Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất của cây Phong quỳ Sapa (Anemone chapaensis Gagnep.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC PHẠM GIANG NAM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CỦA CÂY PHONG QUỲ SA PA Anemone chapaensis Gagnep... ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

PHẠM GIANG NAM

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CỦA CÂY PHONG QUỲ SA PA

(Anemone chapaensis Gagnep.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: PHẠM GIANG NAM

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT CỦA CÂY PHONG QUỲ SA PA

(Anemone chapaensis Gagnep.)

Người hướng dẫn: PGS.TS Phương Thiện Thương

Ths Hà Thị Thanh Hương

Hà Nội – 2017

Lời cảm ơn

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS.Phương Thiện Thương – Trưởng phòng Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, Bộ Y tế và Ths Hà Thị Thanh Hương – Giảng viên Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu viên của phòng Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm tại Viện Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Nguyễn Ngọc Hiếu vì những chỉ bảo ân cần cho em khi thực hiện khóa luận này

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đặc biệt là thầy TS Vũ Đức Lợi đã có những góp ý quý báu trong quá trình em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến chị Trịnh Thị Diệp Thanh vì những giúp đỡ

và đồng hành trong quá trình thực hiện quá luận này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy cô trong Khoa Y Dược

đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm theo học tại trường

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, những người

đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp con có thể hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Phạm Giang Nam

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

APCI-MS: Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectroscopy

CD3OD : methanol-d4 (NMR solvent)

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

d : doublet

dd : double of doublet

ESI-MS : ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy

EtOAc : ethyl acetat

PQLE: cắn ethyl acetat

PQLD: cắn ethanol sau khi chạy qua cột Diaion

PQLW: cắn phân đoạn nước sau quá trình lắc chiết phân đoạn

q : quartet

s : singlet

SKLM: Sắc ký lớp mỏng

t : triplet

TT: thuốc thử

v/v : volume to volume ratio

DANH MỤC BẢNG, BIỂU

1 Bảng 3.1: Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết Ethanol

phần trên mặt đất Phong quỳ Sa Pa

18

2 Bảng 3.2: Kết quả SKLM của 2 chất với 3 hệ dung môi 25

3 Hình 1.3: Một số flavonoid phân lập từ chi Anemone 7

4 Hình 1.4: Một số coumarin phân lập từ chi Anemone 8

5 Hình 1.5: Một số hợp chất khác phân lập từ chi Anemone 9

7 Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ phần trên mặt

đất loài Phong quỳ Sa Pa

17

8 Hình 3.2: Sắc ký đồ của cắn ethyl acetat (hệ III) ở các điều

kiện quan sát: UV254, UV365, sau khi phun thuốc thử dưới

13 Hình 3.7: Cấu trúc hóa học và phổ NMR của hợp chất 1 26

14 Hình 3.8: Cấu trúc hóa học và phổ NMR của hợp chất 2 28

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Thực vật học 2

1.1.1 Vị trí phân loại chi Anemone 2

1.1.2 Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Anemone 2

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Anemone 2

1.2 Thành phần hóa học chi Anemone 4

1.3 Công dụng và tác dụng 10

1.3.1 Công dụng trong dân gian 10

1.3.2 Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu của chi Anemone 10 1.4 Vấn đề cần giải quyết 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 12

2.1.1 Nguyên liệu 12

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn 13

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 14

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 16

3.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn 16

3.1.1 Lấy mẫu và xác định hàm ẩm 16

3.1.2 Chiết xuất 16

3.2 Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong phân đoạn ethyl

acetat từ dịch chiết phần trên mặt đất Phong quỳ Sa Pa 18

3.2.1 Định tính cắn ethyl acetat bằng sắc kí lớp mỏng 18

3.2.2 Phân lập một số hợp chất từ cắn ethyl acetat 19

3.2.3 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 21

3.2.4 Xác định các hợp chất phân lập được 25

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 29

4.1 Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ phần trên mặt đất Phong quỳ Sa Pa 29

4.2 Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 29

KẾT LUẬN 32

KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm cao, lượng mưa lớn, vì vậy thảm thực vật phát triển vô cùng phong phú với trên 12000 loài thực vật trong đó 4000 loài có khả năng sử dụng làm thuốc Với hệ thực vật đa dạng như vậy, chúng không những cung cấp nguồn thực phẩm dồi dào

mà còn cho chúng ta nguồn thuốc chữa bệnh quý giá Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể

Chi Phong quỳ, họ Mao lương (Ranunculaceae), từ lâu được người dân dùng rễ để điều trị viêm họng, sưng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu [1] Cây Phong quỳ Sa Pa, tên khoa học

là Anemone chapaensis Gagnep, được Gagnepain miêu tả lần đầu tiên năm

1929 [7], tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học và tác dụng của loài thực vật này

Nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác, nghiên cứu và nâng cao giá trị sử dụng loài dược liệu này, luận văn được thực hiện với đề tài: “Nghiên

cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất của cây Phong quỳ Sapa (Anemone

chapaensis Gagnep.)” với mục tiêu:

1 Chiết xuất, phân lập được 2 hợp chất tinh khiết từ phần trên mặt đất của loài Phong quỳ Sa Pa

2 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Thực vật học

1.1.1 Vị trí phân loại chi Anemone

Chi Anemone thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên

(Ranunculales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan

(Magnoliophyta)

1.1.2 Số lượng loài và sự phân bố các loài thuộc chi Anemone

1.1.2.1 Trên thế giới

Chi Anemone gọi là chi Phong quỳ, hay còn gọi là Dã miên hoa gồm

khoảng 120 loài được phân bố rộng khắp trên toàn cầu, tập trung tại vùng ôn đới Bắc, Ấn Độ, Nepal, Nam Trung Quốc, Nhật Bản và Bắc Việt Nam [2]

Chi Anemone gồm có một số loài đã được nghiên cứu rộng rãi trên thế

giới như:

- Anemone raddeana Regel

- Anemone taipaiensis W.T Wang

- Anemone tomentosa (Maxim.) Pei

- Anemone rivularis Glacier

1.1.2.2 Ở Việt Nam

Chi Anemone ở Việt Nam có 05 loài: A Japonica, A Rivularis, A

Chapaensis, A.Polilanei, A Sumatrana [1]

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Anemone

Chi Anemone, họ Hoàng Liên (Ranunculaceae): Cây thảo sống nhiều

năm, gốc thành củ, có thân rễ hoặc mọc thành bụi Lá mọc so le, bị chia cắt sâu nhiều hay ít Hoa đều, đơn độc hay thường thành tán có một bao chung gồm 3 lá chét Đài dạng cánh, có màu trắng, vàng, đỏ hoặc lam, 5 - 10 phiến; tràng không có; nhị nhiều, lá noãn có vòi nhụy Quả bế, đơn hạt, rời, tập hợp thành đầu [2]

3

A.japonica (Thunb.) Sieb et Zucc – Phong quỳ Nhật: Cây thảo cao từ

80cm-1m, bậm, có lông mềm Lá chụm ở gốc, có cuống dài đến 8mm, có lông mịn; lá chét 3-5 hay rõ ràng có 3-5 thùy, có lông mịn ở trên, có lông dài ở dưới, dạng tim, đường kính 15-20cm Bao chung có 3 lá giống với những lá ở thân nhưng tiêu giảm hơn Cụm hoa gồm 3-4 hoa trắng, có cuống hoa dài 5cm hay hơn; hoa rộng 3-4cm; lá đài hoa rộng 1,5cm, nhị nhiều, lá noãn có nhụy Quả bế đầy lông len, có cuống khá dài, có vòi nhụy ngắn [1]

A.rivularis Buch Ham ex DC – Phong quỳ bò hay phong quỳ suối:

Cây thảo cao 30-40cm, mang 1-3 tầng nhánh mang hoa Lá đa dạng ở gốc thân, do 3 lá chét xoan rộng, không lông, lá trên thân hẹp Bao chung do 3 lá bắc xẻ, nhọn; hoa có 5-8 lá đài xoan, cao 1,5cm, mặt trong trắng, mặt ngoài lam; nhị nhiều, lá noãn có vòi nhụy Quả bế cao 12mm, có mỏ cong [1]

A.chapaensis Gagnep – Phong quỳ Sapa: Cây thảo, sống nhiều năm,

thường mọc thành bụi, cao từ 10-30 cm Thân rễ hình trụ màu nâu đen, nạc, đường kính 2-4 cm, mang các rễ phụ nhỏ Thân non màu tím, phủ nhiều lông nhỏ trắng mịn, chuyển sang màu xanh lúc già; lông che chở tập trung chủ yếu

ở cành non và ở các mấu thân, mang lá tập trung ở gốc Lá có cuống dài

10-15 cm, mềm, có nhiều lông màu trắng mịn; mọc từ thân rễ và các mấu của thân có bẹ lá to ôm lấy thân Phiến lá hình tim chia 3 thùy, các thùy không tách rời mà liền nhau ở gốc lá, mỗi thùy lại chia thành các thùy nhỏ, mép có răng cưa tròn Lá có 3 gân chính, mỗi gân chính lại toả ra thành nhiều gân phụ nhỏ hình chân vịt Cụm hoa xim 2 ngả Trục mang hoa cao từ 30-40 cm; cuống hoa dài 6-7 cm; lá đài 6-7, dài 2-3,5 cm; tràng 5, rời, đầu tà hay lõm, dài 2-3 cm, rộng từ 1-1,5 cm, màu trắng đến hồng nhạt phủ nhiều lông trắng mịn, tiền khai hoa luân xen; nhị nhiều, rời, màu vàng, mọc ở đế của hoa, chỉ nhị dài 3-4 mm, bao phấn đính gốc dài khoảng 1 mm, nứt dọc; lá noãn không lông, không có vòi nhụy, đầu nhụy màu vàng Rễ hình trụ, nhỏ, đường kính từ 1-2 mm Quả bế không cọng, không lông, dài 4-5 mm, khi chín bung ra nhiều hạt nhỏ Hạt dài khoảng 2-3 mm, mang nhiều lông dài màu trắng Hoa tháng 6-9, quả tháng 8-10 [2, 30]

Theo Gagnepain:

4

- Loài này khác với loài A.begoniifolia ở 3 đặc điểm: đài hoa gần như

không có lông; bao phấn hình elip, thuôn dài và phần đầu của quả bế đột ngột

co lại, hơi uốn cong [7]

Hình 1.1: Tiêu bản thực vật loài Anemone chapaensis Gagnep [30]

- Loài này khác với loài A.howellii ở 4 đặc điểm: lá không có lông

cứng; lá bắc xung quanh cụm hoa lớn hơn 4-5 lần; số lượng cuống hoa thường 5-9, rất hiếm 3-4; bao phấn dài hơn [7]

- Loài này khác với loài A.bicolor ở 2 đặc điểm: số lượng cuống hoa

nhiều hơn và nhụy hoa bé hơn [7]

1.2 Thành phần hóa học chi Anemone

Chi Anemone là chi thực vật đã được sử dụng và nghiên cứu rộng rãi tại

nhiều nơi trên thế giới Thành phần hóa học chủ yếu trong chi này là các saponin [22, 26, 27] Ngoài ra, một số báo cáo còn cho thấy sự hiện diện của

5

các flavonoid[10], coumarin [9], diterpenoid glycosid [9], lactone [22], tinh dầu và chất béo [22], và một số hợp chất khác

Các saponin

Cho đến nay, đã có trên 100 saponin được phân lập từ chi Anemone,

trong đó chủ yếu là các dẫn xuất mang bộ khung olean hoặc hederagenin [22,

β-H

β-OH

Hederacholichiside

F

α-L-Rha(1→2)- [β-D-Glc(1→4)]- α-L-Ara

CH3 α-L-Rha(1→4)-

D-Glc(1→6)- D-Glc

β-OH

Các flavonoid

Năm 2010, H.B Hu và các cộng sự đã phân lập được 8 flavonoid khác

nhau từ rễ loài Anemone tomentosa [10]

7

Hình 1.3: Một số flavonoid phân lập từ chi Anemone [10]

9

Một số hợp chất khác

Hình 1.5: Một số hợp chất khác phân lập từ chi Anemone [9, 22]

1.3.1 Công dụng trong dân gian

Chi phong quỳ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa các bệnh về tim (phối hợp với các thuốc khác), điều trị viêm họng, sưng amydal, viêm gan, viêm túi mật, đau dạ dày, lỵ, thiên đầu thống, bế kinh, đái ra máu, rắn cắn, đau răng, phong thấp đau nhức, đòn ngã và giải độc ô đầu [1]

1.3.2 Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu của chi Anemone

1.3.2.1 Tác dụng chống khối u

Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Wang và cộng sự đã công bố các báo cáo thử nghiệm tác dụng ức chế khối u của các saponin phân lập từ rễ loài

Anemone raddeana Kết quả cho thấy raddeanoside R2 và R3, eleatheroside K

và hederasaponin B có tác dụng ức chế tế bào ung thư dạ dày BGC823 và dòng tế bào bạch cầu người K562 rất mạnh Raddeanoside R3 cho tác dụng tốt

với cả thử nghiệm in vitro và in vivo [20, 24, 25]

1.3.2.2 Tác dụng kháng vi sinh vật

Liu và cộng sự (1988) báo cáo rằng phần tinh dầu dễ bay hơi, lactone,

và saponin từ thân rễ của A raddeana có khả năng ức chế các liên cầu

Streptococcus gây bệnh ở người, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Shigella, và Staphylococcus aureus [14] Ở thử nghiệm in vitro, anemonin

cho thấy hoạt tính kháng nấm, với nồng độ ức chế tối thiểu đạt 15 μg/mL [31]

1.3.2.3 Tác dụng chống viêm

Saponin chiết xuất từ các loài thuộc chi Anemone có tác dụng ức chế

phản ứng viêm bàn chân chuột gây bời carrageenan, formaldehyde và dextran Trong đó, raddeanoside R1 có tác dụng đáng kể trên mô hình gây viêm bằng carrageenan [23]

11

Các nhóm nghiên cứu của Lu và cộng sự (2001), Yamashita và cộng sự (2002) cũng báo cáo một loạt các saponin có tác dụng ức chế sự tạo thành gốc superoxide, bao gồm: oleanolic acid, 3-acetyloleanolic acid, eleatheroside K, raddeanoside R10, raddeanoside R12, raddeanoside R13, lupeol và betulin [15, 29]

1.3.2.4 Tác dụng an thần và giảm đau

Các raddeanoside có tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau trên chuột gây bởi acetic acid Protoanemonin cũng có tác dụng an thần (Wang &

cs 1985) [23]

1.3.2.5 Tác dụng chống co giật và hoạt tính kháng histamin

Saponin chiết xuất từ Anemone có tác dụng giảm co giật ở chuột gây ra

bởi strychnine, nhưng không có tác dụng trên trên mô hình gây ra bởi theine Protoanemonin không những có hiệu quả trong thử nghiệm chống co thắt phế quản gây ra bởi 0,01% histamine, mà còn chống lại sự co thắt hồi tràng của lợn guinea cũng gây ra bởi histamine (Wang & cs 1985) [23]

1.4 Vấn đề cần giải quyết

Theo tổng quan tài liệu, Phong quỳ Sapa là cây thuốc có ở Việt Nam và một số nước trên thế giới nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học và tác dụng dược lý Trên cơ sở đó, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu thành phần hóa học của phần trên mặt đất cây Phong quỳ Sapa nhằm mục tiêu tìm ra được những hoạt chất mới có ý nghĩa trong y học và cuộc sống

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

Hóa chất và dung môi

- Các dung môi hữu cơ dùng trong chiết xuất và phân lập là dung môi

công nghiệp được cất lại, bao gồm: EtOH 96%, MeOH, n-hexan; ethyl acetat,

aceton, dicloromethan

- Các dung môi tinh khiết: dimetylsulfoxid (DMSO), nước cất 2 lần

- Hạt nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich)

- Chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 μm, Merck), pha đảo RP-18 (30-50 μm, Merck)

- Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn và RP-18 F254S tráng sẵn (Merck), hiện màu bằng thuốc thử acid sulfuric 10%/ethanol và đốt nóng ở 110oC

- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 10 lít

- Dụng cụ thủy tinh: các loại cột đường kính từ 1-10cm, dài từ 30-100 cm; bình cầu ngoại dung tích 50 - 2000 mL; ống nghiệm, ống đựng mẫu NMR, pipet chính xác…

Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc Viện dược liệu và Bộ môn Dược học cổ truyền – Khoa Y dược Đại học Quốc gia Hà Nội

13

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn

Theo phương pháp chiết các lớp chất theo độ phân cực tăng dần của dung môi

Cao toàn phần và các phân đoạn được thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa nhằm sàng lọc ra phân đoạn có tác dụng tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu thành phần hóa học tiếp theo

Dược liệu đã xay thô được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol; cất thu hồi dung môi được cắn, hòa cắn vào nước, lần lượt lắc

phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan; ethyl acetat)

Cất thu hồi dung môi các phân đoạn thu được cắn n-hexan (cắn Hx);

cắn ethyl acetat (cắn EtOAc)

Dịch chiết nước thu được sau khi lắc phân đoạn với ethyl acetat được chạy 3 lần qua cột sắc ký Diaion HP-20 Cột được rửa giải bằng EtOH 96% thu được 2 phân đoạn trong EtOH và H2O

Cất thu hồi dung môi 2 phân đoạn này thu được cắn EtOH (ký hiệu cắn EtOHn) và cắn H2O

đã chọn chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột Các phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất

chiết với EtOH Dịch chiết EtOH

thu hồi dung môi, hòa thành nhũ dịch trong H2O

lắc phân đoạn với n-hexan

thu hồi dung môi

Phân đoạn H2O

lắc phân đoạn với EtOAc

Phân đoạn EtOAc

(thử tác dụng)

Phân đoạn H2O (thử tác dụng) thu hồi dung môi

Phân đoạn n-hexan

(thử tác dụng)

rửa giải bằng EtOH 96%

Dược liệu

16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn

3.1.1 Lấy mẫu và xác định hàm ẩm

Phong quỳ được thu hái ngày 24/05/2015 tại đèo Hoàng Liên (Ô Qui

Hồ, ở độ cao 1500 đến 1800 m), thuộc huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai Mẫu được

xác định tên khoa học là Anemone chapaensis Gagnep bởi TS Đỗ Thị Xuyến,

bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, số hiệu tiêu bản 02 (Phụ lục 03) 02 tiêu bản hiện được lưu giữ tại Phòng Bách thảo thực vật (HNU), Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, 01 tiêu bản lưu trữ tại bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phần trên mặt đất được cắt khỏi toàn cây Phong quỳ Sa Pa, sử dụng làm mẫu nghiên cứu Mẫu được sấy ở 60oC đến khô, cắt nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát

Lấy khoảng 2g mẫu nghiên cứu đã làm nhỏ để xác định độ ẩm Bật máy

đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 130oC Trải đều mẫu nghiên cứu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và khởi động máy Thí nghiệm được lặp lại 3 lần lấy kết quả trung bình

Độ ẩm mẫu nghiên cứu xác định được là 9,52%

3.1.2 Chiết xuất

Mẫu nghiên cứu sau khi làm nhỏ được ngâm chiết với EtOH 96% ở nhiệt độ phòng (chiết 3 lần, mỗi lần 4 ngày) Dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm đến cắn để thu được cắn toàn phần, ký hiệu

là PQL Với 3 kg Phong Quỳ thu được 201,74g cắn toàn phần

Hòa cắn toàn phần PQL với một lượng vừa đủ nước nóng 60oC Sử

dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng chiết lần lượt với các dung môi là n-hexan

và ethyl acetat Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới cắn để được kí hiệu lần lượt là PQLH, PQLE Dịch nước còn lại được chạy 3 lần qua cột sắc ký Diaion HP-20, sau được rửa giải bằng EtOH 96% thu được 2 phân đoạn tan trong EtOH và H2O, ký hiệu lần lượt là PQLD và PQLW

17

Sơ đồ chiết xuất để thu được các phân đoạn như ở hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn phần trên mặt đất loài Phong quỳ Sa Pa

Ethyl acetat thu hồi

Cắn PQLD

Cắn PQLH

Dịch chiết ethyl acetat Dịch chiết nước

n-hexan thu hồi

Mẫu thử: cắn EtOAc được hòa tan trong methanol

Bản mỏng silica gel GF254 tráng sẵn, hoạt hóa ở 1100C trong 1h

Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khai triển:

- Hệ I: Toluen - Ethyl acetat (7:3)

- Hệ II: Dicloromethan - Methanol (10:1)

- Hệ III: n-hexan – Ethyl acetat (1:1)

Thuốc thử hiện màu: Nhúng vào dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, sau đó đốt nóng ở 110oC

- Tiến hành: Chấm dịch chấm sắc ký lên bản mỏng, sấy nhẹ cho bay hết dung môi, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra, sấy khô, quan sát dưới UV365nm, UV254nm Sau đó phun thuốc thử, sấy ở 1100C, quan sát tiếp dưới ánh sáng trắng

Hình 3.2: Sắc ký đồ của cắn ethyl acetat (hệ III) ở các điều kiện quan sát:

UV254nm, UV365nm, sau khi phun thuốc thử dưới ánh sáng trắng

Nhận xét:

- Ở UV254nm, quan sát thấy 7 vết màu nâu đen, trong đó có 4 vết rất rõ

- Ở UV365nm, quan sát thấy 8 vết, trong đó có 5 vết phát huỳnh quang xanh lam, 2 vết phát huỳnh quang đỏ

- Sau khi phun thuốc thử, quan sát ở UV-VIS thấy 4 vết

3.2.2 Phân lập một số hợp chất từ cắn ethyl acetat

Phân đoạn ethyl acetat từ phần trên mặt đất Phong quỳ Sa Pa được phân tách thô bằng sắc ký cột silica gel pha thường Cột được rửa sạch, đáy

20

cột được lót một lớp bông mỏng Cột được nhồi bằng phương pháp nhồi cột ướt, pha tĩnh được sử dụng là silica gel 60 Ổn định cột trong 24 giờ

Cắn ethyl acetat (100g) được trộn đều với lượng silica gel 60 tối thiểu,

nghiền mịn Nạp mẫu lên cột, rửa giải với hệ dung môi n-hexan/aceton theo gradient nồng độ từ tỷ lệ 15:1 (v/v) đến 0:1 (v/v) Kiểm tra các dịch rửa giải

bằng sắc ký lớp mỏng và dồn các ống có cùng thành phần, loại dung môi dưới

áp suất giảm thu được 11 phân đoạn: PĐ1-11

Phân đoạn PĐ4 (2,4g) tiếp tục phân lập trên cột pha đảo RP18, rửa giải

với hệ dung môi MeOH/H2O (45:55, v/v) thu được 6 phân đoạn (PĐ4.1-4.6)

Phân đoạn PĐ4.5 được tinh chế trên cột pha thuận silica gel, rửa giải đẳng

dòng với hệ dung môi n-hexan/ethyl acetat (4:1, v/v) thu được hợp chất 1 (51

mg)

Phân đoạn PĐ5 (3,1g) được phân tách trên cột silica gel pha đảo RP-18

rửa giải đẳng dòng với hệ dung môi MeOH/H2O (2:3, v/v) thu được 7 phân

đoạn từ PĐ5.1-5.7

Phân đoạn PĐ5.3 được chọn để tiếp tục tinh chế qua sắc ký cột

silicagel pha thường, rửa giải đẳng dòng với hệ dung môi n-hexan/aceton

(3:1, v/v), thu được hợp chất 2 (10mg)

21

Hình 3.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat

3.2.3 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập

Hợp chất 1 và 2 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và so sánh với

cắn ethyl acetat trên cùng một bản mỏng, triển khai với 3 hệ dung môi:

- Hệ I: Dicloromethan– Methanol (10:1)

- Hệ II: Toluen - Ethyl acetat (7:3)

- Hệ III: n-hexan - Ethyl acetat (1:1)

Silica gel pha thuận, n-hexan : aceton

Cắn PQLE

lại Pha đảo RP18,

Silica gel pha thuận,

n-hexan : ethyl acetat

Hợp chất 2 (10 mg)

Pha đảo RP18, MeOH: H2O

PĐ5.3

22

Quan sát dưới UV254nm và UV365nm hay ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử đều thấy một vết duy nhất trên bản mỏng ở mỗi chất (hình 3.4 –

3.6) Vì vậy sơ bộ kết luận hợp chất 1 và 2 là những chất tinh khiết

Hình 3.4: Sắc ký đồ của hợp chất 1, cắn ethyl acetat, hợp chất 2 hệ I

IA, IB, IC: Sắc ký đồ của hợp chất 1, cắn EtOAc, hợp chất 2 hệ I

lần lượt ở UV254nm, UV365nm và sau khi phun TT ở ánh sáng trắng

23

Hình 3.5: Sắc ký đồ của hợp chất 1, cắn ethyl acetat, hợp chất 2 hệ II

IIA, IIB, IIC: Sắc ký đồ của hợp chất 1, cắn EtOAc, hợp chất 2 hệ II

lần lượt ở UV254nm, UV365nm và sau khi phun TT ở ánh sáng trắng

IIA IIB IIC

24

Hình 3.6: Sắc ký đồ của hợp chất 1, cắn ethyl acetat, hợp chất 2 hệ III

IIIA, IIIB, IIIC: Sắc ký đồ của hợp chất 1, cắn EtOAc, hợp chất 2 hệ III

lần lượt ở UV254nm, UV365nm và sau khi phun TT ở ánh sáng trắng

IIIA IIIB IIIC

25

Bảng 2: Kết quả SKLM của 2 chất với 3 hệ dung môi

Hợp chất 1 thu được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt Phổ

khối ESI-MS có đỉnh ion tại m/z: 207,1 [M-H]- cho biết khối lượng phân tử

của 1 là M=208 tương ứng với công thức phân tử C11H12O4 Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu của 11 cacbon, trong đó có 8 nguyên tử cacbon có độ chuyển dịch nằm trong vùng của vòng thơm hoặc liên kết C=C, 1 nguyên tử cacbon của nhóm cacbonyl (δC 169,3 ppm) Phổ 1H-NMR có 03 tín hiệu của proton nhân thơm đặc trưng cho hệ spin ABX là δH 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H- 2), 6,95 (1H, dd, J=8,0; 2,0Hz, H-6), 6,80 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5); 02 doublet

tại δH 7,50 và δH 6,26 (J=16,0 Hz) đặc trưng cho 2 proton olefinic cấu hình