nghiên cứu tác dụng chống viêm thực nghiệm của cao chiết từ vỏ thân cây núc nác (oroxylum indicum (l ) vent)

Từ các thực tế trên, để góp phần làm sáng tỏ tác dụng chống viêm cũng như cơ chế tác dụng của vỏ thân cây Núc nác, và với mong muốn tạo ra sản phẩm được sử dụng rộng rãi trong điều trị

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ HỒNG OANH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM

THỰC NGHIỆM CỦA CAO CHIẾT

TỪ VỎ THÂN CÂY NÚC NÁC

(Oroxylum indicum (L.) Vent)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ HỒNG OANH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM

THỰC NGHIỆM CỦA CAO CHIẾT

TỪ VỎ THÂN CÂY NÚC NÁC

(Oroxylum indicum (L.) Vent)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 8720205

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đào Thị Vui

HÀ NỘI 2020

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cô, gia đình, bạn bè

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

nhất đến PGS.TS Đào Thị Vui – trưởng bộ môn Dược lực, người thầy luôn nhiệt

tình giúp đỡ, hết lòng chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập

và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Ngô Thanh Hoa – bộ môn Dược lực, người thầy

đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo đang công tác tại Bộ môn

Dược lực đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu trong quá trình thực

hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Đinh Đại Độ cùng các anh chị kĩ thuật viên tại

bô môn Dược lực đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thiện luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn đến Ban giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận

tình dạy dỗ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập của mình

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, luận văn này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn

bè để luận văn được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng 04 năm 2020

HỌC VIÊN

LÊ HỒNG OANH

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về viêm 3

1.1.1 Khái niệm, nguyên nhân và phân loại viêm 3

1.1.2 Những biến đổi xảy ra tại ổ viêm 5

1.1.3 Vai trò các loại bạch cầu trong phản ứng viêm 8

1.1.4 Các chất trung gian hóa học trong viêm 10

1.1.5 Thuốc chống viêm 12

1.2 Một số mô hình nghiên cứu về tác dụng chống viêm 14

1.2.1 Một số mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm in vivo 14

1.2.2 Một số mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro 16

1.3 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu 18

1.3.1 Tên khoa học 18

1.3.2 Bộ phận dùng 18

1.3.3 Liều dùng, công dụng 18

1.3.4 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học 18

1.3.5 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Động vật thí nghiệm 25

2.1.3 Hóa chất và thuốc thử 25

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 26

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vivo của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác 27

2.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO in vitro của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác 36

2.2.3 Xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm in vivo 40

3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo 40

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo 46

3.2 Kết quả đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO in vitro 47

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 49

4.1 Tác dụng chống viêm in vivo của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác 49

4.1.1 Tác dụng chống viêm cấp của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác 50

4.1.2 Tác dụng chống viêm mạn của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác 56

4.2 Khả năng ức chế sản sinh NO in vitro của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác 59

KẾT LUẬN VÀ KIỄN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao HSCCC Sắc kí phân bố ngược dòng tốc độ cao L-NMMA NG-Methyl-L-arginine acetate

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

1 Bảng 2.1: Thang điểm đánh giá mức độ viêm khớp chân

chuột dựa trên triệu chứng 33

2 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết ethanol vỏ thân cây

Núc nác lên mức độ phù bàn chân chuột 40

3 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của cao chiết ethanol vỏ thân cây

Núc nác lên mức độ sưng vùng khớp gối chuột 42

4 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol vỏ thân cây

Núc nác lên mức độ viêm khớp dựa trên triệu chứng 43

5 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol vỏ thân cây

Núc nác lên số lượng bạch cầu tổng và bạch cầu hạt 44

6 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol vỏ thân cây

Núc nác lên số lượng tế bào lympho và bạch cầu mono 44

7 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol vỏ thân cây

8 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol vỏ thân cây

Núc nác lên mức độ tăng khối lượng u hạt 46

9 Bảng 3.8 Khả năng ức chế sản sinh NO của cao chiết

ethanol vỏ thân cây Núc nác 48

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm đánh

giá tác dụng chống viêm cấp in vivo trên mô hình gây

phù bàn chân chuột bằng carrageenan

29

4

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm đánh

giá tác dụng chống viêm cấp in vivo trên mô hình gây

viêm khớp chuột bằng carrageenan

31

5

Hình 2.5 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm đánh

giá tác dụng chống viêm mạn in vivo trên mô hình gây

u hạt thực nghiệm bằng viên bông tẩm carrageenan

35

6 Hình 3.1 Đường chuẩn NaNO2 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm là triệu chứng rất phổ biến, xuất hiện trong nhiều bệnh lý như viêm khớp dạng thấp, gout… Viêm là quá trình bệnh lý phức tạp, là phản ứng bảo vệ của hệ miễn dịch trước sự tấn công của các tác nhân gây bệnh [2], [6], [14] Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs), thuốc chống viêm steroid là những thuốc được sử dụng hiện nay để điều trị viêm nhưng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn trên các cơ quan như dạ dày – ruột, thận… ảnh hưởng đến sức khỏe người dùng [3] Vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm và sàng lọc các thuốc chống viêm khác, đặc biệt các thuốc có nguồn gốc thực vật, vừa có tác dụng chống viêm đồng thời hạn chế tác dụng không mong muốn cho người dùng là một nhu cầu thực tiễn

Ở Việt Nam nền y học cổ truyền có lịch sử lâu đời và đóng vai trò quan trọng trong hệ thống chăm sóc sức khỏe Nước ta có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú đa dạng, bao gồm hơn 12000 loài thực vật bậc cao, trong đó hơn 5000 loài được sử dụng làm dược liệu và thuốc chữa bệnh [79] Tuy nhiên, nhiều cây thuốc chữa các bệnh được sử sụng trong đông y và theo kinh nghiệm dân gian chưa được nghiên cứu khoa học để làm rõ công dụng và phát triển thành thuốc Cây Núc nác,

tên khoa học Oroxylum indicum (L.) Vent, họ Chùm ớt Bignoniaceae, có nguồn gốc

từ Ấn Độ, phân bố ở khắp mọi nơi trên nước ta, được dân gian sử dụng nhiều để chữa

bệnh [4], [9], [18] Theo Đông y, hạt Núc nác dùng để chữa ho lâu ngày, viêm khí quản, đau bụng, đau dạ dày, vết loét không liền miệng [9] Vỏ Núc nác chữa bệnh ngoài da, hạ sốt, chống viêm, đi ngoài [9] Hiện nay trên thế giới, nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng minh được tác dụng chống viêm cũng như định hướng cơ chế chống viêm của vỏ thân cây Núc nác Tuy nhiên ở Việt Nam cho đến nay, nghiên cứu đánh giá dược lý về tác dụng chống viêm của vỏ thân cây Núc nác còn rất hạn chế [24], [36], [89] Từ các thực tế trên, để góp phần làm sáng tỏ tác dụng chống viêm cũng như cơ chế tác dụng của vỏ thân cây Núc nác, và với mong muốn tạo ra sản

phẩm được sử dụng rộng rãi trong điều trị viêm, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên

cứu tác dụng chống viêm thực nghiệm của cao chiết từ vỏ thân cây Núc nác

Oroxylum indicum (L.) Vent” với hai mục tiêu:

+ Đánh giá tác dụng chống viêm in vivo của cao chiết vỏ thân cây Núc nác + Đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO in vitro của cao chiết vỏ thân cây

Núc nác

-

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về viêm

1.1.1 Khái niệm, nguyên nhân và phân loại viêm

1.1.1.1 Khái niệm

Viêm là một quá trình bệnh lý thường gặp nhất, do nhiều nguyên nhân gây ra, xảy ra ở tất cả các động vật đa bào, các cơ quan, các mô [2], [15] Có nhiều yếu tố tham gia vào quá trình phát sinh, phát triển và kết thúc tại ổ viêm Sau khi yếu tố gây viêm tác động, một số tế bào bị tổn thương gây nên một phản ứng toàn diện lôi kéo nhiều loại tế bào của cơ thể, nhiều hệ thống tham gia vào quá trình viêm Do vậy, phản ứng viêm trở nên phức tạp gồm nhiều hiện tượng xen kẽ nhau [6], [15]

Viêm là phản ứng bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh (hóa học, vật

lý hay sinh học) [2], [6], [15], [17], [73], là một quá trình bệnh lý phức tạp bao gồm nhiều hiện tượng: Tổn thương tổ chức, rối loạn chuyển hóa, rối loạn tuần hoàn, bạch cầu đến ổ viêm và thực bào, tế bào tăng sinh [2], [6], [15] Viêm gồm bốn yếu tố biểu hiện bên ngoài: Sưng, nóng, đỏ, đau và gây rối loạn chức năng cơ thể [2]

1.1.1.2 Nguyên nhân gây viêm

Viêm do nhiều nguyên nhân gây nên, bao gồm nguyên nhân bên ngoài và nguyên nhân bên trong

Nguyên nhân bên ngoài thường gặp nhất và phức tạp nhất, bao gồm [6], [14], [15]:

 Vi sinh vật: vi khuẩn và các độc tố của chúng, virus, kí sinh trùng và côn trùng Đây là nguyên nhân gây viêm thường gặp nhất

 Tác nhân cơ học: từ xây xát nhẹ đến chấn thương nặng, gây phá hủy tế bào và

mô, làm phóng thích ra các chất gây viêm nội sinh

 Vật lý: nhiệt độ (nóng, lạnh) làm thoái hóa protid tế bào, gây tổn thương enzym, điện, bức xạ ion hóa tạo ra các gốc oxy tự do, gây tổn thương DNA

 Hóa học: các acid mạnh, các kiềm mạnh, các muối kim loại nặng gây hủy hoại

tế bào hoặc phong bế các hệ enzym chủ yếu

Nguyên nhân bên trong [14], [15]:

 Hoại tử tổ chức: tắc mạch, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dưỡng

 Lắng đọng các phức hợp miễn dịch (phức hợp kháng nguyên – kháng thể)

1.1.1.3 Phân loại viêm

Có nhiều cách phân loại viêm [14]:

 Theo nguyên nhân: viêm nhiễm khuẩn và viêm vô khuẩn

 Theo vị trí: viêm nông và viêm sâu

 Theo dịch rỉ viêm: viêm thành dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ… tùy theo dịch viêm giống huyết thanh, huyết tương hay chứa nhiều bạch cầu thoái hóa…

 Theo diễn biến: viêm cấp và viêm mạn Viêm được phân thành viêm cấp tính hay viêm mạn tính phụ thuộc vào sự tồn tại của tổn thương, những triệu chứng lâm sàng và bản chất của phản ứng viêm

Viêm cấp: Thời gian diễn ra ngắn (vài phút – vài ngày), có đáp ứng tức thời và sớm với tổn thương, có đặc điểm tiết dịch chứa nhiều protein huyết tương và xuất hiện nhiều bạch cầu đa nhân trung tính Một chức năng cốt lõi của đáp ứng là huy động bạch cầu tới vị trí tổn thương, ở đó chúng có thể giúp làm sạch vi khuẩn và các tác nhân gây viêm khác, đồng thời tiêu hủy các mô hoại tử do viêm gây ra Tuy nhiên chính bạch cầu lại có thể kéo dài viêm và cảm ứng sự tổn thương mô do giải phóng các enzym, chất trung gian hóa học và các gốc oxy có độc tính Giai đoạn cấp tính gồm những hiện tượng về mạch máu và một số phản ứng tế bào xuất hiện sớm Ở những mô bị yếu tố tấn công làm tổn thương, các tiểu động mạch bị giãn gây nên ứ huyết trong các mao mạch Trạng thái phù nề của mô là do sự rỉ dịch huyết tương qua thành các mao mạch vào trong khoang ngoài tế bào Sự xuyên mạch của bạch cầu xảy ra song song với sự rỉ dịch huyết tương Những hiện tượng cấp tính này là

do sự can thiệp của hai yếu tố: yếu tố thần kinh là sự tê liệt các dây thần kinh co mạch ở các mao mạch, và yếu tố thể dịch là sự giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, bradykinin…[6], [17]

Viêm mạn: viêm mạn diễn biến vài ngày, vài tháng hoặc vài năm Viêm mạn có thể xảy ra theo sau viêm cấp do đáp ứng viêm không thành công, ví dụ còn tồn tại

vi khuẩn hay dị vật trong vết thương làm cho phản ứng viêm kéo dài hoặc có thể khởi phát ngay từ đầu, ví dụ đối với vài loại vi khuẩn có vỏ lipid dày khiến các tế bào thực bào khó tiêu hủy chúng, chúng có thể tồn tại và tiếp tục kích thích phản ứng viêm; có những trường hợp viêm mạn do có kích thích kéo dài bởi hóa chất hoặc tác nhân vật lý như hít bụi, chỉ khâu Biểu hiện của viêm mạn tính bao gồm: Tiết dịch nhưng sưng đỏ và nóng không rõ ràng hoặc không có, chức năng mô và cơ quan

ít bị ảnh hưởng hoặc chỉ suy giảm chậm chạp, hiện tượng huy động bạch cầu, tăng bạch cầu trung tính vẫn còn nhưng không rõ rệt, vẫn có hiện tượng thực bào tại ổ viêm nhưng không mạnh mẽ, chỉ đủ sức khống chế yếu tố gây viêm mà không loại trừ được Đặc điểm của viêm mạn là sự thâm nhiễm đại thực bào và tế bào lympho Khi đại thực bào không có khả năng bảo vệ vật chủ chống lại sự tổn thương mô, cơ thể sẽ tạo thành vòng vây cô lập nơi bị nhiễm, lúc đó có sự thành lập u hạt U hạt được tạo thành do sự tăng sinh nguyên bào sợi và những tân tạo mao mạch U hạt này khi tiến triển mất các thành phần tế bào và các mao mạch tân tạo, trong khi đó

mô tạo keo xuất hiện dần dần [14], [16], [17]

1.1.2 Những biến đổi xảy ra tại ổ viêm

Tại ổ viêm có ba biến đổi chủ yếu [2], [14], [16]:

 Rối loạn tuần hoàn

 Rối loạn chuyển hóa

 Tăng sinh tế bào và lành vết thương

1.1.2.1 Rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm:

Thường xảy ra sớm, dễ thấy nhất; ngay khi yếu tố gây viêm tác động lên cơ thể

 Rối loạn vận mạch: ngay khi yếu tố gây viêm tác động, tại chỗ lần lượt có các hiện tượng:

Co mạch: xảy ra rất sớm và ngắn, có tính phản xạ, do thần kinh co mạch hưng phấn làm các tiểu động mạch co lại

Sung huyết động mạch: xảy ra ngay sau co mạch, thoạt đầu do cơ chế thần kinh

và sau đó được duy trì theo cơ chế thể dịch, giải phóng các enzym từ lysosom của tế bào chết, các chất trung gian hóa học từ tế bào mast và bạch cầu (histamin, bradykinin,

prostaglandin, leucotrien…), hay các sản phẩm của quá trình thực bào của bạch cầu (protease, H+, K+…), các cytokin Đặc biệt là sự có mặt của NO do NOS của các tế bào viêm (nhất là tế bào nội mô thành mạch) hoạt hóa sinh ra Biểu hiện bên ngoài

có thể quan sát được: căng phồng (phù cứng do áp lực thủy tĩnh), nóng, đỏ tươi và đau Quá trình sung huyết động mạch giúp cung cấp ATP cho bạch cầu thoát mạch,

di chuyển và thực bào

Sung huyết tĩnh mạch: quá trình thực bào bắt đầu yếu đi dẫn đến giảm sung huyết động mạch chuyển dần sang sung huyết tĩnh mạch, các mao tĩnh mạch dãn rộng, dòng máu chảy chậm lại Biểu hiện lâm sàng là ổ viêm bớt nóng, từ màu đỏ tươi chuyển sang màu tím sẫm, phù chủ yếu do tăng thấm nên độ căng giảm, giảm cảm giác đau Quá trình này giúp dọn sạch ổ viêm, chuẩn bị cho quá trình sửa chữa và cô lập ổ viêm, ngăn cản sự lan rộng của tác nhân gây viêm

Ứ máu: giúp cô lập ổ viêm, ngăn cản sự lan rộng của tác nhân gây bệnh đồng thời tăng cường quá trình sữa chữa

 Bạch cầu xuyên mạch

Khi tính thấm thành mạch tăng, có sự thoát mạch, máu chảy chậm, bạch cầu rời khỏi dòng trục, tiến về phía ngoại vi tới bề mặt nội mô thành mạch Tại đây chúng trườn theo thành mạch, bám dính và xuyên mạch Để bạch cầu đến được ổ viêm còn cần có vai trò của đại thực bào Dưới tác dụng của các yếu tố gây viêm như LPS của

vi khuẩn và các chất hóa ứng động, đại thực bào được hoạt hóa, tiết ra TNF, IL-1 và IL-6 làm cho nguyên bào xơ và tế bào nội mô cũng tiết ra TNF, IL-1, IL-8 gây hóa

ứng động mạnh hơn và xa hơn, kéo đại thực bào, bạch cầu trung tính di chuyển tới ổ viêm Tại đây, các mạch đã bị dãn bởi tác dụng của các chất gây dãn mạch mới hình thành và phóng thích từ màng tế bào như PG, LT và các sản phẩm chuyển hóa khác như NO… Mặt khác, do tác dụng của các cytokin (TNF, IL-1, IL-8) các tế bào nội

mô thành mạch hoạt hóa, tăng biểu lộ những phân tử dính tương ứng trên bề mặt bạch cầu Nhờ vậy, bạch cầu bám được vào thành mạch, di chuyển bằng giả túc, xuyên mạch và tới được ổ viêm

 Bạch cầu thực bào

Bạch cầu tập trung ở ổ viêm, vươn chân giả tới quanh đối tượng thực bào, bọc kín chúng, hình thành không bào thực bào (phagosom) Sau đó lysosom tiến tới hòa màng

để tạo ra phagolysosom, giải phóng vào đó các chất trong lysosom để tiêu hủy đối tượng

1.1.2.2 Rối loạn chuyển hóa

Tại ổ viêm quá trình oxy hóa tăng làm tăng nhu cầu oxy, nhưng sự sung huyết động mạch chưa đáp ứng kịp, dẫn đến pH giảm (khi bắt đầu chuyển sang giai đoạn sung huyết tĩnh mạch), từ đó kéo theo hàng loạt những rồi loạn chuyển hóa của glucid, lipid, protid

1.1.2.3 Tổn thương mô

Tại ổ viêm thường có hai loại tổn thương:

 Tổn thương tiên phát: do nguyên nhân gây viêm tạo ra Tùy theo cường độ của nguyên nhân gây viêm mà tổn thương có thể rất nhỏ hoặc rất lớn gây hoại tử

tế bào ít hay nhiều

 Tổn thương thứ phát: do những rối loạn ổ viêm gây nên Tổn thương thứ phát rất quan trọng, phụ thuộc vào cường độ của nguyên nhân gây viêm và mức độ phản ứng của cơ thể

1.1.2.4 Tăng sinh tế bào và quá trình lành vết thương

Quá trình tăng sinh tế bào diễn ra ngay từ giai đoạn đầu của viêm (bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu đơn nhân, lympho) Về cuối, sự tăng sinh vượt mức hoại tử khiến ổ viêm được sửa chữa Nếu không được như vậy thì một phần nhu mô bị thay thế bằng mô xơ (sẹo) Quá trình lành tổn thương có toàn vẹn hay không tùy thuộc vào: cơ quan bị viêm, mức độ hoại tử, thời gian viêm, hoạt lực của yếu tố gây viêm…

1.1.3 Vai trò các loại bạch cầu trong phản ứng viêm

1.1.3.1 Bạch cầu trung tính

Bạch cầu trung tính là bạch cầu đa nhân, có vai trò quan trọng trong viêm cấp Ở người bạch cầu trung tính chiếm 50 – 70 % tổng bạch cầu và trên 90 % bạch cầu hạt Bạch cầu trung tính có mặt với số lượng lớn trong vòng vài giờ tại chỗ viêm, thường

di chuyển đến chỗ viêm trong vòng 90 phút sau chấn thương và có khả năng loại bỏ mầm bệnh bằng nhiều cơ chế Khi đến vị trí mô bị tổn thương, bạch cầu trung tính sẽ được kích hoạt bằng cách tiếp xúc trực tiếp với mầm bệnh hoặc thông qua hoạt hóa các cytokin và chemokin gây viêm để đáp ứng với nhiễm trùng và tổn thương mô [34], [35]

Bạch cầu trung tính tiêu diệt tác nhân xâm nhập bằng cách giải phóng các hạt tế bào chất chứa các enzym và chất liệu kháng khuẩn Bạch cầu trung tính có bốn loại hạt: Hạt thứ nhất là hạt ưa azua chứa các enzym tiêu hóa mạnh như hydrolase, elastase, MPO và các ptotein khác như lysozym; hạt thứ hai là hạt đặc hiệu chứa lactoferrin, lysozym và các protein khác; hạt thứ ba chứa gelatinase và enzym khác,

và hạt bài tiết chứa LFA-1, MAC-1… Các hạt này chứa trên 300 protein tham gia vào một số quá trình tế bào bao gồm di chuyển, bám dính và diệt khuẩn Bạch cầu trung tính tạo ra các tín hiệu hóa học thu hút các bạch cầu đơn nhân, tế bào đuôi gai (DC) và ảnh hưởng đến việc các đại thực bào nhận biết ổ viêm Bạch cầu trung tính lưu hành trong máu khoảng 12 giờ, vào mô sống được vài ngày, khả năng chịu đựng tình trạng nhiễm toan tại ổ viêm kém [14], [16], [25], [34], [35]

1.1.3.2 Bạch cầu ái toan

Những tế bào này chiếm dưới 5 % số lượng bạch cầu và có thể tồn tại đến 12 giờ nhưng nếu cần có khả năng kéo dài tuổi thọ của chúng trong ít nhất một tuần Bạch cầu ái toan lưu thông trong máu và được đưa tới mô tương tự bạch cầu trung tính Bạch cầu ái toan có tác động điều hòa và kiểm soát quá trình viêm Bạch cầu ái toan giữ vai trò quan trọng nhất là điều hòa các chất trung gian được phóng thích từ tế bào mast vì nó có chức năng thoái hóa các amin hoạt mạch như histaminase bất hoạt histamin, arylsulphatase B có tác động bất hoạt các leucotrien tránh gây viêm thêm

Các hạt bạch cầu ái toan có chứa một protein là EBP (Eosinophilic Basic Protein) rất độc với kí sinh trùng Bạch cầu ái toan không thể thực bào kí sinh trùng vì đa số chúng là những sinh vật đa bào [14], [25], [35]

1.1.3.3 Bạch cầu ái kiềm

Bạch cầu ái kiềm có tỷ lệ thấp trong máu (0 – 2 %) Trong bạch cầu ái kiềm chứa các amin hoạt mạnh Khi tới ổ viêm, các chất này được giải phóng gây ra một đáp ứng viêm cấp Ngoài ra, trên bề mặt các bạch cầu này có các thụ thể dành cho Fc của

IgE [25]

1.1.3.4 Bạch cầu đơn nhân

Bạch cầu đơn nhân có nguồn gốc từ tủy xương, do các tín hiệu viêm kích hoạt các tế bào gốc tạo máu Bạch cầu đơn nhân di chuyển đến ổ viêm ngay sau bạch cầu trung tính và thực hiện chức năng thực bào trong nhiều ngày Bạch cầu đơn nhân lưu hành trong máu 1 – 2 ngày rồi vào mô, biệt hóa thành đại thực bào Bạch cầu đơn nhân sản xuất các chất trung gian hóa học, bao gồm prostaglandin, leucotrien, yếu tố kích hoạt tiểu cầu PAF, các cytokin gây viêm và yếu tố tăng trưởng thúc đẩy sự tái sinh của các mô Bạch cầu đơn nhân chịu được pH thấp tại ổ viêm Bạch cầu đơn nhân kích thích sự gia tăng số lượng các đại thực bào và tế bào đuôi Khi ở mô, chúng

sẽ thực bào các mảnh vụn tế bào, mầm bệnh và kích thích tế bào lympho [14], [35], [48]

1.1.3.5 Tế bào lympho

Lympho T có vai trò quan trọng trong phản ứng viêm Các loại lympho T khác nhau có chức năng khác nhau trong các phản ứng miễn dịch thích nghi Các tế bào Th1 đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát vi khuẩn nội bào bằng cách tạo ra IFN-γ để kích hoạt các đại thực bào và miễn dịch chống virus bằng cách sản xuất IFN-γ và kích hoạt tế bào lympho T gây độc tế bào Các cytokin có nguồn gốc từ tế bào Th2 rất quan trọng trong việc hoạt hóa tế bào mast, bạch cầu ái toan trong khả năng miễn dịch chống giun sán Các tế bào Th17 là mấu chốt cho phản ứng viêm qua trung gian bạch cầu trung tính, chống lại nhiễm trùng ngoại bào [42]

1.1.4 Các chất trung gian hóa học trong viêm

Tất cả các chất có hoạt tính sinh học do yếu tố gây viêm kích thích tạo ra từ các

tế bào, từ protein huyết tương có các tác dụng: Gây đau sốt; tăng sinh tế bào, gây giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch, hình thành dịch rỉ viêm; thu hút bạch cầu đến ổ viêm để thực bào, tiêu diệt yếu tố để gây viêm; gây tổn thương mô gọi là chất trung gian hóa học trong viêm [6]

Có nhiều chất có hoạt tính sinh học tham gia vào các phản ứng viêm:

 Các chất được tạo ra từ các tế bào: histamin, serotonin, prostaglandin, thromboxan, leucotrien, yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF), các gốc oxy hóa hoạt động (ROS), oxid nitric, cytokin, chemokin, các enzym từ các lysosom của bạch cầu chết giải phóng ra [6]

 Các protein từ huyết tương: bổ thể, kinin, protease hoạt tính bao gồm cả yếu

tố đông máu [6]

1.1.4.1 Histamin, serotonin

Histamin và serotonin là các amin hoạt mạch: histamin (β-Imidazolylethylamine)

có nhiều ở phổi, da, hệ thần kinh Trong các hạt của tế bào mast và bạch cầu ái kiềm, histamin ở dạng liên kết với heparin Histamin gây giãn tiểu động mạch, tăng tính thấm thành mạch với tiểu tĩnh mạch, làm thoát dịch vào gian bào [6], [101] Histamin còn có tác dụng co cơ trơn, tăng tiết dịch (tăng tiết HCl dạ dày) Serotonin có nhiều

ở tế bào các mô, nhưng chủ yếu tế bào niêm mạc ruột, cũng có tác dụng như histamin

và gây đau [6]

1.1.4.2 Prostaglandin

Trong viêm cấp, các mô và mạch máu tại chỗ sinh ra PGE2 và PGI2, tế bào mast giải phóng ra PGD2 Trong viêm mạn, các bạch cầu đơn nhân và đại thực bào giải phóng PGE2 và thromboxan A2 Các chất PGE2, PGI2 vàPGD2 làm tăng tính thấm thành mạch gián tiếp thông qua histamin và bradykinin Tuy nhiên, bên cạnh chức năng trung gian hóa học trong viêm, một số PG còn đóng vai trò chống viêm đáng kể

do làm giảm hoạt tính của các tế bào viêm, ví dụ PGE2 làm giảm giải phóng các

enzym của lysosom và các chất chuyển hóa gây độc từ bạch cầu trung tính, làm giảm giải phóng histamin từ tế bào mast [50]

1.1.4.3 Leucotrien

Leukotrien được tạo ra bởi hầu hết các loại tế bào tham gia vào các phản ứng viêm bao gồm tế bào mast, bạch cầu ái kiềm, bạch cầu ái toan, bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân Là chất trung gian hóa học trong viêm, leucotrien có hoạt tính sinh học tương tự histamin Leucotrien B4 lôi kéo bạch cầu tới lớp nội mạc của các mạch máu bị tổn thương, nó cũng hoạt động như một chất hóa ứng động thực bào LTC4 và LTD4 gây co thắt phế quản mạnh và đã được tìm thấy trong các trường hợp

dị ứng LTC4, LTD4 và LTE4 là những chất gây phản ứng chậm của phản ứng shock phản vệ được tiết ra trong trường hợp dị ứng (hen suyễn, sốc phản vệ) [15], [101]

1.1.4.5 Các kinin huyết tương

Một số enzym tiêu đạm trong huyết tương như kallicrein tác dụng lên kiniogen, tách ra một protein có tác dụng co bóp cơ trơn, giãn mạch, tăng tính thấm và gây đau

có tên gọi là kinin Ba loại kinin khác biệt đã được xác định ở người: bradykinin, kallidin (lysbradykinin), và met-lys-bradykinin Kallicrein được hoạt hóa bởi yếu tố hageman (yếu tố XII), khi tổn thương ở vách mạch, yếu tố hageman được hoạt hóa [6], [101]

1.1.4.6 Nitric oxid (NO) và superoxid anion

NO là một phân tử tín hiệu đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh của viêm NO có thời gian tồn tại khá ngắn (thời gian bán thải 6 giây), được sản xuất từ

enzym tổng hợp nitric oxid (NOS) NOS cùng với oxy và NADPH chuyển L-arginin thành citrulline và sinh ra NO NO được chứng minh là một phần quan trọng và linh hoạt trong dẫn truyền thần kinh, viêm cấp tính, viêm mạn tính và trong cơ chế bảo vệ vật chủ NO được coi là chất trung gian gây viêm do sản xuất quá mức trong các tình huống bất thường Trong giai đoạn cấp tính của viêm, bạch cầu trung tính là nguồn

tế bào sản xuất NO, ngược lại nhờ các tác nhân là vi khuẩn và các cytokin gây viêm, đại thực bào hoặc bạch cầu đơn nhân là nơi có khả năng giải phóng bền vững NO ở nồng độ cao trong giai đoạn viêm mạn tính Ức chế sản sinh NO hoặc ức chế enzym NOS đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh về viêm như viêm khớp, viêm ruột, viêm phổi [80]

Một gốc quan trọng khác có liên quan đến nhiều phản ứng viêm là anion superoxid Trong viêm cấp tính và mạn tính, sản xuất anion superoxid tăng lên với tốc độ vượt quá khả năng của hệ thống bảo vệ của enzym superoxid effutase (SOD)

để loại bỏ nó Hậu quả của sự mất cân bằng này dẫn đến tổn thương tế bào qua trung gian superoxid anion Một số vai trò gây viêm quan trọng với anion superoxid bao gồm: tổn thương tế bào nội mô và tăng tính thấm của vi mạch, hình thành các yếu tố hóa học như leukotrien B4, tập trung bạch cầu trung tính tại các vị trí bị viêm, phá hủy các chất dẫn truyền thần kinh và hormon như norepinephrin và epinephrin, tạo

ra peroxynitrit gây độc tế bào và gây viêm [92]

1.1.5 Thuốc chống viêm

Một số nhóm thuốc chống viêm: Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs),

các thuốc chống viêm steroid

1.1.5.1 Thuốc chống viêm không steroid (NSAID):

NSAIDs có tác dụng lên hầu hết các loại viêm không kể đến nguyên nhân, theo các cơ chế sau:

+ Ức chế sinh tổng hợp prostaglandin do ức chế có hồi phục COX, làm giảm tổng hợp PGE2 và PGF1α, là những chất trung gian hóa học quan trọng nhất trong phản ứng viêm, do đó làm giảm quá trình viêm (cơ chế quan trọng nhất) [3], [10]

+ Làm vững bền màng lysosom (thể tiêu bào): ngăn cản giải phóng các enzym phân giải, ức chế quá trình viêm [3], [10]

+ Ngoài ra còn có thêm một số cơ chế khác như đối kháng với các chất trung gian hóa học của viêm do tranh chấp với cơ chất của enzym như bradykinin, histamin, serotonin, ức chế hoá hướng động bạch cầu, ức chế sự di chuyển của bạch cầu tới ổ viêm, ức chế phản ứng kháng nguyên – kháng thể [3], [10]

+ Một số thuốc NSAIDs được dùng: diclofenac, indomethacin, ibuprofen…

1.1.5.2 Thuốc chống viêm steroid (glucocorticoid):

Glucocorticoid là thuốc chống viêm mạnh nhất và thường được dùng nhất trong các bệnh viêm cấp và mạn tính như hen, viêm mũi dị ứng, thấp khớp, lupus ban đỏ

[10]

Thuốc có tác dụng trên rất nhiều giai đoạn khác nhau của quá trình viêm do bất

cứ nguyên nhân gì (cơ học, hóa học, nhiễm khuẩn, bức xạ… ), vì vậy ngăn cản được

biểu hiện lâm sàng của viêm như sốt, đỏ, đau [3], [10]

Ở giai đoạn sớm của viêm, glucocorticoid ức chế các yếu tố hóa ứng động và các cytokin thúc đẩy viêm, do đó làm giảm luồng đại thực bào và bạch cầu hạt kéo đến ổ viêm Ngoài ra, glucocorticoid làm giảm tiết các chất vận mạch như serotonin,

histamin, do đó đối kháng với sự tăng tính thấm thành mạch [3], [10]

Glucocorticoid ức chế phospholipase A2, làm giảm tổng hợp và giải phóng leucotrien, prostaglandin Tác dụng này là gián tiếp vì glucocorticoid làm tăng sản xuất lipocortin, protein có mặt trong tế bào, ức chế phospholipase A2 Khi phospholipase A2 bị ức chế, phospholipid không chuyển thành acid arachidonic được

[3], [10]

Glucocorticoid tác dụng ngay cả ở giai đoạn đang viêm: ức chế mạnh nitric oxid synthetase (NOS), làm giảm sản xuất gốc tự do NO. trong đại thực bào Thuốc còn

ức chế sản xuất các protease trung tính: collagenase, elastase [10]

Một số thuốc được dùng: prednisolon, hydrocortison, dexamethason… [3]

1.2 Một số mô hình nghiên cứu về tác dụng chống viêm

1.2.1 Một số mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm in vivo

1.2.1.1 Một số mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp in vivo

 Mô hình gây phù bàn chân chuột [1], [17], [88]

Nguyên tắc: tác nhân gây viêm (carrageenan, kaolin, dextran…) khi tiêm vào bàn chân chuột sẽ kích thích giải phóng các chất trung gian hóa học gây viêm như histamin, serotonin, prostaglandin… gây giãn và tăng tính thấm thành mạch dẫn đến gây phù bàn chân chuột Các thuốc có khả năng ức chế phù bàn chân chuột được coi

là có tác dụng chống viêm

Tiến hành: gây phù bàn chân sau của chuột bằng cách tiêm dưới da ở bề mặt gan bàn chân sau của chuột tác nhân gây viêm Đo thể tích bàn chân sau tới khớp cổ chân tại các thời điểm trước khi tiêm, sau khi tiêm chất gây viêm 1,3,5,7 và 24 giờ

Thông số đánh giá: mức độ tăng thể tích chân chuột (tỉ lệ phù chân chuột) và tỷ

lệ % giảm mức độ tăng thể tích bàn chân chuột của lô thử so với lô chứng

 Mô hình gây phù tai chuột bằng oxazolon [68]

Nguyên tắc: mô hình gây phù tai chuột bằng oxazolon lần đầu tiên được mô tả bởi Evans (1971) Đây là mô hình dựa trên phản ứng quá mẫn chậm của cơ thể gây

ra bởi oxazolon, kết quả màng tế bào mast bị phá vỡ, giải phóng ra các chất trung gian hóa học gây phù

Tiến hành: gây phù tai chuột bằng cách bôi vào bên trong tai phải chuột dung dịch oxazolon trong aceton (không hoặc có hòa tan thuốc đối chiếu và chất nghiên cứu); tai trái giữ nguyên Sau 24 giờ gây viêm, gây mê chuột rồi đục một vòng tròn đường kính 8 mm ở cả hai phía, cân ngay

Thông số đánh giá: Sự khác biệt về trọng lượng là một chỉ số đánh giá phù trong viêm Tính tỷ lệ phần trăm tăng khối lượng của tai phải so với tai trái, sau đó tính giá trị trung bình tỷ lệ phần trăm tăng khối lượng tai chuột trong mỗi lô So sánh tỷ lệ phần trăm ức chế phù của lô thử so với lô chứng

 Mô hình gây viêm khớp bằng carrageenan

Nguyên tắc: carrageenan là tác nhân gây viêm, khi tiêm vào khớp gối chân chuột,

cơ thể sẽ phản ứng lại bằng cách tập trung bạch cầu tại nơi viêm, giải phóng ra các chất trung gian hóa học gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch gây phù khớp gối Thuốc làm giảm các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng của chuột được coi

là có tác dụng chống viêm

Tiến hành: gây viêm khớp gối chân chuột bằng cách tiêm carrageenan 2 % vào khớp gối chân sau phải chuột Sau bốn giờ, tiến hành đánh giá các thông số về biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng trên chuột

Nhận xét:

- Ưu điểm mô hình: độ chính xác cao, xác định được các thông số cận lâm sàng liên quan đến quá trình viêm

- Nhược điểm mô hình: khó thực hiện hơn các mô hình gây viêm cấp khác

1.2.1.2 Mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn in vivo

Mô hình gây u hạt thực nghiệm [1], [17], [68]

Nguyên tắc: Khi cấy dưới da động vật những vật lạ hoặc chất kích thích không hấp thu được (sợi amian, tinh dầu thông, viên bông…) đều gây một phản ứng tập trung nhiều loại tế bào tạo mô bào lưới và nguyên bào sợi bao quanh vật lạ, sau đó là

sự tạo thành khối u hạt tương tự với sự phát triển của viêm mạn tính Những thuốc có

khả năng ức chế sự hình thành u hạt thực nghiệm góp phần điều trị các bệnh viêm mạn tính

Thông số đánh giá: Tác dụng ức chế sự tạo u hạt được biểu thị bằng tỷ lệ % giảm trọng lượng trung bình các u hạt ở lô thử so với lô chứng

 Mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng sợi amian (Ducrot, Julou và cộng sự, 1963) Tiến hành: Dùng chuột cống trắng Gây mê chuột bằng ether Cấy dưới da sợi amian Chuột được uống hoặc tiêm thuốc dưới da mỗi buổi sáng 7 ngày liên tục, lần đầu cho thuốc ngay sau khi cấy viên sợi amian Sau 7 ngày, giết chuột, bóc tách u hạt

và cân tươi từng u hạt Tính trọng lượng thực sự của u hạt

 Mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng viên bông (Meier và cộng sự, 1950)

Tiến hành: Dùng chuột cống trắng Gây mê cho chuột bằng ether, cấy viên bông vào vùng dưới da lưng của chuột Cho chuột dùng thuốc (uống hoặc tiêm dưới da) liên tục trong bảy ngày Mổ chuột bóc tách u hạt, cân tươi từng u hạt, sấy khô đến khối lượng không đổi và cân khối lượng khô Khi cân tươi, khối lượng tăng bao gồm dịch rỉ viêm và sự tăng sinh của tế bào, nguyên bào sợi và collagen Khi sấy khô, nước và dịch rỉ viêm bay hơi hết, khi đó sự tăng khối lượng chỉ còn bao gồm sự tăng sinh tế bào, nguyên bào sợi và collagen Mức độ tạo thành u hạt mạnh hơn khi viên bông được tẩm carrageenan

Nhận xét: Mô hình gây u hạt thực nghiệm tiến hành đơn giản, kết quả tin cậy nên thường được áp dụng trong nghiên cứu thuốc chống viêm mạn tính Sợi amian và viên bông là nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, khi đưa vào cơ thể dễ tạo hình dạng và dễ bóc tách

1.2.2 Một số mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro

Để đánh giá tác dụng chống viêm trên in vitro, nhiều mô hình đã được xây dựng

Nguyên tắc chung là định lượng nồng độ các chất tạo ra tham gia vào quá trình viêm: Bradykinin, histamin, prostaglandin, NO… các enzym COX, NOS…

1.2.2.1 Mô hình giải phóng các cytokin (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 và TNFα) từ tế bào

bạch cầu [68]:

Nguyên tắc: các cytokin đại diện cho một nhóm peptid có hoạt tính sinh học cao, tham gia vào nhiều quá trình tế bào như viêm, phản ứng miễn dịch… Ức chế IL-1 hoặc TNF đã giúp điều trị thành công ở những bệnh nhân bị viêm khớp dạng thấp hoặc viêm ruột Thuốc làm giảm lượng cytokin sinh ra từ tế bào bạch cầu được coi là

có tác dụng chống viêm

Tiến hành:

Chuẩn bị các tế bào bạch cầu: điều chế theo quy trình chuẩn được công bố bởi Böyum (1976) Tổng hợp và giải phóng cytokin: thực hiện trên đĩa 96 giếng Lấy 0,23 ml hỗn dịch tế bào, 500 ng LPS và thuốc nghiên cứu hòa tan trong DMSO/nước (tỷ lệ 1:10) Hỗn dịch tế bào được ủ trong DMSO trong tủ thường ở 37 °C, 5 % CO2

Phản ứng được dừng lại bằng cách đặt đĩa vào trong bát nước đá, sau đó ly tâm ở tốc

độ 2000 vòng/phút trong 2 phút Sử dụng bộ kit ELISA để xác định nồng độ cytokin Thông số đánh giá: nồng độ cytokin của lô thử và so sánh nồng độ cytokin của lô thử so với lô chứng

1.2.2.1 Phương pháp ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 được kích thích

viêm bằng LPS (lipopolysaccharid) [28], [29], [60], [77], [98]

Nguyên tắc: NO là phân tử quan trọng tham gia nhiều quá trình sinh lý của cơ thể, tuy nhiên khi NO được sản xuất quá nhiều gây ra sự tổn thương mô liên quan đến quá trình viêm cấp và viêm mạn tính Do đó ức chế sản sinh NO góp phần là giảm phản ứng viêm [80] Tế bào RAW 264.7 (tế bào có nguồn gốc đại thực bào chuột nhắt) khi được kích thích viêm bằng LPS (lipppolysaccharid – nội độc tố vi khuẩn)

sẽ giải phóng các chất trung gian hóa học gây viêm, trong đó có nitric oxid [76], [104] Do đó thuốc làm giảm lượng NO sinh ra trên tế bào RAW 264.7 được kích thích viêm bằng LPS được coi là có tác dụng chống viêm

Tiến hành: Các tế bào RAW 264.7 (tế bào nguồn gốc đại thực bào chuột nhắt) được ủ trong môi trường nuôi cấy tế bào (DMEM bổ sung chứa 10 % huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serume – FBS), 1 % kháng sinh penicillin (100 U/ml) và

streptomycin (100 µg/ml) (37 °C, 5 % CO2) Lấy mẫu ủ với LPS 1 μg/ml cùng với chất thử nghiệm trong 24 giờ (37 °C, 5 % CO2) Nitrite (NO2-) được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, được xác định nhờ phản ứng Griess

Thông số đánh giá: xác định giá trị IC50 của mẫu nghiên cứu, so sánh khả năng

ức chế sản sinh NO ở mẫu chứng và mẫu nghiên cứu

1.3 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu

1.3.4 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học

1.3.4.1 Một số nghiên cứu ngoài nước về thành phần hóa học

 Lá:

Lá cây Núc nác chứa các flavonoid: Chrysin, oroxylin A, scutellarin và baicalein [44], [108] Từ cao chiết methanol và cao chiết ethyl acetat của lá cây Núc nác, các flavonoid được tách ra bằng sắc kí phân bố ngược dòng tốc độ cao HSCCC: chrysin, baicalein, baicalein-7-O-glucoside, baicalein-7-O-diglucoside, chrysin-7-O-glucuronide, baicalein-7-O-glucuronide, và chrysin-diglucoside [71], [75]

 Vỏ thân:

Vỏ thân cây Núc nác có chứa các flavonoid, tanin, sterol với nồng độ trung bình, alcaloid, saponin, lignin, chất béo và dầu với nồng độ thấp [41] Vỏ thân cây Núc nác được tìm thấy chứa acid ellagic [57], các flavonoid chính chrysin, oroxylin A,

scutellarin, baicalein [109], 8,8''-bisbaicalein, 5,7-dihydroxyflavone, hispidulin, chrysin-7-O-β-D-glucuronide [27], [56], [78]

1.3.4.2 Một số nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học

 Hạt:

Năm 2012, 5 hợp chất từ cao chiết chloroform của hạt cây Núc nác được phân lập: chrysin, baicalein, chrysin-O-glucuronat methyl ester, lupeol, 2-methyl-6-

phenyl-4H-pyran-4-on Trong đó hợp chất chrysin-O-glucuronat methyl ester lần đầu được tìm thấy trong cây Núc nác [13] Năm 2013 phân lập tiếp được ba hợp chất: hai chất diarylheptanoids và một flavon 7-hydroxy-5-methoxyflavone [11]

* Ở Việt Nam và trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Núc nác từ rất lâu Từ kết quả của các nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học chính của cây Núc nác, đặc biệt vỏ thân cây Núc nác là các flavonoid

1.3.5 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý

1.3.5.1 Một số nghiên cứu ngoài nước về tác dụng dược lý

Cao chiết nước của lá cây Núc nác liều 150 mg/kg cân nặng và 300 mg/kg cân nặng thể hiện tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, trong đó mức liều 300 mg/kg cân nặng thể hiện tác dụng chống viêm tối

đa Các hoạt động chống viêm được cho là do có sự hiện diện của flavonoid và polyphenolic [63]

Nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng chống viêm của vỏ thân cây Núc nác Cao chiết nước của vỏ thân cây Núc nác có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan ở mức liều 14 mL/kg [36] Tác dụng chống viêm của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác được nghiên cứu trên hai mô hình:

mô hình gây viêm bởi xylen và mô hình gây viêm bởi formalin có kết quả cả hai mức

liều 250 mg/kg và 300 mg/kg đều thể hiện tác dụng chống viêm trên cả hai mô hình [24] Khi đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan của cao chiết hydro-ethanol vỏ thân cây Núc nác, kết quả hai mức liều nghiên cứu là 250 mg/kg cân nặng và 500 mg/kg cân nặng đều có tác dụng chống viêm, trong đó liều 500 mg/kg có tác dụng tốt hơn [23] Cao chiết methanol vỏ thân cây Núc nác có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan ở cả ba mức liều nghiên cứu 100 mg/kg, 200 mg/kg và 400 mg/kg, trong đó mức liều 400 mg/kg thể hiện tác dụng chống viêm tốt nhất [19]

Định hướng cơ chế tác dụng chống viêm của vỏ thân cây Núc nác cũng đã được nghiên cứu Cao chiết dichloromethan và cao chiết ethyl acetat vỏ thân cây Núc nác

ức chế mạnh hoạt động của NF-κB, ngoài ra cao chiết ethyl acetat vỏ thân cây Núc nác còn ức chế sản sinh PGE2 [27], [62]

 Tác dụng kháng khuẩn:

Vỏ thân cây Núc nác đã được nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn Các cao chiết methanol, ethyl acetat và ethanol vỏ thân cây Núc nác có hoạt tính kháng khuẩn với

ba chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương: Bacillus subtilis, E.coli, Pseudomonas

eruginosa [53] Cao chiết hexan, CCl4 và choloroform vỏ thân cây Núc nác đã được

thử nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn trên một số vi khuẩn Gram âm, Gram dương như Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea E

coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella parathyphii, Salmonella typhi, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Vibrio mimicus Tất cả các cao chiết đều có hiệu quả

chống lại các vi khuẩn Gram dương, Gram âm với hiệu quả tương đương khi so sánh

với kháng sinh ampicilin [61]

 Tác dụng chống oxy hóa

Nhiều nghiên cứu trên các mô hình in vitro đã chứng minh các bộ phận của cây

Núc nác bao gồm vỏ rễ, vỏ thân, lá, quả có hoạt tính chống oxy hóa Tiềm năng chống oxy hóa của cao chiết methanol các phần khác nhau của cây Núc nác bao gồm vỏ rễ,

vỏ thân, lá và quả được xác định bằng khả năng dọn sạch gốc tự do DPPH, nitric oxyd, anion superoxyd, hydroxyl, trong đó cao chiết methanol từ lá thể hiện hoạt

động dọn gốc tự do cao hơn so với cao chiết methanol từ vỏ và quả [59] Cao chiết ethylacetat, methanol và nước của lá cây Núc nác cho thấy hoạt tính chống oxy hóa đáng kể, thể hiện khả năng dọn gốc tự do DPPH với các giá trị IC50 lần lượt là 49,0 μg/mL; 55,0 μg/mL và 42,5 μg/mL [69] Cao chiết methanol vỏ thân cây Núc nác được nghiên cứu có khả năng dọn sạch các gốc tự do DPPH, superoxid, hydroxyl và

ức chế quá trình peroxyd hóa lipid ở gan chuột [55], [64], [67]

 Tác dụng chống ung thư

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vỏ thân cây Núc nác có tác dụng chống ung thư Bốn cao chiết: cao chiết nóng chloroform, cao chiết lạnh chloroform, cao chiết nóng ether dầu hỏa, cao chiết lạnh ether dầu hỏa của vỏ thân cây Núc nác có khả năng gây độc tế bào, cảm ứng gây chết tế bào theo chu trình và tiềm năng chống di căn ung thư khi đánh giá tác dụng trên các dòng tế bào MDA-MB-231 (tế bào ung thư biểu mô vú ở người ER-), MCF-7 (tế bào ung thư biểu mô vú ở người có ER+), WRL-68 (tế bào bình thường không có khối u) và Hep-2 (tế bào ung thư thanh quản

ở người) Tính gây độc tế bào, cả bốn cao chiết, đặc biệt là cao chiết nóng ether dầu hỏa vó thân cây Núc nác gây độc tế bào MDA-MB-231 cao hơn đáng kể so với tế bào WRL-68 Cao chiết ether dầu hỏa vỏ thân cây Núc nác cảm ứng gây chết tế bào theo chu trình dòng tế bào MDA-MB-231 hiệu quả hơn MCF-7 Cao chiết ether dầu hỏa vỏ thân cây Núc nác ức chế sự di chuyển của các tế bào, do đó có tiềm năng ngăn cản quá trình di căn [37], [81]

 Bảo vệ dạ dày, chống loét:

Cao chiết hexan và aceton vỏ thân cây Núc nác có tác dụng chống lại các tổn thương niêm mạc dạ dày do ethanol trên chuột cống trắng ở nồng độ 100 mg/kg và

250 mg/kg [57]

 Hoạt động bảo vệ gan:

Hoạt động bảo vệ gan của lá cây và vỏ thân cây Núc nác đã được nghiên cứu Cao chiết ethanol, nước và chloroform lá cây Núc nác với liều 300 mg/kg cân nặng cho thấy hoạt động bảo vệ gan chống lại tác nhân gây độc gan CCl4, làm thay đổi

đáng kể nồng độ ALP, ALAT, ASAT và tổng lượng bilirubin so với nhóm chứng; trong đó cao chiết ethanol thể hiện hiệu quả tốt hơn các cao chiết khác [65]

Cao chiết ether dầu hỏa, chloroform, methanol và nước của vỏ thân cây Núc nác

có tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương gây ra bởi CCl4, làm giảm nồng độ AST (aspart transaminase), ALT (alanin transaminase), phosphatase kiềm ALP so với nhóm đối chứng (dùng silymarin) [49]

1.3.5.2 Một số nghiên cứu trong nước về tác dụng dược lý

Việt Nam hiện có rất ít nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Núc nác

Năm 2001, Nguyễn Hoàng Hải nghiên cứu tác dụng chống viêm của vỏ thân cây Núc nác kết hợp với alpha chymotrypsin Cao chiết flavonoid toàn phần liều 15 g/kg thử nghiệm trên cả hai mô hình gây viêm cấp (mô hình gây phù bàn chân chuột theo Winter) và gây viêm mạn (mô hình gây u hạt thực nghiệm) đều có tác dụng chống viêm Khi kết hợp với alpha-chymotrypsin 1,5 mg/kg, tác dụng chống viêm tăng cao trên cả hai mô hình gây viêm [5]

Năm 2005, Lê Diễm Hồng và Nguyễn Xuân Thắng nghiên cứu ảnh hưởng của

flavonoid cây Núc nác (Oroxylum indicum Vent.) đối với alpha-chymotrypsin liên

quan đến quá trình viêm Cao chiết flavonoid (Fnntf) với nồng độ 0,05 % có khả năng kích thích hoạt tính của alpha-chymotrypsin mạnh nhất, phần trăm tăng hoạt tính lên đến 29,9 % (p < 0,01) Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm cấp theo mô hình gây phù chân chuột của Winter khi kết hợp dịch chiết Fnntf 1,5 g/kg và alpha-chymotrypsin 1,5 mg/kg cho thấy tỷ lệ ức chế phù tương đương so với thuốc đối chứng là indomethacin 5 mg/kg và cao hơn tỷ lệ trên chuột dùng đơn độc dược liệu hoặc alpha-chymotrypsin [7]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Dược liệu được nghiên cứu là vỏ thân cây Núc nác được trồng tại huyện Kim Động, tỉnh Hưng Yên và được thu hái vào tháng 06/2019

Quy trình chiết xuất được thể hiện ở Hình 2.1

Hình 2.1: Quy trình chiết xuất cao ethanol vỏ thân cây Núc nác

Vỏ thân rửa sạch để loại bỏ các chất ô nhiễm bề mặt, sấy khô ở nhiệt độ 50 °C trong tủ sấy ở điều kiện vệ sinh sạch sẽ đến độ ẩm dưới 10 %, sau đó nghiền thành bột bằng máy xay Bột được giữ khô đến khi sử dụng bằng cách bảo quản trong các túi kín khí

Chiết cao ethanol: Bột dược liệu khô (khối lượng dược liệu khô 1,5 kg) chiết siêu

âm không gia nhiệt ba lần với ethanol 70° (1 kg dược liệu tương ứng với 10 l ethanol),

gộp dịch chiết mỗi lần, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 60 °C, 30 vòng/phút Sau đó cô cách thủy thu được cao đặc ethanol dùng để nghiên cứu Xác định hàm ẩm và hiệu suất cao ethanol để tính mức liều nghiên cứu Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C

* Mẫu nghiên cứu: Cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác với khối lượng cao chiết ethanol thu được: 210 g, hàm ẩm: 14,1 % (cao đặc), hiệu suất chiết: 12,03 %

Định tính cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác thu được: có chứa flavonoid

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột cống trắng chủng Wistar khỏe mạnh, cả hai giới, cân nặng 200 – 300 g do Học viện Quân y cung cấp Động vật được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng, ánh sáng tự nhiên, cho ăn bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm 5 ngày

trước khi bắt đầu nghiên cứu

2.1.3 Hóa chất và thuốc thử

 Thuốc đối chiếu: Diclofenac 50 mg (biệt dược: Voltaren), indomethacin 25 mg (công ty cổ phần dược phẩm Hà Tây), prednisolon 5 mg (công ty dược phẩm Vĩnh

Phúc)

 Carrageenan (Sigma Aldrich)

 Hóa chất dùng trong định lượng hoạt độ MPO: Hóa chất để pha đệm K3PO4, HCl, NaOH (đạt tiêu chuẩn phân tích), hexadecyl trimethyl ammoni bromid (HTAB) (Sigma Aldrich), O-dianisidin hydrochlorid (Sigma Aldrich), H2O2

 Dòng tế bào: RAW 264.7 do GS.TS Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp

 Các dụng cụ và hóa chất khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu

 Máy đo độ phù chân chuột Plethysmometer LE 7500 (Letica Scientific Instrucments)

 Máy đo pH (EUTECH)

 Máy li tâm (HERMLE Z300, Z216MK)

 Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Bioteck, Hoa kì) và máy ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì)

 Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

 Micropipet một đầu kênh với các loại thể tích: 10 – 100 µl, 100 – 1000µl, 1000 – 5000µl (Eppendorf)

 Đĩa 96 giếng (Kartell – Italia)

 Đầu côn, microtube các loại

 Dụng cụ bắt giữ chuột, đồng hồ bấm giây, khay xốp/giá ống nghiệm, ống falcon, nhiệt kế

 Máy móc và thiết bị khác tại bộ môn Dược lực - trường Đại học Dược Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để giải quyết hai mục tiêu đề ra, nghiên cứu gồm hai nội dung chính:

Nội dung 1: Đánh giá tác dụng chống viêm in vivo của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác:

- Đánh giá tác dụng chống viêm cấp: được thực hiện trên hai mô hình: mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan và mô hình gây viêm khớp chuột bằng carrageenan trên chuột cống trắng

- Đánh giá tác dụng chống viêm mạn: được thực hiện trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng viên bông tẩm carrageenan trên chuột cống trắng

Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO in vitro của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác: được thực hiện trên tế bào đại thực bào RAW 264.7

được kích thích viêm bằng lipopolysaccharide (LPS)

Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu được trình bày ở Hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vivo của cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác

2.3.1.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo

 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan

Tác dụng chống viêm cấp của cao Núc nác được tiến hành theo mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan của Winter và cộng sự [112]

Nguyên tắc: Tác nhân gây viêm carrageenan khi tiêm vào bàn chân chuột kích thích giải phóng các chất trung gian hóa học gây viêm như histamin, serotonin, prostaglandin… gây giãn và tăng tính thấm thành mạch dẫn đến gây phù bàn chân chuột Các thuốc có khả năng ức chế phù bàn chân chuột được coi là có tác dụng chống viêm [1], [88]

Cách tiến hành:

Động vật thí nghiệm sử dụng là chuột cống trắng, được lựa chọn và nuôi trong điều kiện mô tả ở mục 2.1.2

Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 4 lô:

Lô 1 (lô chứng): uống nước muối sinh lý

Lô 2 (lô chứng dương): uống thuốc indomethacin liều 10 mg/kg cân nặng chuột

Lô 3 (cao Núc nác 1): uống cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác liều 300 mg/kg cân nặng chuột

Lô 4 (cao Núc nác 2): uống cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác liều 600 mg/kg cân nặng chuột

Chất gây viêm: hỗn dịch carrageenan 1 % pha trong nước muối sinh lý, ngâm đến khi carrageenan trương nở hoàn toàn

Chuột được uống nước muối sinh lý hoặc cao Núc nác vào cùng một giờ nhất định hàng ngày liên tục 5 ngày với cùng thể tích 1 ml/100g cân nặng chuột Trước khi dùng chế phẩm 90 phút, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường Vào ngày thứ năm, chuột được uống nước muối sinh lý, indomethacin hoặc cao Núc nác với cùng thể tích 1 ml/100mg cân nặng Sau 60 phút, tiêm 0,05 ml hỗn dịch carrageenan 1 % đã được chuẩn bị vào dưới da gan bàn chân sau bên phải của từng chuột để gây viêm Đo thể tích bàn chân sau bên phải của chuột tới khớp cổ chân bằng máy đo thể tích bàn chân chuột Plethysmometer LE 7500 (Letica Scientific Instrucments) tại các thời điểm: trước khi tiêm carrageenan (Vo), sau khi tiêm carrageenan một giờ (V1), ba giờ (V3), năm giờ (V5) và bảy giờ (V7)

So sánh mức độ phù bàn chân chuột của các lô cao Núc nác so với lô chứng tại cùng thời điểm để đánh giá tác dụng chống viêm của cao Núc nác Cao Núc nác hoặc thuốc đối chiếu có tác dụng chống viêm cấp khi làm giảm mức độ phù bàn chân chuột có ý nghĩa thống kê so với lô chứng

Quy trình tiến hành thí nghiệm được mô tả như Hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm cấp

in vivo trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan

Thông số đánh giá

 Thể tích bàn chân sau bên phải của từng chuột

 Mức độ phù bàn chân sau bên phải của từng chuột tính theo công thức (1):

∆𝑉 (%) = Vt − Vo

Vo × 100 (1) Trong đó:

∆V (%): Mức độ phù bàn chân sau bên phải chuột tại thời điểm t giờ sau khi tiêm

carrageenan

Vo: Thể tích bàn chân sau bên phải chuột tại thời điểm trước khi tiêm carrageenan

Vt: Thể tích bàn chân sau bên phải chuột tại thời điểm t giờ sau khi tiêm carrageenan

 Phần trăm ức chế phù của lô thử/lô đối chiếu so với lô chứng được tính theo công thức (2):

𝐼 (%) = ∆Vc − ∆Vt

∆Vc × 100 (2) Trong đó:

I (%): Phần trăm ức chế phù của lô thử/lô đối chiếu so với lô chứng

∆Vc: Mức độ phù bàn chân chuột trung bình của lô chứng

∆Vt: Mức độ phù bàn chân chuột trung bình của lô thử/lô đối chiếu

 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây viêm khớp chuột bằng carrageenan

Nguyên tắc: carrageenan là tác nhân gây viêm, khi tiêm vào khớp gối chân chuột, cơ thể sẽ phản ứng lại bằng cách tập trung bạch cầu tại nơi viêm, giải phóng ra các chất trung gian hóa học gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch gây phù khớp gối Thuốc làm giảm các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng được coi là có tác dụng chống viêm

Cách tiến hành [32] [54]

Động vật thí nghiệm sử dụng là chuột cống trắng, được lựa chọn và nuôi trong điều kiện mô tả ở mục 2.1.2

Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 4 lô:

Lô 1 (lô chứng): uống nước muối sinh lý

Lô 2 (lô chứng dương): uống thuốc diclofenac liều 20 mg/kg cân nặng chuột

Lô 3 (cao Núc nác 1): uống cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác liều 300 mg/kg cân nặng chuột

Lô 4 (cao Núc nác 2): uống cao chiết ethanol vỏ thân cây Núc nác liều 600 mg/kg cân nặng chuột

Chất gây viêm: hỗn dịch carrageenan 2 % pha trong nước muối sinh lý, ngâm đến khi carrageenan trương nở hoàn toàn

Chuột được uống nước muối sinh lý hoặc cao Núc nác vào cùng một giờ nhất định hàng ngày liên tục 5 ngày với cùng thể tích 1 ml/100g cân nặng chuột Trước khi dùng chế phẩm 90 phút, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường Vào ngày thứ năm, chuột được uống nước muối sinh lý, diclofenac hoặc cao Núc nác với cùng thể tích 1 ml/100mg cân nặng Đo đường kính khớp gối chân sau bên phải của từng chuột Sau 60 phút uống thuốc, tiêm 0,15 ml hỗn dịch carrageenan

2 % đã được chuẩn bị vào khớp gối chân sau bên phải của từng chuột để gây viêm Sau 4 giờ tiêm carrageenan, đo đường kính khớp gối chân sau bên phải từng chuột (ϕ 4), đánh giá mức độ viêm khớp dựa theo triệu chứng, thu dịch khớp gối bằng cách rửa khớp gối nước muối sinh lí vừa đủ 2 ml để xác định số lượng bạch cầu tổng

và thành phần bạch cầu, định lượng hoạt độ MPO

Quy trình tiến hành được mô tả như Hình 2.4

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm cấp

in vivo trên mô hình gây viêm khớp chuột bằng carrageenan

Thông số đánh giá:

 Mức độ sưng vùng khớp gối chuột:

 Mức độ sưng vùng khớp gối chân sau bên phải chuột được tính theo công thức (3):

∆𝜙 (%) = ϕ4 − ϕo

ϕo × 100 (3) Trong đó:

∆ ϕ (%): Mức độ sưng vùng khớp gối chân sau bên phải chuột tại thời điểm 4 giờ sau khi tiêm carrageenan

ϕo: Đường kính khớp gối chân sau bên phải chuột trước khi tiêm carrageenan(mm)

ϕ 4: Đường kính khớp gối chân sau bên phải chuột tại thời điểm 4 giờ sau khi tiêm carrageenan (mm)

 Phần trăm ức chế sưng vùng khớp gối của lô thử/lô đối chiếu so với lô chứng được tính theo công thức (4):

𝐼 (%) = ∆ϕc − ∆ϕt

∆ϕc × 100 (4) Trong đó:

I (%): Phần trăm ức chế sưng vùng khớp gối của lô thử/lô đối chiếu so với lô

 Điểm mức độ viêm khớp gối chân chuột dựa trên triệu chứng vào thời điểm 4

giờ sau khi tiêm carrageenan tính theo thang điểm được mô tả trong Bảng 2.1