Xây dựng quy trình phân tích đa hình gen Cyp2c9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông Acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGA XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ T

Trang 1

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ NGA

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN

CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ

THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở

NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH Y ĐA KHOA

Hà Nội - 2019

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ NGA

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN

CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ

THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở

NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Người hướng dẫn: ThS Phạm Thị Hồng Nhung

Hà Nội - 2019

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Bác sĩ đa khoa của tôi không chỉ là kết quả cho sự cố gắng của bản thân mà còn do nhận được sự giúp đỡ, động viên của cô thầy, bạn bè và người thân Qua trang viết này tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập – nghiên cứu vừa qua

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn tới ThS Phạm Thị Hồng Nhung – người đã tận tình chỉ bảo, đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Đỗ Thị Lệ Hằng đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm Các cô không chỉ trang bị cho tôi kiến thức khoa học, các kỹ năng phòng thí nghiệm mà còn truyền cho tôi niềm cảm hứng, lòng đam mê với nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Khoa Y Dược và Bộ môn Y Dược học

cơ sở đã hết lòng quan tâm, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài mã số QG.17.29 do PGS.TS Phạm Trung Kiên chủ trì và nghiên cứu của của tôi

là một phần trong đó

Tôi xin cảm ơn tập thể nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất Tôi cũng xin gửi lời tri ân tới các người bệnh đã tham gia vào nhóm nghiên cứu của đề tài

Xin gửi lời cảm ơn tốt đẹp tới nhóm sinh viên nghiên cứu thuộc bộ môn Y Dược học cơ sở đã luôn hỗ trợ kịp thời và giúp đỡ tôi khi tôi gặp khó khăn trong quá trình thực hành nghiên cứu

Bên cạnh đó, xin cảm ơn Quỹ học bổng PDG Trust đã luôn tin tưởng và đồng hành cùng tôi trong thời gian làm khóa luận nghiên cứu bậc đại học

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ sự yêu thương đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn là điểm tựa để tôi yên tâm hoàn thành tốt nhất khóa luận này

Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thị Nga

Trang 4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BMI Body Mass Index (Chỉ số khối cơ thể)

Bp Base pair (Cặp bazơ nitơ)

lệ chuẩn hóa quốc tế)

OD Optical density (Mật độ quang học)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PCR-CTPP Polymerase Chain Reaction with confronting two-pair primers

( Phản ứng chuỗi polymerase với hai cặp mồi kép) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài

đoạn cắt giới hạn) SNP Single nucleotit polymorphism (Đa hình đơn nucleotit)

VKORC1 Vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1 (Phức hợp

reductase vitamin K epoxide, tiểu đơn vị 1)

Trang 5

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị 5 Bảng 3.1 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số 20 Bảng 3.2 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen

CYP2C9*3

22 Bảng 3.3 Kết quả tần số alen và tần số kiểu gen CYP2C9*3 23 Bảng 4.1 Mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 *3 tới chỉ

định liều Acenocoumarol và nguy cơ chảy máu của một số nhóm nghiên cứu Hà Lan

27

Bảng 4.2 Các biến trong thuật toán tính liều acenocoumarol ở nhóm

nghiên cứu người Tây Ban Nha

27

Bảng 4.3 So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật

toán của các nhóm nghiên cứu khác nhau

28

Trang 6

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.2 Cơ chế tác động của chống đông kháng Vitamin K tại gan 6

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm

nghiên cứu

20

Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối

ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dòng alen CYP2C9*3

21

Hình 3.3 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối

ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA nhân dòng alen CYP2C9*3

21

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel

agarose 1,5 %

22 Hình 3.5 Kiểu gen CYP2C9*3 xác định thông qua giải trình tự 23

Hình 4.1 Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người Tần

số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số

24 Hình 4.2 Nguyên lý của phương pháp PCR-CTPP 25

Trang 7

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Khái quát quá trình đông máu và bệnh lý van tim 3

1.1.1 Quá trình đông máu 3

1.1.2 Bệnh lý van tim 4

1.2.Thuốc chống đông kháng vitamin K 4

1.3.Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol 7

1.3.1 Dược động học Acenocoumarol 7

1.3.2 Dược di truyền của Acenocoumarol 8

1.4.Tổng quan về đa hình CYP2C9*3 9

1.4.1 Enzym CYP2C9 9

1.4.2 Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 10

1.4.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh 14

2.1.2 Các tiêu chuẩn loại trừ 14

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

2.2 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 14

2.2.1 Hóa chất 14

2.2.2 Thiết bị 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm 15

2.3.2 Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit 16

2.3.3 Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3 17

2.3.4 Kiểm tra chất lượng DNA 17

2.3.5 Giải trình tự DNA 18

2.3.6 Phân tích kết quả và xử lý số liệu 18

2.4 Đạo đức nghiên cứu

Trang 8

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1 Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA 20

3.2 Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3 20

3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi với enzym Phusion Polymerase 21

3.2.2 Tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA 21

3.3 Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3 23

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 24

4.1 So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau 24

4.2 Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay 25

4.3 Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol 26

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lý van tim là một trong các bệnh phổ biến trên thế giới cũng như tại Việt Nam, là nguyên nhân hàng đầu gây suy tim và đe dọa tính mạng của người bệnh Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh van tim là do di chứng của tổn thương van tim trong bệnh thấp tim [10] Từ khi có kỹ thuật sửa và thay van tim, cuộc sống của người bệnh mắc bệnh van tim đã được cải thiện đáng kể, mang lại cho họ cuộc sống gần như bình thường Tuy nhiên, trong quá trình hoạt động các van tim nhân tạo thường sinh ra các cục máu đông dễ gây tắc mạch, huyết khối Do vậy, ngay sau khi thay van tim người bệnh phải sử dụng thuốc chống đông Tại Việt Nam, thuốc chống đông kháng vitamin K đã được đưa vào sử dụng hơn 25 năm nay với biệt dược chính là Sintrom (Acenoucomarol) có hiệu quả trong phòng và điều trị huyết khối đã được chứng minh Tuy nhiên trong quá trình sử dụng thuốc chống đông kháng vitamin K tỷ lệ gặp biến chứng khá cao, khoảng điều trị hẹp, tác dụng của thuốc chịu ảnh hưởng nhiều bởi nhiều yếu tố (chế độ ăn, các thuốc khác như aspirin, kháng sinh cephalosporin…) nên việc xác định liều lượng điều trị phù hợp gặp nhiều khó khăn Nếu liều dùng thuốc sử dụng thấp thì không đạt hiệu quả điều trị nhưng nếu quá liều sẽ gây biến chứng chảy máu thậm chí gây tử vong

Hiện nay các thầy thuốc lâm sàng điều chỉnh liều thuốc chống đông kháng vitamin K chủ yếu dựa vào xét nghiệm INR (Thời gian Prothrombin đo với tỉ lệ chuẩn hóa quốc tế- International Normalized Ratio) của người bệnh INR yêu cầu phải theo dõi hàng ngày để điều chỉnh liều, điều đó gây khó khăn việc này đòi hỏi phải theo dõi INR hàng ngày để điều chỉnh liều, gây nên những khó khăn về thời gian và kinh tế cho người bệnh tiến hành xét nghiệm Qua quá trình theo dõi điều trị, có sự khác nhau về kết quả điều trị người bệnh trong cùng một nhóm tuân thủ điều trị như nhau Vậy điều gì ảnh hưởng tới kết quả INR ở những người bệnh cùng

độ tuổi, cùng giới tính, cùng phác đồ là câu hỏi vẫn chưa có lời giải thích đầy đủ

Kiểu gen thu được từ dự án giải trình tự bộ gen người năm 2000 đã mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành khoa học sức khỏe Y học cá nhân hóa dựa vào kiểu gen đang trở thành một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng Hơn 30 gen đã được tìm thấy tham gia vào các hoạt động trao đổi chất của thuốc chống đông máu họ Coumarin dạng uống, trong đó nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng

đa hình di truyền CYP2C9*3 (c.1075 A > C) là một trong các yếu tố di truyền quan

trọng ảnh hưởng đến sự đáp ứng thuốc chống đông kháng vitamin K Một số nghiên cứu cho thấy người bệnh mang kiểu gen đồng hợp đột biến CC, và dị hợp AC cần

Trang 10

giảm liều chống đông so với người bệnh đồng hợp kiểu dại AA [25, 42] Do đó, việc xác định được kiểu gen này đóng một vai trò quan trọng trong tiên lượng đáp ứng thuốc điều trị ở từng người bệnh

Trong bối cảnh của Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về mặt di truyền học liên quan tới việc chỉ định liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh Chính vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu: “Xây dựng quy trình phân tích đa hình di

truyền gen CYP2C9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông

Acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu như sau:

Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng được quy trình tối ưu để xác định đa hình di truyền CYP2C9*3

trên mẫu máu người bệnh sau thay van tim

- Áp dụng được quy trình đã tối ưu để đánh giá mức độ đa hình di truyền

CYP2C9*3 trên 100 người bệnh sau thay van tim tại Việt Nam

Nội dung nghiên cứu

- Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen chứa đa hình CYP2C9*3

- Giải trình tự và xác định kiểu gen của các đa hình CYP2C9*3

- Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen trên 100 người bệnh sau thay van tim ở Việt Nam

Trang 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát quá trình đông máu và bệnh lý van tim

1.1.1 Quá trình đông máu

Bình thường máu lưu thông trong lòng mạch ở trạng thái lỏng, không đông nhờ có sự cân bằng giữa hệ thống đông cầm máu và ức chế đông máu Khi xảy ra tổn thương mạch máu, hệ thống đông cầm máu được khởi động nhằm tạo cục máu đông khu trú tại chỗ tổn thương, làm ngừng chảy máu Sau khi hoàn thành chức năng cầm máu, cục máu đông sẽ được tiêu đi, trả lại sự lưu thông bình thường cho lòng mạch Toàn bộ quá trình cần có sự tham gia của các thành phần: thành mạch, tiểu cầu, các yếu tố đông máu, các chất ức chế đông máu, hệ thống tiêu sợi huyết

Quá trình đông cầm máu gồm các giai đoạn: cầm máu nguyên phát (tạo nút cầm máu tạm thời), đông máu huyết tương (tạo nút cầm máu vĩnh viễn), tiêu cục máu đông [6] Cầm máu nguyên phát diễn ra ngay tức khắc, có hai yếu tố quan trọng là tiểu cầu (kết hợp thành nút chặn tiểu cầu) và thành mạch (hiện tượng co mạch) Tiểu cầu kết dính vào nơi thành mạch bị tổn thương trực tiếp hay thông qua yếu tố Von-Willebrand Cầm máu thứ phát (đông máu huyết tương) diễn ra chậm, vài phút tới vài giờ Sau khi ra khỏi lòng mạch 2-4 phút, máu bắt đầu đông lại Máu đông lại là do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan dưới xúc tác của thrombin Các fibrin trùng ngưng với nhau tạo thành mạng lưới giam giữ các tế bào

máu và huyết tương tạo thành cục máu đông Sơ đồ thể hiện ở Hình 1.1

Hình 1.1 Các giai đoạn của quá trình đông máu

Các yếu tố đông máu được hoạt hóa kết hợp với Ca2+

Thrombokinase

Trang 12

1.1.2 Bệnh lý van tim

Bệnh lý van tim là tình trạng van tim bị bệnh lý hoặc bị tổn thương và có thể ảnh hưởng đến dòng máu chảy qua tim Có hai loại bệnh van tim chính Hẹp van: nghĩa là việc mở van bị giới hạn và van không mở ra hoàn toàn Vì vậy, làm hạn chế lưu lượng máu chảy qua van Hở van: nghĩa là van không đóng đúng cách

và có dòng máu phụt ngược qua van bị hở Đôi khi còn được gọi là thiểu năng van, hoặc rò van Bất kỳ van tim nào cũng có thể bị ảnh hưởng bởi những vấn đề này Tuy nhiên, van hai lá và van động mạch chủ thường gặp hơn [4]

Hầu hết các vấn đề về van tim có thể được điều trị bằng thuốc, can thiệp hay phẫu thuật sửa chữa, thay thế Tùy vào nguyên nhân gây hở van, mức độ nặng của bệnh mà bác sĩ đưa ra khuyến cáo phù hợp cho người bệnh Các thuốc điều trị hẹp,

hở van tim đã chứng minh có thể kiểm soát hoặc làm giảm các triệu chứng, giảm gánh nặng cho tim và làm chậm tiến triển của bệnh Các thuốc thường dùng gồm thuốc lợi tiểu: giúp giảm gánh nặng cho tim; thuốc ức chế men chuyển hạ huyết áp

và giảm gánh nặng cho tim; chẹn beta giao cảm: giảm nhịp tim, kiểm soát nhịp tim

và hạ huyết áp; các thuốc trợ tim giúp ổn định nhịp tim và giúp tăng sức bóp cơ tim; thuốc chống đông: ngăn ngừa nguy cơ hình thành cục máu đông, đặc biệt sau phẫu thuật van tim hoặc thay van bằng vật liệu tổng hợp

Phẫu thuật tim hở hay can thiệp tim qua da, sẽ được bác sỹ quyết định dựa trên mức độ tổn thương van Can thiệp qua da được áp dụng với các trường hợp van

bị lỗi hoặc khuyết tật van tim bẩm sinh Sửa chữa van tim đơn giản hơn thay van tim vì tổn thương ít hơn, chi phí điều trị thấp hơn và hạn chế được nguy cơ bị nhiễm trùng sau phẫu thuật Thay thế van tim: khi không còn khả năng sửa chữa, tiến hành thay van tim bằng van tim cơ học hoặc van tim sinh học

Van sinh học được làm từ mô tim động vật, mô tim của người hiến tặng hoặc

sử dụng mô của chính người bệnh Van sinh học không cần sử dụng thuốc chống đông suốt đời Van cơ học được làm bằng vật liệu tổng hợp, thiết kế để hoạt động được nhiều năm tuy nhiên van cơ học đã được nghiên cứu và chứng minh tăng nguy

cơ tạo cục máu đông do đó cần sử dụng thuốc chống đông suốt đời

1.2 Thuốc chống đông kháng vitamin K

Sau thay phẫu thuật thay van tim biến chứng hay gặp nhất là do sử dụng các

thuốc chống đông máu Có thể nói thay van tim là thay một “bệnh van tim” bằng một “bệnh van tim nhân tạo”, do van tim nhân tạo khi hoạt động sẽ hình thành nên

Trang 13

các cục máu đông có nguy cơ gây tắc mạch và huyết khối Do vậy, tất cả người bệnh sau thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông nhằm ngăn ngừa hình thành các cục máu đông, tránh nguy cơ gây tắc mạch và/hoặc huyết khối

Thuốc kháng vitamin K đường uống đã được sử dụng từ rất lâu (từ những năm 1940), có một số nhóm thuốc kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị tại Việt Nam được trình bày ở

Trang 14

acenocoumarol, phenprocoumon), (2) khoảng INR đích đối với từng van, (3) INR trung bình đạt được, (4) phương pháp kiểm soát kháng đông (bác sĩ hoặc điều dưỡng kiểm soát, hoặc người bệnh tự điều chỉnh ở nhà), và (5) thời gian điều trị Nếu người bệnh bị huyết khối van, thuyên tắc hoặc biến cố chảy máu thì phải nêu rõ INR vào thời điểm xảy ra biến cố

Có nhiều loại thuốc chống đông, nhưng tại Việt Nam hiện nay được dùng nhiều nhất là thuốc kháng vitamin K do giá thành hợp lý và nằm trong danh mục được bảo

hiểm y tế chi trả Cơ chế chống đông được miêu tả như Hình 1.2

Hình 1.2 Cơ chế tác động của chống đông kháng Vitamin K tại gan

Chống đông kháng vitamin K tác động bằng làm giảm chức năng carboxyl hóa của vitamin K nhằm biến đổi các tiền chất thành các yếu tố đông máu gồm: yếu

tố prothrombin (yếu tố II), proconvertin (yếu tố VII), yếu tố anti hemophilia B (yếu

tố IX), và yếu tố Stuart-Prower (yếu tố X), sau cùng thành yếu tố đông máu bất hoạt Trong quá trình chuyển đổi, vitamin K bị oxy hóa thành expoxid vitamin K Như vậy các kháng vitamin K có tác dụng chống đông máu gián tiếp bằng cách ngăn cản tổng hợp các dạng hoạt động của nhiều yếu tố đông máu kể trên

Đã có nhiều nghiên cứu và hướng dẫn việc sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim Bourguigon T và cộng sự theo dõi 505 người bệnh thay van tim cơ học trong thời gian 8 năm thấy biến chứng gặp nhiều nhất là tắc mạch và chảy máu

có liên quan đến hoạt động của van [14] Abhijit Trailokya và cộng sự khuyến cáo liều acenocoumarol 4-8 mg/ngày từ ngày thứ hai và duy trì mức INR từ 3 đến 4 là

Yếu tố (II), (VII), (IX), (X) hoạt hóa

Carboxylase

Thuốc kháng vitamin K

Yếu tố (II), (VII), (IX), (X)

Vitamin K oxide Reductase

Trang 15

an toàn và hiệu quả [9] Nghiên cứu của Alec Vahanian và cộng sự đã đưa ra được những chỉ định rất cụ thể về sử dụng thuốc chống đông sau mổ thay van và đề xuất mức INR cho người bệnh thay van tim cơ học từ 2,5 đến 4 [10] Nghiên cứu của Nashimura và cộng sự trên 650 người bệnh thay van tim thấy 0,62 % có tắc mạch

và 0,95 % chảy máu, dùng thuốc chống đông kháng vitamin K liều 1-2,5 mg/ngày

có thể hạn chế được tắc mạch [16] Isthyak Ashmed Mir nghiên cứu trên 127 người bệnh sử dụng acenocoumarol sau thay van tim cho thấy nếu người bệnh duy trì được mức INR từ 2,5-3,5 sẽ giảm tối đa nguy cơ tắc mạch và chảy máu [27] Elbardissi và cộng sự nghiên cứu 861 người bệnh thay van động mạch chủ thấy rằng nếu sử dụng sớm thuốc chống đông thì hầu hết không thấy tai biến huyết khối tắc mạch sau thay van [22]

1.3 Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol

1.3.1 Dược động học Acenocoumarol

Việc hoàn thành dự án bộ gen người năm 2000 đã mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành khoa học sức khỏe Y học cá nhân hóa dựa vào bằng chứng đang nổi lên như một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng trong thời gian gần đây Thuốc chống đông kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol và phenprocoumon là thuốc thường được kê đơn nhất cho việc quản lý các vấn đề liên quan đến đông máu ở người bệnh rung nhĩ, thay van tim, vùng sâu, huyết khối tĩnh mạch, phổi thuyên tắc và với những người bệnh đã trải qua phẫu thuật chỉnh hình [17, 40, 25, 18] Nếu như tại Mỹ, hơn 2 triệu người bệnh được cho warfarin đơn liều

để ngăn ngừa huyết khối tắc mạch [31], thì ở Việt Nam, acenocoumarol (Sintrom) được sử dụng rộng rãi để điều trị hơn warfarin

Cấu trúc hoá học của acenocoumarol được đặc trưng bởi nhóm nitro ở vị trí para của vòng phenyl và tồn tại ở hai dạng đồng phân R (+) và S (-), trong đó R (+) acenocoumarol có tác dụng chống đông mạnh hơn so với S (-) acenocoumarol Cơ chế chống đông acenocoumarol cũng giống như nhóm thuốc chống đông kháng

Vitamin K khác đã trình bày ở Hình 1.2

Acenocoumarol được hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa và đạt nồng

độ tối đa (Cmax) 0,3 (± 0,05) mcg/mL trong 2-3 giờ Acenocoumarol trong huyết tương đa phần ở dạng liên kết với protein, chỉ 1,52 % tồn tại ở trạng thái tự do Sau khi uống, nồng độ thuốc trung bình đạt được trong huyết tương và thời gian bán thải của Acenocoumarol lần lượt là 3,9 (± 0,7) mcg mL/giờ và 10,9 (± 1,5) giờ Thời

Trang 16

gian để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc làm tăng thời gian prothrombin là từ

24-30 giờ [27] Acenocoumarol là thuốc có thời gian bán thải ngắn, do vậy nó được đào thải ra ngoài một cách nhanh chóng

Năm 1982 Tổ chức Y tế Thế giới đưa ra khái niệm INR (International Normalized Ratio) Định nghĩa INR như sau: INR = (PT người bệnh / trung bình

PT bình thường)ISI, trong đó ISI (International Sensitivity Index) là độ nhạy của lô

thromboplastin được dùng so với thromboplastin chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới

có ISI = 1 (ISI của mỗi lô thromboplastin do nhà sản xuất cung cấp) Hiện nay INR được xem là xét nghiệm chuẩn để đánh giá mức độ chống đông bằng thuốc kháng vitamin K Vì không thể có được một giá trị INR cố định trong suốt quá trình điều trị dài hạn, các hướng dẫn điều trị đưa ra một khoảng INR cần đạt đối với từng bệnh

lý (ví dụ đối với người có van 2 lá cơ học khoảng INR cần đạt là 2,5-3,5) Liều thuốc kháng vitamin K được điều chỉnh để đạt INR trong khoảng này Duy trì INR trong một khoảng là một công việc khó khăn INR có thể dao động (dù liều thuốc kháng vitamin K không thay đổi) do những thay đổi của lượng vitamin K trong khẩu phần ăn (các loại thức ăn chứa nhiều vitamin K gồm bắp cải, bông cải, cải xoăn, rau diếp, gan bò, gan lợn), do thay đổi của chức năng gan, do tương tác thuốc hoặc do người bệnh không tuân thủ điều trị Trên thực tế, để duy trì INR ổn định trong một khoảng đích cần thực hiện xét nghiệm này một cách định kỳ, ít nhất 1 lần/tháng và mỗi khi có phối hợp thêm một thuốc có tương tác với thuốc kháng vitamin K

1.3.2 Dược di truyền của Acenocoumarol

Nghiên cứu trong nhiều năm trở lại đây, di truyền học là một trong các yếu

tố quan trọng đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt được khoảng INR mong muốn [12, 44] Hơn 30 gen đã được tìm thấy có tham gia vào các hoạt

động và sự trao đổi chất của thuốc chống đông đường uống, trong đó CYP2C9 (một

trong những gen mã hóa cho họ enzym chuyển hóa thuốc cytochrome P450) và

VKORC1 (gen mã hóa cho tiểu phần 1 của enzym khử vitamin K 2,3 epoxide thành

dạng hoạt động) là hai gen quan trọng nhất ảnh hưởng tới đáp ứng thuốc chống đông Acenocoumarol [36, 28, 43]

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng khoảng 30% của phương sai liều

phụ thuộc vào đa hình đơn nucleotit (SNP) trên gen VKORC1 và khoảng 12% phụ thuộc vào SNP trên gen CYP2C9 [19, 38] Một nghiên cứu của hiệp hội genome mở rộng cũng chỉ ra rằng VKORC1, CYP2C9 và CYP4F2 là các yếu tố di truyền chủ

Trang 17

yếu chịu trách nhiệm cho sự biến thiên liều của chống đông đường uống ở người

bệnh da trắng và trong đó các SNPs của gen VKORC1 và gen CYP2C9 có vai trò

Đa số các công bố hiện nay nghiên cứu nhiều về dược di truyền của warfarin, trong khi đó những hiểu biết về dược di truyền với thuốc acenocoumarol còn rất hạn chế Năm 2016, Kalpana S.R và cộng sự đã chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình di truyền

gen của VKORC1, CYP2C9 với liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh [28]

Tác giả Van Schie và cộng sự công bố chi tiết về các thuật toán tiên lượng liều sử dụng cho acenocoumarol và phenprocoumon có sự khác biệt đáng kể so với thuật toán tiên lượng liều sử dụng cho warfarin [43] Đây là một nghiên cứu trong chuỗi nghiên cứu về gen mã hóa cho enzym ảnh hưởng đến xác định liều thuốc chống đông

1.4 Tổng quan về đa hình CYP2C9*3

1.4.1 Enzym CYP2C9

Cytochrom P450 (CYP) là siêu họ enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa phần lớn các thuốc được sử dụng trên lâm sàng hiện nay như: thuốc chống ngưng tập tiểu cầu (clopidogrel), chống động kinh (phenytoin)… trong đó CYP2C9 là enzym đóng vai trò quan trọng trong oxy hóa các hợp chất nội và ngoại sinh, đồng thời là enzym tham gia chuyển hóa thuốc acenocoumarol

Hàng trăm loại thuốc điều trị được chuyển hóa bởi CYP2C9 tại gan, bao gồm

cả các loại thuốc có chỉ định điều trị hẹp như acenocoumarol, warfarin và phenytoin

và các loại thuốc khác như tolbutamide, losartan, glipizide, cũng như một số loại thuốc chống viêm không steroid Ngoài ra CYP2C9 tham gia chuyển hóa các hợp chất nội sinh quan trọng như 5 -hydroxytryptamine thành epoxygenase hoạt động, các axit béo không bão hòa thành một loạt các sản phẩm có hoạt tính sinh học

Trang 18

Gen CYP2C9 là một trong nhiều gen CYP2C nằm trong một khu vực có kích

thước khoảng 500 kb ở vị trí số 23 trên cánh dài nhiễm sắc thể số 10

(10q23.33) CYP2C9 có tính đa hình cao Hơn 50 nucleotit polymorphisms (SNPs)

đã được tìm thấy trên vùng mã hóa của gen CYP2C9 [21] Một số SNP đã được

chứng minh là có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính khử của enzym so với dạng kiểu dại

1.4.2 Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3

Đa hình đơn nucleotit (Single nucleotit polymorphism – SNP) là những vị trí nằm trong hệ gen của người, mà ở những cá thể khác nhau lại xuất hiện một loại nucleotit khác nhau (A, T, G hoặc C) Mỗi vị trí được coi là một SNP chỉ khi tần số

ít nhất xuất hiện một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1 % Mặc dù về lý thuyết, có thể xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotit, song thông thường SNP lại chỉ xuất hiện 2 loại alen [45] Nguyên nhân là do SNP bắt nguồn từ một đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotit này sang một nucleotit khác Nếu đột biến được xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì sẽ có các thế hệ sau ra đời mang đột biến này,

và qua nhiều thế hệ sẽ hình thành SNP trong quần thể Nhiều SNP có thể giúp dự đoán đáp ứng của từng cá nhân với các loại thuốc điều trị, tính nhạy cảm với các yếu tố môi trường và nguy cơ mắc một số bệnh, cũng như theo dõi các bệnh lý di truyền theo gia đình [43]

Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 (c.1075 A > C) hay rs1057910 là đột

biến đồng hoán A thay thế bằng C Đột biến này làm khung đọc mARN bị ngắn hơn

bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính Alen CYP2C9*3 là dạng alen đột biến CYP2C9 phổ biến nhất Tại vị trí đa hình này tạo ra 3 trường hợp kiểu gen:

đồng hợp tử kiểu dại AA, dị hợp tử AC và đồng hợp tử kiểu đột biến CC

1.4.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu

Tách DNA tổng số

Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số Nguyên lý của kit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNA liên kết với màng silica-gel; loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer;

và thu DNA

Trang 19

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

Nguyên lý của kỹ thuật PCR là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên hai phân tử DNA mới từ 1 phân tử DNA khuôn ban đầu sau mỗi chu kỳ Thành phần chính của phản ứng gồm có DNA khuôn, cặp mồi, dung dịch đệm, 4 loại deoxyrinucleotit triphosphate (dA, dT, dG, dC), DNA polymerase Chu trình nhiệt

gồm 3 giai đoạn chính Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95 °C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống tới

nhiệt độ gắn mồi, tạo điều kiện cho tự bắt cặp của mồi vào sợi DNA khuôn Nhiệt

độ này phụ thuộc vào thành phần và số lượng nucleotit của cặp mồi Giai đoạn kéo dài: Tại 72 oC, DNA polymerase sẽ hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotit mới dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại deoxynucleotit triphosphate [21, 43] Sau n chu kỳ, từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tổng hợp được 2n phân tử DNA mới

Đánh giá chất lượng DNA bằng đo hấp thụ quang và điện di

Sản phẩm DNA sau quy trình tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp

đo hấp thụ quang Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định Để tính nồng độ DNA cần xác định giá trị mật độ đo quang ở bước sóng 260 nm (OD260) Trong đó, 1 đơn vị

OD260 tương ứng dung dịch có nồng độ 50 ng/ml DNA sợi đôi [1] Trong khi đó, protein hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 280 nm (OD280) do có cấu trúc vòng thơm của axit amin tryptophan Độ tinh sạch của dịch chiết DNA được xác định thông qua tỉ số OD260/OD280 hay còn kí hiệu là OD260/280 Nếu tỉ số này trong khoảng 1,8 - 2,2, dung dịch DNA được coi là có độ tinh sạch cao, ít tạp nhiễm Nếu

OD260/280 > 2,2 thì dung dịch DNA đã bị biến tính hoặc phân hủy Nếu OD260/280 < 1,8 thì dung dịch DNA có lẫn nhiều tạp chất [3]

Chất lượng DNA còn có thể kiểm tra bằng phương pháp điện di Nguyên lý của điện di dựa trên nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của giá thể Dung dịch đệm là môi trường dẫn điện và tạo điện trường Dưới tác động của điện trường, các phân tử khác nhau

về kích thước, điện tích, mức độ xoắn và hình dạng phân tử (mạch thẳng hay vòng)

sẽ di chuyển qua giá thể (gel agarose hay gel polyacrylamide) với tốc độ khác nhau Sau khi điện di kết thúc, các phân tử có thể quan sát được nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (như ethidium bromide) Độ sáng, số lượng băng, hình dạng băng (thẳng gọn hay không) là các yếu tố giúp đánh giá chất lượng DNA Cuối cùng,

Trang 20

kích thước băng điện di của mẫu có thể ước lượng thông qua so sánh vị trí của băng DNA với các băng đã biết kích thước trên thang chuẩn DNA [1]

Xác định kiểu gen của từng SNP bằng phương pháp giải trình tự

Giải trình tự của gen là phương pháp giúp phát hiện trình tự sắp xếp của bốn loại nucleotit trên phân tử DNA Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình

tự DNA hiện nay đều dựa trên phương pháp Sanger: bổ sung các dideoxynucleotit (ddNTP) lần lượt tương ứng với mỗi loại nucleotit A – T – G – C, tức là các nucleotit đã mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C2 và C3 của phân tử đường pentose Khi ddNTP được gắn vào mạch, do thiếu nhóm C3’- OH nên sự tổng hợp mạch đơn sẽ

dừng lại tại đó và tạo ra các đoạn DNA khác nhau (mô tả trong Hình 1.3) [1]

Hình 1.3 Phương pháp giải trình tự tự động

Trong phương pháp Sanger, phản ứng được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt, trong mỗi ống gồm một hỗn hợp 4 loại dNTP thông thường, một trong những loại dNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp Ngoài ra, mỗi loại ddNTP sẽ được thêm vào lần lượt mỗi ống với nồng độ bằng 1/10 loại tương ứng Khi tổng hợp mạch mới, dNTP sẽ tham gia, cùng với đó là ddNTP mỗi loại, nhưng với nồng độ thấp, làm kết thúc quá trình sao chép Do đó hình thành hỗn hợp nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’

Trang 21

nhưng khác nhau về chiều dài và nucleotit kết thúc ở đầu 3’ Sản phẩm này sẽ được phân tách trên gel polyacrylamide và đọc trình tự theo thứ tự băng xuất hiện

Máy giải trình tự gen tự động hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại Máy bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu Các vạch điện di trong mao quản sẽ đi qua một chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotit A, T, C, G

Ưu điểm của giải trình tự tự động là khả năng tự động hóa phần lớn các bước, tốc độ đọc và mức độ chính xác rất cao Tuy nhiên hạn chế là không đọc được các trình tự quá ngắn, sai số tăng lên khi đoạn DNA dài hơn 1000 bp, hoặc các đoạn DNA mang nhiều trình tự lặp có xu hướng bị nén lại khi chạy qua cột chứa gel nên

có các pic ở các vùng lặp đó lồng vào nhau, khó xác định trình tự chính xác [21, 43]

Hiện nay tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về dược di truyền liên quan tới các gen chuyển hóa acenocoumarol Từ những dữ liệu ở trên, trong khuôn khổ

đề tài này, tôi chọn CYP2C9*3 (1075 A > C) là đối tượng nghiên cứu chính đồng

thời chọn phương pháp giải trình tự bằng máy tự động để xác định đa hình di truyền

CYP2C9*3 trên người bệnh thay van tim sử dụng acenocoumarol

Trang 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh

100 Người bệnh mắc bệnh van tim có chỉ định thay van tim cơ học tại Bệnh viện Tim Hà Nội tham gia cung cấp mẫu Tiêu chuẩn chọn người bệnh theo Khuyến cáo của Hội Tim mạch học Việt Nam [2]

2.1.2 Các tiêu chuẩn loại trừ

Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng; Huyết động không ổn định; Tai biến mạch não dưới 3 tháng; Mới phẫu thuật dưới 1 tuần; Chống chỉ định dùng thuốc chống ngưng tập tiểu cầu; Nguy cơ cao chảy máu; Suy thận, suy gan giai đoạn cuối; Không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2018

Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega – Biotek); Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck); Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate (hãng Affymetrix); Nước khử ion (hãng Omega Bio-tek); 6X DNA loading dye (Thermo Scientific); Cặp mồi được đặt tổng hợp tại công ty Phusa Biochem (Việt Nam); dNTPMix 2mM mỗi loại (hãng Thermo Scientific); Phusion DNA Polymerase (hãng Thermo Scientific); DNA marker 100bp-4kb (Lonza); Lamda/HindIII DNA Ladder (hãng Thermo Scientific)

2.2.2 Thiết bị

Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Tủ lạnh sâu Panasonic (Nhật Bản); Máy quang phổ NP 80 Nanophotometer (Implen, Đức); Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ); Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh)

Trang 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thể hiện trong Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.3.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm

Về lượng mẫu: 2 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chia đều vào 3 ống chuyên

dụng chứa sẵn EDTA chống đông (tối thiểu 300 µL máu/ống) Mỗi ống máu đủ cho

1 lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen của người bệnh

Cách bảo quản: Mẫu máu được giữ lạnh ở -20 đến -300C cho đến khi được sử dụng Nếu không có tủ lạnh -200C, mẫu cần được giữ ở ngăn đá tủ lạnh dân dụng hoặc trong đá không quá 1 ngày và không được giã đông trước khi tách DNA hoặc chuyển đến nơi có tủ -200C để bảo quản

Kí hiệu mẫu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã người bệnh, tên,

tuổi, ngày lấy mẫu Thông tin về mẫu máu của người bệnh phải được lưu trong sổ

Trang 24

với các thông tin: tên, tuổi, mã người bệnh, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA

2.3.2 Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit

Các bước thao tác được tiến hành như sau:

Bước 1 Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng

Bước 2 Lắc đều ống máu Chuyển 250µL mẫu vào ống ly tâm vô trùng

Bước 3 Thêm 25 µL OB Protease Solutionvà 250 µL BL Buffer, vortex 10 giây Bước 4 Ủ 65 oC trong 10 phút Sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15 giây

Bước 5 Thêm 260 µL Ethanol 100% Vortex trong 20 giây

Bước 6 Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên

thành và nắp ống Bước 7 Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 mL

Bước 8 Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µL)

Bước 9 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 10 Bỏ dịch lọc và Collection Tube

Bước 11 Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2mL mới

Bước 12 Thêm 500 µL HBC Buffer

Bước 13 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 14 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

Bước 15 Thêm 700 µL DNA Wash Buffer

Bước 16 Ly tâm trong 1 phút ở 14.000 vòng/phút

Bước 17 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

Bước 18 Lặp lại các bước 14-16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer

Bước 19 Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 vòng/p trong 2 phút để làm

khô cột Bước 20 Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2mL mới

Bước 21 Thêm 100 µL Elution Buffer (đã làm ấm đến 65 oC) Ủ ở 65 oC trong 5

phút

Trang 25

Bước 22 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 23 Thêm 50 µL Elution Buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 24 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 25 Thu và bảo quản DNA ở -20 oC

2.3.3 Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3

Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tôi tiến hành xác định nhiệt

độ gắn mồi, nồng độ hoạt động tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng Phusion polymerase (Thermo Scientific) Đoạn mồi tự thiết kế được đặt tổng hợp tại Công ty Phusa Biochem (Việt Nam) có trình tự lần lượt là: mồi xuôi 5’ GCA TCT GTA ACC ATC CTC TC 3’ và mồi ngược 5’ GTG TCA AGA TTC AGT TCT TTC C 3’ Dựa trên trình tự DNA tham chiếu trên Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia- Mỹ (National Center for Biotechnology Information

- NCBI), đoạn DNA nhân dòng có độ dài lý thuyết được xác định là 719 bp

2.3.4 Kiểm tra chất lượng DNA

DNA tổng số và sản phẩm PCR sẽ được đánh giá chất lượng thông qua hai phương pháp được mô tả bên dưới

Đánh giá chất lượng DNA thông qua phương pháp đo quang

Bước 1 Khởi động máy, chọn chế độ đo nồng độ DNA

Bước 2 Đo mẫu trắng: lấy 2 µL Elution buffer dùng để pha loãng DNA làm dung

dịch đo mẫu trắng

Bước 3 Đo mẫu DNA: lấy 2 µL mỗi mẫu DNA để đo, máy sẽ tự động tính toán

nồng độ DNA và độ tinh sạch dựa vào giá trị OD260 và OD280 thu được

Đánh giá chất lượng DNA thông qua điện di trên gel agarose

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Cho 1,5 g agarose pha trong 100 ml đệm

TAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, sau đó để nguội đến 50 – 60 oC thì đổ vào khay điện di có cài sẵn răng lược để tạo các giếng tra mẫu Sau khoảng 30 phút, gel đã đông lại, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bể điện di, phần giếng nằm gần phía cực âm của máy Đổ đệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1 – 2 mm

Bước 2: Tra mẫu DNA: 5 µL mẫu DNA được trộn với 1 µL 6X DNA loading dye

đã nhuộm Ethidim Bromua trước khi tra vào giếng 5 µL thang chuẩn

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	1,48 MB