Phân tích thành phần STIPULEANOSID R2 trong các bộ phận của cây sâm vũ diệp

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ======  ====== TRẦN THỊ NGỌC HÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN STIPULEANOSID R2 TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA CÂY SÂM

Trang 1

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

======  ======

TRẦN THỊ NGỌC HÀ

PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN STIPULEANOSID R2 TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP

(Panax bipinnatifidus Seem.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2019

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

=======  ======

Người thực hiện: TRẦN THỊ NGỌC HÀ

PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN STIPULEANOSID R2 TRONG CÁC BỘ PHẬN CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP

(Panax bipinnatifidus Seem.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH2014.Y Người hướng dẫn: GV.TS NGUYỄN HỮU TÙNG

Hà Nội - 2019

Trang 3

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

Danh mục ký hiệu và tên viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ và đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Sâm Vũ Diệp 2

1.1.1 Tên khoa học 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái 2

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Tính vị, công năng 8

1.1.6 Tác dụng dược lý 8

1.1.7 Công dụng 8

1.2 Tổng quan về Saponin 9

1.3 Tổng quan về Stipuleanosid R2 10

1.4 Tổng quan về một số nghiên cứu phân tích định tính và định lượng về thành phần hóa học trong Sâm Vũ Diệp 11

2 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Dung môi, hóa chất 14

2.1.3 Thiết bị 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP 15

2.2.1 Phương pháp chiết xuất Sâm Vũ Diệp 15

`2.2.2 Phương pháp phân tích TLC 16

Trang 4

2.2.3 Phương pháp định lượng Stipuleanosid R2 bằng HPLC 17

3 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ 25

3.1 Chiết xuất saponin từ các bộ phận lá, thân, rễ Sâm Vũ Diệp 25

3.2 Định tính bằng TLC thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm Vũ Diệp 25

3.3 Định tính thành phần Stipuleanosid R2 trong cao chiết từ các bộ phận Sâm Vũ Diệp bằng HPLC 26

3.4 Định lượng Stipuleanosid R2 trong các bộ phận Sâm Vũ Diệp bằng HPLC 27

4 CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN 29

4.1 Về chiết xuất và xác định thành phần saponin có trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp 29

4.2 Về định lượng sơ bộ thành phần Stipuleanosid R2 trong các bộ phận của Sâm Vũ Diệp bằng HPLC 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 35

Trang 5

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian tiến hành nghiên cứu và hoàn thiện đề tài cùng khóa luận,tôi đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ tận tình và tâm huyết của cácthầy cô, các anh chị đi trước tại Khoa Y Dược-ĐHQGHN cùng với sự ủng hộ củabạn bè và người thân gia đình Qua đây, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chânthành tới những người đã luôn bên cạnh, dìu dắt, chỉ dạy và ủng hộ tôi trong quátrình thực hiện khóa luận

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Dương Thị LyHương, T.S Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y Dược ĐHQGHN, thầy cô đã dành thờigian để trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt cho tôi những kinh nghiệmquý báu và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thiện khóa luận của mình Tôixin cảm ơn sâu sắc tới anh Nguyễn Hoàng Việt ; chị Đặng Thị Ngần - Khoa YDược ĐHQGHN, những người tiền bối đã luôn bên cạnh tôi trong suốt quá trìnhthực nghiệm tại labo, giúp tôi khắc phục những sai sót hay vượt qua những khókhăn thất bại trong qúa trình thí nghiệm

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trongKhoa Y Dược, đặc biệt là bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạođiều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt làcác bạn Nông Mỹ Hoa, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Cao Thị Phương Thảo, Bùi ThịThanh Vân đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu và bạn bè đã ởbên ủng hộ tôi trong cả quá trình học tập, phấn đấu để đạt được thành tích như ngàyhôm nay

Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Trần Thị Ngọc Hà

Trang 6

Danh mục ký hiệu và tên viết tắt

Ký hiệu Tên đầy đủ

HPLC-DAD Sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò mảng diod

Trang 7

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 Các thành phần hóa học đã nghiên cứu trong Sâm Vũ Diệp 7

Bảng 1.2 Điều kiện sắc ký và kết quả phân tích định tính, định lượng acid oleanolic trong dược liệu Sâm Vũ Diệp 12

Bảng 1.3 Chương trình pha động chạy HPLC-DAD 13

Bảng 2.1 Chương trình dung môi chạy HPLC-DAD 18

Bảng 3.1 Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ thân rễ Sâm Vũ Diệp 25

Bảng 3.2 Hàm lượng cắn phân đoạn chiết xuất từ lá và thân Sâm Vũ Diệp 25

Bảng 3.3 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký 19

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của stipuleanosid R2 20

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 21

Bảng 3.6 Khảo sát độ thu hồi 22

Bảng 3.7 Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD 27

Bảng 3.8 Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân và lá SVD 28

Trang 8

Danh mục các hình vẽ và đồ thị

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Sâm Vũ Diệp 2

Hình 1.2 Đặc điểm thực vật và vùng phân bố Sâm Vũ Diệp 3

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của 10 saponin tách được từ rễ SVD 5

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol 5

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của Stipuleanosid R2(a) và Aralosid A methyl(b) ester 6

Hình 1.6 Thành phần saponin thuộc nhóm triterpenoid có trong Sâm Vũ Diệp.10 Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Stipuleanosid R2 11

Hình 2.1 Mẫu dược liệu Sâm Vũ Diệp 14

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết 16

Hình 2.3 Dịch lọc rễ, thân, lá SVD 16

Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử 19

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 21

Hình 3.3 Kết quả TLC Stipuleanosid R2 của các bộ phận dược liệu Sâm Vũ Diệp 26

Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và các mẫu cao của thân rễ (B), thân và lá (C) Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 26

Hình 3.5 Sắc ký đồ cao tổng lá và thân SVD 28

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae) là

một trong những cây thuốc quý phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên SơnTây Bắc nước ta [9] Gần đây Sâm Vũ Diệp (SVD) đã được thuần hóa và bước đầuđược trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang, Lào Cai Về mặt y học,SVD được sử dụng làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyềnthống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc Theo các tài liệu cũng như các nghiên cứutrước [2,12] cho thấy dược liệu SVD đang được sử dụng là phần thân rễ, chứa hàmlượng lớn saponin-Stipuleanosid R2-thành phần hoạt chất chính mang lại tác dụngdược lý và giá trị sử dụng của dược liệu quý này trong y học Tuy nhiên, chưa cócông bố chính thức nào về thành phần saponin này trong bộ phận trên mặt đất củaSVD Do đó, việc tập trung nghiên cứu thành phần saponin trong các bộ phận SVDcũng như định lượng được thành phần đó có ý nghĩa rất quan trọng trong việc ứngdụng dược liệu SVD trong thực tiễn Vậy liệu trong các bộ phận khác trên mặt đấtcủa SVD (lá, thân, hoa) có chứa thành phần saponin như phần (dưới mặt đất) thân

rễ hay không? Nếu có thì hàm lượng là bao nhiêu? Có thể sử dụng các bộ phận đóthay thế dược liệu SVD được không?

Để trả lời những câu hỏi trên, đồng thời đóng góp vào việc nghiên cứu mộtcách có hệ thống về saponin và xây dựng các tiêu chí định tính, định lượng, cơ sở

dữ liệu về hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD; chúng tôi thực hiện đề tài

“Phân tích thành phần Stipuleanosid R2 có trong các bộ phận của cây Sâm Vũ Diệp” tiếp nối nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học của thân rễ SVD và

“Nghiên cứu thành phần saponin có trong thân rễ của SVD trồng ở Sa Pa”-luận vănthạc sĩ Nguyễn Thị Thu Thủy [12], với các mục tiêu định tính và bước đầu địnhlượng thành phần stipuleanosid R2 trong các bộ phận của cây Sâm Vũ Diệp gồm:thân (trên mặt đất), lá và thân rễ

Trang 10

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Sâm Vũ Diệp

1.1.3.Đặc điểm phân bố và sinh thái

Trong tự nhiên, SVD phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nepan (vùng cậnHymalaya) và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nước ta [1] Sa Pa-Việt Nam cũng

là điểm phân bố cuối cùng của SVD ở phía nam Năm 1973, cây đã được phát hiện

ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sa Pa, ở độ cao 1600 m Hiện nay vùng phân bố củaSVD đã bị thu hẹp dần, từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây được coi là cực hiếm[1] Gần đây SVD đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một sốđịa phương ở Hà Giang và Lào Cai [18]

Trang 11

Hình 1.2 Đặc điểm thực vật và vùng phân bố Sâm Vũ Diệp.

Sâm Vũ Diệp thường mọc rải rác hay tập trung (vài chục khóm) dưới tánrừng ẩm, gần như quanh năm có sương mù Đất nơi có SVD mọc được xác định làferalit có mùn, có những chỗ SVD mọc lần với thảm rêu dày trên hốc đá hay ở gốccây gỗ lớn SVD còn là cây ưa khí ẩm mát Các chỉ số về khí hậu ở Trạm quan trắcđèo Hoàng Liên Sơn, cho thấy SVD đã tồn tại và phát triển vững bền từ bao đờinay trong một điều kiện khí hậu có nền nhiệt độ khá thấp (nhiệt độ trung bình năm12.8°C, lượng mưa: 3552 mm/năm; lượng bốc hơi là 494 mm/năm và độ ẩm khôngkhí và độ ẩm không khí trung bình khoảng 90% )

Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần đầu mầm thân rễ phânnhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân (tùy thuộc vào sốđầu mầm thân rễ phân nhánh) Chồi này sinh trưởng nhanh trong vòng một tháng

đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực đại Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có thểcho ra một cụm hoa Quả xanh quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả

đã chín và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ Do quả chín đúng vào thời kì cólượng mưa lớn tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khảnăng tái sinh tự nhiên của SVD Sau khi quả chín, từ tháng 9 – 10, toàn bộ phầnthân mặt đất tàn lụi qua mùa đông, để lộ những vết sẹo thân rễ khá rõ Đó là dấuhiệu giúp ta xác định tuổi của cây [1]

1.1.4.Thành phần hóa học

Hiện tại các nghiên cứu về Sâm Vũ Diệp chưa nhiều, song hầu hết các kếtquả nghiên cứu đều cho thấy thành phần hóa học mang hoạt tính chính của SVD làSaponin Trần Công Luận và cộng sự năm 2009, đã định lượng saponin tổng số củathân rễ và rễ củ của SVD theo phương pháp trọng lượng của Namba là 5,86% [7]

Trang 12

Trong lá và thân rễ Sâm Vũ Diệp được các nhà nghiên cứu xác định có chứa thànhphần chính là các Saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng vớimột số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [11,12]

Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponinkhung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một sốginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3[17].Thân rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất nhưchikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [1]

Ở Việt Nam, nghiên cứu về TPHH của SVD còn khá mới mẻ Nghiên cứucủa Trần Công Luận và cộng sự năm 2002, kết quả định tính sơ bộ cho thấy trongthân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùngvới acid béo, acid amin Đồng thời bằng cách thủy phân saponin rồi kết tinhsapogenin toàn phần thu được acid oleanolic [7,8]

Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc đã phân lập và xác địnhđược một nhóm gồm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.2) là thành phầnchính của rễ cây SVD được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn (Việt Nam), trong đó có

3 chất mới bifinosid A-C (1-3) [3]

Trang 13

G c: β-D-g ucopyranosyXy: β-D-xy opyranosy

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của 10 saponin tách được từ rễ SVD

Đỗ Văn Hào năm 2017, đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học 3hợp chất β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol từ phân đoạn ethyl acetat thân

rễ SVD [4]

β-sitosterol

Oleanolic acid

Daucostero

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của β-sitosterol, oleanolic acid và daucosterol.

Năm 2018, Thạc sỹ Nguyễn Thu Thủy đã phân lập và xác định được cấu trúchóa học của 2 hợp chất khác có trong thân rễ SVD là stipuleanosid R2 , aralosidmethyl ester [12]

Trang 14

a) Stipuleanosid R2

b) Aralosid A methyl ester

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của Stipuleanosid R2(a) và Aralosid A methyl(b) ester.

Như vậy, tổng cộng có 23 hợp chất saponin đã được xác định từ các phầncủa cây SVD có liên quan đến tác dụng sinh học

Trang 15

Bảng 1.1 Các thành phần hóa học đã nghiên cứu trong Sâm Vũ Diệp

Trang 16

Nhận xét: Các kết qủa nghiên cứu bước đầu chỉ ra rằng saponin

Stipuleanosid R2 là thành phần chính trong dược liệu SVD (thân rễ) với hàm lượngtương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn[1,7,12,14] Song các nghiên cứu chỉ mới thực hiện chủ yếu trên đối tượng là thân

rễ của SVD mà chưa có nhiều báo cáo về các thành phần có trong các bộ phận khácnhư lá, phần thân trên mặt đất của cây Do đó từ tổng quan về TPHH của SVD đãtrình bày, đề tài định hướng nghiên cứu phân tích TPHH của các bộ phận thân, lá,thân rễ SVD trồng ở Sa Pa, đặc biệt là thành phần Stipuleanosid R2 với mục đích

so sánh về thành phần và hàm lượng thành phần này giữa các bộ phận Từ đó cungcấp cơ sở khoa học cho dược liệu SVD trồng ở Việt Nam

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã chỉ ra rằng SVD cótác dụng chống stress, chống trầm cảm, có tác dụng bảo vệ gan và kích thích tăngmiễn dịch [5]

1.1.7.Công dụng

Từ xa xưa, dân gian đã dùng SVD làm thuốc bổ huyết, chủ yếu cho phụ nữsau sinh và người cao tuổi SVD còn được dùng ngoài, bôi lên các vết thương đểcầm máu, tán ứ, tiêu sưng, làm lành vết thương nhanh Bên cạnh đó SVD còn đượcdân gian sử dụng như một thực phẩm tăng cường sinh lực, kích thích sinh dục bằngcách ngâm rễ SVD rồi chiết dưới dạng tinh sâm, rất tốt cho sức khỏe [1]

Trang 17

Trong y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của SVD đã được sử dụng như mộtloại thuốc bồi bổ tinh thần và thể chất, cải thiện trí nhớ, giảm nguy cơ ung thư vàlàm giảm đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường [3]

Ở Trung Quốc, SVD còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổhuyết, đòn ngã tổn thương [1]

1.2 Tổng quan về Saponin

Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycoside với phần genin có cấutrúc triterpene hay steroid 27 Cacbon gặp nhiều trong thực vật; ở động vật tìm thấynhiều trong Sao Biển, Hải Sâm Theo truyền thống, saponin thường được địnhnghĩa dựa trên một số tính chất chung đặc trưng của nhóm hợp chất này bao gồm:

 Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước

 Làm vỡ hồng cầu ngay cả khi ở nồng độ loãng

 Độc với cá, diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên…

 Kích thích niêm mạc mắt gây hắt hơi, đỏ mắt

 Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3β-hydroxysteroid.Tuy nhiên không phải tất cả steroid đều thể hiện tất cả tính chất trên

Cấu trúc của Saponin cũng như các glycosid khác, gồm có 2 phần là phầnđường và phần aglycon (còn được gọi là sapogenin) Saponin có cấu trúc triterpenvới khung cơ bản 30C hoặc steroid với khung cơ bản 27C dẫn xuất từ khungcholestan Trên các khung cơ bản của sapogenin các sapogenin khác nhau bởi mức

độ oxi hóa trên khung hay vị trí, số lượng của các nhóm thế Nhóm thế trongsapogenin thường là hydroxyl, đôi khi gặp nhóm oxo hay sulfat Nhóm OH có thể

tự do hay glycosid hóa với đường Một vài trường hợp nhóm có thể được acyl hóavới các acid hữu cơ Số lượng và vị trí nhóm thế trên khung cũng không nhiều Ở

vị trí C3 của sapogenin gần như luôn có nhóm OH Nhóm OH này trong đa sốtrường hợp có định hướng β Đây cũng là vị trí gắn với đường của đa số saponin.Với số lượng không nhiều các sapogenin, sự đa dạng của saponin chủ yếu do thànhphần, số lượng và vị trí của các đường trong phân tử Ngoài ra, còn có thể gặp cácdây nối trên khung

Đa số saponin có từ 1-2 mạch đường (được gọi là monodesmosid vàbidesmosid) Ở các monodesmosid, phần đường gắn vào sapogenin hầu hết là ở vị

Trang 18

trí C-3 bằng dây nối glycosid Saponin có thể có thêm mạch đường thứ hai Tổng

số đơn vị đường trong một saponin có thể tới 11 đơn vị, nhưng số đường trên mộtmạch được biết tới nay tối đa là 8 Số đơn vị đường trong saponin thường là 1-4đường Đường trong saponin là các đường thông thường như β-D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose và α-L-arabinose… [11]

Dựa trên cấu trúc hóa học của phần genin người ta chia saponin thành 2nhóm lớn là saponin triterpenoid và saponin steroid; mỗi nhóm lại được chia thànhnhiều nhóm nhỏ [11] Nhiều công trình nghiên cứu trước đây đã cho thấy thànhphần chính của thân rễ và rễ củ của cây SVD là saponin thuộc nhóm triterpenoidkhung oleanan với phần sapogenin đã được xác định là acid oleanolic [1]

Hình 1.6 Thành phần saponin thuộc nhóm triterpenoid có trong Sâm Vũ Diệp 1.3 Tổng quan về Stipuleanosid R2

Stipuleanosid R2 là một hoạt chất saponin quan trọng, thành phần manghoạt tính, đang tiếp tục được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, hợpchất này được phân lập trong một số dược liệu như: Sâm Vũ Diệp, Tam Thất hoang,Aralia taibaiensis [14], Aralia elata [17] …

Trang 19

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Stipuleanosid R2 Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2S,3S,4R,5R,6R)-6-

[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-3[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4-

[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b-heptamethyl-8a-carboxylic acid [16]

[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2-Công thức phân tử: C53H84O23 [19].

Phân tử lượng: 1089.232 g/mol [19].

Tính chất lý hóa: Chất bột màu trắng, độ tan: 0,57 g/L, điểm nóng chảy

Năm 2017, Đỗ Văn Hào và Nguyễn Thị Huệ đã tiến hành khảo sát và lựachọn điều kiện sắc ký và xây dựng phương pháp định tính, định lượng acidoleanolic trong dược liệu SVD bằng phương pháp HPLC–DAD Điều kiện sắc ký

và kết quả phân tích định tính, định lượng như bảng 1.2

Trang 20

Bảng 1.2 Điều kiện sắc ký và kết quả phân tích định tính, định lượng acid

oleanolic trong dược liệu Sâm Vũ Diệp

- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt3,5μm)

- Pha động: MeOH - Acid acetic 0,15%/H2O (85:15, v/v)

- Detector UV-DAD phát hiện ở bước sóng: 203 nm - Tốc độ dòng: 1ml/phút

- Thể thích bơm mẫu: 20 µl

- Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng

- Dung môi pha mẫu: Methanol

Định tính: Kết quả phân tích

dung dịch thử (cao tổng ethanol)

có pic oleanolic acid xuất hiện ở

thời gian lưu tR=10,485 phút tương

tự như thời gian lưu của pic

oleanolic acid chuẩn (tR=10,690

phút) [4]

Định lượng: Kết quả cho thấy

hàm lượng acid oleanolic trong caoSVD và dược liệu SVD lần lượt là:0,034% và 0,0066% [12]

Năm 2018, Nguyễn Thị Thu Thủy đã xác định và định lượng thành phầnchính stipuleanosid R2 trong mẫu thân rễ SVD nghiên cứu trong đề tài là 0,49%bằng phương pháp HPLC-DAD được thực hiện trong điều kiện như sau:

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity

 Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)

 Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203 nm

 Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

 Thể thích bơm mẫu: 20 µl

 Nhiệt độ: 25℃

 Dung môi pha mẫu: Methanol

 Pha động: Acetonitril (kênh A): 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chươngtrình gradient như bảng 1.3

Trang 21

Bảng 1.3 Chương trình pha động chạy HPLC-DAD Thời gian

(phút)

Acetonitri l

Với điều kiện sắc ký như trên, các thành phần saponin trong mẫu thử chuẩn

bị từ dịch chiết n-butanol, ethanol thân rễ SVD đều được tách tương đối tốt, pic cânđối, thời gian lưu hợp lý [12]

Nhận xét: Đây là những kết quả bước đầu về các chỉ số định tính, định

lượng thành phần Stipuleanosid R2 trong thân rễ của SVD Cho đến thời điểm hiệntại, chưa có kết quả công bố phân tích các thành phần saponin cụ thể trong các bộphận khác của cây SVD Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân tích địnhtính và định lượng thành phần Stipuleanosid R2-saponin chính trong các bộ phậnSVD bằng phương pháp TLC và HPLC

Trang 22

2 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Hình 2.1 Mẫu dược liệu Sâm Vũ Diệp 2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Chất chuẩn liên kết Stipuleanosid R2 của Wako Chemicals, Nhật Bản (độtinh khiết 98%, mã sản phẩm 155-01701)

- Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đềtài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC

- Ethanol 70% được pha từ Ethanol PA

- Acid acetic 0.5%/H2O được pha từ acid acetic PA (Merk, Đức) - Methanoldùng cho HPLC (Merk Đức)

- Nước cất hai lần đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Metanol, acetonitril) của Merck, Đức

- Sắc ký lớp mỏng pha đảo bằng silica gel 60 RP-18 F254S (Merck,Damstadt, Đức)

2.1.3 Thiết bị

Định dạng
Số trang	45
Dung lượng	1,54 MB