Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS PHOSPHORYL hóa và một số cơ trơn cô lập

Trang 1

KHOA Y DƢỢC

HỒ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HÓA

VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Trang 2

KHOA Y DƯỢC

HỒ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL

HÓA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa : QH.2013.Y

Người hướng dẫn : 1 TS VŨ THỊ THƠM

2 PGS TS DƯƠNG THỊ LY HƯƠNG

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ Ban chủ nhiệm khoa Y - Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Bộ môn Y - Dược học cơ sở đã tạo điều kiện cho em để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua

Em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Thơm và

PGS TS Dương Thị Ly Hương, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo

điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, thầy cô Bộ môn Y – Dược học cơ sở đã giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận

Em xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp

khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-

18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung nghiên cứu này Em cũng xin cảm ơn Bộ môn Sinh lý học, Học viên Quân Y đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân

đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót,

em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô để khóa luận thêm hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Hồ Thị Thu Hà

Trang 4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ACh Acetylcholin

BH4 Tetrahydrobiopterin

CaM Camodulin

CD Cụm biệt hóa (Cluster of differentiation)

cGMP GMP vòng (Cyclic guanosine monophosphate)

COX Cyclooxygenase

COX-1 Cyclooxygenase-1

COX-2 Cyclooxygenase-2

eNOS Endothelial nitric oxide synthase

FAD Flavin adenine dinucleotide

FMN Flavin mononucleotide

GTP Guanosine-5'-triphosphate

HUVEC Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (Human umbilical vein

endothelial cell) ICAM - 1 Phân tử kết dính liên bào 1 (Intercellular adhesion molecule 1) iNOS Inducible nitric oxide synthase

LD50 Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%)

LPS Lipopolyshaccharide

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

nNOS Neuronal nitric oxide synthase

NO Nitric oxide

NOS Nitric oxide synthase

Trang 5

NSAIDs Thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal

anti-inflammatory drugs) NST Nhiễm sắc thể

PDGF Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet-derived growth

factor)

PG Prostaglandin

PGE2 Prostaglandine E2

PGI2 Prostacyclin

PS27 Cao giàu saponin Tam thất hoang

PSBt Cao chiết bằng dung môi n - butanol Tam thất hoang

PSnH Cao chiết bằng dung môi n - hexan Tam thất hoang

PST Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70% Tam thất hoang

RT-PCR PCR thời gian thực (Reverse transcription polymerase chain

reaction)

sGC Guanylyl cyclase hòa tan (Soluble guanylyl cyclase)

Thr Threonin

TTH Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M.Feng)

VCAM-1 Phân tử kết dính tế bào mạch (Vascular cell adhesion molecule)

Trang 6

Hình 1.5 Sự điều hòa các vị trí phosphoryl hóa eNOS 11 Hình 1.6 Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội

mạc

12 Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin 15 Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn Tam thất hoang 18 Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 19 Hình 2.3 Phương pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình nuôi và hệ thống ghi 20 Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2-

23 Hình 3.1 Sự giãn cơ trơn khí quản của cao tổng Tam thất hoang 25 Hình 3.2 Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của cao tổng Tam thất hoang 25 Hình 3.3 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng

hợp NO

26

Hình 3.4 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu

hiện protein eNOS phosphoryl hóa

27

hiện mARN COX-2

28

hiện protein COX-2

29

Trang 7

Trang 8

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Tam thất hoang 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Sinh thái và phân bố 2

1.1.3 Thành phần hóa học 3

1.1.4 Tác dụng dược lý 4

1.1.5 Công dụng 4

1.2 Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS 5

1.2.1 Nội mạc mạch máu 5

1.2.2 eNOS 6

1.3 Tổng quan về viêm và COX-2 14

1.3.1 Viêm và prostaglandin trong viêm 14

1.3.2 COX – 2 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Dung môi, hóa chất và thiết bị 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập 21

2.3.2 Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

Trang 9

3.1.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập 24

3.1.2 Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa 26

3.1.3 Tác dụng trên sự biểu hiện COX-2 28

3.2 Thảo luận 30

3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập 30

3.2.2 Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa 31

3.2.3 Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 10

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mô mỏng nằm lót mặt trong của lòng mạch [1] Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chất giãn mạch quan trọng và có nhiều vai trò trong điều hòa chức năng sinh lý của mạch máu như trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu – nội mô… Tại nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxide synthase ở nội mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase) Hoạt động của enzym này được điều khiển bởi nhiều cơ chế trong đó có quá trình phosphoryl hóa eNOS [41,69] Viêm là một trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nội mạc [67] Rối loạn chức năng nội mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS và quá trình viêm đã được báo cáo trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp…[24,37] Trong những năm gần đây, sự điều hòa eNOS thông qua quá trình phosphoryl hóa đang là một mục tiêu y học triển vọng trong điều trị nhiều bệnh lý [41]

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng ) thuộc chi

Panax L., ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9]

Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thất hoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6] Đặc biệt, saponin trong các loài

thuộc chi Panax L đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp

NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa [39,73] và chống viêm [32,45,58] Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế Điều này đặt ra câu hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có những tác dụng kể trên hay

không? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) trên sự biểu

hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập” với ba mục tiêu:

1 Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên

cơ trơn cô lập của khí quản, bàng quang và thể hang

2 Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO

3 Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện của gen COX-2 và protein COX-2

Trang 11

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Tam thất hoang

Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên

khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8]

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá

Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm Lá chét 5,

có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu

đỏ Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1.1) [2]

Hình 1.1 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) [11]

1.1.2 Sinh thái và phân bố

Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng Cây mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m Tái sinh bằng hạt Ra hoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9 Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9]

Trang 12

1.1.3 Thành phần hóa học

Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [19]

Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2 saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19]

Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm lượng nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd [43]

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được

11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15] Năm 2013, nhóm tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45] Ngoài ra

3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P stipuleanatus [45]

Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự chỉ ra trong TTH ngoài saponin còn có thành phần khác như: polyacetylen, triterpenoid, tinh dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic, acid béo, acid amin và các nguyên tố

vi lượng [5,6]

Trang 13

1.1.4 Tác dụng dƣợc lý

Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 –

11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc

trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người

(HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với

giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dòng tế bào HL-60 và HCT-116 [15]

Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15,

hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất

từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự

biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2 (cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45]

Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol

ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thông qua kích

hoạt quá trình apotosis của tế bào [46]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: Cao TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở các mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao saponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl dialdehyd Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều LD50 = 8,8 g/kg [5]

Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả

TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11]

1.1.5 Công dụng

Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an

thần” TTH có tác dụng tán ứ, định thống Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma

Panacis Stipuleanati [2]

Trang 14

1.2 Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS

1.2.1 Nội mạc mạch máu

1.2.1.1 Đặc điểm cấu trúc

Về giải phẫu học từ trong ra ngoài, thành động mạch có cấu tạo gồm 3 lớp áo đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mô (Hình 1.3) [3]

1.2.1.2 Chức năng của nội mạc mạch máu

Nội mạc mạch máu có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lưu thông dòng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hòa các quá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội môi [30] Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52]

Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm soát sự di chuyển của các chất hòa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dòng máu với các

mô xung quanh [27,30] Irie và Tavassoli gọi đó là hàng rào máu – mô [65] Rối loạn tính thấm nội mạc có thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết

Trang 15

Các tế bào nội mô có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), EDHF (yếu tố cường phân cực có nguồn gốc nội mô/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co mạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin, P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin

và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thực bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6)

và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin, fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóa plasminogen mô), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tố Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu tố mô), TFPI (chất ức chế con đường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch: VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor), PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor) [17,26,27,38]

Rối loạn về cấu trúc cũng như chức năng nội mạc mạch máu liên quan đến nhiều quá trình bệnh lý như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn

1987, Palmer và cộng sự đã xác định được yếu tố đó là nitric oxide (NO) [25] Ngày nay, NO được biết đến là một trong những gốc khí tự do đơn giản nhất và đóng vai trò tín hiệu trung gian quan trọng trong cơ thể [41] NO tham gia điều hòa nhiều quá trình sinh lý như sự dẫn truyền thần kinh, trương lực mạch máu, sự co cơ, kết tập tiểu cầu, chuyển hóa, đáp ứng miễn dịch, phiên mã gen và dịch mã mARN, quá trình biến đổi sau dịch mã của protein [25,69]

Trang 16

Về đặc điểm cấu trúc và tính chất, NO là một gốc khí tự do nhỏ nặng 30 Dalton, không màu và nhiệt độ nóng chảy khoảng 163,6 °C, trong cấu trúc của

NO có một electron chưa ghép cặp [25,60] NO có khả năng phản ứng với các nguyên tố kim loại chuyển tiếp để hình thành nên nitrosyl kim loại, đây là đặc tính quan trọng trong con đường tín hiệu của nó Mặt khác, NO tan kém trong nước, có thể dễ vượt qua được màng tế bào để tham gia điều hòa các quá trình sinh lý Tuy nhiên, chất này không bền có thời gian bán thải (T1/2) ngắn và bị chuyển hóa nhanh trong cơ thể [25]

Trong cơ thể NO được tổng hợp qua hai con đường: thông qua các enzym NOS (Nitric oxide synthase) hoặc từ quá trình khử của NO2- NOS là enzym xúc tác cho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O2 [69] Ở động vật có

vú, NOS có ba dạng chính, mã hóa bởi các gen riêng biệt trên nhiễm sắc thể (NST) khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1; NOS do cảm ứng (iNOS) hay NOS loại 2 và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 (Bảng 1.1) Con đường thứ hai

để hình thành NO là từ phản ứng khử NO2-, phản ứng này được tạo điều kiện bởi enzym NO2- reductase như các enzym chứa molypden (xanthin oxidase), NOS và nhiều thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử ti thể Phản ứng khử NO2- đóng vai trò quan trọng trong trường hợp thiếu oxy khi đó hoạt động của NOS bị giới hạn Trong cơ thể NO được chuyển hóa bằng quá trình oxy hóa để hình thành nên NO2-

và NO3- Quá trình này có thể tự xảy ra (autooxidation) hoặc được xúc tác Một phần NO bị bất hoạt trong stress oxy hóa, NO kết hợp với superoxid (O2-) để hình thành nên peroxynitrit (ONOO-) [25,69]

Trang 17

iNOS (Inducible NOS)

eNOS (Endothelial NOS)

Tế bào

biểu hiện

Neuron thần kinh và một số tế bào khác

Nhiều loại tế bào hệ thống miễn dịch như đại thực bào khi đáp

lipopolysaccharid (LPS), cytokin và các chất khác

Tế bào nội mô

Gen NST 12, gồm 29 exon NST 17, 26 exon NST 7, 26 exon

và ghi nhớ; kiểm soát huyết áp trung ương

Ở hệ thần kinh ngoại vi: Chất dẫn truyền thần kinh, giãn cơ trơn

và mạch

Tham gia vào sinh lý bệnh của quá trình viêm và hệ thống miễn dịch

Tham gia vào nhiều chức năng tim mạch quan trọng: Giãn mạch,

ức chế các quá trình như kết tập tiểu cầu, kết dính bạch cầu, tăng sinh của tế bào cơ trơn thành mạch

1.2.2.2 eNOS

eNOS (Endothelial nitric oxide synthase) là một trong 3 dạng của NOS NO sản xuất tại nội mô bởi eNOS là một hợp chất vận mạch quan trọng, tham gia điều hòa nhiều quá trình sinh lý đặc biệt liên quan đến chức năng tim mạch eNOS biểu hiện chủ yếu trong tế bào nội mô, ngoài ra enzym này cũng được phát hiện trong tế bào cơ tim, tiểu cầu, neuron ở não, hợp bào lá nuôi của nhau thai người và trong tế bào biểu mô ống thận LLC-PK1 [69,70]

Trang 18

Cấu trúc gen và protein

eNOS được mã hóa bởi một gen nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q35–7q36);

có cấu trúc gồm 26 exon, gen này chiếm một đoạn khoảng 21 – 22 kb [13,66,70]

Về cấu trúc, eNOS là một protein chứa 1203 acid amin, nặng 133 kDa, có dạng

homodimer gồm 2 domain (Hình 1.4) [13,70]:

- Domain reductase nằm ở đầu –COOH, chứa vị trí gắn của NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), FAD (Flavin adenine dinucleotide) và FMN (Flavin mononucleotide)

- Domain oxygenase nằm ở đầu –NH2 chứa vị trí gắn của BH4(Tetrahydrobiopterin), hem và L-arginin

- Hai domain này được gắn kết với nhau bởi một trình tự dài khoảng 30 acid amin chứa vị trí gắn của Camodulin (CaM)

Hình 1.3 Cấu trúc của eNOS (Ser: Serine; Thr: Threonin) [29]

Phosphoryl hóa eNOS

Hoạt động của eNOS được điều khiển bởi 2 cơ chế đó là cơ chế phụ thuộc

Ca2+ và không phụ thuộc Ca2+:

độ Ca2+ nội bào tăng, tạo điều kiện cho CaM gắn được vào vị trí của nó trên eNOS CaM là protein đầu tiên tương tác với eNOS, sự gắn của CaM làm dịch chuyển điện

tử từ NADPH ở domain reductase đến hem ở domain oxygenase thông qua FAD và FMN Tại vị trí hem các điện tử được dùng để khử và hoạt hóa O2 từ đó oxi hóa L-arginin thành L-citrullin và NO Các yếu tố thiết yếu cần cho eNOS chức năng bao gồm L-arginin, Fe, BH4, NADPH, FAD và FMN [69]

Phosphoryl hóa eNOS: Phosphoryl hóa eNOS là một biến đổi sau dịch mã,

được điều khiển bởi hệ thống các kinase, phosphatase và tương tác protein – protein

và đây là một trong những cơ chế tham gia điều khiển eNOS Mặc dù hoạt động của

Trang 19

cho sự điều hòa hoạt động của enzym này Sự gắn của CaM và sự dịch chuyển của dòng các điện tử từ domain reductase đến domain oxygenase của enzyme cũng phụ thuộc vào sự phosphoryl hóa và khử phosphoryl hóa eNOS [41] Các nghiên cứu chỉ ra rằng, sự phosphoryl hóa eNOS xảy ra tại Serin (Ser) và ở một mức độ thấp hơn trên Tyrosin (Tyr) và Threonin (Thr) Ở người, phosphoryl hóa Ser1177, Ser617

và Ser633 làm kích hoạt eNOS trong khi phosphoryl hóa tại Thr495 và Ser114 làm giảm chức năng eNOS Sự phosphoryl hóa eNOS có thể được điều hòa bởi nhiều yếu tố như “shear stress”, yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu (VEGF), bradykinin, insulin, estrogen… làm hoạt hóa các enzym khác nhau như serin/ threonin kinase Akt, CaMKII (Ca2+/ calmodulin dependent protein kinase II), AMPK (AMP-activated protein kinase), PKA (protein kinase A) và gây phosphoryl hóa eNOS tại các vị trí khác nhau (Hình 1.5) [29,34,41]

Ngoài ra, hoạt động của eNOS còn được điều khiển bởi sự tương tác với các protein như Hsp90 hay Caveolin-1 Cav-1 (Caveolin-1) là protein vỏ chính của caveolae tại tế bào nội mô, cav-1 gắn với eNOS và kết quả là làm bất hoạt eNOS [59] Hsp90 (Protein shock nhiệt 90) làm tăng hoạt động của eNOS theo cơ chế điều hòa dị lập thể, nghiên cứu cho thấy sự hình thành phức hợp eNOS – Hsp90 ở tế bào nội mô khi bị kích thích bởi histamin, bradykinin, yếu tố tăng trưởng nội mạc và

“shear stress” làm tăng hoạt tính của eNOS lên 3 lần [31] Sự tương tác của eNOS với

2 protein này đều là những cơ chế điều hòa hoạt tính của eNOS độc lập với Ca2+

Trang 20

Hình 1.5 Sự điều hòa các vị trí phosphoryl hóa eNOS

Các vị trí eNOS phosphoryl hóa được đánh số theo thứ tự eNOS người/ bò [41]

(VEGF: Vascular endothelial cell growth factor/ Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu; 8-Br-cAMP: 8-bromoadenosine-3’,5’- monophosphate vòng; S-1-P: sphingosine 1-phosphate; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; HDL: high- density lipoprotein/ lipoprotein trọng lượng phân tử cao; S: Serin; T: Threonin; )

1.2.2.3 Chức năng sinh lý của eNOS và NO nội mạc

a Điều hòa trương lực mạch máu

Tại nội mạc NO được tạo ra bởi eNOS làm hoạt hóa guanylyl cyclase hòa tan (sGC/ soluble guanylyl cyclase) kích hoạt con đường truyền tin cGMP (GMP vòng) sGC xúc tác cho phản ứng chuyển GTP (Guanosine-5'-triphosphate) thành cGMP là một chất truyền tin thứ hai, cGMP hoạt hóa các protein kinase G (PKG), thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa các protein kết quả là làm giảm nồng độ Ca2+

nội bào và giãn mạch (Hình 1.6) [25] Nghiên cứu cho thấy huyết áp tăng ở nhóm chuột

bị xóa bỏ gen eNOS [47]

b Ức chế sự kết dính bạch cầu và viêm mạch máu

NO kiểm soát sự biểu hiện của các gen liên quan đến xơ vữa động mạch NO làm giảm sự biểu hiện của protein hóa hướng động bạch cầu mono MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) [56], ức chế sự kết dính của bạch cầu với thành mạch bằng cách can thiệp vào khả năng gắn của các phân tử kết dính bạch cầu CD11/ CD18 (Cụm biệt hóa/ Cluster of differentiation) với bề mặt tế bào nội

mô hoặc ức chế sự biểu hiện của CD11/ CD18 ở bạch cầu Sự kết dính bạch cầu là

Trang 21

sự kiện sớm của xơ vữa động mạch do vậy NO có thể bảo vệ chống sự hình thành

xơ vữa động mạch [69] Rối loạn tính toàn vẹn của hàng rào nội mô có thể khởi

phát các sự kiện của tiền viêm NO ngăn chặn quá trình apotosis của tế bào nội mô

gây ra bởi các cytokin và các yếu tố tiền xơ vữa như oxygen hoạt tính (ROS -

reactive oxygen species) và angiotensin II Điều này có thể góp phần vào tác dụng

chống viêm và chống xơ vữa của NO được sản xuất tại nội mạc [64]

c Ức chế sự kết tập tiểu cầu

NO sản xuất trong mạch là một chất ức chế sự kết tập và kết dính tiểu cầu

vào thành mạch [68,72]

d Kiểm soát sự tăng sinh của cơ trơn mạch

NO thể hiện hoạt tính ức chế tổng hợp ADN, ức chế sự sinh sản và tăng sinh

của tế bào cơ trơn thành mạch Tác dụng này có thể thông qua trung gian cGMP

[14,51] Bên cạnh đó NO còn ngăn chặn sự giải phóng của yếu tố tăng trưởng có

nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), là chất kích thích sự tăng sinh của cơ trơn NOS cũng

quan trọng đối với sự tái tạo lại mạch máu để thích ứng với sự thay đổi dòng chảy

trong bệnh mạn tính [22]

Hình 1.6 Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội mạc [52]

Trang 22

1.2.2.4 Vai trò của eNOS phosphorayl hóa và NO trong một số bệnh lý

a Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh tim mạch mãn tính như bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não và tắc động mạch ngoại vi [16] Quá trình này được đặc trưng bởi giảm hoạt động của eNOS và sinh khả dụng của NO kèm theo đó là tăng sự biểu hiện của các phần tử kết kính như VCAM-1, ICAM-1

Ức chế eNOS đã thể hiện làm tăng tốc độ xơ vữa động mạch cho thấy NO có thể ức chế một số bước quan trọng trong quá trình xơ vữa động mạch Do vậy, eNOS có thể là một gen ứng cử viên liên quan đến xơ vữa động mạch và sự điều chỉnh hoạt tính của eNOS thông qua thay đổi sự phosphoryl hóa eNOS đang được quan tâm

đáng kể vì những vai trò sinh lý bệnh của nó [41]

b Nhồi máu cơ tim

Nghiên cứu cho thấy, trong nhồi máu cơ tim mãn tính kích thước vùng nhồi máu ở chuột bị loại bỏ eNOS không thay đổi nhưng mật độ mao mạch ít hơn, phì đại tăng lên đi kèm với huyết áp tâm thu tăng, rối loạn chức năng tâm trương và tăng tỷ lệ tử vong ở chuột sau 28 ngày, điều này cho thấy vai trò có lợi của NO và eNOS trên tâm thất sau nhồi máu cơ tim [55]

c Tăng huyết áp

Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý như xơ vữa động mạch, suy tim, bệnh động mạch vành, đột quỵ NO và eNOS có vai trò quan trọng giãn mạch gây hạ áp Sự tăng huyết áp đã được quan sát thấy ở nhóm chuột bị xóa

bỏ gen eNOS [47]

d Stress oxy hóa

Stress oxy hóa là bệnh lý xảy ra do sự mất cân bằng trong sự hình thành và phá hủy các ROS Stress oxy hóa tham gia vào bệnh sinh của nhiều tình trạng bệnh

lý như dị tật tim mạch, tăng huyết áp, tiểu đường, xơ vữa động mạch, ung thư, dẫn đến rối loạn chức năng nội mô Sự sản xuất ROS liên quan đến sự bất hoạt của phân

tử tín hiệu NO dẫn đến rối loạn chức năng nội mô [41]

Bên cạnh đó, sự rối loạn trong tổng hợp NO và phosphoryl hóa eNOS còn liên quan trong nhiều bệnh lý khác như thiếu máu cục bộ, tiểu đường, rối loạn cương dương, Alzheimer Chính vì vậy, trong những năm gần đây eNOS phosphoryl hóa trở thành một mục tiêu tiềm năng trong điều trị nhiều bệnh lý [41]

Trang 23

1.3 Tổng quan về viêm và COX-2

1.3.1 Viêm và prostaglandin trong viêm

Viêm vừa là phản ứng mang tính chất bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm có thể gây ra các tổn thương, hoại tử hay rối loạn chức năng cơ quan [4] Phản ứng viêm được đặc trưng bởi sự tăng tính thấm của thành mạch, giãn mạch và kèm theo sự xuyên mạch của bạch cầu, dẫn đến những dấu hiệu kinh điển là sưng, nóng, đỏ, đau Quá trình này có sự tham gia của nhiều chất trung gian có hoạt tính như histamin, bradykinin, prostaglandin, leucotrien Trong đó, prostaglandin (PG) là một trong những yếu tố đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng viêm [3]

PG và thromboxan A2 (TXA2) được gọi chung là prostanoid, là các chất được hình thành từ acid arachidonic (AA), một acid béo không bão hòa được giải phóng từ phospholipid màng tế bào nhờ enzym phospholipase A2 Acid arachidonic được oxi hóa bởi cyclooxygenase (COX) hay còn được gọi là prostaglandin G/H synthase để hình thành nên PGG2 và sau đó là PGH2 PGH2 không bền bị chuyển hóa bởi các enzym prostaglandin synthase để tạo nên các PG khác nhau (Hình 1.7)

Có 4 PG hoạt tính sinh học chủ yếu được tạo ra trong in vivo đó là: prostaglandin E2

(PGE2), prostacyclin (PGI2), prostaglandin D2 (PGD2) và prostaglandin F2α (PGF2α) [33,61] Trong đó, PGE2 đóng vai trò quan trọng trong viêm vì nó tham gia vào tất

cả các quá trình dẫn đến các dấu hiệu kinh điển của viêm Cụ thể, PGE2 gây giãn mạch, làm tăng dòng máu đến mô viêm, đồng thời cùng với các chất trung gian của quá trình viêm như histadin, bradykinin, leucotrien,PGE2 làm tăng tính thấm của thành mạch gây thoát dịch và kết quả đỏ và sưng xuất hiện Đau là kết quả PGE2làm tăng nhạy cảm của các sợi thần kinh cảm giác ngoại vị và trung ương ở não và tủy sống dẫn đến tăng cảm giác đau Cuối cùng, PGE2 được xem như một chất trung gian gây sốt Trong viêm, các PG còn làm khuếch đại các phản ứng viêm bằng cách tăng cường và kéo dài các tín hiệu gây ra bởi các chất tiền viêm [21,36]

Sự sản xuất của PG phụ thuộc nhiều vào hoạt tính của enzym COX Enzym này có 2 dạng chính là COX-1 (cyclooxygenase - 1) và COX-2 (cyclooxygenase – 2) COX-1 được biểu hiện cơ định trong nhiều loại tế bào lành của cơ thể, tham gia sản xuất các PG cần cho tác dụng sinh lý bình thường của một số cơ quan như tăng tiết chất nhầy ở dạ dày, kết tập tiểu cầu, tăng sức lọc cầu thận thận Ngược lại, COX-2 là một enzym cảm ứng, nó không biểu hiện hoặc chỉ biểu hiện ở mức độ rất

Trang 24

yếu tố tăng trưởng sự biểu hiện của COX-2 tăng lên đáp ứng để tạo ra các PG gây viêm và tham gia vào bệnh lý viêm Chính vì vậy, COX trở thành đích phân tử của các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs - Non-steroidal anti-inflammatory drugs) và các NSAIDs tác dụng chọn lọc trên COX-2 đang là xu hướng nghiên cứu hiện nay [44]

Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin [33]

prostaglandin synthase khác nhau gồm TxAS, PGDS, PGES, PGIS và PGFS)

1.3.2 COX – 2

COX-2 là một trong 2 dạng chính của COX Enzym này xúc tác cho hai bước đầu tiên trong con đường tổng hợp PG [36] Ở người, gen mã hóa cho COX-2 nằm trên NST số 1, kích thước nhỏ khoảng 8 Kb với 10 exon [35,63] COX-2 là enzym cảm ứng, đáp ứng chủ yếu để sản xuất các PG trong viêm Sự tăng biểu hiện của COX-2 đã được quan sát thấy trên các mô hình viêm khớp ở động vật cũng như trong hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp [36,75]

Trang 25

1.3.2.1 COX-2 trong một số bệnh lý

a Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là sự tích tụ của cholesterol dưới lớp áo trong động mạch gây ra hẹp, loét, xơ cứng lòng mạch Đây là nguyên nhân của một số bệnh lý như hội chứng mạch vành cấp, đột quỵ, thiếu máu cục bộ Quá trình viêm xảy ra bên trong các mảng xơ vữa đóng góp cho bệnh sinh của bệnh [35] Một số nghiên cứu cho thấy, enzym COX-1 xuất hiện trong cả động mạch bình thường và động mạch

xơ vữa trong khi COX-2 chỉ được tìm thấy trong các động mạch xơ vữa Trong mảng xơ vữa, COX-2 được biểu hiện bởi nhiều loại tế bào như tế bào đại thực bào, bạch cầu mono, tế bào nội mô Enzym này có thể tham gia vào xơ vữa động mạch theo nhiều cơ chế liên quan đến một số quá trình như hoạt hóa các chất hóa hướng động, sản xuất của các cytokin gây viêm, biến đổi tính thấm của thành mạch [28] Nghiên cứu trên chuột cũng cho thấy, celecoxib một chất ức chế chọn lọc COX-2 có thể ngăn chặn sự tiến triển của tổn thương mảng xơ vữa [54] Từ đó, có thể thấy được vai trò của viêm và COX-2 trong xơ vữa động mạch Tuy nhiên, các chất ức chế chọn lọc COX-2 cũng có thể gây ra bất lợi trong sự ổn định của mảng xơ vữa và

do vậy làm tăng nguy cơ biến cố tim mạch và tử vong [35]

b Sinh mạch và ung thư

Sinh mạch là sự hình thành các mạch máu mới trên nền các mạch máu cũ, xảy

ra trong suốt quá trình phát triển của phôi thai, sinh mạch cũng tham gia vào bệnh sinh nhiều rối loạn đặc biệt là ung thư Các báo cáo chỉ ra rằng, các chất trung gian gây viêm (như PGE2, CRP, IL-6, TNFα) tăng trong ung thư [23,35] Sự tăng tổng hợp PGE2 và tăng biểu hiện của COX-2 nhưng không phải là COX-1 cũng đã được quan sát thấy trong mô ung thư đại trực tràng khi so sánh với mô lành [48,71] Ngoài ra, cả hai loại NSAIDs tác dụng không chọn lọc và chọn trên COX-2 đã thể hiện hoạt tính

ức chế sự sinh mạch và tăng sinh của khối u trên mô hình động vật [50] Từ đó có thể gợi ý được vai trò quan trọng COX-2 trong sự tiến triển của ung thư [23,35]

c Suy thận

Các PG đặc biệt là PGE2 và PGI2 đóng vai trò quan trọng trong chức năng thận người trưởng thành PG gây giãn mạch thận; ức chế sự tái hấp thu natri ở ống thận; kiểm soát sự giải phóng renin và phát triển thận ở giai đoạn bào thai Ở thận vai trò của COX-2 trong tổng hợp PG khá phức tạp, tham gia cho đáp ứng cả chức năng sinh lý và bệnh lý Nghiên cứu cho thấy, trong suy thận, nồng độ của mARN

Định dạng
Số trang	51
Dung lượng	2,12 MB