Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ cặn chiết Ethyl Acetat vỏ quả cây bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H. Hara) trồng ở Lào Cai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ BƯỞI CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CẶN CHIẾT ETHYL ACETAT VỎ QUẢ CÂY BẢY LÁ MỘT HOA Paris polyphylla var... ĐẠI HỌC QUỐC GIA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ BƯỞI

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT

TỪ CẶN CHIẾT ETHYL ACETAT VỎ QUẢ

CÂY BẢY LÁ MỘT HOA

(Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H Hara)

TRỒNG Ở LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: NGUYỄN THỊ BƯỞI

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT

TỪ CẶN CHIẾT ETHYL ACETAT VỎ QUẢ

CÂY BẢY LÁ MỘT HOA

(Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H Hara)

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn đến Lãnh đạo, thầy cô Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, nghiên cứu, rèn luyện để hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua và làm khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đỗ Thị Hà, PGS.TS

Dương Thị Ly Hương, ThS Nguyễn Thị Duyên, những người đã luôn tận tình

hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới cán bộ nghiên cứu khoa Hóa thực vật – Viện Dược liệu, lãnh đạo Viện Dược liệu đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành thực nghiệm tại Viện

Tôi cũng xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài của Quỹ L'oreal National

Fellowship – 2016 và một phần kinh phí từ đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu cây

Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinensis Smith) theo hướng hỗ trợ điều

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 06 năm 2017

Sinh viên Nguyễn Thị Bưởi

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

GI50 Nồng độ ức chế 50% sự gia tăng tế bào

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

MS Phổ khối (Mass Spectroscopy)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

SKLM Sắc ký lớp mỏng

TGI Total growth inhibitor

TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TT Thuốc thử

UV Phổ tử ngoại (Ultra Violet)

VKH&CNVN Viện khoa học và công nghệ Việt Nam

v/v Thể tích/ Thể tích

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Paris L ở Việt Nam 3

Bảng 1.2 Các flavonoid đƣợc phân lập từ chi Paris 10

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong vỏ quả PPC 27

Bảng 3.2 Hệ dung môi rửa giải sắc ký cột phân đoạn EtOAc 30

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất 3 (500MHz-MeOD) và viniferin 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của các saponin spirostan của chi Paris 6

Hình 1.2 Cấu trúc của các saponin furostan 6

Hình 1.3 Cấu trúc của các saponin pregnan 7

Hình 1.4 Một số saponin steroid khác đƣợc phân lập từ các loài thuộc chi Paris 8

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của các saponin triterpen 9

Hình 1.6 Các bộ phận sinh dƣỡng và sinh sản của Bảy lá một hoa – Paris polyphylla var chinenis Franchet đƣợc trồng tại Sapa, Lào Cai 12

Hình 2.1 Mẫu quả Bảy lá một hoa thu hái tại Lào Cai 18

Hình 2.2 Nguyên tắc sắc ký 20

Hình 3.1 Sơ đồ chiết cao phân đoạn vỏ quả bảy lá một hoa 29

Hình 3.2 Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) của cao ethyl acetat 29

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn PE phần vỏ quả 31

Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) cao phân đoạn EtOAc và các hợp chất phân lập đƣợc 32

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1-3 33

Hình 3.6 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 34

Hình 3.7 Sắc ký đồ TLC trên silica gel 60 F254 (Merck, 20x10 cm) của hợp chất 1 và chất chuẩn stigmasterol 34

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 35

Hình 3.9 Phổ DEPT của hợp chất 2 36

Hình 3.10 Phổ ESI-MS của hợp chất 3 36

Hình 3.11 Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 37

Hình 3.12 Phổ 13C-NMR (A) và HSQC (B) của hợp chất 3 38

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Paris 2

1.1.1 Phân loại thực vật và phân bố chi Paris 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Thành phần hóa học chi Paris 3

1.1.4 Độc tính 11

1.2 Tổng quan về loài Bảy lá một hoa 11

1.2.1 Vị trí phân loại và tên gọi 11

1.2.2 Đặc điểm thực vật 12

1.2.3 Sinh thái, phân bố 13

1.2.4 Thành phần hóa học 13

1.2.5 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học 14

1.2.6 Cách trồng 16

1.2.7 Thu hái và chế biến 16

1.2.8 Công dụng và cách dùng 16

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng 18

2.2 Hoá chất, trang thiết bị 18

2.2.1 Hoá chất 18

2.2.2 Thiết bị 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Định tính bằng phương pháp hóa học 19

2.3.2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 19 CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Định tính các nhóm chất 21

3.1.1 Đinh tính tanin 21

3.1.2 Định tính flavonoid 21

3.1.3 Định tính saponin 22

3.1.4 Định tính alcaloid 22

3.1.5 Định tính glycosid 23

3.1.6 Định tính coumarin 24

3.1.7 Định tính chất béo, caroten, sterol 25

3.1.8 Định tính đường khử, acid amin, acid hữu cơ 26

3.1.9 Định tính polysaccharid 26

3.2 Chiết xuất 28

3.3 Khảo sát và phân lập các hợp chất trong cao ethyl acetat 29

3.3.1 Khảo sát bằng SKLM 29

3.3.2 Phân lập bằng phương pháp sắc ký cột 30

3.4 Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất đã phân lập được 32

3.4.1 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập được 32 3.4.2 Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập được 33

3.5 Bàn luận 39

3.5.1 Về định tính 40

3.5.2 Về chiết xuất 40

3.5.3 Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc các hợp chất 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội phát triển, chất lượng cuộc sống ngày càng được cải thiện Vì vậy nhu cầu chăm sóc sức khỏe được chú trọng hơn Hiện nay để đáp ứng nhu cầu đó, lĩnh vực dược phẩm phát triển không ngừng Tận dụng những lợi thế về điều kiện tự nhiên và kinh nghiệm trong việc sử dụng những cây thuốc và động vật làm thuốc từ rất lâu Nhiều dược chất làm thuốc có nguồn gốc từ dược liệu như: rutin, berberin, taxol, artermisinin Xu hướng nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên để phát triển nguồn tài nguyên dược liệu theo hướng hiện đại ngày càng được chú trọng

Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var chinenis) và những loài khác cùng chi

là những cây thuốc quý hiếm, thường được sử dụng trong dân gian để tiêu sưng nhọt, chữa rắn cắn…[6], từ lâu Trung Quốc đã sử dụng vị thuốc này để điều trị ung thư Hiện nay, tác dụng dược lý đặc biệt là tác dụng chống ung thư của Bảy lá một hoa đang được các nhà khoa học trên thế giới đi sâu nghiên cứu Một số tác dụng

dược lý của loài Paris là tác dụng chống ung thư, điều hòa miễn dịch, cầm máu,

chống oxy hóa, kháng virus, kháng nấm, chống ký sinh trùng, hạ sốt, giảm đau, an thần,….[1] Về thành phần hóa học, các hợp chất đã phân lập được từ một số loài

Paris là saponin, flavonol, sphingolypid và các glycosid khác [7] Tại Việt Nam đã

có một số nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các bộ phận trên mặt đất, dưới mặt đất, thân rễ, tuy nhiên chưa có nghiên cứu về phần vỏ quả của Bảy lá một hoa

Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng của loài

Paris polyphylla var chinenis nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Chiết

xuất, phân lập một số hợp chất từ cặn chiết ethyl acetat vỏ quả cây Bảy lá một

hoa (Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H Hara) trồng ở Lào Cai” với

mục tiêu phân lập và xác định cấu trúc 3 hợp chất hóa học từ cặn chiết ethyl acetat

vỏ quả cây Bảy lá một hoa thông qua việc thực hiện các nội dung sau:

- Định tính các nhóm hợp chất có trong vỏ quả bằng các phản ứng hóa học đặc trưng

- Chiết xuất và phân lập các hợp chất

- Xác định và nhận dạng cấu trúc của một số chất phân lập được trong phân đoạn ethyl acetat

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chi Paris

1.1.1 Phân loại thực vật và phân bố chi Paris

Phân loại thực vật

Hiện nay, hệ thống phân loại thực vật chi Paris chưa có sự thống nhất Theo

hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris:

Phân giới thực vật bậc cao

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Hành (Liliopsida)

Phân lớp Loa kèn (Lilidae)

Bộ củ nâu (Dioscoreales)

Họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae)

Chi Bảy lá một hoa, Tảo hưu (Paris) [5]

Phân bố

Chi Paris là một chi nhỏ, phân bố ở vùng cận nhiệt đới và ôn đới, chủ yếu ở

châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ, Butan, Nê Pan, Pakistan, Mianma, Thái Lan), châu

Âu và châu Mỹ [7]

Thực vật chí Trung Quốc đã mô tả hình thái và xếp chi Paris vào họ Loa kèn

(Liliaceae) với 22 loài, 17 thứ, trong đó có 12 loài đặc hữu [20,26]

Ở Việt Nam, chi Paris hiếm gặp, phân bố chủ yếu ở một số tỉnh vùng núi

phía bắc và vùng núi cao Tây Nguyên, theo Nguyễn Thị Đỏ nghiên cứu mô tả chi

tiết và có khóa phân loại kèm hình ảnh về chi Paris L có 6 loài theo bảng 1.1 [7]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây thảo nhiều năm; thân rễ thường hình trụ, nạc, nằm ngang; phần thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh hoặc hiếm khi phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông Lá mọc đối hoặc mọc vòng trên thân, 4 -

10 lá; phiến lá màu lục, có vệt tím hoặc không, hình mũi giáo, hình thuôn, hình trứng ngược, mềm, gân bên rõ, không có cuống hoặc có cuống dài hoặc ngắn Hoa thường đơn độc hoặc một vài hoa mọc ở đỉnh, to, màu lục, đều, lưỡng tính, mẫu 3 -

5, cuống dài, thẳng đứng Đài (2) 3 - 5 (10), rời nhau, hình mũi giáo, màu lục hoặc màu trắng, thường to hơn cánh hoa, xếp lợp hoặc hơi vặn Cánh hoa 2 (3) - 5 (10), dạng dải hoặc hình trứng, bằng nhau, màu sắc khác nhau Nhị 3 - 22 chiếc, phần lớn

là 6 - 12; chỉ nhị dẹt, ngắn, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình cầu hoặc hình sợi hoặc không kéo dài Bầu thượng, tròn hoặc có cạnh, 3 - 12 lá noãn, nhiều ô, với kiểu đính noãn trung trụ hoặc 1 ô với kiểu đính noãn bên, mỗi bên nhiều noãn; vòi nhụy 3 - 5, rời hoặc dính nhau phần gốc; đầu nhụy 3 - 5 Quả mọng hoặc quả nang,

mở ở lưng ô Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nước hoặc không, nội nhũ rắn chắc hoặc nạc, chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [7]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Paris L ở Việt Nam [6],[ 7]

Paris delavayi Franch

(Trọng lâu kim tiền)

Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng (Nguyên Bình), Vĩnh Phúc (Tam Đảo)

Paris polyphylla Smith

(Trọng lâu nhiều lá)

Sơn La (Mộc Châu)

Paris dunniana Levl

(Trọng lâu hải nam)

Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Hải An), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Ninh Bình (Cúc Phương), Kon Tum (Kon Plong)

Paris fargesii Franch Sa Pa (Lào Cai)

Paris chinensis Franch

(Bảy lá một hoa, Tảo hưu)

Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái (Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Nội (Ba Vì), Hoà Bình (Lương Sơn, Mai Châu: Pà Cò)

Paris yunnanensis Franch

(Trọng lâu vân nam) Lào Cai (Sa Pa), Lai Châu (Phong Thổ)

1.1.3 Thành phần hóa học chi Paris

Những nghiên cứu trong nước

Các công bố về thành phần hóa học chi Paris ở Việt Nam cho đến nay còn

sterol từ thân rễ loài Paris yunnanensis thu thái tự nhiên tại Kon Tum là diosgenin, gracillin và hỗn hợp stigmasterol-3-O-β-D-glucosid và sistosterol-3-O-β-D-glucosid

[10]

Những nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Paris L chỉ ra

sự có mặt của các nhóm chất tanin, flavonoid, acid phenolic, saponin [28,52], đường [1], acid amin [45] Trong đó thành phần chính là saponin steroid [40,54]

Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Paris bắt đầu từ năm 1938 bởi Dutt

và cộng sự [19] phân lập được parid và paristyphnin từ loài P quadrifolia Sau đó

năm 1983 Nakano [31] và Chen (1995) [17] công bố các hơp hợp chất saponin,

flavonoid glycosid, sterol [14,18], β-phytoecdyson và polysaccharid được công bố

lần lượt bởi Singh [42] và Zhou [53] Cho đến nay có trên 55 saponin được phân lập

từ 8 loài là: P polyphylla var yunnanensis, P polyphylla var chinensis, P delavayi Franch, P vietnamensis, P dunniana, P luquanensis, Paris polyphylla var

Chen và cộng sự [14,15,41] từ loài P axialis và PPY Các saponin spirotan (hình

1.1) đã phân lập được là:

Diosgenin (1) phân lập từ thân và lá loài PPY [37]

Trillin (2), Diosgenin-3-O-α-L-Rha-(1→4)-β-D-Glc (3) phân lập từ thân rễ

PP [39], thân và lá PPY [37]

Paris V (4) phân lập từ thân rễ PPC [30], thân và lá PPY [37]

Polyphyllin C (5) phân lập từ thân rễ PP [43]

Diosgenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-β-D-Glc (6) phân lập từ thân rễ PP [31]

Polyphyllin D/ Paris I (7) phân lập từ thân rễ PPC [30], thân rễ PPY [47]

Dioscin/Paris III (8) phân lập từ thân rễ Paris axialis, thân lá PPY [16]

Paris II (13) phân lập từ thân rễ PP, thân và lá PPY [50]

Polyphyllin F (14), Polyphyllin E (15) phân lập từ thân rễ PP [43]

Paris IV (21) phân lập từ thân rễ, thân và lá PPY [50]

Pennogenin-3-O-α-L-Ara-(1→4)-β-D-Glc (22) phân lập từ thân rễ PP [31]

Paris H (23), Paris D (24) phân lập từ thân rễ PPC [30]

Hình 1.1 Cấu trúc của các saponin spirostan của chi Paris

 Các saponin furostan

Hình 1.2 Cấu trúc của các saponin furostan Các saponin furostan có cấu trúc tương tự như các saponin spirostan nhưng

bị phản ứng của enzym mở vòng ở vòng F và bị đường hóa tại C-26 Cấu trúc dạng

này lần đầu tiên phân lập từ Paris bởi Matsuda và cộng sự năm 2003 [29] là

protogracillin Ngoài ra một số saponin furostan có thể chứa C-20 không no tại khung E Các saponin furostan (hình 1.2) đã phân lập được là:

(25R)-26-O-β-D-Glc-22-hydroxy-5-en-furost-3β,26-diol-3-O-α-L-Rha-(1→2)-[α-L-Ara-(1→3)]-β-D-Glc (31) phân lập từ cây Paris quadriforia L [33]

Parisaponin I (32) phân lập từ thân rễ PP [29]

Parisyunnanosid A (33), Th (34), Pseudoproto-Pb (35), Parisyunnanoside B (36) phân lập từ thân rễ PP [51]

 Các saponin pseudo-spirostanol và pregnan

Chen và cộng sự lần đầu tiên phân lập đƣợc hai nhóm saponin

pseudo-spirostanol và pregnan từ chi Paris, trong đó nhóm saponin pseudo-pseudo-spirostanol

(1995) [17] gồm nuatigenin và isonuatigenin, năm 1990 công bố nhóm saponin pregnan [14,18]

Các saponin pregnan (hình 1.3) đã công bố gồm:

Pregna-5,16-dien-3-ol-20-on-3-O-α-L-Rha-(1→2)-[α-L-Ara-(1→4)]-β-D-Glc

(37) [14]

Hypoglaucin H (38) phân lập từ lá PPY [37]

Chonglouosid SL-7 (39), Chonglouosid SL-8 (40) phân lập từ thân và lá PPY

26-O-β-D-Glc-(25R)-Δ(5,6),(17,20)-dien-16,22-dion-cholestan-3β,26-diol-3-O- α-L-Ara-(1→4)-[α-L-Rha-(1→2)]-β-D-Glc (42) đƣợc

phân lập từ thân rễ PP [51] Hợp chất 18-norspirostanol đƣợc phân lập từ loài P

quadrifolia bởi Nohara năm 1982 [33] Năm 2016 Qin và cộng sự [35] đã phân lập

đƣợc hai sterol là 7α-hydroxy stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (43) và hydroxy sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (44)

7β-Hình 1.4 Một số saponin steroid khác đƣợc phân lập từ các loài thuộc chi Paris

3-O-β-D-Glc-β-D-Glc-(1→2)-β-D-Xyl (paristrisid F, 50), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid

Glc-(1→2)-α-L-Ara (51), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid Glc-(1→2)-β-D-Xyl (52), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-α-L-Ara (53), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-β-D-Xyl (54), 3β-hydroxyolean-12-dien- 28-oic acid 3-O-β-D-Glc (55), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O-α-L-Rha- (1→2)-β-D-Glc (56), 3β-hydroxyolean-12-dien-28-oic acid 3-O- β-D-Glc-(1→2)-β-

3-O-β-D-D-Glc (57), 3β,23-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid 3-O-β-D-Xyl-(1→2)-α-L-Ara (58), 3β,23-dihydroxyolean-12-en-28-oic acid 3-O-β-D-Glc-(1→2)-α-L-Ara (59)

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của các saponin triterpen

1.1.3.2 Các flavonoid

Các flavonoid glycosides trong đó 6 chất có aglycon là kaempferol, 3 chất

với aglycon là isorhamnetin, 1 quercetin đƣợc phân lập từ PPY và P.axialis [50]

Hầu hết đều là dạng O-glycosid Hợp chất 65, 66 và 67 đƣợc phát hiện từ chi

Paris bởi Wang Trong đó hợp chất 69 đƣợc phân lập từ P Mairei by Huang et al

Bảng 1.2 Các flavonoid đƣợc phân lập từ chi Paris [50]

1.1.3.4 Các nhóm chất khác

Một phenylpropanosid glycosid là parispolysid F (73) và một ramification

của phenolic glycosid parispolysid G (74), một sphingolipid

ethyl-α-D-fructofuranosid (75) và một glycosid (76) được phân lập từ PPY bởi Wang [50]

Ngoài ra, phân lập bằng CC phát hiện 18 acid amino [45]

1.1.4 Độc tính

Theo Danbensky, Stepven Clavey và cộng sự, Paris polyphylla có độc tính

nhẹ, ở liều bình thường gần như không có tác dụng phụ, ở liều cao (60 – 90 g) có phản ứng ngộ độc nhẹ, xuất hiện sau 1 – 3 giờ dùng thuốc Biểu hiện: buồn nôn, nôn, ỉa chảy, hoa mắt chóng mặt, đau đầu, da mặt xanh tái, mắt mờ Một số trường hợp có thể gây co thắt, khó thở, loạn nhịp Bột dược liệu có thể gây kích ứng mũi và kết mạc mắt [10]

1.2 Tổng quan về loài Bảy lá một hoa

1.2.1 Vị trí phân loại và tên gọi

Bảy lá một hoa có tên khoa học là Paris polyphylla var chinensis (Franch.)

H Hara

Tên đồng nghĩa là Paris chinensis Franchet, Paris formosana Hayata, 1911;

Paris polyphylla auct non Smith: Pei & Chou, 1964; Paris polyphylla ssp polyphylla auct non Smith: Phamh., 1993 [10,27]

Tên thông thường là Tảo hưu, Thất diệp nhất chi hoa, cúa dô (H’Mông) [1] Tên nước ngoài: Parisette, Herbe – Paris (Pháp) [1]

Họ Trọng lâu (Trilliaceae) [1,10]

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Bảy lá một hoa là cây thảo nhiều năm, cao 40 - 100 (130) cm; thân rễ gần hình trụ ngắn, nằm ngang, đường kính khoảng 2 cm; thân trên mặt đất thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông Lá 5 - 6 (7), xếp thành 1 vòng trên thân; phiến lá mỏng, màu lục, hình trứng ngược, hình thuôn, kích thước 25 (27)  (5 – 7) cm, 5 - 7 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc tròn hoặc hình nêm, cuống dài 2,5 - 4 (6) cm Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, lưỡng tính; cuống dài 15 - 40 cm, thẳng đứng Đài 5 - 6 (7), dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thước (3,5) 5 - 8 (9) × ((1) 1,5 - 2,5 (3,5)) cm, màu lục Cánh hoa 5 - 6 (7), màu vàng, dạng dải, kích thước ((3) 4,5 - 6 (7))  0,1 cm, bằng nhau Nhị 10 - 12, dài 1,5 - 3 cm; chỉ nhị dẹp, dài 0,5 - 1,2 cm, đính ở gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh trung đới kéo dài thành hình kim, dài 1 - 3 mm Bầu thượng, hình trứng, 4 - 5 lá noãn, 5 - 6 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhuỵ 5 - 6, dính nhau phần gốc; đầu nhụy 5 – 6 Quả nang, mở ở lưng ô Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nước hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [7]

Hình 1.6 Các bộ phận sinh dưỡng và sinh sản của Bảy lá một hoa – Paris

polyphylla var chinenis Franchet được trồng tại Sapa, Lào Cai [11]

A Thân khí sinh mang lá và hoa; B Một lá; C Thân rễ; D Lát cắt ngang thân rễ;

E Đài hoa; F Cánh hoa; G Nhị; H Nhụy; I Quả; K Hạt

1.2.3 Sinh thái, phân bố

Bảy lá một hoa là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác dưới tán rừng kín thường xanh, dọc theo bờ khe suối, đất ẩm nhiều mùn Phần thân trên mặt đất lụi hàng năm vào cuối thu Thân rễ mang 1 – 2 chồi ngủ tồn tại qua đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau Trong tự nhiên, thường chỉ những cây lớn với chiều dài thân rễ trên 5 cm mới thấy có hoa quả [1] Mùa ra hoa tháng 2 - 6, mùa

quả tháng 3 – 10 [7,27]

Bảy lá một hoa phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái (Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Nội (Ba Vì), Hoà Bình (Lương Sơn, Mai Châu: Pà Cò) Còn có ở Mianma, Trung Quốc, Lào, Thái Lan [7]

1.2.4 Thành phần hóa học

Những nghiên cứu trong nước

Theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” (tập I), thân rễ Bảy lá một hoa chứa 7 – 9 % đường, 2% glycosid là α – paridin và α - paristyphnin [1]

Năm 2005, trong khoá luận tốt nghiệp dược sỹ của Nguyễn Thị Bảo Vân

“Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng của cây Bảy lá một

hoa”, cho thấy trong thân rễ của Bảy lá một hoa có chứa các nhóm chất saponin,

tanin catechic, sterol, acid amin và polysaccharid

Năm 2013, khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Hoàng Thị Thu Hồng (Đại học

sư phạm TP.Hồ Chí Minh) đã thực hiện “Khảo sát thành phần hóa học của cao

ethyl acetat cây Bảy lá một hoa (Paris Polyphylla)” phân lập được hỗn hợp của

và vi học của cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, 21( 4), 242-247

Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Thị Thu, Phạm Quốc Long (2016), “Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất Bảy lá một

hoa (Paris polyphylla var chinensis Franchet) họ Trọng lâu (Triliaceae)”, Tạp chí

khoa học và công nghệ 56 (2C), 472-478

Nguyễn Thị Duyên, Đỗ Thị Hà, Trần Vũ Thắng, Nguyễn Quyết Chiến, Phạm Quốc Long, “Thành phần hóa học cao phân đoạn etyl axetat cây Bảy lá một hoa

(Paris polyphylla var chinensis Franchet) trồng tại Việt Nam”, Tạp chí Hóa học

Những nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu tổng quan về thành phần hóa học chi Paris gồm hơn 70 hợp chất được công bố, tuy nhiên hầu hết các hợp chất đều được phân lập từ Paris polyphylla var yunnanensis 20 hợp chất được phân lập từ PPC và đều là các saponin sterol

gồm saponin diosgenin (12 hợp chất), saponin pennogenin (6 hợp chất), hợp chất 39

và 42 Các hợp chất này đều được glycosid hóa tại vị trí C-3 trong đó saponin diosgenin là 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 và saponin pennogenin là 21,

22, 23, 24, 25, 26

1.2.5 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.2.5.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Theo nghiên cứu của Yoshihiro Mimaki và cộng sự phân lập được 10

saponin steroid là: 4, 7, 11, 20, 21, 22, 24, 25, 26 và 28 từ cao methanol phần thân

rễ Paris polyphylla var chinensis Dịch chiết methanol ức chế 99% sự sinh trưởng

của tế bào HL-60 ở mức liều 10 µg/ml, IC50 = 3,3 µg/ml Các hợp chất 4, 7, 11, 20,

21, 24, 25 và 28 biểu hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư với IC50 lần lượt là: 1,8,

0,5, 2,1, 0,8, 5,1, 5,0, 1,5 và 1,7 µg/ml Hợp chất 7 còn có khả năng ức chế nhiều

dòng tế bào ung thư khác như tế bào ung thư máu MOLT-4 (GI50 = 0,19 µg/ml; TGI

= 0,41 µg/ml; LC50 = 0,91 µg/ml), ung thư phổi A549/ATCC (GI50 = 0,20 µg/ml; TGI = 0,36 µg/ml; LC50 = 0,66 µg/ml), ung thư đại tràng SW-620 (GI50 = 0,19 µg/ml; TGI = 0,42 µg/ml; LC50 = 0,91 µg/ml), u ác tính M14 (GI50 = 0,20 µg/ml; TGI = 0,36 µg/ml; LC50 = 0,65 µg/ml), ung thư trực tràng 786-0 (GI50 = 0,22 µg/ml; TGI = 0,47 µg/ml; LC50 = 0,98 µg/ml) [30]

Theo Lin-Lin Gao và cộng sự, phân lập được dioscin (8) từ Paris chinensis

Hợp chất này ức chế sự tăng trưởng của dòng tế bào ung thư buồng trứng SKOV3 phụ thuộc thời gian và liều, với IC50 lần lượt là 14,6±0,11, 7,64±0,40 và 5,81±0,33

mg/ml tương ứng với các thời điểm sau 24, 48 và 72 h dùng thuốc Dioscin (8) làm

tăng đáng kể quá trình apotosis, do làm tăng nồng độ Ca2+ quá mức trong ti thể, dẫn đến tăng nồng độ enzym caspase-3 và cytochrom C trong tế bào SKOV3 [22]

Trong một nghiên cứu khác trên dòng tế bào ung thư dạ dày SGC-7901, nhóm nghiên cứu đã phát hiện khả năng gây độc tế bào này theo cơ chế liên quan đến chu kỳ tế bào và quá trình apotosis Kết quả nghiên cứu cho thấy dioscin ức chế

sự tăng trưởng của dòng tế bào SGC-7901 phụ thuộc thời gian với nồng độ với IC50lần lượt là 13,77±0,18, 8,73±0,41 và 3,62±0,29 mg/ml tương ứng với các thời điểm

24, 48 và 72 h Nghiên cứu về ảnh hưởng của dioscin với chu kỳ tế bào: dioscin làm tăng số lượng tế bào ở pha G2/M và làm giảm biểu hiện của hai protein là: cyclin B1 và CDK1 đồng nghĩa với việc làm tế bào không thể phân chia (Pha M của chu trình tế bào) Dioscin cũng làm tăng quá trình apotosis của tế bào 17,18%±2,58%, 24,75%±2,72% và 54,91%±3,35% ứng với các mức liều 10, 50 và 250 μg/ml Cơ chế được cho là dioscin kích thích tăng giải phóng cytochrom C từ ti thể dẫn đến tăng nồng độ enzym caspase-3 kích thích quá trình apotosis tế bào SGC-7901 Sau 24h ủ dioscin, hợp chất này làm tăng vận chuyển Ca2+ vào tế bào phụ thuộc nồng độ 41% ± 4,72%, 66% ± 5,61%, và 86% ± 7,25% tương ứng với các liều 10, 50 và 250 μg/ml Mặt khác, các nghiên cứu trước chỉ ra sự gia tăng quá mức của nồng độ

Ca2+ Sau 24h dùng thuốc, dioscin ức chế dòng tế bào ung thư dạ dày SGC-7901 thông qua việc dừng chu kỳ tế bào tại pha G2/M và quá trình Ca2+- cytochrome C- apoptosis [21]

Năm 2015, Hao Jiang và cộng sự nghiên cứu tác dụng chống ung thư phổi

của Paris saponin I (7) từ Paris polyphylla Smith var chinensis (Franch) Hara và

Paris polyphylla Smith var yunnanensis (Franch) Hand-Mazz Kết quả cho thấy 7

ức chế dòng tế bào ung thư phổi kháng gefitinib PC‑9‑ZD in vitro với IC50 là

2,5132 μg/ml sau 24 h, giảm tỉ lệ kháng thuốc 1,77 lần Tác dụng này là do 7 làm

tăng tính nhạy cảm của dòng tế bào này với phương pháp xạ trị Cơ chế được cho là

do 7 gây gián đoạn chu kì tế bào ở pha G2/M và gây ra quá trình chết tế bào do làm

tăng enzym caspase-3, yếu tố làm tăng giải phóng cytochrom C Bax, enzym chặn chu kỳ tế bào P21waf1/cip1, giảm sản xuất Bcl‑2 – yếu tố ức chế giải phóng cytochrom C [24]

2 Tác dụng hạ sốt, giảm đau, an thần

Paris polyphylla có tác dụng hạ sốt và giảm đau đầu [44]

Sáu loài chi Paris gồm P polyphylla var yunnanensis, P polyphylla var

chinensis, P fargesii, P thibetica, P vietnamensis và P stenophylla có tác dụng

giảm đau, an thần Các loài P.polyphylla var yunnanensis và P polyphylla var

chinensis thể hiện tác dụng giảm đau tốt hơn các loài còn lại, trong khi P polyphylla var chinensis, P fargesii và P thibetica có tác dụng an thần tốt hơn[44]

1.2.6 Cách trồng

Bảy lá một hoa thích nơi có khí hậu ẩm mát, ít gió, nhưng không chịu úng Cây chưa được trồng trên quy mô lớn, mà chỉ ở phạm vi các vườn thuốc một số địa phương Cây được nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân rễ Hằng năm, vào tháng 10 – 11, thu lấy quả chín đem gieo ngay hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới gieo Mỗi cây chỉ có một hoa, mỗi hoa chỉ có một ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao Thân rễ Bảy lá một hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách ra từng đoạn để trồng Thời vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu Cây giống thu gom từ hoang dại có thể trồng quanh năm Khi đánh cây con, cần chú ý không làm đứt rễ, tốt nhất là đánh cả bầu [1]

1.2.7 Thu hái và chế biến

Mùa thu hoạch thường vào tháng 6 – 7 Khi thu, đào thân rễ rửa sạch để nguyên đem phơi hoặc thái mỏng rồi phơi khô đều được [1]

1.2.8 Công dụng và cách dùng

Bộ phận dùng: Thân rễ, thu hái quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa thu đông, rửa sạch phơi khô [6]

Tính vị, tác dụng: vị đắng, hơi cay, tính hàn, có độc Tác dụng chủ yếu của

nó là thanh nhiệt giải độc, bình suyễn, chỉ khái, tức phong định kinh, tiêu viêm chỉ

thống, hoạt huyết tán ứ, tiêu thũng [6]

Thường dùng trị rắn độc cắn và sâu bọ đốt, viêm não truyền nhiễm, viêm mủ

da, lao màng não, hen suyễn Còn dùng trị yết hầu, bạch hầu, trẻ em lên sởi có viêm phổi, quai bị, lòi dom Ngày dùng 6 – 15 g rễ, dạng thuốc sắc; nếu có ác tính, dùng tới 15 – 30 g [6]

Ở Trung Quốc, vị thuốc tảo hưu được chế biến từ thân rễ nhiều loài cây

thuộc chi Paris L mọc ở những tỉnh miền Tây Nam Trung Quốc đã được dùng chủ

yếu làm thuốc chữa sốt, giải độc và chữa ho [1] Cũng có khả năng trị kinh phong lắc đầu, lè lưỡi Cũng có thể trị bệnh phổi và giang mai Dân gian thường dùng làm mát khi bị sưng đau và hen suyễn [6]

Ở Ấn Độ và Nê Pan, thân rễ Bảy lá một hoa trị giun sán bằng cách uống bột

thân rễ mỗi lần một thìa cà phê, ngày một lần, liền trong hai ngày Để trị mụn nhọt

và nhọt độc, hàng ngày bôi bột nhão chế từ thân rễ Bảy lá một hoa đều đặn [1]

 Một số bài thuốc có Bảy lá một hoa:

- Chữa trẻ em kinh sài, tay chân co giật: thân rễ Bảy lá một hoa, sấy khô tán

bột, uống mỗi lần 0,5 - 1 g ngày 4 - 5 lần [1]

- Chữa trẻ em sốt cao co giật, hoặc quai bị, lên sởi và các chứng viêm sưng

phát sốt: thân rễ Bảy lá một hoa (4 g), thiên hoa phấn (8 g), bạc hà (12 g), sắc uống

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Mẫu cây Bảy lá một hoa được thu hái tại huyện Sa Pa - tỉnh Lào Cai, tháng 8/2015 Mẫu (mẫu tươi bao gồm: thân, lá, hoa, rễ, quả) được giám định tên khoa học bởi Ths Bùi Hồng Quang, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật – Viện hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam Tên khoa học của mẫu nghiên cứu được xác định

là Paris polyphylla var chinensis (Franch.) H Hara, họ Trọng lâu (Trilliaceae)

Mẫu quả được bỏ hạt, giữ lại phần vỏ quả tiến hành nghiên cứu

Hình 2.1 Mẫu quả Bảy lá một hoa thu hái tại Lào Cai

2.2 Hoá chất, trang thiết bị

2.2.1 Hoá chất

Các dung môi hóa chất: Cồn 70o, nước cất hai lần, dung môi n-hexan, ethyl

acetat, methanol, aceton, dicloromethan, ether dầu hỏa (Trung Quốc), FeCl3 5%, chì acetat 10%, gelatin 1%, amoniac, HCl, NaOH, KOH, Na2CO3, H2SO4 1N, thuốc thử Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, TT Libermann – Burchardt, TT Natri nitroprussiat, acid picric 1%, TT Baljet, TT Diazo, TT Fehling A, B, TT Lugol (Merck), …

Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo YMC (30-50 µm, FuJi Silisa Chemical Ltd.)

SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254(Merck) (silica gel, 0.25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0.25 mm)

Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất

2.2.2 Thiết bị

Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký, bình cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm (Merck)…

Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI)

Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

Bếp điện, bếp đun cách thủy

Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR

Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

Máy siêu âm Power sonic 405

Máy Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

[α]D đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, VKH&CNVN

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Định tính bằng phương pháp hóa học

Định tính các nhóm chất có trong vỏ quả Bảy lá một hoa bằng các phản ứng hóa học thường quy ghi trong sách Thực tập Dược liệu và Bài giảng Dược liệu tập

1, trường Đại học Dược Hà Nội [2,3,4]

2.3.2 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

- Phương pháp chiết xuất [8,9]

Phương pháp chiết nóng: sử dụng cồn 70o

ở 70o C Phương pháp chiết lỏng – lỏng: sử dụng để chiết thành các cao phân đoạn

- Phương pháp phân lập và tinh chế chất tinh khiết:

Phương pháp SKLM, SKC (nguyên tắc theo hình 2.2) [9,12]

Phương pháp rửa, kết tinh

- Phương pháp phổ và so sánh các cơ sở dữ liệu để xác định và nhận dạng cấu trúc: Xác định và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý và các phương pháp phổ bao gồm: điểm chảy, độ quay cực, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ 1 chiều: 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), phổ 2 chiều (COSY, HMBC, HSQC) … [9] và so sánh với các cơ sở dữ liệu thực nghiệm và cơ sở sở dữ liệu trước đó

Hình 2.2 Nguyên tắc sắc ký [12]

Minh họa một quá trình tách một hỗn hợp đơn giản gồm chất A, B và C

(lực tương tác với pha tĩnh của A < B < C) theo thời gian

a) sắc ký cột b) sắc ký bản mỏng

CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Định tính các nhóm chất

3.1.1 Đinh tính tanin

Tiến hành: Cho khoảng 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml,

thêm 20 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội, lọc Dịch lọc cho đều vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 2 ml để làm định tính

Ống nghiệm 1: Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều

Hiện tượng: Sau phản ứng dung dịch có vẩn đục màu vàng nâu Vẩn đục

vàng nâu xuất hiện là do tanin tạo kết tủa với muối kim loại sắt

Kết luận: Phản ứng dương tính

Ống nghiệm 2: Thêm 2 giọt dung dịch chì acetat 10%, lắc đều

Hiện tượng: Sau phản ứng thấy dung dịch có xuất hiện kết tủa rất rõ rệt Do

tanin tạo kết tủa với muối kim loại chì

Kết luận: Phản ứng dương tính

Ống nghiệm 3: Thêm 5 giọt gelatin 1%, lắc đều

Hiện tượng: Sau phản ứng thì dung dịch không có hiện tượng gì xảy ra Kết luận: Phản ứng âm tính

Kết luận chung: 2/3 phản ứng dương tính với tanin

3.1.2 Định tính flavonoid

Tiến hành: Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 25

ml cồn 90o, đun cách thủy sôi trong 10 phút, lọc nóng được dịch chiết cồn, đem làm các phản ứng flavonoid

Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater): Dung dịch trong

ethanol, thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanon, flavanonol

Hiện tượng: Sau phản ứng thấy dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu

vàng và xuất hiện bọt khí thoát ra mạnh mẽ

Mg + HCl → MgCl2 + H2

Kết luận: Phản ứng âm tính

Phản ứng với FeCl 3 5%: Tùy theo nhóm Flavonoid và tùy theo số lượng, vị

trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu

Hiện tượng: Dung dịch có xuất hiện kết tủa và chuyển sang màu nâu sẫm Kết luận: Phản ứng dương tính

Phản ứng với hơi NH 3 :

Hiện tượng: Trên giấy lọc có xuất hiện màu vàng rất nhạt là do nồng độ

Flavonoid rất ít và tùy theo nhóm Flavonoid

Kết luận: Phản ứng dương tính

Phản ứng diazo hóa

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút)

Hiện tượng: Dung dịch xuất hiện màu vàng đậm dần lên là do thuốc thử

diazo có màu vàng cam

Kết luận: Phản ứng âm tính

Kết luận chung: Như vậy 2/4 phản ứng dương tính

3.1.3 Định tính saponin

Tiến hành định tính : Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 g bột dược liệu, thêm 5

ml nước Lắc mạnh trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt

Hiện tượng: Quá trình tạo bọt xảy ra rất mãnh liệt và bọt còn bền vững sau

15 phút

Kết luận: Phản ứng dương tính mạnh

3.1.4 Định tính alcaloid

Tiến hành định tính: Cho khoảng 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích

100 ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac đặc Sau 30 phút thêm 25 ml cloroform vào, đậy kín Sau 12 giờ lọc lấy dịch chiết cloroform cho vào bình gạn Lắc kỹ với 10 ml dung dịch H2SO4 1N hai lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiết acid lại với nhau, đem làm phản ứng (khi đó dịch có màu trắng)

Phản ứng với thuốc thử Mayer (K2HgI4)

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer (Các alcaloid sẽ cho tủa vô định hình màu trắng hoặc trắng ngà)

Hiện tượng: Sau phản ứng ta thấy dung dịch không có hiện tượng gì xảy ra Kết luận: Phản ứng âm tính

Phản ứng với thuốc thử Dragendorff (KBiI4)

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff (Các alcaloid cho tủa màu đỏ cam đến đỏ)

Hiện tượng: Dung dịch chuyển từ không màu sang màu cam do thuốc thử

Dragendorff có màu cam

Kết luận: Phản ứng âm tính

Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat (Các alcaloid cho tủa màu nâu đến nâu đen)

Hiện tượng: Sau phản ứng ta thấy dung dịch không có hiện tượng gì xảy ra Kết luận: Phản ứng âm tính

Kết luận chung: Như vậy không có phản ứng nào dương tính với Alcaloid

3.1.5 Định tính glycosid

Tiến hành định tính: Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón 250 ml, ngâm

trong 50 ml cồn 25o trong 24 giờ Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ 100 ml, đem loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% đến dư Lọc bỏ tủa qua giấy lọc gấp nếp vào cốc

có mỏ dung tích 100 ml, nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat là lúc đó lượng chì acetat đã đủ Cho dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml lắc với chloroform, mỗi lần 8 ml Gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã sấy khô, chia đều vào 6 ống nghiệm nhỏ đem cô cách thủy Cắn thu

Hiện tượng: Dung dịch phân ra thành 2 lớp, lớp dưới có màu trắng còn lớp

trên có màu nâu nhạt

Kết luận: Phản ứng dương tính

Phản ứng Legal

Cho vào ống nghiệm 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều sẽ xuất hiện màu vàng

Hiện tượng: Sau phản ứng thấy dung dịch chuyển từ trắng sang vàng, do

dịch chiết được hòa tan với ethanol và phản ứng với thuốc thử Natri nitroprussiat

Hiện tượng: Ta so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn

glycosid, thấy ống thử có màu cam đỏ đậm hơn ống chứng

Kết luận: Phản ứng dương tính

Phản ứng Keller – Kiliani

Cho vào ống nghiệm 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong lòng ống

Hiện tượng: Dung dịch trong ống nghiệm phân thành hai lớp, lớp dưới có

màu trắng đục lớp trên có màu nâu

Kết luận: Phản ứng dương tính

Kết luận chung: Như vậy 4/4 phản ứng dương tính với Glycosid

3.1.6 Định tính coumarin

Tiến hành định tính: Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100

ml, thêm 50 ml cồn 90o, đun cách thủy tới sôi 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch chiết thu được đem làm các phản ứng sau