Nghiên cứu thành phần hóa học trong rễ cây phong quỳ Sapa (Anemone chapaensis Gagnep.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC HOÀNG VĂN HÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG RỄ CÂY PHONG QUỲ SAPA Anemone chapaensis Gagnep.. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC HOÀNG VĂ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

HOÀNG VĂN HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG RỄ CÂY

PHONG QUỲ SAPA

(Anemone chapaensis Gagnep.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI- 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

HOÀNG VĂN HÙNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG RỄ CÂY

PHONG QUỲ SAPA

(Anemone chapaensis Gagnep.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn ThS Hà Thị Thanh Hương, Giảng viên Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; PGS.TS Phương Thiện Thương - Trưởng Khoa Hoá Phân Tích -Tiêu Chuẩn, Viện Dược liệu, Bộ Y tế

đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn thầy TS.Vũ Đức Lợi đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo

em trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin đặc biệt cảm ơn anh ThS.Nguyễn Ngọc Hiếu đã giúp đỡ và hướng dẫn

em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị trong khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giảng viên Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận, cũng như

đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường

Cảm ơn bạn Phạm Giang Nam đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm tại Viện Dược Liệu

Xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, bạn bè đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp em có thể hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên Hoàng Văn Hùng

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectroscopy

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 3.1 Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết

ethanol rễ Phong quỳ Sa Pa

16

2 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của 2

hợp chất PQRB 2 và PQRB 3

28-29

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

2 Hình 1.2: Một số saponin tách ra từ Anemone amurensis (Korsh.) Kom 4

3 Hình 1.3: Một số saponin tách ra từ Anemone anhuiensis Y K YANG,

N WANG et W C YE

4

(THUNB.) BOWLES et STEARN

6

7 Hình 1.7: Một số saponin tách ra từ Anemone raddeana Regel 6

8 Hình 1.8: Một số saponin tách ra từ Anemone rivularis var

12 Hình 1.12: Ảnh chụp rễ Phong Quỳ Sapa (Anemone chapaensis

Gagnep.)

10

15 Hình 3.1 : Sơ đồ phân lập một số hợp chất từ phân đoạn BuOH của rễ

cây Phong quỳ Sapa

17

19 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR : 3 protons anomer hợp chất PQRB 2 20

21 Hình 3.7: Các tương tác trên phổ HMBC hợp chất PQRB 2 21

22 Hình 3.8: Cấu trúc hóa học hợp chất PQRB 2 (Huzhangoside A) 22

29 Hình 3.15: Cấu trúc hóa học hợp chất PQRB 3 (Huzhangoside C) 27

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2

1.1.TỔNG QUAN VỀ CHI Anemone 2

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY PHONG QUỲ SA PA (Anemone chapaensis Gagnep.) 9

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 11

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 11

2.2.1 Hóa chất và dung môi 11

2.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ 11

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất 12

2.3.2 Phương pháp phân lập 14

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học 14

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 15

3.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn 15

3.1.1 Lấy mẫu và xác định độ ẩm 15

3.1.2 Chiết xuất 15

3.2 Kết quả phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ rễ cây Phong quỳ Sapa 16

3.2.1 Phân lập một số hợp chất trong rễ cây Phong quỳ Sa Pa 16

3.2.2 Nhận dạng các chất phân lập 18

CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN 30

4.1 Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ phần rễ Phong quỳ Sa Pa 30

4.2 Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 30

KẾT LUẬN 31

KIẾN NGHỊ 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm quanh năm nên Việt Nam

có hệ sinh thái vô cùng phong phú và đa dạng; đi cùng với đó là tiềm năng to lớn về tài nguyên dược liệu (thực vật, động vật, khoáng vật) nói chung và tài nguyên cây thuốc nói riêng

Hiện nay một lượng lớn các hợp chất thiên nhiên được sàng lọc và phân lập từ động thực vật, chúng đã được chứng minh giá trị đối với khả năng chữa bệnh cho người, hoặc trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm Trải qua hàng nghìn năm, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ trong chữa bệnh dân gian, các bài thuốc cổ phương, chân truyền đã được cha ông ta đúc kết và truyền lại; đó là nguồn kiến thức quý báu mà chúng ta cần đầu tư nghiên cứu và ứng dụng; đây là xu hướng và là mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu dược phẩm, thực vật học hiện nay

Ở độ cao 1500-1800m, đèo Hoàng Liên thuộc Ô Qui Hồ huyện Sapa tỉnh Lào Cai quanh năm mây mù và độ ẩm rất lớn; nơi đây có một loài thực vật được nhà thực vật Pháp Gagnepain mô tả lần đầu tiên năm 1929 [11] mang tên gọi Phong quỳ Sapa

(Anemone chapaensis Gagnep.) Kinh nghiệm dân gian địa phương cho thấy rễ cây

Phong quỳ Sapa được người dân sử dụng để chữa các bệnh viêm họng, viêm túi mật, đau dạ dày, đau răng, phong thấp , xương khớp đau nhức Mặc dù được đánh giá là

có nhiều tiềm năng khai thác cho mục đích chữa bệnh , nhưng cho đến nay mới chỉ

có một số rất ít nghiên cứu về đặc điểm thực vật, tác dụng sinh học và thành phần hóa học phần trên mặt đất của cây Phong quỳ Sapa

Với mục đích tìm hiểu về thành phần hóa học của rễ cây Phong quỳ Sa Pa, một cây đặc hữu của địa phương, để góp phần vào việc khai thác bảo tồn và phát triển loài này, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài:“NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA

HỌC TRONG RỄ CÂY PHONG QUỲ SAPA (Anemone chapaensis Gagnep.)” với mục tiêu: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 1-2 chất trong

rễ cây Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.)

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI Anemone

1.1.1 Thực vật học

- Vị trí phân loại

Chi Anemone thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên

(Ranunculales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) [2], [3]

- Đặc điểm thực vật

Cây thảo, sống nhiều năm, gốc thành củ, có thân rễ hoặc mọc thành bụi Lá mọc so le, bị chia cắt sâu nhiều hay ít Hoa đều, đơn độc hay thường thành tán có một bao chung gồm 3 lá chét Đài dạng cánh, có màu trắng, vàng, đỏ hoặc lam, 5-10 phiến; tràng không có; nhị nhiều, lá noãn có vòi nhụy Quả bế, đơn hạt, rời, tập hợp thành đầu [3]

- Phân bố

Phân bố chủ yếu ở miền bắc Ấn Độ, Nepal, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản,

Bắc Mỹ… [13,30]; chi Anemone có khoảng 120-150 loài [4,27,11], trong đó đã phát

hiện ở Trung Quốc khoảng 50 loài

Chi Anemone hay Phong quỳ ở Việt Nam, xuất hiện nhiều ở các tỉnh vùng núi

phía Bắc như: Yên Bái, Lai Châu, Hà Giang và vùng núi cao miền trung [1], [2], [3]

Việt Nam có 05 loài là A japonica, A rivularis, A chapaensis, A polilanei, A sumatrana, trong đó có 02 loài được nghiên cứu nhiều là A japonica và A rivularis

[11], [2], [13], [5]

1.1.2 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học chính trong các loài thuộc chi Anemone là saponin và flavonoid trong rễ và lá của các loài như Anemone tomentosa, Anemone rivularis, Anemone altaica, Anemone amurensis, Anemone anhuiensis, Anemone begoniifolia, Anemone coronaria, Anemone flaccida var hofengensis, Anemone hupehensis, Anemone raddeana, Anemone taipaiensis [8,14,15,17,18,20-23,31-34] Ngoài ra trong các loài Anemone còn chứa diterpenoid glycosid, coumarin, một số acid béo

[7]

Sơ lược các hợp chất được tách ra từ chi Anemone

Flavonoid trong chi Anemone

Saponin chính trên chi Anemone

Anemone amurensis (Korsh.) Kom,[22]

Hình 1.2: Một số saponin tách ra từ Anemone amurensis (Korsh.) Kom

Anemone anhuiensis Y K YANG, N WANG et W C YE (Ranunculacese) [32,33]

Hình 1.3: Một số saponin tách ra từ Anemone anhuiensis Y K YANG, N WANG

et W C YE

Anemone begoniifolia H.Lév & Vaniot [20]

Hình 1.4: Một số saponin tách ra từ Anemone begoniifolia H.Lév & Vaniot

Anemone coronaria L [23]

Hình 1.5 : Một số saponin tách ra từ Anemone coronaria L

Anemone hupehensis LEM var japonica (THUNB.) BOWLES et STEARN [17,29,34]

Hình 1.6: Một số saponin tách ra từ Anemone hupehensis LEM var japonica

(THUNB.) BOWLES et STEARN

Anemone raddeana Regel (Rununculaceae) [21,18]

Hình 1.7: Một số saponin tách ra từ Anemone raddeana Regel

Anemone rivularis var flore-minore Maxim [8]

Hình 1.8: Một số saponin tách ra từ Anemone rivularis var flore-minore Maxim

Anemone tomentosa (Maxim.) C.Pei [14,15,31]

Hình 1.9: Một số saponin tách ra từ Anemone tomentosa (Maxim.) C.Pei

Hình 1.10: Một số saponin tách ra từ Anemone tomentosa (Maxim.) C.Pei

1.1.3 Tác dụng sinh học và công dụng

1.1.3.1 Công dụng trong dân gian

Cây phong quỳ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa các bệnh về

tim (phối hợp với các thuốc khác), điều trị viêm họng, sưng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu [2]

1.1.3.2 Tác dụng sinh học

Các saponin nhóm triterpenoid là thành phần chính trong rễ của chi này có tiềm năng cao trong kháng u, kháng khuẩn, chống oxi hóa, chống viêm… [9], [28], [35] Trong y học dân gian Trung Quốc, hơn 10 loài đã được nhắc đến và sử dụng

Ví dụ: trong dược điển Trung Quốc, thân rễ của A raddeana được dùng để điều trị bệnh thấp khớp và đau thần kinh [26]; A rivularis được sử dụng để điều trị bệnh viêm gan, viêm cơ, đau khớp, phù nề… [30]; rễ của A tomentosa được người dân Trung

Quốc dùng điều trị bệnh lỵ, sốt rét, suy dinh dưỡng trẻ em.Ở một số nước Châu Á thì

A japonica dùng chữa bệnh về tim (phối hợp với thuốc khác), A rivullaris để điều

trị viêm họng, sưng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống,

bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu [3]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY PHONG QUỲ SA PA (Anemone chapaensis

Gagnep.)

Đến nay mới thấy các tài liệu mô tả về hình thái thực vật của Phong quỳ Sa Pa

A chapaensis Gagnep., và mộtnghiên cứu chi tiết về đặc điểm thực vật (vi phẫu, soi bột), và một nghiên cứu về thành phần hóa học phần trên mặt đất của cây

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

1.2.1.1 Đặc điểm thực vật

Vào năm 1929, Phong quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep được nhà thực

vật Pháp Gagnepain mô tả lần đầu tiên [11] Cây Phong quỳ Sa Pa được mô tảlà cây thảo, thân 2-4cm mang lá chụm ở đất Lá có cuống dài 10-15cm, mềm, có lông rải rác; phiến hình tim có 3 thùy, không lông, bìa có răng tròn Trục mang hoa cao hơn 20cm; lá hoa 6-7, dài 2-3,5cm; lá đài 5, đầu tù hay lõm, cao 2-4cm; tiểu nhụy nhiều; tâm bì không lông, không vòi nhụy Quả bế không cọng, không lông, dẹp dẹp, dài 4-5mm [13], [36], [11]

Hình 1.11: Tiêu bản thực vật Anemone chapaensis Gagnep [37]

Anemone chapaensis là loài đặc hữu của miền Bắc Việt Nam mới chỉ gặp ở Sa

Pa, tỉnh Lào Cai., Cây mọc rải rác trong rừng vùng núi đá, nơi ẩm, ven khe suối, ở độ cao 1200-1500m Ưa bóng, mát Tái sinh bằng thân rễ [13], [1], [11]

1.2.2 Thành phần hóa học và tác dụng sinh học

Hiện tại đã có một số nghiên cứu về đặc điểm thực vật , thành phần hoá học

và tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của Phong quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis

Gagnep.)

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thực vật được tiến hành trên phần rễ cây Phong quỳ Sa Pa khi cây

có đủ hoa, quả được thu hái ở đèo Hoàng Liên (Ô Qui Hồ, ở độ cao 1500 đến 1800m), thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

Mẫu tiêu bản khô gồm có cành, lá, hoa số 01 thu hái ngày 11/9/2013 và mẫu tiêu bản số 02 thu hái ngày 24/5/2015 tại đèo Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai được giám định bởi TS.Đỗ Thị Xuyến; được lưu giữ tại phòng Bách thảo thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

Mẫu dược liệu được lưu giữ tại Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hóa chất và dung môi

- Các dung môi công nghiệp dùng để chiết: cồn 96%, hexan, ethyl acetat,

n-butanol, nước cất

- Các dung môi tinh khiết (PA) dùng trong sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột

- Acid acetic, HCl (Merk)

- Các thuốc thử, dung môi, hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

2.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ

- Bản mỏng silica gel F254 và RP-18 F254S tráng sẵn trên tấm nhôm (Merck)

- Bột silica gel pha thường cỡ hạt 40-200 µm, pha đảo RP-18 cỡ hạt 30-50 µm (Merck)

- Cân kỹ thuật Sartorius, cân phân tích Precisa XT 220A

- Máy xác định độ ẩm Precisa XM60-HR, tủ sấy Shellab, đèn tử ngoại

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 10 lít, máy cất quay

- Dụng cụ thủy tinh: các loại cột sắc ký đường kính từ 1-10cm, dài từ 30-100 cm; bình cầu ngoại dung tích 50-2000 ml; ống nghiệm, ống đựng mẫu NMR, pipet chính xác…

- Máy đo phổ khối lượng (MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap

- Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer

- Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Viện dược liệu - Bộ Y tế; Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất

Rễ cây Phong quỳ được rửa sạch sau khi thu hái, sau đó được thái nhỏ và phơi khô trong bóng râm Mẫu tiếp tục được đem chiết nóng ở 70oC bằng dung môi cồn 96%, chiết 3 lần sau đó gộp dịch lại và tiến hành cất thu hồi dung môi và thu được cao toàn phần Ethanol

Phân tán cao chiết này trong nước cất và chiết phân bố qua ba phân đoạn hexan, ethyl acetat, n-Butanol Mỗi phân đoạn chiết 3 lần, sau đó dịch chiết ở mỗi

n-phân đoạn được đem đi cô thu hồi dung môi và thu được cao trên các n-phân đoạn

Dược liệu

Dịch chiết Ethanol

Cắn toàn phần

Phân đoạn Ethyl Acetat

Phân đoạn nước 2

chiết nóng 3 lần với cồn 96%

thu hồi dung môi

Phân tán trong H2O chiết phân đoạn với n-Hex thu hồi dung môi

Chiết phân đoạn với BuOH thu hồi dung môi

thu hồi dung môi

Chiết phân đoạn với EtOAc

Hình 2.1: Sơ đồ quá trình chiết xuất Rễ Phong quỳ Sapa

2.3.2 Phương pháp phân lập

Lựa chọn phân đoạn có tiềm năng và tiến hành xử lý và phân lập Quá trình

phân lập các hợp chất từ phân đoạn đã chọn sử dụng phương pháp sắc kí cột với các chất hấp phụ là hạt silica gel pha thường, pha đảo Sắc ký lớp mỏng được dùng để theo dõi vết các chất từ dịch chiết phân đoạn và sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập

Đặc điểm chính của những phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu [6]:

 Sắc ký cột:

o Cột thủy tinh: đường kính thay đổi từ 1-10cm, chiều dài từ 30-100 cm

o Pha tĩnh: thường dùng hạt silica gel pha thuận cỡ hạt 63-200 μm (dùng cho cột to đường kính khoảng 10 cm) hoặc 40-63 μm (dùng cho cột có đường kính 5 cm trở xuống); silica gel pha đảo cỡ hạt 30 - 50 μm

o Phương pháp nạp cột và đưa mẫu lên cột: Hạt silica gel được nạp vào cột theo phương pháp nạp cột ướt sử dụng hỗn hợp dung môi chính là pha động để rửa giải Lựa chọn pha động rửa giải căn cứ vào bản mỏng sắc ký Mẫu phân lập được đưa lên cột bằng cách đưa thẳng dung dịch hòa tan mẫu hoặc phân tán mẫu trong silica gel, sau đó làm khô silica gel, nghiền mịn rồi đưa lên cột

o Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy tinh Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng

5 - 10 phút

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học

Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết (đã được kiểm tra độ tinh khiết sơ

bộ bằng SKLM ) được xác định căn cứ vào tính chất hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và các dữ liệu phổ: phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC ) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn

3.1.1 Lấy mẫu và xác định độ ẩm

Rễ Phong quỳ thu hái tại Sa Pa được sấy ở 60oC đến khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu

Lấy khoảng 2g mẫu nghiên cứu đã làm nhỏ để xác định độ ẩm Bật máy đo độ

ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 130oC Trải đều mẫu nghiên cứu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả, đo 3 lần rồi lấy kết quả trung bình

Độ ẩm mẫu nghiên cứu xác định được là 12,7%

Hòa cắn toàn phần PQR với một lượng vừa đủ nước nóng 60oC Sử dụng

phương pháp chiết lỏng-lỏng chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan, ethyl acetat

và n-butanol Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn để được kí

hiệu lần lượt là PQRH, PQRE và PQRB

Bảng 3.1 Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết Ethanol rễ Phong quỳ Sa Pa

Khối lượng dược liệu (g)

Khối lượng cắn (g)

% so với nguyên liệu khô

3.2.1 Phân lập một số hợp chất trong rễ cây Phong quỳ Sa Pa

Phân lập các chất có trong phân đoạn BuOH bằng sắc ký cột Cột sắc ký được làm sạch, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột Nhồi cột bằng phương pháp nhồi cột ướt với chất nhồi cột pha thuận là silica gel Ổn định cột trong 12-24h

Cắn Buthanol (PQRB – 100g) được phân lập trên cột pha thuận silica gel, rửa giải với hệ dung môi EtOAc:MeOH:H2O theo gradient nồng độ từ tỷ lệ EtOAc:MeOH: H2O =15 :1: 0,3 đến MeOH 100% Kiểm tra các dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng và dồn các ống có sự tương đồng cao, loại dung môi dưới áp suất

giảm thu được 2 phân đoạn có tiềm năng: PĐ13 và PĐ25

Phân đoạn PĐ13 (1,3 g) được tiếp tục phân lập trên cột pha đảo RP18, rửa giải

gradient với hệ dung môi metanol-nước với tỷ lệ metanol tăng dần từ 70% đến 85% Kiểm tra thành phần của dịch rửa giải bằng SKLM để dồn các ống có cùng thành

phần thu được 2 phân đoạn nhỏ có tiềm năng : PĐ13.1, PĐ13.2 Phân đoạn PĐ13.2

có hợp chất kết tinh màu vàng, loại dung môi thu được chất PQRB2 (60mg)

Phân đoạn PĐ25 (1,5g) được tiếp tục phân lập trên cột pha đảo RP18, rửa

giải gradient với hệ dung môi metanol-nước đẳng dòng với tỷ lệ metanol 70% Kiểm tra thành phần của dịch rửa giải bằng SKLM để dồn các ống có cùng thành

phần thu được 2 phân đoạn nhỏ PĐ25.1 và PĐ25.2 Phân đoạn PĐ25.1 có hợp chất kết tinh màu vàng nhạt, loại dung môi thu được PQRB3 (75mg)

Hình 3.1 : Sơ đồ phân lập một số hợp chất từ phân đoạn BuOH của rễ cây Phong

quỳ Sapa (Anemone chapaensis Gagnep.)

3.2.2 Nhận dạng các chất phân lập

Hợp chất PQRB 2

Hợp chất PQRB 2 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, khối

lượng phân tử được xác định là 866,5 dựa vào pic ion (+) tại m/z 889,4 [M-Na]+ trên

phổ khối ESI-MS, tương ứng với công thức phân tử C46H74O15 với độ bất bão hòa là 10.Nhiệt độ nóng chảy : 280-283 oC

Phổ 1H-NMR của hợp chất thể hiện 7 tín hiệu methyl mũi đơn tại δH 1,07 (s, H-23); 0,88 (s, H-24); 0,96 (s, H-25); 0,82 (s, H-26); 1,18 (s, H27); 0,92 (s, H-29); 0,96ppm (s, H-30), kết hợp với hai tín hiệu carbon không no tại δC 123,48 (C-12) và 145,02 (C-13) và một tín hiệu carboxylic tạiδC 181,78 (C-28)trên phổ 13C-NMR Điều này gợi ý rằng hợp chất PQRB 2 mang khung triterpenoid loại oleanan [31]

Hình 3.2: 7 tín hiệu methyl mũi đơn

Hình 3.3 : Tín hiệu CH3 trên phổ DEPT

Hình 3.4 : Phổ 13C-NMR : Tín hiệu olefin và cacboxylic Căn cứ vào dữ liệu phổ trên ta thấy sự xuất hiện của 30 tín hiệu cacbon của phần

aglycon ( khung triterpenoid loại oleanan )

Kết hợp cùng các tài liệu tham khảo ta dựng được khung oleanan

Hình 3.5 : Cấu trúc khung oleanan

Thêm vào đó, phổ 1H-NMR còn thấy sự xuất hiện của 3 tín hiệu proton anomer tại δH 4,40 (1H, d, J= 7Hz); 5,35 (1H, brs); 4,99 (1H, d, J= 5Hz), điều này chỉ ra rằng

phân tử PQRB 2 còn gắn thêm 3 phân tử đường vào cấu trúc

Hình 3.6: Phổ 1H-NMR : 3 protons anomer hợp chất PQRB 2

Vị trí gắn đường được xác định bởi tương quan HMBC của H-1(xyl) (δH 4,40)

và C-3 (δC 90.14)

Tương tự như vậy, phần đường còn lại được xác định gắn với nhau thông qua các tương quan HMBC của H-1(rha I) (δH 5,35) / C-2(xyl) (δC 78,4) và H-1(rib) (δH 4,99) / C-3(rha I)(δC 80,7) Hơn nữa, dữ liệu phổ của PQRB 2 được xác nhận trùng khớp với dữ liệu đã công bố của huzhangoside A [24,25], do đó công thức cấu tạo

của PQRB 2 được xác định là 3β-[(O-β-ᴅ-ribopyranosyl-(1→3)-O-α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)-β - ᴅ -xylopyranosyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid], với tên

-thường gọi là Huzhangoside A

Hình 3.7 : Các tương tác trên Phổ HMBC hợp chất PQRB 2

Căn cứ toàn bộ các thông tin trên cùng với dữ liệu phổ HSQC , kết hợp với các tài liệu đã công bố ta thu được cấu trúc hợp chất PQRB 2

Hình 3.8 : Cấu trúc hóa học của hợp chất PQRB 2 (Huzhangoside A)

Hợp chất PQRB 3

Hợp chất PQRB 3 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt,

khối lượng phân tử được xác định là 1336.7, dựa vào pic ion dương trên phổ ESI-MS

tại m/z 1359,7 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tửC64H104O29 , độ bất bão hòa

là 13 Nhiệt độ nóng chảy : 269 – 272 oC

Tương tự như PQRB 2, phổ 1H-NMR của hợp chất PQRB 3 cũng thể hiện 7

tín hiệu methyl mũi đơn tại δH 1.06 (s, H-23), 0.88 (s, H-24), 0.97 (s, H-25), 1.29 (s, H-26), 1.18 (s, H-27), 0.94 (s, H-29), 0.97 (s, H-30) Kết hợp với hai tín hiệu carbon không no tại δC 123.8 (C-12) và 144.8 (C-13) và một tín hiệu carboxylic tại δC 178.1 (C-28) trên phổ 13C-NMR Điều này gợi ý rằng hợp chất PQRB 3 cũng mang khung triterpenoid loại oleanan [31]

Hình 3.9 : Phổ tín hiệu 7 proton metyl (7 mũi đơn )

Hình 3.10 : Phổ DEPT : Tín hiệu CH3

Hình 3.11 : Phổ 13C-NMR : Tín hiệu olefin và cacboxylic

Căn cứ vào dữ liệu phổ trên ta thấy sự xuất hiện của 30 tín hiệu cacbon của phần aglycon ( khung triterpenoid loại oleanan )

Kết hợp cùng các tài liệu tham khảo ta dựng được khung oleanan

Hình 3.12 : Cấu trúc khung oleanan

Tuy nhiên, khác với PQRB 2, phổ 1H-NMR của PQRB 3 xuất hiện 6 tín hiệu proton anomer tại δH 4.41 (1H, d, J= 7Hz), 5.38 (1H, brs), 4.42 (1H, d, J=8Hz), δH

5.36 (1H, d, J= 8Hz), 5.00 (1H, d, J=4.5Hz), 4.86 (1H, brs), điều này chỉ ra rằng phân

tử PQRB 3 gắn thêm 6 phân tử đường nữa

Hình 3.13 : Phổ 1H-NMR : 6 protons anomer hợp chất PQRB 3

Vị trí gắn đường vào gốc aglycon được xác định bởi tương quan HMBC của

H-1(xyl) (δH 4,40) với C-3 (δC 90.14) và H-1(glc I) (δH 5,36) với C-28 (δC 178,1)

Với phần đường gắn vào C-3 qua liên kết ether, các đường được xác định gắn

với nhau thông qua các tương quan HMBC của H-1(rha I) (δH 5,378) /C-2(xyl) (δC

79,5) và H-1(rib) (δH 5,00) / C-3(rha I) (δC 80,8) Trong khi đó, các liên kết của phần

đường gắn vào C-28 qua liên kết ester được xác định bởi các tương quan HMBC của

H-1(glc II) (δH 4,42) /C-6(glc I) (δC 69,5) và H-1(rha II) (δH 4,40) / C-4(glc II) (δC 78,08)

Hình 3.14 : Phổ HMBC hợp chất PQRB 3

Hơn nữa, dữ liệu phổ của PQRB 3 được xác nhận trùng khớp với dữ liệu đã

công bố của huzhangoside C [25,16], do đó công thức cấu tạo của PQRB 3 được xác

định là 3β-[(O- β -ᴅ-ribopyranosyl-(1→3)-O-α-Lrhamnopyranosyl(1→2) β ᴅ xylopyranosyl)oxy]olean-12-en-28-oic acid-O- α -L-rhamnopyranosyl (1→4)-O- β -

-ᴅ -glucopyranosyl-(1→6)- β - -ᴅ -glucopyranosyl ester, với tên thường gọi là Huzhangoside C

Căn cứ toàn bộ các thông tin trên cùng với dữ liệu phổ HSQC , kết hợp với các tài liệu đã công bố ta thu được cấu trúc hợp chất PQRB 3

Hình 3.15 : Cấu trúc hóa học của hợp chất PQRB 3 ( Huzhangoside C )

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của 2 hợp chất PQRB 2 và PQRB 3

Mẫu PQRB 2 đo trong 600 uL MeOD + 50 uL CDCl3

Mẫu PQRB 3 đo trong 600 µL MeOD

CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN

4.1 Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ phần rễ Phong quỳ Sa Pa

Rễ Phong quỳ sau khi đã làm nhỏ được chiết nóng với cồn 96% ở 70oC (chiết

4 lần, mỗi lần 8 tiếng) Phương pháp này giúp tiết kiệm thời gian , đồng thời có thể đảm bảo chiết xuất triệt để hơn so với phương pháp chiết lạnh Khối lượng cao toàn phần sau quá trình này đạt 245g (~10% so với nguyên liệu khô )

Đối với quá trình chiết phân đoạn bằng phương pháp lỏng-lỏng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần n-Hexan, Ethyl Acetate, Buthanol Khối lượng cắn n-butanol là cao nhất (4.1%), điều này cho thấy các hợp chất phân cực (saponin) chiếm

tỷ lệ lớn trong cây

4.2 Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

Quá trình phân lập sử dụng các phương pháp sắc ký khác nhau trong đó chủ yếu là sắc kí cột; đây là một phương pháp phổ biến và được ứng dụng nhiều tại Việt Nam do giá thành rẻ, nguyên vật liệu dễ kiếm và dễ tiến hành

Sau quá trình phân lập thu được 02 hợp chất từ phân đoạn Buthanol của mẫu nghiên cứu Dựa theo đặc điểm lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy), phổ khối (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC) và qua đối chiếu với các tài liệu đã công bố, 2 hợp chất này được xác định lần lượt là

Huzhangoside A và Huzhangoside C; hai hợp chất này lần đầu tiên được tách ra từ

rễ loài Anemone chapaensis Gagnep., góp phần bổ sung thêm kiến thức về loài này

Huzhangoside A: Hợp chất Huzhangoside A là một saponin loại oleanan đã

từng được phân lập từ loài Anemone hupehensis LEM var japonica (THUNB.)

BOWLES et STEARN[17,29,34] và loài Anemone rivularis Buch.-Ham ex DC [8]

Năm 2009, Akihito YOKOSUKA và cộng sự đã thực hiện quá trình nuôi cấy

tế bào và nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của huzhangoside A trên các dòng tế bào : HL-60, A549, HSC-2 và HSC-4 Kết quả này đã chứng minh tiềm năng gây độc tế bào của huzhangoside A có thể được khai thác trong điều trị ung thư[34]

Huzhangoside C : Hợp chất Huzhangoside C là một saponin loại oleanan đã

từng được tách ra trên loài Anemone rivularis Buch.-Ham ex DC[8] Nhưng cho đến

nay chưa có bất cứ nghiên cứu nào về tác dụng sinh học của hợp chất này, điều này

mở ra hướng nghiên cứu dược lý mới từ hợp chất này, đặc biệt khi hàm lượng của nó trong phần rễ là tương đối cao

KẾT LUẬN

Như vậy trải qua quá trình thực hiện, đề tài khoá luận đã thu được một số kết quả sau đây :

- Phân lập thành phần chính trong rễ phong quỳ Sapa (Anemone chapaensis

Gagnep.) trong phân đoạn Buthanol (02 hợp chất)

- Xác định cấu trúc hóa học, tên gọi của các hợp chất đã phân lập được (Huzhangoside A và Huzhangoside C)

KIẾN NGHỊ

Do thời gian cũng như điều kiện kinh phí còn hạn hẹp nên khóa luận chưa thực sự

đóng góp được nhiều cho kiến thức về loài Anemone chapaensis Gagnep

Xin có một số kiến nghị sau :

- Nghiên cứu thêm về thành phần hóa học trong rễ cây Phong quỳ Sapa nói riêng

và trên toàn bộ cây nói chung

- Nghiên cứu về tác dụng sinh học của các nhóm chất tồn tại trong rễ Phong quỳ Sapa

- Cần xây dựng chiến lược khai thác hợp lý cho dù phục vụ bất kì mục đích nào (nghiên cứu hoặc thương mại hóa ) do phong quỳ Sapa là loài mọc hoang và đang có nguy cơ bị tàn phá do khai thác thiếu kiểm soát

- Nghiên cứu phát triển các sản phẩm dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng phục vụ hỗ trợ hoặc điều trị bệnh cho cộng đồng với nguồn gốc từ phong quỳ

Sapa nói riêng và chi Anemone nói chung

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Việt Nam

1 Nguyễn Tiến Bân, V P Serov (2003), Danh lục các loài thực vật Việt Nam,

tập II, Nhà xuất bản Nông nghiệp

2 Võ Văn Chi (2003), Từ điển Thực vật thông dụng, tập I, NXB Khoa học Kỹ

thuật

3 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, tập I, tr.320, NXB Trẻ

4 Trần Văn Ơn (2012), Thực vật và nhận biết cây thuốc, Trung tâm thông tin-

Thư viện Đại học Dược Hà Nội

5 Đặng Kim Vui, Hoàng Văn Hùng (2013), “Đánh giá đa dạng sinh học thực vật

đặc hữu và quý hiếm tại vườn quốc gia Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào

Cai”, Tạp chí khoa học và công nghệ, 104(04):49-54

6 Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và kỹ

thuật, tr.493-511, 581-602

Tài liệu nước ngoài

7 Aitzetmüller K (1995), “Fatty acid patterns of Ranunculaceae seed oils”, Plant

systematics and evolution, 9:229–240

8 Chau Thi Anh Minh, Nguyen Minh Khoi, Phuong Thien Thuong, In Hyun

Hwang, Dong Woo Kim, MinKyun Na (2012), “A new saponin and other

constituents from Anemone rivularis Buch.-Ham.”, Biochemical Systematics and Ecology 44, 270–274

9 Chen X, Li JC, He WF, Chi HD, Yamashita K, Manabe M, Kodama H (2009)

“Antiperoxidation activity of triterpenoids from rhizome of Anemone

raddeana”, Fitoterapia, 80(2):105-111

10 Ding Yu, Tang Hai-Feng, Wang Jian-Bo, Liu Dan, Tian Xiang-Rong, Wang

Xiao-Yang, Zhou Xiao-Ming (2011), “Triterpenoid saponins from Anemone

rivularis var flore-minore”, Biochemical Systematics and Ecology, 39, 236–

239