm với kích thước hạt 5 µm)

Đệm phosphate

5 mM (pH 5,4):

acetonitrile:methanol (42:55:03, v/v/v)

(0,020

và 0,018) µg/ml

Tomofumi

Ohmori và

cộng sự [54]

8 kháng sinh β-lactam

Huyết thanh người

Waters Oasis® HLB cartridges (30 mg)

0.1% formic acid - methanol

(0,001 đến 0,05) µg/ml

Dược phẩm, huyết thanh

và nước tiểu người

Chromolith®

, SpeedROD RP-18e 50

mm × 4.6

mm

1 mL đệm – MeOH 10:90 (v/v)

(0,001; 0,0025; 0,0025; 0,0025) ng/µL

Weiqing Li

và cộng sự

[58]

22 cephalospori

n

μg/L

Thịt, thận và sữa

Inertsil ODS2 (4,6 mm×150

mm, 5 μm)

ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55)

Sữa (2 đến 10) μg/kg, thịt (25 đến 100) μg/kg Xiaodan Liu

và cộng sự

[60]

cefalexin, cefazolin, cefoperazone

Sữa

C18

(C18-Fe3O4 mSiO2)

1.4.2.2 Phương pháp điện di mao quản (CE)

1.4.2.2.1 Tổng quan một số nghiên cứu xác định hàm lượng các hoạt chất trong một

số dạng mẫu dược phẩm

Phương pháp điện di mao quản (CE) gần đây đã cho thấy được tiềm năng phát triển do có nhiều ưu điểm như thời gian tách ngắn, hiệu quả tách cao, lượng mẫu tiêu tốn ít Đã có nhiều công trình nghiên cứu được ứng dụng để xác định các kháng sinh nhóm β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau, được tóm tắt trong Bảng 1.6

Bảng 1.6 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam bằng phương pháp

điện di mao quản

Tác giả Chất phân

Kĩ thuật điện di

Dược phẩm, nước tiểu

MEKC UV-Vis

25 mM đệm Borat, 100

mM SDS, pH=7,75

(0,54 đến 1,0) µg/ml

Attila Gaspar

và cộng sự

[19]

14 kháng sinh cephalosporin Nước CZE UV

Đệm photphat 25

mM có pH 6,8

(0,42 đến 1,62) mg/l Biyang Deng

và cộng sự

[21]

AMO

Nước tiểu người

CE kết hợp ECL

UV

Đệm phosphate (50

mM, pH 7,5)

0,31 mg/l

Ching-ErhLin

và cộng sự

[23]

cephalexin, cefotaxime

Dược phẩm, nươc,…

Đệm citric (40 mM, pH

< 5)

(2,87; 2,95) µg/ml

L Nozal và

cộng sự [37]

amoxicillin, ampicillin, penicillin G, oxacillin, penicillin V, cloxacillin

Nước thải của trang trại chăn nuôi

Mixen (MEKC)

UV

40 mM đệm borat, 100

mM SDS pH 8,5

(0,14 đến 0,27) mg/l

M.I.Bailon-Perez và cộng

sự [40]

AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin

Nước sông, nước thải…

DAD

Đệm tris 175

mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol

(0,08 đến 0,9) mg/l

M.I Bailon-P´

erez và cộng

sự [41] β-lactam

Nước giếng, nước sông

CZE-DAD

Đệm tris pH 8,0

(0,08 đến 0,80) µg/ml

Dược

26 mM đệm borat pH 8,5

(0,35 đến 1,42) mg/l

Trên cơ sở các kết quả tổng quan được về các phương pháp phân tích kháng sinh nhóm β-lactam Nhìn chung, với phương pháp quang học và phương pháp điện hóa đơn giản, dễ tiến hành, nhưng chỉ xác định từng chất riêng rẽ, với các mẫu có đa thành phần thì không phù hợp Với phương pháp HPLC cho kết quả tách tốt, độ chính xác, độ nhạy cao nhưng giá thành và chi phí phân tích một mẫu lớn Nhận thấy phương pháp di mao quản (CE) có thể xác định đồng thời các kháng sinh này với dung dịch đệm khá đơn giản và LOD của phương pháp khá thấp, nó sẽ là bước phát triển mới nh m khắc phục những nhược điểm của các phương pháp quang, điện và HPLC mà cho kết quả đáng tin cậy Phương pháp CE với detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis tuy được sử dụng rộng rãi nhất trong CE do đo độ hấp thụ trong vùng UV-Vis, phù hợp với đa dạng các

chất phân tích vô cơ và hữu cơ, được trang bị cho đa số các thiết bị điện di Tuy nhiên detector này thường có độ nhạy kém do bề dày lớp đo quang trong mao quản có kích thước nhỏ Vì vậy phương pháp điện di mao quản với detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) được lựa chọn để khảo sát xác định đồng thời các kháng sinh nhóm β-lactam trong luận văn này

1.4.2.2.2 Nguyên tắc chung của phương pháp điện di mao quản CE-C 4 D

Điện di mao quản (CE - Capillary electroohoresis) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên cơ sở sự di chuyển khác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện giải (thường là dung dịch đệm điện di), dưới tác dụng của điện trường E nhất định (do thế V đặt vào hai đầu mao quản sinh ra) và tính chất đặc trưng của dòng điện di thẩm thấu EOF trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thước của chúng

Phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít, chi phí phân tích thấp Cũng như những phương pháp khác, phương pháp điện di mao quản đã và đang phát triển ở mức độ cao

và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của khoa học, công nghệ, y dược và sinh học [5,6,9,13]

1.4.2.2.3 Cấu tạo của một hệ CE cơ bản

Cấu tạo của hệ thống phân tích điện di mao quản gồm các phần chính được mô tả trong Hình 1.3

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản

a) Mao quản:

Mao quản chính là cột tách, là một bộ phận không thể thiếu trong phương pháp điện di, là một trong các yếu tố chính quyết định sự điện di của hỗn hợp chất mẫu Mao quản được chế tạo chủ yếu b ng Silica được gọi là mao quản silica, một số loại làm

b ng Teflon

Đường kính trong (ID) của mao quản từ 25 đến 150 µm và có thành dày khoảng 80÷120 µm còn chiều dài mao quản tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần phân tích

Hình 1.4 Mặt cắt ngang bề mặt mao quản

Dòng điện di thẩm thấu (electroosmotic - EOF) trong mao quản xuất phát từ lớp điện kép trên thành mao quản và chất điện ly chứa trong nó Lớp điện kép này hình thành khi thành mao quản tiếp xúc với chất điện ly

Hình 1.5 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản

Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm Dưới tác dụng của điện trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần

tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển cùng tốc độ với dòng EOF Như vậy, dòng EOF đóng vai trò quan trọng trong việc xác định thời gian tồn tại chất tan ở trong ống mao quản Vì vậy phải lựa chọn các điều kiện điện di phù hợp nhất

để có tốc độ dòng điện di phù hợp cho quá trình tách sắc ký hỗn hợp chất

b) Dung dịch đệm điện di:

Dung dịch đệm điện di được dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di xảy ra khi áp thế cao vào hai đầu mao quản Các yếu tố như bản chất, thành phần, độ nhớt và giá trị pH của pha động điện di có ảnh hưởng trực tiếp lên bề mặt mao quản từ đó ảnh hưởng đến kết quả của quá trình điện di Ngoài ra trong quá trình điện di, hai đầu mao quản được đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di

c) Nguồn điện thế cao:

Thường dao động từ 5 đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu mao quản nh m sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra Để phân tích các cation thì áp cực dương vào đầu bơm mẫu của mao quản và ngược lại để phân tích các anion thì áp cực âm vào đầu bơm mẫu của mao quản

d) Detector:

Detector là bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau quá trình điện di, do đó thường được đặt ở phần cuối hoặc gần cuối của mao quản Các loại cảm biến thông dụng trong phương pháp CE bao gồm: Hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, điện thế (đo dòng, đo thế, độ dẫn), độ dẫn nhiệt, chỉ số chiết suất của chất [5]

Trong luận văn này, detector được sử dụng là detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D) Đây là một detector đa năng, có độ nhạy khá cao, có thể dùng cho nhiều loại chất phân tích khác nhau, có thể chế tạo thu nhỏ và tối ưu hóa cho mục tiêu phân tích ngoài hiện trường Tuy trở ngại khi dùng detector đo độ dẫn để định lượng chất phân tích là dòng điện di trong điện trường mạnh ảnh hưởng tới tín hiệu đo, thông thường dòng nền rất lớn do dung dịch đệm được pha chế từ các chất điện ly Nhược điểm này được khắc phục qua việc khảo sát chọn dung dịch đệm, nồng độ, pH để hạn chế dòng nền, tăng dòng chất phân tích Còn phương pháp CE với detector DAD có độ nhạy kém do bề dày lớp đo quang trong mao quản có kích thước nhỏ, dù đã được cải tiến nhưng còn nhiều hạn chế

e) Bộ phận điều khiển:

Thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích Hiện nay, bộ phận này còn có thể thực hiện chức năng điều khiển tự động hoá của quá trình phân tích từ khâu bơm mẫu đầu vào đến khâu cho

ra kết quả cuối cùng của quá trình phân tích điện di

1.4.2.2.4 Các kỹ thuật bơm mẫu trong CE

Mẫu phân tích được nạp vào mao quản b ng các phương pháp: Có 2 phương pháp bơm mẫu vào mao quản là phương pháp thuỷ động lực học (dùng áp suất hoặc theo kiểu xiphông) và điện động học Các phương pháp bơm mẫu được mô tả trong Hình 1.6

Hình 1.6 Các phương pháp bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản

a) Kỹ thuật bơm mẫu thuỷ động lực học dùng áp suất:

+ Dùng một áp suất thích hợp khoảng 50 đến 300 mBar để nén (đẩy) hoặc hút một lượng vào đầu cột mao quản trong một thời gian nhất định (hình A)

+ Kiểu xiphông: Dựa trên sự chênh lệch về chiều cao của hai đầu ống mao quản, chiều cao chênh lệch từ 10-30 cm trong khoảng thời gian từ vài giây đến vài phút tuỳ nồng độ chất phân tích (hình B)

b) Kỹ thuật bơm mẫu kiểu điện động học:

Nguyên tắc của kỹ thuật này là dùng lực của dòng điện với một điện thế cao (5-10

kV trong vài giây) để đưa mẫu phân tích vào mao quản (hình C) trong một thời gian nhất định Phương pháp bơm mẫu này cho kết quả các pic phân tách có độ sắc nét cao Tuy nhiên phương pháp có nhược điểm rất lớn là diện tích pic có độ lặp lại thấp với các nền mẫu khác nhau, do đó thường chỉ dùng để định tính [5,14]

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là ứng dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4

D) để định lượng các kháng sinh nhóm β-lactam trong mẫu dược phẩm, từ kết quả khảo sát thu được để áp dụng phân tích với một số mẫu chế phẩm đang lưu hành trên thị trường Đồng thời cũng hướng đến mục tiêu áp dụng một cách hiệu quả, linh hoạt quy trình phân tích này vào các phòng kiểm nghiệm hoặc các nhà máy sản xuất đồng thời nhiều loại kháng sinh bao gồm các thuốc đơn hoạt chất và các thuốc kết hợp các hoạt chất khác nhau, được chia theo hai nhóm:

+ Nhóm 1 là nhóm chế phẩm riêng rẽ chỉ chứa đơn hoạt chất nhóm β-lactam: Cephalexin, Cefotaxime Natri, Cefixime và Sulbactam

+ Nhóm 2 là nhóm chế phẩm phối hợp giữa các hoạt chất nhóm β-lactam và Sulbactam: Amoxcillin, Ampicillin, Cefaperazone và Sulbactam

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu cần thực hiện bao gồm:

- Tổng quan các tài liệu về kháng sinh nhóm β-lactam trong mẫu dược phẩm

- Khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định đồng thời các hoạt chất kháng sinh trong mẫu dược phẩm:

+ Khảo sát loại đệm, nồng độ đệm và pH của dung dịch đệm

+ Khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản

+ Khảo sát thời gian bơm mẫu

+ Khảo sát chiều cao bơm mẫu

- Đánh giá phương pháp phân tích:

+ Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

+ Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

+ Đánh giá độ đúng, đánh giá độ chụm của phương pháp phân tích

- Phân tích một số mẫu dược phẩm đang lưu hành trên thị trường có chứa các hoạt chất kháng sinh nghiên cứu với các điều kiện tối ưu đã khảo sát được

- Thực hiện phân tích đối chứng kết quả hàm lượng hoạt chất kháng sinh trong một số mẫu dược phẩm b ng phương pháp LC-MS/MS

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất

2.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ

2.2.1.1 Thiết bị

+ Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu là hệ CE-C4D bán tự động sử dụng detector

độ dẫn không tiếp xúc (Hình 2.1) được thiết kế lắp đặt với sự tài trợ của Công ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/) phối hợp với Khoa Hóa học, Trường Đại học Basel, Thụy sĩ

+ Cân phân tích của hãng Scientech độ chính xác 10-2, 10-4 (gam)

+ Máy lọc nước deion (Mỹ)

+ Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521

+ Máy đo pH của hãng HANNA, điện cực thủy tinh, các dung dịch pH chuẩn 4,7,10 để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH

+ Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu

2.2.1.2 Dụng cụ:

+ Pipet paster các loại: 20, 100, 200, 1000 µL

+ Các lọ falcon 15; 25 ml để đựng mẫu và dung dịch chuẩn

+ Giấy lọc đường kính màng lọc là 0,45 µm

+ Mao quản sử dụng là mao quản silica, chiều dài 60 cm, đường kính trong (ID) là

2.2.2.2 Hóa chất dung môi:

+ L-Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, Japan, >99%)

+ Tris (hydroxymethyl) aminomethane, (Fluka, Japan, hàm lượng >99%)

+ Ascobic (>99%, Acros Organic (USA))

+ Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức)

+ Axit clohydric (HCl) (Merck, Đức)

+ Axit axetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức)

+ Nước deion: Là nước cất hai lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết

2.2.2.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

a) Pha dung dịch chuẩn gốc: Pha các dung dịch chuẩn có nồng độ 1000 ppm

tương ứng với 7 chất phân tích từ chất chuẩn rắn trong nước deion

Cân chính xác 0,0250 g mỗi loại chất chuẩn, chuyển vào bình định mức 25,0 ml Thêm khoảng 10 đến 15 ml nước deion và rung siêu âm trong 40 phút, định mức tới vạch b ng nước deion Dung dịch thu được được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C

và sử dụng trong 2 tháng Các dung dịch trước khi sử dụng phải đưa về nhiệt độ phòng, lắc đều dung dịch trước khi sử dụng

b) Pha dung dịch đệm điện di:

Hệ đệm dùng trong nghiên cứu là hệ Tris (10mM)/Ace ở khoảng pH 7,5 và 7,8: Cân 0,1211 g Tris trên cân phân tích hòa tan và rung siêu âm đến tan b ng nước deion, chuẩn lại giá trị pH b ng acid acetic trên máy đo pH về pH 7,8 và 7,5 rồi định mức đến vạch b ng nước deion, dung dịch đệm được pha mới hàng ngày

2.3 Thông tin mẫu và phương pháp xử lý mẫu thuốc

2.3.1 Thông tin các mẫu thuốc

Thông tin các mẫu thuốc sử dụng để phân tích được tóm tắt ở Bảng 2.1 và Bảng 2.2 Thông tin chi tiết các mẫu này được nêu ở Bảng PL.1 và Bảng PL.2 (phụ lục 1)

Bảng 2.1 Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 1

Stt Tên thuốc Mã thuốc thuốc Dạng Hàm lượng ghi trên nhãn

1 Fabafixim 200 D CFX1 Viên nén Mỗi viên chứa 200 mg Cefixim

2 Fabafixim 400 CFX2 Viên nang Mỗi viên chứa 400 mg Cefixim

3 Cefimed 200 CFX3 Viên nén Mỗi viên chứa 200 mg Cefixim

4 Cefalexin 500mg CFL4 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin

5 Franlex 500 CFL5 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin

6 GOLDCEFO 1G CFT2 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 g Cefotaxime

7 Cefalexin 500mg CFL-CH1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin

8 BICEBID 100 CFX-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 100 mg Cefixime

9 Cefalexin 500mg CFL-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin

10 Cefalexin 500mg CFL-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin

11 CEFIXIM 100mg CFX-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 100 mg Cefixime

12 Cefalexin 500mg CFL-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Cefalexin

Bảng 2.2 Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 2

Stt Tên thuốc Mã thuốc Dạng

thuốc Hàm lượng ghi trên nhãn

1 Amoxicillin 500 AM1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin

2 Amoxicillin 500 AM2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin

3 Amoxicillin AM3 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin

4 Ospamox 500 AM4 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin

5 Ampicillin 500 AP1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin

6 Ampicillin 500 AP2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin

7 Amoxicillin 500 AM-CH1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxcillin

8 Amoxicillin 500 AM-CH2 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin

9 Amoxicillin 500 AM-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin

10 Ampicillin 500 AP-QT1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin

11 Amoxicillin 500 AM-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin

12 Ampicillin 500 AP-QD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin

13 Amoxicillin 500 AM-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Amoxicillin

14 Ampicillin 500 AP-KD1 Viên nang Mỗi viên chứa 500 mg Ampicillin

15 Auropennz 1.5 APvSB1 Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Ampicillin, 0.5

gam Sulbactam, 5 ml nước cất tiêm

16 SUKLOCEF CPvSB Ống tiêm Mỗi lọ chứa 1 gam Cefoparazone,

a) Xử lí mẫu thuốc dạng viên nang

Lấy 10 viên thuốc cân chính xác khối lượng (được khối lượng viên thuốc), bỏ phần nang thuốc để lấy phần thuốc bột, trộn đều Lau sạch phần nang thuốc rồi đem cân khối lượng (được khối lượng phần nang thuốc) để tính khối lượng trung bình viên Cân chính xác một lượng nhỏ 1/100 khối lượng bột đã trộn đều ở trên, cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 đến 20 ml nước deion, rung siêu âm khoảng 40 phút rồi định mức tới vạch b ng nước deion Dung dịch thu được được lọc qua màng 0,45 µm và được pha loãng trước khi được bơm mẫu vào thiết bị CE [3]

b) Xử lí mẫu thuốc dạng viên nén

Lấy 10 viên thuốc dạng nén, cân chính xác khối lượng để tính khối lượng trung bình viên Tiến hành nghiền b ng cối mã não đến khi thành dạng bột mịn, trộn đều rồi cân chính xác khoảng 1/100 khối lượng bột ở trên, cho vào bình định mức 25,0 ml, thêm khoảng 15 đến 20 ml nước deion, rung siêu âm khoảng 40 phút rồi định mức tới vạch b ng nước deion Dung dịch thu được được lọc qua màng 0,45 µm và được pha loãng trước khi bơm mẫu vào thiết bị CE

c) Xử lí mẫu dạng bột tiêm

Cân chính xác khối lượng của 1 lọ thuốc, sau đó lấy hết lượng thuốc trong lọ ra, trộn đều Tráng rửa sạch vỏ lọ và sấy tới khối lượng không đổi, cân vỏ lọ (được khối lượng vỏ lọ) để tính được khối lượng thuốc trong 1 lọ Sau khi trộn đều thuốc, cân chính

xác khoảng 1/40 khối lượng bột thuốc cho vào bình định mức 25,0 ml rồi định mức tới vạch b ng nước deion Dung dịch thu được được lọc qua màng 0,45 µm và được pha loãng trước khi tiến hành bơm mẫu vào thiết bị CE

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích

2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp phân tích

+ Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền Đối với các quá trình sắc ký (quá trình điện di) giá trị LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) b ng 3

+ Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của nền Đối với các quá trình sắc ký (quá trình điện di) giá trị LOQ được xác định theo tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N) b ng 10 [10]

2.4.2 Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp

Độ chụm (độ lặp lại) một cách tương đối là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi

và giá trị trung bình trên các mẫu thử giống hệt nhau trong những điều kiện thí nghiệm giống nhau (cùng người phân tích, cùng trang thiết bị, phòng thí nghiệm trong các khoảng thời gian ngắn)

Độ chụm (độ lặp lại) có thể xác định qua độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) Khi độ lệch chuẩn càng lớn thì sai số của phép đo hay của phương pháp càng lớn [10] Công thức tính SD và %RSD là:

+ Si: Diện tích của pic điện di thứ i

+ Stb: Diện tích trung bình của n lần phân tích

+ n: Số lần phân tích lặp lại

2.4.3 Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp

Độ đúng của phương pháp chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận Do đó, thước đo độ