xây dựng phương pháp xác định một số thuốc kháng histamin h1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng hplc và hptlc

Do đó, việc phát triển các phương pháp phân tích phát hiện các chất trộn trái phép là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng của thuốc đông dược và thực phẩm chức năng phục vụ tốt công tác

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT

SỐ THUỐC KHÁNG HISTAMIN H1 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG

DƯỢC BẰNG HPLC và HPTLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT

SỐ THUỐC KHÁNG HISTAMIN H1 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG

DƯỢC BẰNG HPLC và HPTLC

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2020

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị cán bộ, sự ủng hộ của gia đình và bạn bè

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, là người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều

kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin được cảm ơn các thầy cô bộ môn Hóa phân tích- Độc chất, bộ môn Dược học cổ truyền và các anh chị cán bộ Viện Công nghệ Dược Phẩm Quốc Gia đã

chỉ bảo, hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi về thiết bị, máy móc để tôi có thể hoàn thành

đề tài nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học, cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 10 tháng 03 năm 2020

Trần Thị Lan

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1.Nhóm thuốc kháng histamin H1 3

1.1.2 Một số nghiên cứu phát hiện thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược 5

1.2 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 12

1.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC) 12

1.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 13

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 14

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn 14

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị 14

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Chuẩn bị nền mẫu 15

2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích 15

2.2.3 Xử lý mẫu 17

2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng 17

2.2.5 Ứng dụng phân tích các mẫu thu thập được 19

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 19

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 20

3.1.1 Xây dựng phương pháp HPLC 20

3.1.2 Xây dựng phương pháp HPTLC 24

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 27

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 29

3.3.1 Thẩm định phương pháp HPLC 29

3.3.2 Thẩm định phương pháp HPTLC 35

3.4 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành trên thị trường 41 3.4.1 Kết quả phân tích mẫu thực bằng HPTLC 41

3.4.2 Kết quả phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPLC 45

Chương 4 BÀN LUẬN 48

4.1 Tạo nền mẫu 48

4.2 Xây dựng phương pháp phân tích 49

4.2.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 49

4.2.2 Xây dựng phương pháp sắc ký 50

4.2.3 Lựa chọn xử lý mẫu 51

4.3 Thẩm định phương pháp 51

4.4 Ứng dụng 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

KẾT LUẬN 54

KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

CLO Clorpheniramin maleat

CYP Cyproheptadin hydroclorid

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC High Performance Thin Layer

Chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

ICH International Conference on

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

LOR Loratadin

MeOH Methanol

PRO Promethazin hydroclorid

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các nghiên cứu phân tích một số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép

trong chế phẩm đông dược 7

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 14

Bảng 3 1 Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3) 28

Bảng 3 2 Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống HPLC 30

Bảng 3 3 Kết quả đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính bằng HPLC 31

Bảng 3 4 Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác trên 3 nền mẫu (HPLC) 33

Bảng 3 5 Kết quả xác định LOD, LOQ của phương pháp HPLC 34

Bảng 3 6 Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống HPTLC 37

Bảng 3 7 Kết quả đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính bằng HPTLC 38

Bảng 3 8 Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác trên 3 nền mẫu (HPTLC) 39

Bảng 3 9 Kết quả xác định LOD, LOQ bằng HPTLC 40

Bảng 3 10 Kết quả định tính trên mẫu thực bằng phương pháp HPTLC 42

Bảng 3 11 Kết quả định lượng các mẫu thực dương tính bằng HPTLC 43

Bảng 3 12 Kết quả định tính trên mẫu thực bằng phương pháp HPLC 45

Bảng 3 13 Kết quả định lượng các mẫu thực dương tính bằng HPLC 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3 1 Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động HPLC 21

Hình 3 2 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động 21

Hình 3 3 Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký HPLC 22

Hình 3 4 Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu trên máy HPLC 23

Hình 3 5 Sắc ký đồ khảo sát pha động HPTLC 24

Hình 3 6 Sắc ký đồ lựa chọn tỉ lệ thành phần pha động HPTLC 25

Hình 3 7 Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu (phương pháp HPTLC) 26

Hình 3 8 Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết 27

Hình 3 9 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 29

Hình 3 10 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp HPLC 30

Hình 3 11 Sắc ký đồ xác định LOD của phương pháp HPLC (nền N3) 34

Hình 3 12 Sắc ký đồ và sắc đồ analog đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp HPTLC 36

Hình 3 13 Sắc ký đồ analog xác định LOD trên nền viên nang (N3) (HPTLC) 40

Hình 3 14 Sắc ký đồ phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPTLC 41

Hình 3 15 Sắc ký đồ HPTLC analog của mẫu dương tính M22 (a) và chồng phổ UV tại vị trí có R f = 0,26 ( vết CLO) của M22 và CLO chuẩn (b) 44

Hình 3 16 Sắc ký đồ HPLC mẫu dương tính M22 (a) và chồng phổ UV tại tại vị trí có t R = 6,016 ( pic CLO) của M22 và CLO chuẩn (b) 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Với đặc điểm khí hậu nhiệt đới ẩm và tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng ở Việt Nam, tỉ lệ người mắc các bệnh dị ứng đang tăng nhanh [42], [56] Thuốc chỉ điều trị triệu chứng nên bệnh tái đi tái lại Bên cạnh sử dụng thuốc hóa dược, người bị dị ứng hay tìm và sử dụng chế phẩm đông dược, với “niềm tin” rằng các chế phẩm này an toàn và ít tác dụng phụ Tuy nhiên, vì lợi nhuận nhiều người sản xuất trộn thêm thuốc hóa dược để bệnh của người dùng mau giảm triệu chứng, bán được số lượng nhiều Việc này là một mối quan tâm lớn không những của cơ quan quản lý mà còn của cộng đồng khi có nhiều báo cáo về các rủi ro ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe mà nguyên nhân là từ các chế phẩm đông dược được khẳng định là "hoàn toàn tự nhiên"

Nhóm thuốc hóa dược để điều trị dị ứng hay sử dụng là nhóm kháng histamin H1 Các dược chất thuộc nhóm thuốc này có giá rẻ, tác dụng nhanh, mạnh ở mức liều thấp nên khả năng các chất này được trộn trong các chế phẩm đông dược trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng, cảm cúm…là rất cao và khó bị phát hiện Ngoài ra chúng còn có tác dụng an thần, chống nôn, chống đau đầu (cinarizin), kích thích ăn ngon (cyproheptadin hydroclorid)… Tuy nhiên, các thuốc thuộc nhóm này đều có thể gây những tác dụng phụ, đặc biệt khi được trộn lẫn vào các chế phẩm đông dược và được dùng trong thời gian kéo dài Các tác dụng phụ thường gặp như: buồn ngủ, ngủ

gà, mệt mỏi, chóng mặt, tăng co giật ở trẻ em, khô miệng, khô họng, khô mũi, gây ăn kém ngon, buồn nôn, tiêu chảy… [4-6]

Do đó, việc phát triển các phương pháp phân tích phát hiện các chất trộn trái phép là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng của thuốc đông dược và thực phẩm chức năng phục vụ tốt công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Các quy trình phát hiện thành phần thuốc đông dược rất phức tạp và thách thức Phương pháp hay được sử dụng trong phát hiện thuốc hóa dược nói chung và các thuốc hóa dược kháng histamin H1 nói riêng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược thường là LC-MS [30], LC-MS-MS [14], [19], [38], [39],[53],[54], GC –MS [41] với độ đặc hiệu cao và LOD thấp Tuy nhiên hệ thống LC-MS rất đắt tiền và không phổ biến so với HPLC hoặc HPTLC

Xuất phát từ thực tế đó, đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC

và HPTLC” được thực hiện với mục tiêu:

1 Xây dựng được các quy trình định tính, định lượng đồng thời một số thuốc kháng histamin H1 (Cinarizin, Clorpheniramin maleat, Cyproheptadin hydroclorid, Loratadin, Promethazin hydroclorid) trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC và HPTLC

2 Áp dụng các quy trình đã xây dựng được để xác định các thuốc kháng histamin H1 trên trộn lẫn trong một số chế phẩm đông dược ( nếu có)

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.1.1.Nhóm thuốc kháng histamin H1

❖ Tác dụng: [4], [6]

• Cơ trơn : giãn cơ trơn khí quản, tiêu hóa

• Mao mạch : giảm tính thấm mao mạch

• Thần kinh trung ương : ức chế, các thuốc kháng hitamin H1 thế hệ 2 không có

hoặc ít có tác dụng này

• Kháng cholinergic: chống nôn, chống say tàu xe

• Kháng α-adrenergic: đặc biệt là dẫn xuất phenothizin ( promethazin), gây giãn mạch, hạ huyết áp thế đứng

• Kháng serotonin: điển hình là cyproheptadin, do đó có thể dùng để điều trị hội chứng serotonin hoặc dùng ngắn hạn để tăng cảm giác thèm ăn

• Gây tê tại chỗ: đặc biệt là promethazin và diphenhydramin

❖ Tác dụng không mong muốn: [4], [6]

Tác dụng không mong muốn hay gặp nhất của thuốc kháng histamine H1 thế hệ

1 là an thần, gây ngủ, kháng cholinergic gây khô miệng, họng, mũi Ngoài ra còn gây căng ngực, hồi hộp, đau đầu, khó tiêu; trên hệ tiêu hóa: ăn kém ngon, nôn, buồn nôn, tiêu chảy; ức chế thần kinh trung ương, gây chóng mặt, mệt mỏi,buồn ngủ, ù tai, bồn chồn, tăng co giật (động kinh) ở trẻ em Thế hệ 2 ít gặp các tác dụng này

Các thuốc thuộc nhóm này đều có thể gây những tác dụng phụ, hay gặp ở trẻ

em và người cao tuổi hoặc khi điều trị dài ngày hặc dùng liều cao Đặc biệt khi được trộn lẫn vào các chế phẩm đông dược và được dùng trong thời gian kéo dài

❖ Cấu trúc, tính chất vật lý, liều dùng của các thuốc nghiên cứu

• Cinarizin

- Công thức cấu tạo: [8]

C26H28N2 ( M= 368,5)

- Tên khoa học: (E)-1- ( diphenylmethyl)-4-(3- phenylprop-2-enyl) piperazin [8]

- Tính chất: Bột màu trắng hay gần như trắng Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong methylen clorid, tan trong aceton, khó tan trong ethanol 96% [8]

- Liều lượng: Người lớn: 25 mg x 1-3 lần mỗi ngày Trẻ em 5 - 12 tuổi: 1/2 liều người lớn [4], [6]

- Liều dùng: Người lớn: 4 mg cách 4-6 giờ/lần Tối đa: 24 mg/ngày (người cao

tuổi tối đa 12mg/ngày) [5], [6]

- Liều dùng : Người lớn ngày uống 2-3 lần, mỗi lần 25 mg sau ăn [4]

1.1.2 Một số nghiên cứu phát hiện thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược

Nhóm thuốc chống dị ứng kháng histamin H1 hay bị trộn vào các chế phẩm đông dược vì tác dụng chống dị ứng và tác dụng an thần của nó

Một số nghiên cứu gần đây [22] đã thuyết phục FDA ban hành lệnh cấm hoặc hạn chế bán một số chế phẩm có nguồn gốc thảo dược có chứa hoạt chất hoá dược, phổ biến ở các nhóm PDE-5, corticoid, NSAID, glucocorticoid, kháng histamin H1…Cụ thể đó là Nhân sâm “She Lian Wan” với tuyên bố hỗ trợ giảm đau khớp, viêm khớp, và bệnh gút, nhưng đã phát hiện có chứa 2 hóa dược là dexamethason và clorpheniramin [59] Hay “Saurean Fong Sep Lin” được quảng cáo dùng cho trường hợp đau lưng và chấn thương, nhưng dương tính với dexamethason và cyproheptadin [60] …

Ở Trung Quốc, YE Lin-hu và cộng sự sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát 7 kháng histamin H1 bao gồm loratadin, diphenhydramin hydroclorid, cyproheptadin hydroclorid, cetirizin hydroclorid, promethazin hydroclorid, mizolastin, and clorpheniramin maleat trên 9 loại chế phẩm thảo dược, kết quả đã xác định 4 mẫu chế phẩm dương tính với các kháng histamin H1 trên [54] N Song

và cộng sự cũng đã sử dụng phương pháp LC-MS/MS, xác định được 12 loại hóa dược được thêm vào trà thảo dược một cách bất hợp pháp, trong đó phát hiện có clorpheniramin maleat [53]

Ở Hàn Quốc, Jung Yeon Kim và cộng sự sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát trên 117 mẫu chế phẩm đông dược dùng chăm sóc sức khỏe và đã phát hiện

1 mẫu chứa diphenhydramin [39]

Tại Việt Nam, chế phẩm đông dược có mặt trên thị trường trong nước hiện nay rất đa dạng, nhiều thành phần, khó kiểm soát vì được bán qua nhiều kênh khác nhau như trong quầy thuốc, nhà thuốc, cửa hàng bán các sản phẩm chăm sóc sức khỏe, qua mạng internet, đa cấp, siêu thị, … nên có thể có nguy cơ các sản phẩm này bị trộn thêm các thuốc hóa dược gây ra tác dụng không mong muốn khi sử dụng cho người dùng

Năm 2017, Sở Y tế thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện cơ sở đông y Nhơn Tâm Tế (quận 12) đang lưu giữ và bày bán nhiều mặt hàng được cho là thuốc mà kết quả kiểm nghiệm cho thấy có chứa corticoid và cyproheptadin [58]

Ngoài ra, có một số phát hiện chế phẩm đông dược trộn hóa dược của nước ngoài lưu hành trên thị trường Việt Nam Năm 2007: phát hiện “Thuốc Dân tộc cứu nhân vật”, sản xuất tại Campuchia, trộn 5 loại hóa dược dexamethason, diazepam, paracetamol, clopheniramin và cyproheptadin Thuốc tăng phì hoàn của Đài Loan có trộn cyproheptadin và dexamethason [9]

Từ những thực trạng trên có thể thấy rõ tình hình trộn trái phép thuốc hóa dược trong chế phẩm đông dược đang xảy ra nhiều và phức tạp, không chỉ ở nhiều nước trên thế giới mà ở cả Việt Nam

Một số nghiên cứu phân tích phát hiện các thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược, được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các nghiên cứu phân tích một số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược

Hoạt chất và

mẫu thử Phương pháp phân tích

Kết quả phân tích

Tài liệu

Pha động : acetonitril/ formic acid 0,1% (tt/tt)

-Dung môi chiết: ACN, tinh chế bằng kỹ thuật QuEChERS và lọc qua màng lọc 0,22 µm

- LOD: 0,1µg/L đến 2,1 g/L

- LOQ: 0,4g/L đến 8,0 g/L

Pha động: 0,1% acid formic trong nước (kênh A) và 0,1% acid formic

- LOD: 0,006 đến 6,0 µg/L

- LOQ: 0,008 đến 12,0 µg/L

- Độ thu hồi:

[39]

89,7% - 111,8%

- 1/117 mẫu chứa diphenhydramin

Tốc độ dòng: 0,4 mL/·phút Pha động: 0,1% acid formic trong acetonitril : 0,1% acid formic trong nước

Detector: ESI-MS

- Dung môi chiết: Methanol 80%, siêu âm 30 phút, ly tâm

- LOD: 0,5-2,5 ng/mL

- LOQ: 1-5ng/mL

- Độ thu hồi:

86,2% -112,5%

- 4/9 chế phẩm được phát hiện dương tính với thuốc kháng histamin H1

m x 0,25 mm i.d 0,25 μm ) + Chương trình nhiệt độ lò:

+ Chế độ quét phổ: SIM + Chế độ tiêm mẫu: Không chia

- LOD từ 10 -

1000 μg/g

[41]

dòng

- Chiết mẫu bằng ethanol

Tác động: Siêu âm, lắc quay, ly tâm Clorpheniramin

100 RP-18 (4 × 4 mm; 4 µm) Thể tích tiêm: 25 µl

Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút Pha động: ACN và dung dịch đệm amoni format 10 mM (pH 3,0)

Gradient pha động Detector: ESI-MS

- Chiết mẫu bằng MeOH hoặc isopropanol : diclormethan (1:9) Tác động: Siêu âm, lắc xoáy, ly tâm

- LOD: 5 pg đến

1 ng/mL

- Độ thu hồi: 100%

Thể tích tiêm: 2µL Tốc độ dòng: 0,30 mL/phút Pha động: 0,1% acid formic trong nước và 0,1% acid formic trong acetonitril

Detector: Q/TOF – MS -Mẫu được thêm dung dịch Na2CO3

pH=10, dịch thu được đem chiết lỏng lỏng với ethyl acetat Lấy phần dịch thân dầu đem cô cắn rồi hòa tan cắn

- LOD: 0,02 đến 16,04 ng/mL

- Độ thu hồi:

81,6-124,7%

[38]

vào hỗn hợp dung dịch acid formic 0,1% : MeOH (1:1)

Tác động: siêu âm, lắc xoáy, ly tâm Clorpheniramin

Pha động: 0,1% acid acetic trong nước và 0,1% acid acetic trong acetonitril

Thể tích tiêm: 10 µl Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

Detector: IT/TOF-MS

- Mẫu chiết bằng MeOH Tác động: ly tâm, lắc xoáy

- LOD: 0,1 mg/kg

- Pha động gồm acid formic 0,1%

trong nước (A) và acetonitril (B); chế

độ pha động: gradient -Thể tích tiêm 2 µl

LOD: 0,083 0,165 ng/mL

LOQ: 0,25 0,5 ng/mL

- Độ thu hồi:

80-110%

- Phát hiện 2/9

[14]

thuốc bột, cốm,

hoàn

- Tốc độ dòng 0,3 ml/phút và thời gian phân tích 12 phút

- Chiết mẫu bằng MeOH

mẫu chứa clorpheniramin maleat

- Pha động : Cloroform – methanol – acid acetic – amoniac (9,5 : 0,5 : 0,2 : 0,05)

- Phát hiện 7/15

clorpheniramin maleat

[3]

Như vậy, công bố nghiên cứu phát hiện các thuốc kháng histamin H1 trộn trong thuốc đông dược bằng sắc ký lớp mỏng rất ít và mới dừng ở mức sàng lọc, phát hiện định tính [3] Còn qui trình định lượng thuốc hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC đối với thuốc kháng histamin H1 mới chỉ xây dựng đối với CLO [55] nên cần mở rộng trên những chất khác trong nhóm Đa số các nghiên cứu định lượng dùng phương pháp LC-MS [30], LC-MS-MS [14], [19], [38], [39],[53],[54], GC –MS [41]…, phương pháp này cho độ đặc hiệu, độ nhạy cao, nhưng hệ thống MS rất đắt tiền và không phổ biến ở các phòng phân tích như HPLC

và HPTLC Đặc biệt, hiện nay hệ thống HPTLC được trang bị bộ phận phát hiện, xử

lý số liệu cho phép nâng cao khả năng định tính bằng quét phổ, chồng phổ và định lượng với sai số chấp nhận được do đó việc phát triển phương pháp HPTLC rất có ý nghĩa trong công tác kiểm tra, giám sát ban đầu

Vì vậy, nghiên cứu này sẽ phát triển phương pháp HPTLC và HPLC là các phương pháp khoa học, đáng tin cậy, dễ áp dụng rộng rãi để có thể phát hiện thuốc kháng histamin H1 trong chế phẩm đông dược, góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược đối với nhóm thuốc này

nhằm đảm bảo chất lượng thuốc, bảo vệ sức khỏe cho người dân và giữ uy tín cho các sản phẩm đông dược lưu hành trên thị trường

1.2 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1]

Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và được cho qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục gọi là pha động Tốc độ di chuyển của các chất là khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan giữa ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [2]

1.2.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

1.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật sắc ký dùng để tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 - 30 µm, được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất, dày khoảng 250 µm trên giá đỡ làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex, trong đó được dùng phổ biến nhất là silica (SiO2) và nhôm oxyd [1],[2]

Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần, thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký Cơ chế tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế, tùy thuộc vào tính chất của hai pha Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2 - 3 dung môi Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng, có vị trí khác nhau trên bản mỏng Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các

chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường di chuyển của pha động [1]

Rf = dR /dM

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết chất phân tích (cm)

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf: có giá trị dao động giữa 0 và 1

1.2.2.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ( HPTLC)

HPTLC là một hình thức hiện đại của TLC (sắc ký lớp mỏng) Pha tĩnh trong HPTLC là những hạt chất hấp phụ kích thước nhỏ, đồng đều nên tăng cường khả năng tách Hơn nữa, HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt

độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn

UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc

Chất

chuẩn

1 Cinarizin

Chất đối chiếu

Chuẩn VKNTHCM 99,7%, SKS: QT082060916

2 Clorpheniramin

maleat

Chất đối chiếu

Chuẩn VKNTTW 99,75%, SKS 0209032

3 Cyproheptadin

Hydroclorid

Chất đối chiếu

Chuẩn VKNTTW 100,64%, độ ẩm 7,6%, SKS: 0102126

chiếu

Chuẩn VKNTTW 99,24%, độ ẩm 0,02% , SKS: 0108242

5 Promethazin

hydroclorid

Chất đối chiếu

Chuẩn VKNTTW 99,65%, độ ẩm 0,13%, SKS : 0204085

Hóa

chất

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị

- Bản mỏng TLC và HPTLC silica gel 60 GF254 của Merck- Đức

- Cân phân tích METTLER TOLEDO– AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1 mg)

- Cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg)

- Máy HPLC –DAD: Hệ thống HPLC Shimadzu 20AD với detector UV-PDA, Nhật

- Hệ thống máy HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thụy Sỹ): máy chấm sắc ký bản mỏng tự động, máy triển khai sắc ký, buồng chụp ảnh sắc ký, phần mềm

xử lý kết quả winCATS

- Máy đuổi dung môi bằng khí Nitơ Hanon – Đài Loan

- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 – Ý

- Máy lọc hút chân không

- Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức

- Máy siêu âm DAIHAN WUC – A22H – Hàn Quốc

- Tủ sấy MEMMERT ULM 500 – Đức

- Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, micropipet, mao quản, ống ly tâm,…

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu thử : 25 mẫu chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng dạng bào

chế viên nén, viên nang cứng, viên hoàn, thuốc bột được sử dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các trường hợp mề đay, mẫn ngứa, dị ứng, đau đầu, kích thích ăn ngon để tăng cân đang lưu hành tại Việt Nam Các mẫu được mã hóa ngẫu nhiên từ M01 -> M25

- Mẫu nền : gồm 3 nền mẫu dạng viên hoàn, bột cốm, viên nang cứng, dùng để

xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được xây dựng dựa trên nguyên lý y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đã công bố và một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, mề đay có thị phần lớn trên thị trường Việt Nam hiện nay

- Mẫu tự tạo : Mẫu nền có thêm các chất chuẩn nghiên cứu với tỉ lệ nhất định 2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị nền mẫu

- Nền N1 (viên hoàn): Dựa vào bài thuốc cổ tryền Ngân kiều tán trong sách

Ôn bệnh điều biện và Dược điển Việt Nam V, gia giảm thành phần của bài thuốc cho

phù hợp với tác dụng điều trị, gồm 9 loại dược liệu như sau: kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, bạc hà, đạm trúc diệp, kinh giới tuệ, lô căn, ngưu bàng tử, cam thảo Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều, vê thành viên, bao màu, sấy khô, đóng gói

- Nền 2 (bột cốm): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Liên kiều bại độc tán trong sách Thương hàn toàn sinh tập gồm 14 loại dược liệu như sau: liên kiều, chi tử, khương hoạt, huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy, hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu, thêm tá dược tạo khối ẩm, xát hạt qua rây, sấy hạt, sửa hạt, đóng gói

- Nền 3 (viên nang): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Tiêu phong tán trong sách Y tông kim giám, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với tác dụng điều trị, gồm 11 loại dược liệu như sau: kinh giới, phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền thoái, sinh địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều tạo khối

ẩm, rây qua rây tạo hạt, sấy hạt, thêm tá dược thích hợp, đóng nang

2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích

2.2.2.1 Phương pháp HPLC

Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

- Khảo sát và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu

- Khảo sát điều kiện sắc ký: tham khảo điều kiện phân tích trong công bố [7], [16], [36], [46] Lựa chọn pha động và tỉ lệ pha động, cột sắc ký, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện để có thể tách và phát hiện đồng thời các chất nghiên cứu ở nồng độ ppm, pic gọn, thời gian phân tích không quá dài

silicagel 60 GF254 , thể tích chấm 1 µl Dựa vào các tài liệu và các nghiên cứu đã công bố [3], [8], [16], [24], [25], [29], [44] khảo sát trên 4 hệ pha động gồm:

+ n-hexan: dicloromethan:triethylamin ( 5,5:4:0,5)

+ Cyclohexan: aceton: triethylamin (80:10:10)

+ Aceton: n-hexan: amoniac (45:55:5)

+ Ethylacetat: methanol: amoniac ( 80:20:8)

- Sau khi triển khai sắc ký, tiến hành quét phổ lựa chọn bước sóng phát hiện phù hợp

- Lựa chọn hệ dung môi tách riêng các chất, các vết gọn, rõ nét Sau đó, khảo sát tỷ

lệ thành phần pha động để có pha động tối ưu

2.2.3 Xử lý mẫu

Dựa vào tính tan của các chất phân tích và một số nghiên cứu đã công bố tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc tân dược từ nền mẫu bằng các dung môi như : methanol, ethanol, methanol : nước (50 :50), acetonitril

Dựa trên công bố [3], [14], [54], nghiên cứu đã thực hiện xử lý mẫu như sau:

- Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng với khoảng 1/2 liều dùng vào ống ly tâm

- Thêm chính xác 25 ml dung môi chiết vào ống ly tâm

- Lắc xoáy 5 phút, sau đó siêu âm 10 phút ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha loãng bằng methanol tới nồng độ thích hợp Tiến hành phân tích bằng HPLC Đối với HPTLC: Quy trình xử lý mẫu tương tự như trên Sau khi ly tâm, lấy chính xác 2,0 ml dịch trong, cô dưới luồng khí nitơ đến cắn Hòa tan cắn bằng 1,0 ml methanol, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành phân tích bằng HPTLC

2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng

Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 [18] và ICH 2005 [34] trên 3 nền mẫu tự tạo chứa các chất phân tích với các chỉ tiêu:

- Độ đặc hiệu của phương pháp:

+ Thực hiện phân tích trên 3 nền mẫu, mỗi nền mẫu bao gồm 3 mẫu như sau: Mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn của 5 chất phân tích, mẫu nền và mẫu nền có thêm hỗn hợp chuẩn của 5 chất phân tích

+ Yêu cầu: Trên sắc ký đồ mẫu nền không xuất hiện pic trùng với thời gian lưu hoặc Rf của các chất phân tích Trên sắc ký đồ mẫu nền thêm chuẩn, các pic xuất hiện trùng thời gian lưu hoặc Rf với mẫu chuẩn

- Độ thích hợp của hệ thống:

+ Phân tích lặp lại 6 lần mẫu dung dịch chuẩn hỗn hợp của 5 chất phân tích ở nồng

độ xác định trong cùng điều kiện sắc ký

+ Yêu cầu: diện tích pic và thời gian lưu ( hoặc Rf) thu được của 6 lần sắc ký lặp lại phải có giá trị RSD < 2%

- Khoảng nồng độ tuyến tính:

+ Pha các dãy nồng độ trong khoảng nồng độ khảo sát của 5 chất phân tích ròi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Sau đó xây dựng phương trình đường hồi quy tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng Từ

đó thu được hệ số tương quan r

+ Yêu cầu: Hệ số tương quan r ≥ 0,99

- Độ đúng và độ chính xác:

+ Thực hiện trên 3 nền mẫu N1, N2, N3 Độ đúng và độ chính xác trong ngày được xác định bằng cách thêm chính xác lượng dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào nền mẫu ( tương ứng khoảng ½ liều dùng: nền N1 là 2,5g; N2 là 0,7 g; N3 là 1,6 g) ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao), lắc đều, để yên 15 phút Sau đó, tiến hành xử lý mẫu theo điều kiện đã chọn Tiến hành lặp lại 6 lần ở mỗi mức nồng

độ Độ đúng và độ chính xác khác ngày được tiến hành tương tự nhưng vào ngày phân tích khác

+ Độ đúng: được xác định dựa vào tỉ lệ % của lượng chuẩn tìm lại của mỗi chất phân tích so với lượng chuẩn thêm vào Yêu cầu: Độ đúng phải đạt theo yêu cầu của AOAC 2016 ở mức nồng độ thử nghiệm

+ Độ chính xác của mỗi mức nồng độ được xác định thông qua đại lượng RSD của kết quả thu được 6 lần làm lặp lại ở mỗi mức nồng độ Yêu cầu: Độ lặp lại phải đạt theo yêu cầu của AOAC 2016 ở mức nồng độ thử nghiệm

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (LOD, LOQ) :

Thêm lượng chuẩn hỗn hợp với lượng giảm dần vào mỗi nền mẫu Xử lý mẫu theo quy trình đã lựa chọn và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn Nồng độ tại

đó cho tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) khoảng bằng 3 là LOD và nồng độ

cho tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) khoảng bằng 10 là LOQ

2.2.5 Ứng dụng phân tích các mẫu thu thập được

- Xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng

- Áp dụng phương pháp HPLC và HPTLC phát hiệncác chất nghiên cứu (dựa vào các thông số thời gian lưu/ thừa số chậm, chồng phổ) trong một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng, đau đầu, kích thích

ăn ngon thu thập trên thị trường (nếu có)

- Xác định nồng độ các chất nghiên cứu trong các mẫu thử thu thập được dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng của các chất nghiên cứu (nếu có) được xây dựng trong cùng ngày phân tích

xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

Chuẩn bị các dung dịch:

- Dung dịch chuẩn gốc đơn 1mg/ml: cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chuẩn

CIN, CLO, CYP, LOR, PRO vào các bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức vừa

đủ 10 ml bằng methanol

- Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 1mg/ml: cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chuẩn

CIN, CLO, CYP, LOR, PRO vào 1 bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức vừa

đủ 10 ml bằng methanol

- Dung dịch chuẩn đơn (10 µg/ml): Dùng micropipet hút chính xác 100 µl mỗi

dung dịch chuẩn gốc đơn cho mỗi vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ

thu được các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ chính xác khoảng 10 µg/ml

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/ml: Dùng micropipet hút chính xác 100 µl

dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp, cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ

3.1.1 Xây dựng phương pháp HPLC

3.1.1.1 Lựa chọn hệ pha động

Sử dụng điều kiện sắc ký: Cột Inertsil ODS- 3 (250 x 4,6mm; 5µm) , tốc độ

dòng 1,4 ml/phút; thể tích tiêm 20 µl, bước sóng phát hiện 254 nm Tiến hành phân

tích các dung dịch chuẩn đơn (10 µg/ml) và dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/ml Tiến

hành khảo sát với các pha động khác nhau Kết quả được trình bày ở hình 3.1

(a) Methanol: dd đệm acetate pH=3 (80:20) (b) Acid formic 0,1% : ACN ( 30:70)

(c) ACN- dd KH2PO4 0,01 M (80-20) (d) ACN- natri heptansulfonat 0,01 M (pH =2,8 bằng acid acetic băng) ( gradient )

Hình 3 1 Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động HPLC

Nhận xét:

- Hình (a): các pic ra sớm, thời gian lưu từ 2,2 – 10,4 phút Các pic bị dính chân

- Hình (b): Các pic bị dính chân nhiều

- Hình (c): Ra nhiều pic, pic bị bể đầu

- Hình (d): Các pic có thời gian lưu từ 5,2 - 14,7 phút Các pic nhỏ gọn, sắc nét, cân đối ( T˷ 1,0), tách nhau rõ ràng ( Rs > 2,0), cường độ tín hiệu pic phù hợp để phân tích

Vì vậy, hệ pha động gồm ACN- heptansulfonat natri 0,01 M (điều chỉnh đến

pH =2,8 bằng acid acetic băng), chế độ gradient từ 0 - 17 phút ACN 38% -> 67% ; từ

17 – 20 phút ACN từ 67% -> 38% được lựa chọn để tiến hành phân tích

* Tốc độ dòng pha động

Tiêm vào hệ thống sắc ký hỗn hợp 5 chất nghiên cứu có nồng độ mỗi chất là 10 µg/ml với tốc độ dòng 1,3 ml/phút và 1,4 ml/phút Kết quả được trình bày ở hình 3.2

(a) Tốc độ dòng 1,3 ml/phút (b) Tốc độ dòng 1,4 ml/phút

Hình 3 2 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động

Nhận xét: Ở cả 2 tốc độ dòng pha động khảo sát, các pic đều có hình dáng nhỏ

gọn, cân xứng Với tốc độ dòng 1,4 ml/phút, các chất phân tích rửa giải sớm hơn (thời gian lưu từ 5,2 – 14,5 phút) Với tốc độ dòng 1,3 ml/phút, các chất phân tích rửa giải chậm hơn (thời gian lưu từ 6,2 – 16,7)

Khi phân tích mẫu đông dược với khoảng thời gian 5 phút đầu là thời gian rửa giải của nhiều thành phần trong dược liệu Do đó, tiến hành lựa chọn tốc độ dòng pha động kéo dài được thời gian lưu của các chất phân tích, nhằm giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu Vì vậy, lựa chọn tốc độ dòng 1,3 ml/phút để tiến hành nghiên cứu tiếp theo

3.1.1.3 Bước sóng phát hiện

Quét phổ UV từ bước sóng 200 – 400 nm tại vị trí pic của 5 chất phân tích trong

sắc ký đồ của chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp Kết quả được trình bày ở hình 3.4

Hình 3 4 Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu trên máy HPLC

Nhận xét: CIN có hai cực đại hấp thụ ở 199 và 250 nm; CLO là 197 và 255 nm; CYP

là 199 và 305 nm; LOR là 197, 214 và 253 nm; PRO là 197, 250 và 300 nm Cả 4 chất CIN, CLO, LOR, PRO đều có cực đại hấp thụ khoảng 250 – 255 nm, tại khoảng này CYP cũng hấp thụ quang học mạnh do đó bước sóng 254 nm được lựa chọn để phát hiện cả 5 chất phân tích trong nghiên cứu này

Từ kết quả khảo sát, điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau:

- Cột: InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5µm)

- Pha động: ACN- dung dịch heptansulfonat natri 0,01 M (điều chỉnh tới pH =2,8 bằng acid acetic băng); chạy chế độ gradient dung môi từ 0 - 17 phút ACN 38% -> 67% ; từ 17 – 20 phút ACN từ 67% -> 38%;

- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút;

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl;

- Bước sóng phát hiện: 254 nm

3.1.2 Xây dựng phương pháp HPTLC

3.1.2.1 Khảo sát hệ dung môi

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc đơn CLO, CYP, CIN, LOR, PRO và chuẩn gốc hỗn hợp 5 chất trong methanol có nồng độ 1 mg/ml

- Pha tĩnh: bản mỏng TLC silicagel 60 GF 254 (7 x 10 cm)

- Thể tích chấm: 1 µl

- Pha động: + Hệ 1: n-hexan: dicloromethan:triethylamin ( 5,5:4:0,5)

+ Hệ 2: Cyclohexan: aceton: triethylamin (80:10:10) + Hệ 3: Aceton: n-hexan: amoniac (45:55:5)

+ Hệ 4: Ethyl acetat: methanol: amoniac ( 80:20:8) Kết quả được trình bày ở hình 3.5

Hệ 1 Hệ 2 Hệ 3 Hệ 4

Hình 3 5 Sắc ký đồ khảo sát pha động HPTLC

Nhận xét:

Hệ 1 , hệ 4 vết PRO và CYP bị trùng nhau

Hệ 3 Các vết tách nhau hoàn toàn Vết CLO thấp sát vạch xuất phát

Hệ 2 Các vết gọn và tách nhau hoàn toàn Rf = 0,2-0,8

Tiếp tục tiến hành thay đổi tỉ lệ thành phần hệ 2 để tìm pha động tối ưu nhất tách 5 chất CIN, CLO, CYP, LOR, PRO Khảo sát hệ Cyclohexan: aceton:

triethylamin với tỉ lệ thay đổi như sau:

Hình 3 7 Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu (phương pháp HPTLC) Nhận xét: CIN có hai cực đại hấp thụ ở 254 nm; CLO là 224 và 250 nm; CYP là 226,

253 và 287 nm; LOR là 254 nm; PRO là 254 và 305 nm Nên lựa chọn bước sóng

254 nm để phát hiện cả 5 chất phân tích do có đáp ứng cao và giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu

Từ các kết quả khảo sát điều kiện HPTLC được lựa chọn là:

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Khảo sát dung môi chiết : methanol, ethanol, acetonitrile, methanol : nước

(50 :50)

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong methanol có

nồng độ các chất CIN, CLO, CYP, LOR, PRO là 10 µg/ml

- Dung dịch mẫu tự tạo: Nghiền mịn và làm đồng nhất mẫu nền Thêm chính xác dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 1mg/ml vào mẫu nền sao cho sau xử lý có nồng độ các chất tương đương với dung dịch chuẩn Lắc nhẹ, để bay hơi dung môi ở điều kiện phòng Tiến hành chiết các mẫu theo quy trình đã nêu tại mục 2.2.3 sử dụng các loại dung môi chiết khác nhau Mỗi dung môi tiến hành làm lặp lại 3 lần Tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC, tính độ thu hồi dựa vào diện tích pic của chất phân tích của dung dịch mẫu tự tạo và dung dịch chuẩn hỗn hợp Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.8

Hình 3 8 Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết

Bảng 3 1 Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3)

CLO 147141 143841 97,76 ± 1,63% 143482 97,51 ± 3,04% 144164 98,15 ± 1,80% 144459 98,18 ± 1,18%

CYP 407412 340317 83,53 ± 6,99% 308569 75,74 ± 2,75% 385481 94,99 ± 3,10% 289292 71,01 ± 6,23%

LOR 341309 257721 75,51 ± 4,61% 219119 64,20 ± 2,61% 332641 97,43 ± 1,79% 254361 74,53 ± 4,19%

PRO 882022 656861 74,47 ± 6,05% 646787 73,33 ± 2,64% 861764 98,93 ± 1,33% 663591 75,24 ± 2,91%

Nhận xét: Kết quả cho thấy: hiệu suất chiết của các dung môi không có sự khác biệt

lớn trên 3 nền mẫu, tuy nhiên hiệu suất chiết của các dung môi khác nhau có sự chênh lệch đáng kể Với dung môi chiết là methanol, hiệu suất chiết các chất phân tích khá đồng đều nhau từ 94,99% - 100,32% và cao hơn 3 dung môi còn lại Do

đó, chọn dung môi chiết mẫu là methanol

Sau quá trình khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu như sau:

Hình 3 9 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

3.3.1 Thẩm định phương pháp HPLC

3.3.1.1 Độ đặc hiệu

Chuẩn bị các dung dịch sau:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Pha hỗn hợp chuẩn có nồng độ CIN, CLO, CYP, LOR,

PRO là 10 µg/ml trong methanol

- Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị 3 dung dịch nền mẫu Xử lý theo quy trình đã xây dựng ở mục 3.2

- Dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn: Thêm chuẩn vào 3 nền mẫu sao cho sau xử lý thu được các dung dịch có nồng độ tương tự với mẫu chuẩn Xử lý theo quy trình đã xây dựng ở mục 3.2

- Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Kết quả được trình bày ở hình 3.10

Chế phẩm đông dược

Cân lượng bột tương ứng ½ liều

Hình 3 10 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp HPLC

Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic trùng với thời gian lưu của

các chất phân tích Trên sắc ký đồ mẫu nền thêm chuẩn, các pic xuất hiện trùng thời gian lưu với mẫu chuẩn, các pic đều có hình dạng đẹp, cân đối, phổ UV-VIS tại đỉnh pic có dạng giống như của mẫu chuẩn (hệ số chồng phổ của mẫu nền thêm chuẩn và mẫu chuẩn lớn hơn 0,99) Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ đặc hiệu trên cả 3 nền mẫu N1, N2, N3

3.3.1.2 Độ thích hợp hệ thống

Tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 10µg/ml vào hệ thống HPLC, đánh giá độ biến thiên của diện tích pic và thời gian lưu Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3 2 Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống HPLC

Nhận xét:

Từ các kết quả bảng trên cho thấy: Thời gian lưu và diện tích pic thu được của 6 lần sắc kí lặp lại mẫu chuẩn của 5 chất có giá trị RSD thấp (< 1%), đạt yêu cầu theo AOAC 2016 và ICH 2005 (RSD ≤ 2,0 %) Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký là phù hợp để định lượng đồng thời CIN, CLO, CYP, LOR, PRO

3.3.1.3 Khoảng nồng độ tuyến tính

Từ dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp chất bằng methanol Xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic của từng chất chuẩn với nồng độ các chất, được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3 3 Kết quả đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính bằng HPLC

3,14 214117 3,40 44664 2,97 124782 3,11 106454 3,03 270934 C2

5,23 317822 5,67 68119 4,96 189572 5,18 159172 5,06 405464 C3

10,47 653005 11,33 146882 9,91 405811 10,36 341417 10,11 875355 C4

15,70 920184 17,00 198951 14,87 554259 15,54 476959 15,17 1221491 C5

20,94 1198184 22,66 265625 19,83 738234 20,72 626342 20,22 1587364 C6

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát của CIN, CLO, CYP, LOR, PRO có

sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ của các chất, với hệ

số tương quan r > 0,995

3.3.1 4 Độ đúng và độ chính xác

Độ đúng và độ chính xác trong ngày được xác định bằng cách thêm chính xác lượng dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào nền mẫu ( tương ứng khoảng ½ liều dùng:nền N1 là 2,5g; N2 là 0,7 g; N3 là 1,6 g) ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao), lắc đều, để yên 15 phút Sau đó, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng tại mục 3.2 Nồng độ chuẩn sau khi xử lý mẫu ở 3 mức lần lượt là 3 ppm-10ppm- 20 ppm Tiến hành lặp lại 6 lần ở mỗi mức nồng độ Độ đúng và độ chính xác khác ngày được tiến hành tương tự nhưng vào ngày phân tích khác Phân tích bằng phương pháp HPLC với các điều kiện đã chọn Lượng chuẩn tìm lại tính theo đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích Kết quả được trình bày trong bảng 3.4