Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen từ phân đoạn dicloromethan của Nấm cổ cò - ganoderma flexipes pat., họ ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐẶNG THỊ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOR

Trang 1

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐẶNG THỊ QUỲNH

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN CỦA NẤM CỔ CÒ

- GANODERMA FLEXIPES PAT.,

HỌ GANODERMATACEAE THU HÁI

TẠI TÂY NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2019

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐẶNG THỊ QUỲNH

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN

CỦA NẤM CỔ CÒ - GANODERMA FLEXIPES PAT., HỌ

GANODERMATACEAE THU HÁI TẠI TÂY NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa : QH.2014.Y Người hướng dẫn: 1 TS Nguyễn Thị Duyên

2 TS Nguyễn Hữu Tùng

Hà Nội - 2019

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen

từ phân đoạn diclomethan của Nấm cổ cò - Ganoderma flexipes Pat., họ

Ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên” là kết quả cho qúa trình học tập, rèn luyện của em tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực tập tại Khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của quý thầy cô, gia đình và bạn bè

Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

TS Nguyễn Thị Duyên - Khoa Hóa Thực Vật - Viện Dược liệu, TS Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn em hoàn thành đề tài khóa luận này

Lãnh đạo, thầy cô công tác tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

đã giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện để em được học tập, nghiên cứu tại Khoa trong suốt 5 năm học qua

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Dược liệu, đặc biệt là các cán bộ, nhân viên tại khoa Hóa Thực vật đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua

Dù đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ từ nhiều nguồn nhưng vì kiến thức cũng như thời gian còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự thông cảm và những ý kiến đóng góp của quý thầy cô, bạn bè để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019

Sinh viên Đặng Thị Quỳnh

Trang 4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Các phương pháp sắc ký

CC Column Chromatography Sắc ký cột thường

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

Các phương pháp phổ

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscop

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

DEPT Distortionless Enhancement

HSQC Heteronuclear Single

Quantum Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

UV-Vis Ultra Violet - Visible Phổ tử ngoại

Các loại dung môi, phân đoạn dịch chiết

DL/DM Dược liệu/Dung môi

DNCC Phân đoạn diclomethan của nấm Cổ cò

ENCC Phân đoạn etyl acetat của nấm Cổ cò

EtOAc Etyl acetat

Trang 5

CAT Enzyme Catalase

DNA Deoxyribonucleic acid

ED50 Effective dose 50% Liều có hiệu quả ở 50%

động vật thí nghiệm ERK Extracellular signal - regulated

HIV Human immunodeficiency virus

HSV Virus herpes simplex

IC50 Half maximal inhibitory

RNA Ribonucleic acid

ROS Reactive oxygen species Gốc tự do oxy hóa

SOD Superoxide dismutase Enzyme xúc tác quá trình

phân hủy superoxide

Trang 6

Bảng 1.4 Một số sterol phân lập từ chi Ganoderma 9

Bảng 1.5 Kết quả tra cứu tài liệu tham khảo tính

đến tháng 7/2018

17 Bảng 3 Dữ liệu phổ của 2 hợp chất NCC03 và NCC06 31

Trang 7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của Triterpen nhóm I 6

Hình 1.2 Cấu trúc của Triterpen nhóm II 7

Hình 1.3 Cấu trúc của Triterpen nhóm III 8

Hình 1.4 Nấm cổ cò – Ganoderma flexipes Pat., thu tại Tây

Nguyên

16

Hình 2 Nguyên liệu nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes Pat 19

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn nấm Cổ cò 24

Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC cao tổng và các cao phân đoạn

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC03 30

Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC06 31

Trang 8

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chi Ganoderma 3

1.1.1 Vài nét về thực vật của chi Ganoderma 3

1.1.2 Thành phần hóa học 4

1.1.2.1.Triterpen/ Triterpenoid 4

1.1.2.2.Sterol 9

1.1.2.3.Polysaccharit 9

1.1.3 Tác dụng sinh học 10

1.1.3.1.Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư 10

1.1.3.2.Tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ gan 12

1.1.3.3.Tác dụng kháng virut 13

1.1.3.4.Tác dụng kháng vi khuẩn, kháng nấm 13

1.1.3.5.Tác dụng trên hệ thần kinh 14

1.1.3.6.Tác dụng khác 15

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu - Nấm Cổ cò 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Hóa chất, thiết bị 19

2.2.1 Hóa chất, dung môi 19

2.2.2 Thiết bị 19

Trang 9

2.3 Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh

khiết 20

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập 20

2.3.2 Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Chiết các phân đoạn nấm Cổ cò và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn diclomethan 24

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn nấm Cổ cò 24

3.1.2 Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn diclomethan của nấm Cổ cò 26

3.1.3 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết 27

3.2 Biện luận cấu trúc 2 hợp chất NCC03 và NCC06 28

3.2.1 Hợp chất NCC03 28

3.2.2 Hợp chất NCC06 30

3.3 Bàn luận 32

3.3.1 Về chiết xuất 32

3.3.2 Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc hợp chất 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

1 Kết luận 35

2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 10

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự tiến bộ của khoa học – kỹ thuật, xu hướng quay về với thiên nhiên, tìm về những phương thuốc truyền thống dân gian ngày càng được quan tâm, phát triển Dược thảo thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quan trọng trong phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ Trong đó, việc tìm ra loại dược liệu

có nguồn gốc thiên nhiên để chữa các bệnh hiểm nghèo trên cơ sở khoa học có

ý nghĩa vô cùng to lớn [10]

Nấm Linh chi là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền Với thành phần hóa học có chứa polysaccharit (giàu β-glucan), triterpenoid, steroid, saponin…, nấm Linh chi được ghi nhận có tác dụng phòng chống ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, giải độc gan, hỗ trợ điều trị tiểu đường, giảm cholesterol trong máu… Chính vì thế, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi trong phòng ngừa và điều trị bệnh là rất lớn, không chỉ ở Việt Nam, mà còn ở nhiều nơi trên thế giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,…[9]

Theo cuốn Nấm linh chi - Tài nguyên dược liệu quý ở Việt Nam của Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, nước ta có khoảng trên 80 loài nấm Linh chi, chiếm khoảng 1/3 số loài trên thế giới với không ít loài mới, đặc hữu [7] Riêng

ở Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh thuộc khu vực Tây Nguyên, chi Ganoderma có

ít nhất là 25 loài, trong đó 10 loài có tác dụng dược liệu như Ganoderma

tornatum, Ganoderma amboinense, Ganoderma gibbosum, Ganoderma capense, Ganoderma lobatum, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum,

Ganoderma flexipes, Ganoderma tropicum, Ganoderma cochlear, các loài còn

lại chưa biết rõ ý nghĩa [6] Do đó, nghiên cứu tài nguyên nấm Linh chi ở Việt Nam sẽ là một công trình có ý nghĩa và mang lại hiệu quả to lớn cho người trồng nấm Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu (cả trong và ngoài nước) về chi

Ganoderma mới chỉ dừng lại trên đối tượng Ganoderma lucidum Trong khi

cũng được công bố là một trong số 10 loài có tác dụng dược liệu tại Vườn Quốc

gia Kon Ka Kinh, nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes lại chưa được nghiên cứu

về thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng

Vì vậy, để góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của Ganoderma

flexipes, em thực hiện đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất

lanostan triterpen từ phân đoạn dicloromethan của nấm Cổ cò -

Trang 11

2

Ganoderma flexipes Pat., họ Ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên” với

2 mục tiêu cần đạt được:

1 Chiết xuất và phân lập một số hợp chấttừ phân đoạn dicloromethan

2 Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn

Trang 12

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Ganoderma

1.1.1 Vài nét về thực vật của chi Ganoderma

Chi Ganoderma thuộc họ Ganodermataceae Donk, trong tất cả, có 219

loài trong họ đã được gán cho chi này [13], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ [5] Ở Việt Nam, theo GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt, có khoảng 80 loài, phân bố rộng, đặc biệt vùng nhiệt đới [3] Riêng trong hệ sinh thái của vườn Quốc gia Kon Ka Kinh ở Tây Nguyên nước ta đã định danh được 25 loài nấm thuộc chi này [6] Các loài nấm thuộc chi

Ganoderma đa số sinh trưởng và phát triển dưới tán rừng ở sinh cảnh rừng lá

rộng thường xanh là chủ yếu, tiếp theo là một số sinh cảnh khác như rừng lá rộng bán thường xanh, rừng hỗn giao lá rộng lá kim, rừng hỗ giao tre nứa Đa

số các loài xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 12 trong năm [6]

Vị trí phân loại của chi Ganoderma Karst

Theo hệ thống phân loại của P Karsten (1881) chi Garnoderma Karst

Chi Ganoderma Karst [3]

Đặc điểm của chi Ganoderma Karst:

Quả thể có cuống hoặc không cuống, mọc trên gỗ Mũ nấm bóng láng thường dạng thận hay quạt có khi tròn Thịt nấm màu nâu chất gỗ đến chất bì dai Ống nấm đa số một tầng, một số ít hai tầng Bào tử có dạng hình trứng nhụt một đầu, vỏ bào tử gồm hai lớp, lớp ngoài nhẵn lớp trong có gai nhẹ có màu vàng gỉ sắt [6] Tuy nhiên,các đặc điểm hình thái có thể thay đổi do, ví dụ, sự khác biệt trong canh tác ở các vị trí địa lý khác nhau trong các điều kiện khí hậu khác nhau và sự phát triển di truyền tự nhiên (đột biến, tái tổ hợp) của từng loài [13]

Trang 13

4

1.1.2 Thành phần hóa học

Ngoài gần 90% là nước trong đặc trưng của tất cả các loại nấm, 10%

khối lượng còn lại của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm: protein (10 - 40%),

carbohydrate (3 - 28%), chất béo (2 - 28%), chất xơ (3 - 32%), vitamin và khoáng chất.Người ta đã xác nhận rằng protein có nguồn gốc từ nấm có chứa tất cả các axit amin thiết yếu và chúng đặc biệt giàu lysine và leucine Tuy nhiên, nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong các loại nấm khác nhau của

chi Ganoderma là triterpen và polysaccharit (Boh và cộng sự, 2007) [35]

1.1.2.1 Triterpen/ Triterpenoid

Terpen là một nhóm các hợp chất xuất hiện trong tự nhiên, có bộ xương carbon bao gồm một hoặc nhiều đơn vị isopren Terpen bao gồm bốn nhóm: (a) mono- và sesquiterpen dễ bay hơi (tinh dầu) (C10 và C15), (b) diterpen ít bay hơi (C20), (c) triterpen và sterol (C30) và (d) ) các sắc tố caroten (C40) Hầu hết các nghiên cứu về nấm Linh chi liên quan đến các dạng triterpene và sterol

ít bay hơi hơn [13]

Triterpen là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren [13] Hàng trăm hợp chất triterpen đã được phân lập từ chiết xuất methanol, ethanol, acetone và chloroform của bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của các loại nấm

Linh chi, đặc biệt là loài G.lucidum [36]

Kubota lần đầu tiên phân lập được axit ganoderic A và axit ganoderic B

từ Ganoderma lucidum (FR.) KARST năm 1982. Kể từ đó, hơn 316 triterpen

đã được phân lập từ cơ thể đậu quả, bào tử, và sợi nấm của nhiều loại nấm Linh

chi trong chi Ganoderma [46]

Cấu trúc hóa học của triterpen dựa trên lanostane, là một chất chuyển hóa của lanosterol, thông thường chúng có hai nhóm cụ thể được xác định là ganoderic (C30) và axit lucidenic (C27) Theo nghiên cứu của Cole R J và Schweikert M A đã có hơn 130 hợp chất là dẫn xuất của lannosterol (acid ganoderic, ganoderiol, ganolucidic, các lucidon, acid lucidenic, ) được phân lập từ phân đoạn không phân cực chiết xuất từ nấm Linh chi Các triterpen tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -OAc; -O- (eter); C=O; nối đôi C=C Cấu trúc hóa học của nó rất phức tạp và bị oxy hóa cao Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan

Trang 14

5

tốt trong eter dầu hỏa, n-hexan, diethyl ether, cloroform), ít tan trong nước

ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [2]

Các triterpen phân lập từ chi Ganoderma được phân thành từng nhóm

khác nhau theo 3 cấu trúc chính dưới đây

Trang 15

6 Hình 1.1 Cấu trúc của Triterpen nhóm I [1]

Bảng 1.1 Một số triterpen nhóm I phân lập được từ chi Ganoderma

3 Acid

lanosta-3β,15α,22β-triacetoxy-26-oic

7,9(11),24-trien-OAc

β-OAc

α-OAc

Trang 16

7

Hình 1.2 Cấu trúc của Triterpen nhóm II [1]

Bảng 1.2 Một số triterpen nhóm II phân lập được từ chi Ganoderma

COOH G lucidum [1]

2 Acid lucidenic C β-OH β-OH β-OH Me

3 Acid 20-hydroxylucidenic N β-OH β-OH H OH COOH G lucidum

5 20-hydroxylucidenic acid A O OH β-OH COOH G sinense [39]

Trang 17

8 Hình 1.3 Cấu trúc của Triterpen nhóm III [1]

Bảng 1.3 Một số triterpen nhóm III phân lập được từ chi Ganoderma

gốc

TLTK

1

Acid ganoderic α β-OH O O

β-OAc β-OH α-Me O H COOH Me

G

lucidum

[17]

2

Acid ganoderic H β-OH O O

3 Acid ganoderic V O α-OH H H α-OAc α-Me H Δ24-25 Me COOH

[1]

4 Acid ganoderic W α-OAc α-OH H H α-OAc α-Me H Δ24-25 Me COOH

Trang 18

9

1.1.2.2 Sterol

Gần đây, Fa – Huan Ge và cộng sự (2017) lần đầu tiên phân lập được từ dầu bào tử nấm Linh chi thu được bằng chiết xuất CO2 siêu tới hạn một sterol, Ganoderin A, được chứng minh là cấu trúc trước đây chưa từng có [19]

Dưới đây là một số sterol đã được phân lập và xác định từ chi

5α-G.annulare [43]

4 ergosta-6,22-dien-3β-ol

5,8-epidioxy-5α,8α-G.annulare [43]

1.1.2.3 Polysaccharit

Polysacchrit của linh chi là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa dạng

và phức tạp [10] Cho đến nay, hơn 200 polysaccharit đã được phân lập từ bào

tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của chi Ganoderma (Huie và Di, 2004) Nhưng

polysaccharit chỉ gồm 2 loại chính và tỉ lệ các thành phần có trong mỗi loại như sau: GL – A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Glactan, còn GL – B có thành phần chính là Glu, nên gọi là Glucan [35] Theo các báo cáo trước đây,

các polysacharit của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm glucan, galactan và/hoặc

các heteropolysaccharit khác bao gồm một số monosaccharit như glucose, galactose, mannose và fucose [50] Hầu hết các GPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharit, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100.000

- 1.000.000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM) Một phần

Trang 19

10

polysaccharit phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng [2]

1.1.3 Tác dụng sinh học

Từ thời xa xưa, trong các tài liệu y học cổ đã ghi nhận nhiều tác dụng

bảo vệ sức khỏe của nấm Linh chi đối với cơ thể Ngày nay, khi nền khoa học hiện đại ngày càng phát triển, đặc biệt là lĩnh vực phân tử học và dược lý dược lâm sàng, hàng trăm những công trình nghiên cứu đã công bố, một lần nữa khẳng định tính năng, công dụng của loài thảo dược quý này Kết quả của các

nghiên cứu khoa học này cho rằng tác dụng sinh học của chi Ganoderma chủ

yếu do triterpen và polysaccharit đem lại

1.1.3.1 Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư

Tác dụng chống ung thư của các loài nấm Linh chi đã và đang được quan tâm, nghiên cứu và ứng dụng nhiều Nhiều cơ sở khoa học về tác dụng này của

nó đã được công bố

Axit ganoderic T (GA-T) gây ra sự giảm sự tăng sinh của một số tế bào ung thư Nó có độc tính tế bào cao hơn đối với dòng tế bào ung thư phổi 95-D

so với các dòng tế bào bình thường Khả năng tồn tại của các tế bào 95-D đã bị

ức chế 70% ở liều 50 μg/mL trong 24 giờ bởi GA-T GA-T ở nồng độ thấp cũng

có thể ức chế mạnh sự hình thành các khuẩn lạc tế bào 95-D Chen và cộng sự chứng minh rằng GA-T ức chế thành công sự xâm lấn tế bào ung thư trong ống

nghiệm và di căn trong thí nghiệm in vivo, do đó GA-T có thể hoạt động như

một loại thuốc tiềm năng để điều trị ung thư [45]

Gao và cộng sự đã nghiên cứu các tác dụng chống độc in vivo của

ganoderiol F, cho thấy hoạt động mạnh nhất trong xét nghiệm độc tế bào Nó được dùng cho chuột mang tế bào ung thư biểu mô tế bào phổi (LLC) của Lewis với ba liều 5, 10 và 20 mg/kg/ngày Ganoderiol F ức chế đáng kể sự phát triển khối u Trong khi đó, không có tác dụng phụ hoặc độc hại rõ ràng nào được nhận thấy [15]

Su và cộng sự (2000) đã kiểm tra hoạt động gây độc tế bào của lanostan

từ G tsugae và tìm thấy hoạt động chống lại ba dòng tế bào ung thư Lanostan

và một steroid từ G tsugae đã gây chết tế bào do apoptosis và cho rằng đó là

Trang 20

11

sterol sở hữu hoạt động ức chế chu kỳ tế bào (Gan và cộng sự, 1998a) Gonzalez

và cộng sự (2002) cũng đã quan sát thấy apoptosis trong các tế bào ung thư

bạch cầu ở người tiếp xúc với ba lanostanoid phân lập từ G.concinna Ngược lại, ba triterpen từ G concinna đã ức chế DNA polymerase của bê và chuột có

liên quan đến sửa chữa DNA, tái tổ hợp và sao chép DNA (Mizushina và cộng

sự, 1999) [38]

Triterpen được coi là tác nhân chống ung thư tiềm năng do hoạt động chống lại các khối u đang phát triển (Lin và cộng sự, 2003): chúng gây độc tế bào trực tiếp chống lại các tế bào khối u (Gonzalez và cộng sự, 2002) [38]

Polysacharit phân lập từ chi Ganoderma làm tăng phản ứng miễn dịch

chống khối u bằng cách thúc đẩy hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên và tế bào lympho T gây độc tế bào [37] Ngoài ra, các nó cũng được công nhận để cải thiện sự biểu hiện của phức hợp tương hợp mô, chủ yếu trong dòng tế bào

u ác tính, giúp cải thiện quá trình trình diện kháng nguyên và do đó kích thích kháng virut và ung thư [44] Polysaccharit thường không tác động trực tiếp gây đến độc tế bào trong các tế bào khối u, nhưng tác động đến các hoạt động chống khối u thông qua việc tăng cường miễn dịch qua trung gian của vật chủ [15]

Theo các nghiên cứu mới nhất của Wiater và cộng sự, các α- D -glucan

được phân lập từ G lucidum thể hiện hành động gây độc tế bào liên quan đến

các tế bào ung thư HeLa biểu mô ở người [42]

Một số nghiên cứu in vivo đã chứng minh rằng polysaccharit (β D glucan, heteropolysaccharit và glycoprotein) được phân lập từ Ganoderma có

-hoạt tính chống khối u sarcoma 180 ở chuột Sự kích thích của hệ thống miễn dịch, được trung gian bởi các polysaccharit, có thể là cơ chế chính giải thích cho khả năng chống khối u của nấm Linh chi Trong số rất nhiều polysaccharit, β- D -glucan chịu trách nhiệm chính cho các hiệu ứng chống độc [48]

Isocitrate dehydrogenase (IDH) là một trong những enzyme quan trọng trong chu trình acid tricarboxylic, và đột biến IDH có liên quan đến nhiều bệnh ung thư Bằng phương pháp sàng lọc phối tử ảo, phát hiện rằng sterol có tiềm năng ức chế IDH1 Như vậy, phát hiện của Zheng M và cộng sự nhấn mạnh

rằng hợp chất sterol từ Ganoderma sinense có thể có tiềm năng lâm sàng trong

các liệu pháp khối u như một chất ức chế hiệu quả của IDH1 đột biến [51]

Trang 21

12

Hexokinase 2 (HK2), một enzyme giới hạn tốc độ trong bước đầu tiên của con đường glycolysis HK2 cung cấp một mục tiêu mới cho điều trị ung thư do vai trò then chốt của nó trong quá trình khối u và di căn khối u Việc sàng lọc phối tử ảo dựa trên cấu trúc trong một cơ sở dữ liệu nhỏ các sản phẩm

tự nhiên đã dự đoán rằng một steroid mới, (22E, 24R) -6β-methoxyergosta-7,9

(11), 22-triene-3β, 5α-diol từ Ganoderma sinense có ái lực liên kết cao với HK2 Kết quả nghiên cứu in vitro của Bao F và cộng sự đã khẳng định rằng

sterol này là chất ức chế HK2 tự nhiên đầu tiên, nó có thể được coi là một ứng

cử viên thuốc tiềm năng nhắm mục tiêu tại HK2 để điều trị ung thư [12]

Ngai và cộng sự đã phân lập được một lectin từ G capense thể hiện hoạt

động giảm thiểu mạnh đối với tế bào lách chuột và hoạt động chống tăng sinh đối với các tế bào ung thư bạch cầu và tế bào gan trong ống nghiệm [36]

1.1.3.2 Tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ gan

Trong số các thành phần hóa đã được phân lập và xác định của chi

Ganoderma thì terpen được chứng minh là phần có hoạt tính chống oxy hóa

cao nhất [15] Sự gia tăng các enzym chống oxy hóa chủ yếu được đóng góp bởi axit ganoderic Nó có thể kích hoạt yếu tố hạt nhân erythroid 2 liên quan đến yếu tố 2 (Nrf2), từ đó khởi đầu sự biểu hiện của các gen chống oxy hóa (SOD, CAT và GPx) và do đó tăng cường nồng độ enzyme chống oxy hóa (Ko

và cộng sự 2008) [29]

Trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, Chu cùng cộng sự (2012) suy ra rằng do sự hiện diện của lanostan triterpen có thể góp phần vào việc hạ lipid máu Kết quả đánh dấu gan và siêu âm bụng cho thấy lanostan triterpen

có thể cải thiện chức năng gan (bảo vệ gan) bằng cách giảm căng thẳng oxy hóa (ROS), lắng đọng lipid và do đó làm giảm tổn thương gan cũng như bình thường hóa các tình trạng bất thường khác nhau như gan nhiễm mỡ và polyp túi mật [14]

Các nghiên cứu này đã chứng minh tính chống oxy hóa, chống lão hóa

và bảo vệ gan của triterpen bằng cách kiềm chế stress oxy hóa một cách hiệu quả

Ngoài ra, tác dụng chống oxi hóa của các loài nấm Linh chi còn được chứng minh qua hoạt tính sinh học của polysaccharit Một nghiên cứu chéo

Trang 22

13

ngẫu nhiên, mù đôi đã được thực hiện giữa viên nang là dịch chiết nấm Linh chi được làm giàu polysaccharit (GL) và viên nang giả dược với 90% là tinh bột được thực hiện bởi Hui Fang Chiu và cộng sự Kết quả nghiên cứu thu được

ở các đối tượng được điều trị GL cho thấy sự giảm đáng kể mức độ của các dấu hiệu stress oxy hóa khác nhau Hơn nữa, các tổn thương gan đã được bình thường hóa khi điều trị bằng GL Do đó, nhóm tác giả đã kết luận rằng GL được làm giàu với polysaccharit có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chống oxy hóa, chống lão hóa và bảo vệ gan thông qua việc làm giảm quá mức các gốc tự do và do

đó bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại [14]

Năm 2011 Kao cùng các cộng sự báo cáo rằng β-1,3-glucan (một glucan

trọng lượng phân tử thấp) được phân lập từ G lucidum có thể tăng đáng kể

(40% - 80%) khả năng sống sót của dòng tế bào đại thực bào bạch cầu đơn nhân chuột (RAW 264,7) với stress oxy hóa do H2O2 gây ra, và giảm sự hình thành các loại gốc tự do oxy hóa (ROS) [27]

1.1.3.3 Tác dụng kháng virut

HIV là virut gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) Phương pháp điều trị hiện tại cho HIV là hoãn sự phát triển của AIDS Một số triterpen của các loài nấm Linh chi (ganoderic acid beta, lucidumol B, ganodermanondiol, ganodermanontriol và ganolucidic acid A) đã được chứng minh là có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở người, với giá trị IC50 là 20-

90 microM [32] Hai terpen: axit lucidenic O và lucidenic lactone, đã ức chế men sao chép ngược loại 1 của HIV [36] Nhiều nghiên cứu vẫn cần được thực hiện để tạo cơ sở cho việc khẳng định các loài nấm Linh chi là tác nhân chống HIV, tuy nhiên triterpen dường như vẫn là nhóm hợp chất chính có tác dụng chống HIV [15]

Một số nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng polysacharit của Ganoderma

lucidum hòa tan trong nước đã ức chế đáng kể virut herpes simplex HSV-1 và

HSV-2 [28]

1.1.3.4 Tác dụng kháng vi khuẩn, kháng nấm

Heleno và cộng sự báo cáo rằng chiết xuất methanol của nấm Linh chi cho thấy hoạt động chống lại Staphylococcus aureus và Bacillus cereus cao hơn

Trang 23

14

so với kháng sinh ampicillin và streptomycin, trong khi Staphylococcus aureus

và Bacillus cereus là những vi khuẩn nhạy cảm nhất Nồng độ ức chế tối thiểu nằm trong khoảng 0,0125-0,75 mg/mL và nồng độ diệt khuẩn là 0,035-1,5 mg/mL [22] Như vây, polysaccharit cho thấy hoạt động kháng khuẩn, ức chế

sự phát triển của vi khuẩn hoặc gây ra cái chết của vi khuẩn gây bệnh Tuy nhiên, các cơ chế hoạt động chống vi khuẩn của nấm Linh chi vẫn chưa được xác định rõ ràng [15]

Các hợp chất sterol của G.applanatum, được tìm thấy có hoạt tính phổ

kháng khuẩn rộng và tác dụng diệt khuẩn [15] Ganomycins A và B từ

G.pfeifferi thể hiện hoạt động chống lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương

[34]

Ngoài ra, Wang và cộng sự đã phân lập được protein kháng nấm 15 kDa,

được xác định là ganodermin, từ G.lucidum [45]

1.1.3.5 Tác dụng trên hệ thần kinh

Stress oxy hóa là một lý do cho sự tiến triển của nhiều bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Parkinson, bệnh Huntington, bệnh xơ cứng teo cơ và bệnh Alzheimer (AD) Một trong những cách tiếp cận để điều trị AD là kiểm soát chức năng của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine trong não thông qua việc

ức chế acetylcholinesterase (AChE) Zhang và cộng sự đã báo cáo rằng hỗn

hợp các hợp chất triterpen trong G.lucidum thúc đẩy sự tồn tại của tế bào thần

kinh và giảm mệt mỏi Và người ta đã chứng minh rằng việc tiếp tục uống

G.lucidum có thể cắt giảm sự tiến triển của bệnh Alzheimer [49]

Bên cạnh đó, nghiên cứu của Huang và cộng sự cho thấy rằng polysaccharit của nấm Linh chi cũng đại diện cho một sản phẩm tự nhiên có tiềm năng lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị sớm AD Phát hiện của nhóm tác giả cho thấy polysaccharit có thể phục vụ như một tác nhân trị liệu tái tạo

để điều trị suy giảm nhận thức liên quan đến các bệnh thoái hóa thần kinh [23]

Ngoài ra, từ thời cổ đại, G.lucidum được sử dụng như một thuốc giảm

đau và có đặc tính thư giãn [15], Matsuzaki và cộng sự cũng đã báo cáo rằng chiết xuất nước giàu polysaccharit thể hiện tác dụng chống trầm cảm và giảm hành vi lo lắng ở chuột [33]

Trang 24

15

1.1.3.6 Tác dụng khác

Sterol phân lập từ nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng ức chế tổng hợp cholesterol trong ống nghiệm [28]

Nucleoside, uridine và uracil từ sợi nấm của một loài nấm Linh chi -

G.capense đã được tìm thấy có khả năng làm giảm mức độ aldolase trong huyết

thanh của những con chuột bị chứng thiếu máu thực nghiệm Adenosine cũng

đã được chứng minh là ức chế kết tập tiểu cầu [23, 39]

Như vậy, từ những bằng chứng nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm sử dụng trong y học cổ truyền từ xa xưa, các loại nấm Linh chi đã được báo cáo

là có một số tác dụng dược lý bao gồm: điều hòa miễn dịch, chống xơ vữa động mạch, chống viêm, giảm đau, giảm một số tác dụng phụ do hóa trị liệu gây ra, chống ung thư, thúc đẩy giấc ngủ, kháng khuẩn, kháng virut (HBV, HSV, cho tới HIV), bảo vệ gan, hạ lipid máu, bảo vệ tế bào thần kinh, chống dị ứng, chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do triệt để, chống lão hóa, hạ đường huyết,

hoạt động estrogen và đặc tính chống loét Điển hình là Ganoderma lucidum

hiện đã được công nhận là một chất bổ trợ thay thế trong điều trị bệnh bạch cầu, ung thư biểu mô, viêm gan và tiểu đường [13]

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu - Nấm Cổ cò

Nấm Cổ cò có tên khoa học là Ganoderma flexipes Pat., được cho là có

nguồn gốc từ Việt Nam Bằng chứng đã được trình bày trong các nghiên cứu phát sinh gen trước đây rằng đây là một loài độc lập (Cao và cộng sự, 2012; Wang và cộng sự, 2012), được tìm thấy rộng rãi trên khắp châu Á cận nhiệt đới

và nhiệt đới Cao và cộng sự (2012) đề xuất rằng Ganoderma atrum,

Ganoderma calidophilum, Ganoderma hhaiense (J.D Zhao và cộng sự, 1979)

và Ganoderma parviungulatum (J.D Zhao & X.Q Zhang, 1986) tất cả được

mô tả từ tỉnh Hải Nam, Trung Quốc của Giáo sư Ji-Ding Zhao và các đồng

nghiệp của ông là từ đồng nghĩa của G.flexipes [52]

Vị trí phân loại của Ganoderma flexipes Pat

Giới : Mycota hay Fungi Ngành : Eumycota

Ngành phu ̣ : Basidiomycotina

Trang 25

16

Lớp : Hymenomycetes Lớp phu ̣ : Hymenomycetidae

Bộ : Ganodermatales

Họ : Ganodermataceae Chi : Ganoderma Đặc điểm sinh học của Ganoderma flexipes Pat

Hình 1.4 Nấm Cổ cò – Ganoderma flexipes Pat., thu tại Tây Nguyên

a Quả thể b Bào tử c Bào tầng

Ghi chú: Thước đo tự nhiên = 2cm, thước đo hiển vi 2µm,

thước đo bào tầng = 0.5 mm Quả thể có màu nâu đỏ Mũ nấm khi non có dạng vòi, sau phát triển thành dạng quạt hay móng nhỏ Mặt trên mũ nấm có cấu trúc vòng đồng tâm và vân thớ phóng xạ Mép mũ tà, ít lượn sóng và không chia thùy Bề mặt mũ nấm gồ ghề, có màu nâu đỏ Kích thước quả thể khoảng 1,5-10 x 1,0-7,0 cm; dày 0,5-1,0 cm

Thịt nấm chất lie cứng, khi non màu trắng, sau đó chuyển sang màu nâu

Hệ sợi dimitric gồm sợi không vách ngăn ngang và sợi bện; kích thước

từ 1,5-7,0 µm Hệ sợi trong nuôi cấy trên môi trường thạch (môi trường thuần khiết) lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu vàng nhạt

Bào tầng dạng ống nhỏ, mỗi milimet có 4-7 ống, miệng ống nấm tròn đều Miệng ống nấm khi non màu trắng, khi già chuyển sang màu vàng nhạt

Trang 26

Nấm phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy nhân tạo

Nấm mọc trên gốc cây sống hoặc đã chết của nhiều loài cây gỗ, đây là loài phân bố rộng ở các tỉnh Tây Nguyên [3, 52]

Tình hình nghiên cứu về nấm Cổ cò

Khi tiến hành tra cứu trên ba trang Website: Sciencedirect,

ncbi.nlm.nih.gov và Scifinder với các từ khóa là Ganoderma, Ganoderma

lucidum và Ganoderma flexipes cho kết quả như bảng 1.5

Bảng 1.5 Kết quả tra cứu tài liệu tham khảo tính đến tháng 7/2018

Từ khóa Sciencedirect ncbi.nlm.ih.gov Scifinder

Ganoderma 3924 1813 20703

Ganoderma lucidum

Ganoderma flexipes

Kết quả bảng cho thấy trên chi Ganoderma có nhiều công bố và chủ yếu tập trung ở loài nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), các nghiên cứu về đối

tượng nấm Cổ cò còn rất hạn chế Hai công bố trên các website trên là:

Theo nghiên cứu của Da Yu Cheng (2012) [16] về đa dạng các loài nấm

lỗ polypore ở Trung Quốc có chú thích địa lý đã xác định loài nấm Cổ cò phân

bố vùng nhiệt đới trên xác thực vật hạt kín

Một nghiên cứu khác về đa dạng của các loài thuộc nấm gỗ họ nấm lỗ polypore dựa trên phân tích hình thái và phát sinh loài của nhóm tác giả Li Wei

Zho và cộng sự (2015) [52] đã xác định các loài Ganoderma curtisii,

Ganoderma flexipes, Ganoderma lingzhi, Ganoderma multipileum,

Trang 27

18

Ganoderma resinaceum, Ganoderma sessile, Ganoderma sichuanense và Ganoderma tropicum thuộc cùng một nhánh phát sinh (Clade A)

Các nghiên cứu trong nước của tác giả Nguyễn Phương Đại Nguyên [6]

và Trịnh Tam Kiệt [3], hai tác giả cũng chỉ có những mô tả về thực vật và phân

bố của loài nấm Cổ cò tại Việt Nam Như vậy, theo tìm hiểu của nhóm thực hiện đề tài, các nghiên cứu trong và ngoài nước về loài nấm Cổ cò còn rất hạn chế và chỉ dừng lại ở công bố về thực vật và sinh thái của loài

Trang 28

19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng của nghiên cứu là cơ thể đậu quả của nấm Cổ cò được thu hái

ở Tây Nguyên vào tháng 12 năm 2017 Mẫu được xác định tên khoa học là

Ganoderma flexipes Pat bởi TS.Nguyễn Phương Đại Nguyên – Bộ môn Sinh

học – Trường Đại học Tây Nguyên Mã số mẫu DL 001 Tiêu bản mẫu mã số GF1217 được lưu giữ tại khoa hóa học, Viện Dược liệu

Hình 2 Nguyên liệu nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes Pat

2.2 Hóa chất, thiết bị

2.2.1 Hóa chất, dung môi

Các dung môi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV: nước cất hai lần (H2O), dung môi ethyl acetat (EtOAc),

dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), n – hexan

Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha

đảo YMC C18 (30-35 mm, FuJi Silisa Chemical Ltd.)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol để phát hiện vết chất

2.2.2 Thiết bị

Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký, bìnhcầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm…

Trang 29

20

Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi)

Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

Bếp điện, bếp đun cách thủy

Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

Máy siêu âm Power sonic 405

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization MassSpectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của ViệnHoá học Các hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMRcủa Viện Hoá học, VKH&CNVN

2.3 Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất

tinh khiết

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập

Toàn bộ nấm Cổ cò bao gồm: tán nấm và thân nấm được phơi khô, xay nhỏ (5,7 kg) chiết nóng tại 65ºC với methanol (3 lần, mỗi lần 3h) Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch chiết lại và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng Cao này được hòa lại trong nước, đem chiết lỏng –

lỏng lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, DCM và EtOAc, sau đó tiếp tục đem cô riêng rẽ từng phân đoạn, thu được cao phân đoạn n-

hexan, phân đoạn DCM, phân đoạn EtOAc, và phân đoạn nước

Các hợp chất trong các phân đoạn của nấm Cổ cò được phân lập bằng

phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường (0,040-0,063

mm, Merck), và pha đảo RP – 18

Theo dõi, kiểm tra các phân đoạn của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng, thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck) Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366

nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

Thu gom, tinh chế các chất phân lập được bằng dung môi thích hợp Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng TLC, HPLC với các hệ dung môi phù hợp

Trang 30

21

Các bước tiến hành:

+ Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để rửa giải: khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt để làm dung môi rửa giải

+ Chuẩn bị cột: chọn cột sắc ký có kích thước phù hợp, rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định Lót một lớp bông xung quanh vị trí vít Cân một lượng thích hợp chất nhồi cột vào cốc có mỏ, thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí thu được hỗn dịch Mở khóa cột, từ từ rót hỗn dịch đã chuẩn bị lên cột, vừa rót vừa gõ nhẹ, đều và đối xứng quanh thân cột bằng quả bóp cao su Sau khi đưa hết pha tĩnh lên cột, tiếp tục cho dung môi chảy liên tục qua cột để luyện đến khi cột hoàn toàn ổn định (có thể từ 5-

10 giờ) Chú ý không được để cột bị khô dung môi làm nứt cột

+ Nạp mẫu lên cột:

Nạp mẫu khô: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay hơi dung môi đến khi thu được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều đặn bên trên chất nhồi cột

Nạp mẫu ướt: dùng pipet hút dung dịch mẫu cần phân tích, rót từ từ, nhẹ nhàng dọc quanh thành cột

Sau khi đưa mẫu lên cột, đặt một miếng bông lên để bảo vệ mặt tiếp xúc

+ Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải Dịch rửa giải được hứng vào bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích phù hợp Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau, các phân đoạn chứa chất cần được tinh chế

2.3.2 Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc

Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào số liệu các phổ cộng hưởng

từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1H và 13C, DEPT, HSQC, HMBC, NOESY), phổ khối (MS),…; và một số đặc trưng lý hóa như điểm chảy, cảm quan,

a Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh

ra từ phân tử Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối lượng của ion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z) Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion

Trang 31

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị

tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm Carbon lai hóa sp2 chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyển tới 240 ppm Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon (hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử

Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận (thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY)

Trang 32

Trang 33

24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Chiết các phân đoạn nấm Cổ cò và phân lập các hợp chất từ cao

phân đoạn DCM

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn nấm Cổ cò

Toàn bộ nấm Cổ cò bao gồm: tán nấm và thân nấm được phơi khô, xay nhỏ (5,7 kg) chiết nóng tại 65ºC với MeOH (3 lần, mỗi lần 3h) Dịch chiết gộp lại và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng 245 g (NCCT, đạt hiệu suất là 4,3%) Lấy 240 g cao tổng bổ sung nước (1 lít) rồi chiết phân

bố lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, DCM, EtOAc Loại

bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được cao: phân đoạn n-hexan (HNCC, 12,2

g), phân đoạn DCM (DNCC, 46,4 g), phân đoạn EtOAc (ENCC, 23,1 g), và phân đoạn nước (WNCC, 157,3 g) Quy trình được mô tả như hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Nấm Cổ cò

Định dạng
Số trang	66
Dung lượng	2,62 MB