nghiên cứu xây dựng quy trình xác định đồng thời một số chất màu trộn trái phép trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ LAN PHƯƠNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT MÀU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ LAN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ CHẤT MÀU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Cao Sơn

TS Lê Thị Kim Vân

HÀ NỘI 2020

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Trần Cao Sơn

- Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Lê Thị Kim Vân -

Viện Dược liệu Việt Nam, hai người thầy đã tận tình hướng dẫn và quan tâm giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Hóa Phân tích - độc chất đã chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hà Bình và các đồng

nghiệp tại Khoa độc học và dị nguyên - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ với tôi trong quá trình thực hiện

luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã

giúp đỡ và động viên để tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận văn

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ, động viên, khích lệ của Quý Thầy, Cô, Cơ quan, Bạn bè và Gia đình đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Hà nội, ngày 22 tháng 05 năm 2020

Học viên

Vũ Lan Phương

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ………… ………1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ PHẨM MÀU 3

1.1.1 Giới thiệu chung về phẩm màu 3

1.1.2 Tình trạng chất màu trộn trái phép vào thực phẩm 4

1.1.3 Đặc điểm hóa lý các nhóm phẩm màu 5

1.1.4 Tính chất các chất màu 6

1.1.5 Độc tính 14

1.1.6 Các quy định hiện hành về chất màu trộn trái phép 16

1.2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHẤT MÀU 19

1.2.1 K thuật x lý mẫu 19

1.2.2 K thuật phân tích chất màu 22

1.2.3 Một số nghiên cứu xác định chất màu trộn trái phép 28

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 29

2.1.1 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất 29

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 30

2.2 ĐÔ I TƯƠ NG NGHIÊN CƯ U 30

2.2.1 Mẫu thực phẩm 30

2.2.2 Chất màu trộn trái phép 31

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHA P NGHIÊN CƯ U 32

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 32

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 32

2.3.3 Ứng dụng phân tích phẩm màu trộn trái phép trong mẫu thực phẩm 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 KÊ T QUA XÂY DƯ NG PHƯƠNG PHA P PHÂN TI CH 35

3.1.1 Tối ưu điều kiện khối phổ 35

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 35

3.1.3 Khảo sát quy trình x lý mẫu 38

3.2 KÊ T QUA THÂ M ĐI NH PHƯƠNG PHA P PHÂN TI CH 44

3.2.1 Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp 44

3.2.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 46

3.2.4 Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính 48

3.2.5 Độ chính xác của phương pháp 49

3.3 KÊ T QUA PHÂN TÍCH MẪU THỰC 53

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 58

KẾT LUẬN 62

KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid

ELSD Evaporative light scattering

detector Detector tán xạ bay hơi

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-

mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ 2

lần LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

US-FDA United States – Food and Drug

Administration

Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm M

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1 Màu sắc của các chất màu nghiên cứu 17

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chất màu trộn trái phép 25

Bảng 2.1 Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp chất màu 31

Bảng 3.1 Thông tin mảnh mẹ, mảnh con của các chất 35

Bảng 3.2 Khảo sát hệ dung môi pha động 37

Bảng 3.3 So sánh thời gian lưu của pic thu được từ chuẩn và mẫu thêm chuẩn 45

Bảng 3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các chất màu 46

Bảng 3.5 Đường chuẩn của các chất phân tích 48

Bảng 3.6 Kết quả độ thu hồi, độ lặp lại của pararosanilin trong mẫu thịt bò khô 50

Bảng 3.7 Kết quả độ thu hồi, độ lặp lại của auramine O trong mẫu thịt bò khô

……… 50

Bảng 3.8 Kết quả độ thu hồi, độ lặp lại của crystal violet trong mẫu thịt bò khô

……… 51

Bảng 3.9 Kết quả độ thu hồi, độ lặp lại của sudan I trong mẫu thịt bò khô 51

Bảng 3.10 Kết quả độ thu hồi, độ lặp lại của sudan II trong mẫu thịt bò khô 52

Bảng 3.11 Tổng hợp kết quả thẩm định 53

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 CTCT Oil Orange SS 6

Hình 1.2 CTCT Rhodamin B 7

Hình 1.3 CTCT Canthaxanthin 7

Hình 1.4 CTCT Crystal violet 8

Hình 1.5 CTCT Malachite green 8

Hình 1.6 CTCT LeucoMalachite 9

Hình 1.7 CTCT Chrysodine G 9

Hình 1.8 CTCT Auramin O 10

Hình 1.9 CTCT Sudan I 10

Hình 1.10 CTCT Sudan II 11

Hình 1.11 CTCT Sudan III 11

Hình 1.12 CTCT Sudan IV 12

Hình 1.13 CTCT Sudan Red B 12

Hình 1.14 CTCT Sudan Black B 13

Hình 1.15 CTCT Para red 13

Hình 1.16 CTCT Pararosanilin 14

Hình 1.17 Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ 23

Hình 1.18 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba 24

Hình 3.1 Sắc ký đồ các chất màu không trong danh mục cho phép của Bộ Y tế 37

Hình 3.2 So sánh độ thu hồi chất phân tích của 3 phương pháp x lý mẫu 39

Hình 3.3 Độ thu hồi các chất phân tích của các hệ dung môi 40

Hình 3.4 Độ thu hồi các chất phân tích của các muối chiết 41

Hình 3.5 Độ thu hồi các chất phân tích của các bột làm sạch dịch chiết 42

Hình 3.6 Quy trình x lý mẫu tối ưu 43

Hình 3.7 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn Rhodamin B của thịt bò khô 44

Hình 3.8 Sắc ký đồ LOQ của Malachite green 47

Hình 3.9 Sắc ký đồ LOQ của sudan IV 47

Hình 3.10 Đường chuẩn sudan I 49 Hình 3.11 Sắc đồ mẫu GV-21 dương tính Rhodamin B ở mức hàm lượng 6112 µg/kg 55 Hình 3.12 Sắc đồ mẫu GV-16 dương tính Rhodamin B ở mức hàm lượng 215 µg/kg 55 Hình 3.13 Sắc đồ mẫu GV-22 phát hiện Rhodamine B (1010 µg/kg) và sudan I (420 µg/kg) 56 Hình 3.14 Sắc đồ mẫu GV-2 dương tính với Rhodamine B (12,5 mg/kg) 56 Hình 3.15 Sắc đồ mẫu GV-27 dương tính Rhodamine B (150 mg/kg)

và auramine O (5 mg/kg) 56 Hình 3.16 Sắc đồ mẫu GV-30 dương tính rhodamine B (480 µg/kg) 57

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng, vấn đề vệ sinh

an toàn thực phẩm đang được đặt lên hàng đầu Theo số liệu của tổ chức Y tế thế giới WHO, năm 2010 mỗi năm nước ta có khoảng 126.000 người mới mắc bệnh ung thư và khoảng 94.000 người chết vì ung thư Bên cạnh các nguyên nhân được chỉ ra như hút thuốc lá, rượu, viêm gan virus và ô nhiễm khói, bụi thì các nhà nghiên cứu ung thư cũng đã chỉ ra nghi vấn về các chất gây ung thư có mặt trong thực phẩm bẩn

Theo xu hướng phát triển của ngành công nghiệp thực phẩm thì việc s dụng phẩm màu thực phẩm ngày càng phổ biển và được ứng dụng rộng rãi Tuy nhiên, việc s dụng phẩm màu đang bị lạm dụng, đặc biệt là việc dùng các phẩm màu không nằm trong danh mục cho phép của Bộ Y tế s dụng trong thực phẩm nhờ những ưu điểm về đa dạng màu sắc, dễ mua, dễ s dụng, bền màu và hiệu quả kinh tế cao Các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng, việc

s dụng các loại phẩm màu thực phẩm không nằm trong danh mục cho phép của Bộ Y tế có thể gây ra những ảnh hưởng tức thời như nôn m a, tiêu chảy, đau bụng, mẩn ngứa hoặc dẫn tới khả năng ngộ độc thức ăn cấp tính, có thể t vong nếu không được chữa trị kịp thời Nếu cơ thể hấp thụ lâu ngày chúng sẽ tích tụ lại và gây ra bệnh ung thư, biến đổi gen trong cơ thể [9]

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu tập trung vào đối tượng nghiên cứu là nhóm bột gia vị có màu như: ớt bột, bột hoa hiên, bột điều, viên gia vị

bò, gà, các loại bánh, nước ngọt nhiều màu bán ở cổng trường tiểu học… Tham khảo các nghiên cứu trên thế giới về xác định phẩm màu trộn trái phép trong thực phẩm, đề tài tập trung phân tích 16 phẩm màu trộn trái phép sau: Malachite green, LeucoMalachite, chrysodine G, rhodamine B, auramine O, sudan I, sudan II, sudan III, sudan IV, sudan red B, sudan black B, para red, oil orange SS, pararosanilin, crystal violet, canthaxanthin Đây là nhóm có nguy cơ s dụng trái phép trong thực phẩm Chúng thuộc nhóm các hợp chất azo là chất nhuộm tổng hợp được s dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp dệt, công nghiệp đồ chơi, công nghiệp da giầy… Bất kỳ mức độ có mặt nào của thuốc nhuộm nhóm này đều được coi là không an toàn cho người tiêu dùng [9]

Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình xác

định đồng thời một số chất màu trộn trái phép trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ” đã được thực hiện với mục tiêu:

1 Xây dựng được quy trình xác định đồng thời các chất màu trộn trái phép trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng được trên các mẫu thực phẩm thu thập trên địa bàn Hà Nội để phân tích các chất màu này trong thực phẩm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ PHẨM MÀU

1.1.1 Giới thiệu chung về phẩm màu

Các chất màu được s dụng trong thực phẩm có 2 loại là chất màu tự nhiên và chất màu tổng hợp Chất màu tự nhiên là các chất màu được chiết xuất hoặc chế biến từ nguyên liệu hữu cơ (thực vật, động vật) sẵn có trong tự nhiên Ví dụ, Caroten tự nhiên được chiết xuất từ các loại quả có màu vàng, Curcumin được chiết xuất từ củ nghệ, màu Caramen được chế biến từ đường…Nhóm phẩm màu nguồn gốc tự nhiên có nhược điểm là độ bền kém,

s dụng với lượng lớn nên giá thành sản phẩm cao…

Phẩm màu tổng hợp là các chất màu được tạo ra bằng phản ứng tổng hợp hoá học Một số phẩm màu tổng hợp được phép s dụng trong thực phẩm đã được quy định tại Thông tư 24/2019/TT-BYT ngày 38 tháng 8 năm 2019 quy định về quản lý và s dụng phụ gia thực phẩm với 57 phẩm màu được phép

s dụng trong thực phẩm Ví dụ Curcumin, Turmeric, Riboflavin, Tartrazin,

… Nhiều người, nhất là cơ sở chế biến thực phẩm chuộng phẩm màu hóa học

vì chúng thường đem lại màu sắc đẹp cho món ăn, không bị bay màu trong quá trình chế biến và giúp cho món ăn bắt mắt, hấp dẫn hơn, không dễ bị hỏng Các phẩm màu tổng hợp thường đạt độ bền màu cao, với một lượng nhỏ đã cho màu đạt với yêu cầu đặt ra do đó tiết kiệm chi phí sản xuất

Tuy nhiên, phẩm màu hóa học hiện đang bán nhiều ngoài thị trường với giá thường rất rẻ, chỉ khoảng 25.000-50.000 đồng/kg với loại không có nhãn mác xuất xứ từ Trung Quốc Rất dễ mua các loại phẩm màu này, tất cả đều được bày bán nhiều ở chợ, chúng còn dễ s dụng và không bao giờ hỏng Người sản xuất vẫn có thể dùng chất tạo màu để bổ sung vào thực phẩm nhằm tránh mất màu tự nhiên hoặc tạo màu sắc mong muốn Ngoài ra, phẩm màu cũng có thể bị nhiễm vào thực phẩm trong quá trình bao gói, vận chuyển, nhiễm chéo … Điều này ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Các chất

màu trộn trái phép trong thực phẩm được nghiên cứu gồm: Malachite green, LeucoMalachite, chrysodine G, rhodamine B, auramine O, sudan I, sudan II, sudan III, sudan IV, sudan red B, sudan black B, para red, oil orange SS, pararosanilin, crystal violet, canthaxanthin

1.1.2 Tình trạng chất màu trộn trái phép vào thực phẩm

Trên thế giới đã ghi nhận một số sự vụ liên quan đến việc s dụng phẩm màu không có trong danh mục cho phép của Bộ Y tế trong thực phẩm Năm

2006 tại Trung Quốc phát hiện dư lượng thuốc nhuộm Sudan trong trứng Số lượng Sudan IV được phát hiện ở gà mái, gà và trứng đạt tới 300 µg/kg [17] Theo dữ liệu thu được năm 2014 từ Hệ thống cảnh báo nhanh về thực phẩm (RASFF) trong Liên minh châu Âu, thuốc nhuộm bị cấm pha trộn thường được phát hiện trong ớt, ớt đỏ, bột nghệ, và các sản phẩm cà ri Năm 2013, theo nghiên cứu của Juan Li và cộng sự, cũng tại Trung Quốc, phát hiện 2 mẫu ớt bột dương tính với Rhodmin B và Auramin O [18] Zhibo Hua và cộng sự (năm 2018) nghiên cứu xác định phẩm màu trộn trái phép trong thực phẩm phát hiện 1 mẫu tương ớt chứa rhodamine B và 1 mẫu đậu khô chứa yellow 36 [31] Nhiều nghiên cứu khác cũng đã phát hiện các loại phẩm màu azo trong các sản phẩm thực phẩm

Tại Việt Nam, vấn đề s dụng phẩm màu này trong thực phẩm cũng rất đáng quan ngại Năm 2007, thành phố Hồ Chí Minh phát hiện mẫu trứng tại một số chợ truyền thống chứa sudan với tỷ lệ khoảng 50% Năm 2010, Trung tâm Đào tạo và Phát triển sắc khí EDC TP Hồ Chí Minh phân tích và phát hiện Rhodamin B trong một loạt các sản phẩm hạt dưa, ớt bột với tỷ lệ dương tính tới 80% Năm 2016, Chi cục an toàn vệ sinh thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh (Chi cục) đã triển khai lấy các mẫu măng tươi qua luộc và măng khô tại hai chợ trên địa bàn Thành phố g i Viện Y tế công cộng phân tích Kết quả: 04/04 mẫu phát hiện có chất nhuộm màu vàng Auramine O với hàm

lượng 2 mẫu măng khô: 11,84 µg/kg; 41,35 µg/kg và 2 mẫu măng tươi luộc: 17,06 µg/kg; 3108,94 µg/kg [8]

1.1.3 Đặc điểm hóa lý các nhóm phẩm màu trộn trái phép

Dựa trên các quan điểm của Butlerov và Alektsev, năm 1876 O Witt [7]

đã lập nên thuyết mang màu của hợp chất hữu cơ, được coi là thuyết đầu tiên Theo thuyết này thì hợp chất hữu cơ có màu do chúng chứa các nhóm mang màu trong phân t , đó là những nhóm nguyên t chưa bảo hoà hoá trị Những nhóm mang màu quan trọng hơn cả là:

- Khi liên kết nối đôi cách trong phân t hợp chất hữu cơ được kéo dài hơn thì màu sẽ sâu hơn

- Tăng số nhân thơm trong hợp chất từ cấu trúc đơn giản thành cấu trúc

đa nhân phức tạp thì màu sẽ sâu hơn

- Tăng số nhóm cacbonyl liên kết trực tiếp với nhau trong hợp chất cũng dẫn đến sâu màu

- Việc tạo thành mối liên kết mới giữa các nguyên từ cacbon trong từng

phân t và không phá vở hệ thống nối đôi liên hợp cũng làm cho màu sâu

hơn

- Việc chuyển nhóm trợ màu thành dạng muối và ankyl hoá nhóm amin

sẽ dẫn đến sâu màu

- Khi ankyl hoá nhóm hiđroxyl tronh nhân thơm hoặc chuyển nhóm trợ

màu vào liên kết vòng thì màu của hợp chất nhạt đi

Tùy theo loại nhóm thế có trong phân t mà độ hòa tan phẩm màu sẽ dao

động trong khoảng từ rất tốt đến không tan Tăng số nhóm SO3H hay COOH

sẽ tăng độ hòa tan của phẩm màu trong nước Khi đưa vào phân t phẩm màu

các nguyên t hay nhóm thế như: Cl, NO2, CH3 sẽ là tăng độ hòa tan của

phẩm màu trong dung môi hữu cơ Các muối của phẩm màu với kim loại

kiềm thổ không hòa tan cả trong nước và dung môi hữu cơ

1.1.4 Công thức và tính chất các chất màu trộn trái phép

1.1.4.1 Oil Orange SS

- Tên khác: Orange OT, C.I Solvent Orange 2

- Mã chất màu: 58044

- Tan tốt trong methanol

- Tên khoa học: 1-[(2-methylphenyl)diazenyl]naphthalen-2-ol

- Công thức phân t : C17H14N2O

- Khối lượng phân t : 262,31

Hình 1.1 CTCT Oil Orange SS

1.1.4.2 Rhodamin B

- Tên khác: Rhodamine 610, CI pigment Violet 1, Basic Violet 10

- Mã màu: 145170 [6]

- Tan tốt trong nước (khoảng 50g/l), methanol và ethanol

- Tên khoa học:

[9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammoniumclorid

- Công thức phân t : C28H31N2O3Cl

- Khối lượng phân t : 479,02

O N

- Tên khác: Orobronze, Carophyll Red beta,beta-Carotene-4,4'-dione

- Mã màu: 5281227 [10]

- Tan tốt trong methanol

- Tên khoa học: β,β-Carotene-4,4'-dione

- Công thức phân t : C40H52O2

- Khối lượng phân t : 564,8

N N

S O

OH Cl

CH3

O

-O [Ba]2+

1/2

Hình 1.3 CTCT Canthaxanthin

1.1.4.4 Crystal violet

- Tên khác: Getian violet, Methyl Violet 10B, hexamethyl pararosanilin

clorid, hoặc pyoctanin, Tím tinh thể

- Tên khác: Aniline green, Basic green 4

- Mã chất màu: 10820 [22]

- Tan tốt trong methanol

- Tên khoa học:

4-{[4-(Dimethylamino)phenyl](phenyl)methylidene}-N,N-dimethylcyclohexa-2,5-dien-1-iminium chloride

- Công thức phân t : C23H25ClN2

- Khối lƣợng phân t : 364,91

Hình 1.5 CTCT Malachite green

- Tên khác: Basic Orange 2, Chrysoidine Y

- Mã chất màu: 10771 [21]

- Tan tốt trong methanol

-Tên khoa học: 4-Phenylazo-m-phenylenediamine monohydrochloride

- Công thức phân t : C12H13ClN4

- Khối lƣợng phân t : 248,71

Hình 1.7 CTCT Chrysodine G 1.1.4.8 Auramin O

- Tên khác: Basic yellow 2, C.I 41000

- Mã chất màu: 16254 [18]

- Tan tốt trong methanol

- Tên khoa học: bis[4-(dimethylamino)phenyl]methaniminium chloride

- Công thức phân t : C17H22ClN3

- Khối lƣợng phân t : 303,83

Hình 1.8 CTCT Auramin O 1.1.4.9 Sudan I

- Tên khác: Brilliant Oil Orange R

- Khối lƣợng phân t : 276,33

Hình 1.10 CTCT Sudan II 1.1.4.11 Sudan III

- Tên khác: Scarlet Red

- Khối lƣợng phân t : 380,45

Hình 1.12 CTCT Sudan IV 1.1.4.13 Sudan Red B

- Tên khác: Solvent Red 25, C.I Solvent Red 25

- Mã chất màu: 26110 [20]

- Tan tốt trong ethanol

- Tên khoa học: 1-[[3-methyl-4-[(3-methylphenyl)diazenyl]phenyl]

- Tan tốt trong methanol

- Tên khoa học:

2,3-Dihydro-2,2-dimethyl-6-[[4-(phenylazo)-1-naphthalenyl]azo]-1H-perimidine

- Công thức phân t : C29H24N6

- Tan tốt trong methanol

- Tên khoa học: 1-(4-Nitrophenylazo)-2-naphthol,

- Tan tốt trong methanol

- Tên khoa học: [4-[Bis(4-aminophenyl)methylidene]-1-cyclohexa-

2,5-dienylidene]dianiline

- Công thức phân t : C19H17N3

- Nhóm dẫn xuất azoic: Phẩm màu azoic được s dụng nhiều trong thực phẩm Trong thời gian đầu s dụng, hầu như người ta không quan tâm đến ảnh hưởng của phẩm màu đối với sức khoẻ người tiêu dùng Nhưng từ khi Kino-sita phát hiện khả năng gây ung thư của p-dimetyl amino azobenzen (-NH2, CH3), người ta mới bắt đầu quan tâm và lo lắng nhiều về độc tính của phẩm azoic Cơ cấu phân t phẩm màu và khả năng gây ung thư: người ta tin tưởng rằng có thể gắn tác dụng gây ung thư này khi có sự tồn tại của các nhóm kiềm, nhất là với các nhóm định chức amin Nhóm này thường ít tan trong nước, được tích lu trong mô mỡ và sự bài tiết đào thải ra ngoài thường rất chậm

- Các nhà khoa học đã chứng minh sudan có khả năng làm biến đổi cấu trúc của gen và gây ung thư cho người Công bố đầu năm 2007 của An Y và cộng sự cho rằng sudan I tác động "phá vỡ" cấu trúc của DNA và nhiễm sắc thể (NST) khi đưa vào môi trường nuôi cấy tế bào Khả năng oxi hóa của sudan có thể được thực hiện bởi ion benzenediazone Các quá trình biến đổi làm Sudan

có khả năng kết hợp với các DNA tạo liên kết sudan-DNA (sudan-DNA adducts) Đặc biệt, Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) - một trong những enzym

quan trọng tham gia vào quá trình biến đổi các chất gây ung thư, cũng được chứng minh là có liên quan đến biến đổi của Sudan và các dẫn chất của nó để tạo ion benzenediazone (Stiborova và cs, 1995) Nhiều phương pháp hiện đại khác nhau trong sinh học phân t đã được dùng để chứng minh sự can thiệp của sudan vào cấu trúc DNA Bằng phương pháp thí nghiệm s dụng Baculovirus tái tổ hợp mang gene CYP1A1 của người, nhóm nghiên cứu của Stiborowa đã chứng minh khả năng gây biến đổi DNA của sudan hoàn toàn có thể sảy ra khi

nó "tiếp xúc được" với hệ thống enzym vận chuyển điện t trong các tế bào của

cơ thể người EU cũng không yêu cầu các phòng thí nghiệm phải tuân theo các phương pháp đã định sẵn nhưng vẫn đưa ra giới hạn phát hiện của sudan 0,5 - 1mg/kg và phải thu hồi bất cứ thực phẩm nào có hàm lượng Sudan nhiều hơn giới hạn này [6]

Thuốc nhuộm Sudan có thể được chuyển hóa thành enzyme amin thơm gây ung thư (Sudan I và III - anilin, Sudan II - 2,4 - dimethylaniline, Sudan IV - o-toluidine, Para-Red - p-nitroaniline) Sudan I là genotoxic nhưng dữ liệu về tác dụng độc hại của thuốc nhuộm Sudan khác không được công nhận đầy đủ

Vì thế, theo Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế về Ung thư (IARC), chúng được phân loại là chất gây ung thư loại thứ ba Ví dụ: thuốc nhuộm như: Sudan đỏ G, Sudan đỏ 7B, Sudan đỏ B, Sudan Cam G, Toluidine đỏ, Rhodamine B, Cam II, Para-Red, cũng được coi là gây ung thư cho người và bị cấm làm thức ăn phụ gia, cũng được phát hiện trong thực phẩm ở châu Âu Liên hiệp

Nhóm dẫn xuất Triphenyl methan: Về độc tính, phẩm màu dẫn xuất Triphenyl methan có thể gây eczema, rối loạn dạ dày, tiêu chảy và các triệu chứng khác về phổi khi hấp thụ qua thực phẩm

Nhóm dẫn xuất Diphenyl methan: Auramin O có thể gây ung thư gan Công nhân làm việc để sản xuất phẩm màu này thường bị ung thư bàng quang Nhóm dẫn xuất Phtalesin (xanthen) – Eosin - Fluoescein – Rhodamin: Theo Ureda, cả 3 phẩm màu này, nhất là Rhodamin B, đều gây trên chuột cống

trắng những sarcome sau nhiều lần trích lập lại dưới da (riêng với Rhodamin B trên chuột cống trắng qua đường uống cũng có triệu chứng giống như tiêm dưới

da nhưng không gây ung thư) - Theo Bonser với liều lượng 0,5% thêm vào trong nước uống ở chuột nhắt trắng đã gây hai trường hợp bướu ở ruột trên 30 động vật thí nghiệm - Hansen cũng cho biết, Rhodamin-B dùng lâu dài qua đường miệng đối với chuột cống trắng cho thấy sự tăng trưởng và sự bất thường ở tế bào Nói chung, Rhodamin B là một chất màu độc, có khả năng gây ung thư, [25] và nằm trong danh mục cấm s dụng trong m phẩm theo Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý m phẩm [5] Trái lại, với Eosin

và Erythrosin 5 (887 theo Schult-773 theo CL/1924-45130 theo CL/1956) người ta thấy: Ở chó có thể gây ói m a và có albumin trong nước tiểu Ở chuột trắng có s dụng huyết và nồng độ cao có sự liệt ruột [4]

- Chất vàng ô hay chất cấm Aurmine là một chất nhuộm vải, chất này đứng hàng thứ 5 trong 116 chất gây ung thư hàng đầu trên thế giới Đáng lo ngại là chất vàng ô độc hại đến mức tổ chức Ung thư thế giới IARC đã xếp chất này vào hàng gây ung thư nhóm 3, tức là khả năng gây ung thư cao Bộ NNPTNT đã ban hành Thông tư số 42 về danh mục bổ sung hóa chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và s dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam Theo đó, bổ sung 5 loại vàng ô vào danh mục này gồm: VAT yellow 1, VAT yellow 2, VAT yellow 3, VAT yellow 4, Auramine và các dẫn xuất của Auramine hay còn được gọi là cơ bản màu vàng

2, s dụng trong công nghệ dệt nhuộm

1.1.6 Các quy định hiện hành về chất màu trộn trái phép

Trên thế giới, các phẩm màu này bị cấm s dụng trong thực phẩm theo quyết định 2005/402/EC Bất kỳ sự có mặt nào trong thực phẩm cũng đều gây hại cho người s dụng

Ở Việt Nam, thông tư 24/2019/TT-BYT ngày 30 tháng 8 năm 2019 hướng dẫn quản lý phụ gia thực phẩm đã có các quy định về phẩm màu dung trong

thực phẩm Các chất màu không có tên trong danh sách đƣợc phép s dụng thì đều bị coi là cấm s dụng trong thực phẩm tại phụ lục 1

Bảng 1.1 Màu sắc của các chất màu nghiên cứu

1.2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHẤT MÀU

1.2.1 K thuật x lý mẫu

Mẫu cần phải được chiết tách, x lý để loại tạp chất, các ảnh hưởng của nền mẫu và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích để tăng độ nhạy của phương pháp Hiện nay, để x lý mẫu thực phẩm, người ta thường hay áp dụng các k thuật cơ bản đó là: chiết lỏng – lỏng, QuEChERS và chiết pha rắn [19]

- K thu t chi t l ng- l ng:

Chiết lỏng - lỏng là phương pháp được dùng phổ biến nhất để phân tích chất màu trongtrộn trái phép trong thực phẩm Nguyên lý của k thuật này là chuyển chất phân tích được hoà tan trong dung môi này sang dung môi khác không đồng tan [1] Tỉ lệ thu hồi hoạt chất phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong dung môi chiết, tính phân cực của dung môi chiết, pH của pha nước, hệ số/hằng số phân bố của hoạt chất trong hai pha lỏng không trộn lẫn với nhau Trong thực nghiệm, các dung môi hay được lựa chọn là diethylether,

methyl tert-butyl ether, cloroform, acetonitril, dicloromethan, n-hexan,

methanol Các dung môi này có thể dùng đơn thành phần hoặc dùng phối hợp với tỷ lệ thích hợp tuỳ theo từng hoạt chất phân tích

Ưu điểm của k thuật chiết lỏng - lỏng là mẫu thu được tương đối sạch

và có thể làm giàu mẫu, áp dụng được với nhiều chất, phù hợp với điều kiện

và thiết bị của nhiều phòng thí nghiệm Nhược điểm của k thuật này s dụng nhiều dung môi ảnh hưởng tới sức khỏe người phân tích và môi trường, có thể hình thành nhũ tương trong quá trình chiết ảnh hưởng đến kết quả phân tích [19] Chủ yếu ứng dụng với mẫu dạng lỏng

Nguyễn Văn Yên [3] đã tiến hành nghiên cứu quy trình x lý mẫu xác định các chất sudan trong thực phẩm và m phẩm với hiệu suất thu hồi từ 91,1% đến 95,6% Mẫu nước sốt, gói lẩu được x lý bằng k thuật chiết lỏng-lỏng với 30 mL dung môi aceton, dịch chiết được gộp vào cốc có mỏ 50 mL

đun cách thủy ở 80oC trong 5 phút, lọc qua giấy lọc, cô dịch chiết trên cách thủy ở nhiệt độ 80oC đến cắn, hòa cắn bằng hỗn hợp dung môi methanol:ethylacetat (1:1), lọc qua màng lọc 0,45 µm

- K thu t chi t pha rắn (SPE - Solid Phase Extraction):Là k thuật

được phát triển dựa trên nguyên tắc của các k thuật tách sắc ký (chất phân tích được lưu giữ trên cột và sau đó được r a giải nhờ một hệ dung môi thích hợp) Các giai đoạn chính của k thuật SPE gồm các giai đoạn: hoạt hóa cột, nạp mẫu, r a tạp và r a giải K thuật này đòi hỏi người phân tích phải được đào tạo và có kinh nghiệm trong việc chọn cột và dung môi thích hợp để r a tạp và r a giải Ưu điểm của k thuật này là nền mẫu sạch ít gây ra hiện tượng ảnh hưởng của nền mẫu, tỷ lệ thu hồi cao, độ lặp lại tốt Hiện nay trên thế giới

k thuật SPE được áp dụng khá phổ biến nhưng trong các phòng thí nghiệm của Việt Nam k thuật này chưa được áp dụng nhiều do cột dùng cho SPE đắt nên chi phí phân tích cao Mặt khác nếu s dụng k thuật SPE thủ công thì thời gian x lý mỗi mẫu kéo dài do quá trình chiết trải qua nhiều giai đoạn, nếu s dụng k thuật SPE tự động thì có thể x lý đồng thời nhiều mẫu nhưng đòi hỏi thiết bị hiện đại, giá thành cao [19]

Feng và cộng sự [13] đã xây dựng phương pháp xác định đồng thời 40 phẩm màu trộn trái phép trong mẫu nước giải khát với hiệu suất thu hồi đạt từ 91-105% Mẫu được đuổi CO2 trước khi làm sạch bằng cột SPE HLB Cột được hoạt hóa bằng 5 mL MeOH, 5 mL nước Nạp dịch qua cột và r a tạp bàng 5 mL MeOH: H2O (15/85) Chất phân tích được r a giải bằng 5 mL MeOH chứa 0,1% amoni

Liu và cộng sự [10] xác định đồng thời 15 phẩm màu trộn trái phép trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần với việc làm sạch mẫu bằng cột alumina Mẫu được chiết bằng ACN trước khi làm sạch qua cột SPE alumina Cột được hoạt hóa bằng 3 mL ACN, nạp 1 mL

dịch chiết qua cột, r a giải chất phân tích bằng 3 mL MeOH-acid acetic 95/5 Phương pháp cho độ thu hồi trong khoảng 60-140%, giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,01 đến 5,61 µg/kg

- K thu t QuEChERS:

K thuật QuEChERS (viết tắt của thuật ngữ Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) là k thuật chuẩn bị mẫu hiện đại được thiết kế ban đầu cho phân tích bảo vệ thực vật trong nông sản sau đó được ứng dụng rộng rãi cho các mẫu khác nhờ vào tính ưu việt của nó Phương pháp này tối thiểu hóa các bước chuẩn bị mẫu, giảm s dụng dung môi hóa chất độc hại, đồng thời giảm chi phí th nghiệm K thuật QuEChERS hiện nay là cơ sở cho các phương pháp th được thừa nhận rộng rãi trên thế giới như AOAC

2010 (2001.07), EN 15662 và đang được các PTN lớn, hiện đại ở nước ta áp dụng [1]

Wei Jia và cộng sự [28] đã xây dựng phương pháp xác định đồng thời 69 phẩm màu trộn trái phép trong mẫu rượu Mẫu được chiết bằng ACN chứa 1% acid acetic, thêm 6 g MgSO4, 1,45 g NaCl Làm sạch dịch chiết bằng 0,12

g MgSO4, 107 mg PSA, 96 mg C18 Phương pháp cho độ thu hồi từ 87-107%, giới hạn phát hiện của phương pháp là 1-1000 µg/kg, tùy chất

Xiran He và cộng sự [27] xác định sudan I trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC Mẫu được chiết bằng ACN: H2O 8/2, thêm 4 g MgSO4,

1 g NaCl, lắc mạnh Ly tâm, lọc dịch đo HPLC tại bước sóng 474 nm Phương pháp có độ thu hồi là 79-92% Giới hạn phát hiện là 1,5 µg/kg

Zhibo Huo và cộng sự [31] xác định đồng thời các phẩm màu trộn trái phép trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần Mẫu được chiết bằng MeOH-ACN 1/1, dịch chiết được làm sạch bằng 200 mg bột làm sạch C18 Phương pháp cho độ thu hồi trong khoảng 71-111%

Các nghiên cứu s dụng QuEChERS để x lý mẫu cho kết quả khả quan

về việc phân tích đồng thời các chất có tính chất khá khác nhau và trên đa dạng nền mẫu

1.2.2 K thuật phân tích chất màu trộn trái phép

Trên thế giới đã có nhiều phương pháp như phương pháp TLC, phương pháp HPLC với detector UV- VIS, phương pháp HPLC với detector FD, phương pháp LC–MS/MS đã được s dụng để định tính và định lượng các chất màu Tùy thuộc vào nồng độ, cấu trúc phân t , tính chất hóa lý, khả năng hấp thụ UV-VIS, khả năng phát huỳnh quang… của chất phân tích mà lựa chọn detector phù hợp để phát hiện Với phương pháp TLC có độ đặc hiệu và

độ nhạy thấp Phương pháp HPLC độ đặc hiệu và độ nhạy đã cải thiện hơn so với phương pháp TLC Tuy nhiên, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cao chưa phù hợp để định lượng các chất cấm - thường được cho vào với hàm lượng nhỏ trong thực phẩm Phương pháp LC–MS/MS, giá trị giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp khoảng tuyến tính rộng, phù hợp để phân tích các chất cấm trong thực phẩm

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là một k thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa khả năng phân tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân

tích khối của detector khối phổ [1]

Trong số các k thuật LC-MS, k thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa kiểu phun điện

t (ESI) có độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao do vậy thường được s dụng để phân tích chất màu trộn trái phép

Sơ đồ khối của một máy khối phổ được miêu tả như trong hình 1.17

Hình 1.17 Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ 1.2.2.1 Bộ ph n nạp mẫu

Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết

bị khối phổ Với LC-MS mẫu phân tích được nạp vào MS gián tiếp thông qua

Trong nguồn ion s dụng kĩ thuật ion hóa kiểu phun sương điện t (ESI), tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn, lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi vào bộ phận phân tích khối Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị khối phổ Nguồn ESI, với k thuật ion hóa mềm, nhiễm điện bề mặt nên có thể áp dụng để ion hóa nhiều hoạt chất với các đặc điểm hóa lý khác nhau [14], [15]

1.2.2.3 Bộ ph n phân tích khối tứ cực ch p ba

Bộ phân tích khối sẽ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng của điện trường

Bộ phận phân tích khối kiểu tứ cực chập ba gồm ba tứ cực Q1, Q2 và Q3

nối tiếp nhau Mỗi tứ cực này được cấu tạo gồm có 4 thanh kim loại đặt song song và sát nhau tạo thành hai cặp điện cực (hình 1.18)

Hình 1.18 Cấu tạo và cơ ch hoạt động của phổ khối tứ cực ch p ba

Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực Dưới tác động của điện trường trong lòng ống điện cực, các ion có số khối khác nhau di chuyển với tốc độ và qu đạo khác nhau Ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại

Tại Q1 sẽ lựa chọn các ion có tỷ số m/z xác định và được đưa đi thẳng đến Q2, những ion khác sẽ bị loại đi do bị va đập vào các bản điện cực trái dấu Quá trình phân mảnh ion mẹ thành các ion nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại

Q2 Trong buồng Q2, ion ban đầu (ion mẹ) chuyển động Brown, va chạm với

các phân t khí trơ có mặt trong buồng (khí argon) Nhờ va chạm này năng lượng động học củacác ion chuyển thành nội năng nên chúng phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn (ion con) tùy theo mức độ bền vững của các liên kết trong ion ban đầu Các ion con mới hình thành có số khối m/z khác nhau tiếp tục được phân tách riêng tại Q3 với cơ chế phân tích khối lượng tương tự như tại Q1và cuối cùng được đưa đến detector để định lượng [15]

Các hợp chất với cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như

cơ chế phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau Vì

vậy, có thể định tính, định lượng các hoạt chất cần phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS

1.2.2.4 Bộ ph n phát hiện (detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận này cho phép phát hiện và khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng Tín hiệu tạo ra sẽ được chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ

1.2.3 Một số nghiên cứu xác định chất màu trộn trái phép

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chất màu trộn trái phép

(E122) và

erythrosine

(E127)

Chiết bằng methanol và amoniac (80:20 v/v) trong bể siêu

âm và sau đó dịch chiết được lọc qua giấy lọc thủy tinh

Phương pháp:

HPLC-DAD trên cột C18 (250 x 4 mm).Pha động:

Dung dịch đệm acetat (pH 4,8)

và đệm acetat (pH 4,8) với acetonitril (40/60 v/v)

Tốc độ dòng 1,0 mL/min

Độ thu hồi:

77,0% với (erythrosine) đến 99,5% với (vàng hoàng hôn)

[11]

5, v / v) Hoàn nguyên với 1

mL acetonitril

UHPLC-MS / MS), cột Eclipse XDB-C18 (2,1 mm ×

50 mm, 1,8 μm)

Nhiệt độ cột

động động bao gồm dung dịch acid formic 0,1% với đệm

20 mM- nium acetate

và acetonitril

Độ thu hồi:

60 đến 140%

[10]

Chiết lòng đỏ trứng với acetonitril, chiết pha rắn qua HLB hoạt hóa với 1,5

mL acid formic 0,1%

trong acetonitril, r a giải bằng 1 mL acid formic

Dùng

LCMS-MS với cột phân tích Luna C18 (50 × 2.0 mm,3 μm), pha động gồm acetonitril (A)

và 0,1% acid formic (B)

Tốc độ dòng chảy là 400 μL/phút và thể tích tiêm là 25

μL

Độ thu hồi:

97%

Phương pháp LC-MS/MS (ESI +) Cột Symmetry ODS-C18 (150

mm 2.1 mm)

Pha động:

Methanol và nước (chứa 0,1% (v/v) acid formic), tốc độ dòng 0,2 mL

nước (8/2), Thêm 4g

NaCl Lọc dịch qua màng lọc mẫu

Phương pháp HPLC, Cột Waters C18, detector UV bước sóng 474

Thêm 6g

NaCl, làm sạch dịch bằng

107 mg PSA,

96 mg C18

Q-Orbitrap-

UHPLC–ESI-MS, côt C18, pha động là acid formic và amoni formate

Nhận xét:

Phương pháp HPLC với detector UV-VIS được Xiran He và cộng sự [27] s dụng để phân tích sudan trong thực phẩm Giới hạn phát hiện có thể đạt được khoảng 1,5 µg/kg nhưng tính đặc hiệu không tốt trên các nền mẫu phức tạp và chỉ áp dụng cho một vài chất màu cùng nhóm K thuật LC-MS/MS đang được s dụng để xác định đồng thời các chất màu trộn trái phép trong thực phẩm do tính đặc hiệu và độ nhạy tốt, thiết bị khối phổ ba tứ cực được nhiều tác giả s dụng Li và cộng sự [18] xác định đồng thời 8 chất màu trộn trái phép trong ớt với LOD khoảng 0,05 µg/kg, độ thu hồi từ 70% đến 119% Feng và cộng sự [13] xác định đồng thời 40 phẩm màu trộn trái phép trong mẫu nước giải khát với LOD từ 0,125 mg/L, hiệu suất thu hồi từ 91-105% Liu và cộng sự [10] xác định đồng thời 15 phẩm màu trộn trái phép trong thức ăn chăn nuôi với độ thu hồi trong khoảng 60-140%, LOD từ 0,01 µg/kg đến 5,61 µg/kg Ngoài ra, một số nghiên cứu s dụng thiết bị sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao để sàng lọc các chất màu [11], [28], [31] Nhược điểm của phương pháp này là thiết bị đắt tiền nên chưa phổ biến

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất

- Chất chuẩn:

Độ tinh khiết

4 Crystal violet Sigma- Aldrich 612204002 C10427

500 Lọ 100 mg 98,00%

400 Lọ 100 mg 97,50%

- Dung môi, hóa chất:

+ Acetonitril, acid formic đặc, loại dùng cho sắc ký Các hóa chất khác đều

là loại hóa chất tinh khiết phân tích: methanol, ethanol, acetonitril, acid formic, amoniacetate của Merck

+ Bột làm sạch GCB, PSA, C18: Agilent

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích

- Hệ thống LC-MS/MS gồm sắc ký lỏng siêu hiệu năng model 1290 và khối

phổ loại Triple Quadrupole, model 6460 với nguồn ion hóa kiểu phun điện t (ESI) của Agilent Technology, M

- Cân phân tích Sartorius CP224S (d = 0,1 mg);

- Máy ly tâm Sartorius Sigma 2-16K;

- Thiết bị bay hơi dung môi bằng khí nitơ có gia nhiệt Reacti-Therm III, Thermo scientific;

- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP scientific;

- Máy lắc ngang 3006 GFL;

- Bộ chiết pha rắn SPE;

- Micropipet Eppendorf: 10-100 µL, 100-1000 µL, 1000 - 5000 µL

- Bình định mức, pipet thủy tinh class A: Prolabo-Pháp

Tất cả các thiết bị phân tích tại Khoa độc học và dị nguyên - Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đều đƣợc kiểm tra, hiệu chuẩn định kỳ đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017

2.2 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.2 Chất màu trộn trái phép

- Malachite green, LeucoMalachite, chrysodine G, rhodamine B, auramine O, sudan I, sudan II, sudan III, sudan IV, sudan Red B, sudan black B, para red, oil orange SS, pararosanilin, crystal violet, canthaxanthin

- Dung dịch chuẩn gốc: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 µg/mL bằng cách cân 0,01 g các chất màu riêng biệt và hòa tan trong methanol đến 10 mL

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp: Pha 10 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/mL từ các dung dịch chuẩn đơn 1000 µg/mL (bảng 2.1):

Bảng 2.1 Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp chất màu