xây dựng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để xác định một số chất cấm trong mỹ phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ DUYÊN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ ĐỂ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT CẤM TRONG MỸ PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ DUYÊN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

ĐỂ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT CẤM

TRONG MỸ PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ DUYÊN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LỜI CẢM ƠN Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Tạ Mạnh

Hùng – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, PGS.TS Lê Đình Chi - Trường

Đại học Dược Hà Nội, hai người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh

nghiệm quý báu và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Hóa Phân tích –

độc chất đã chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung

ương đã tạo điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm –

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình

thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã

giúp đỡ và động viên để tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận văn

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy, Cô, Cơ quan, Gia đình và Bạn bè đã hỗ trợ và động viên, giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2020

Học viên: Ngô Thị Duyên

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ QUI ĐỊNH QUẢN LÝ MỸ PHẨM 3

1.1.1 Quản lý mỹ phẩm trên thế giới 3

1.1.2 Quản lý mỹ phẩm ở Việt Nam 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ NHÓM CHẤT GLUCOCORTICOID 5

1.2.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa 5

1.2.2 Tác dụng dược lý 8

1.2.3 Tác dụng không mong muốn 8

1.2.4 Một số phương pháp định tính và định lượng GC trong mỹ phẩm 9

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 10

1.3.1 Bộ phận nạp mẫu 11

1.3.2 Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện (ESI – Electrospray ionization) 11

1.3.3 Bộ phận phân tích khối ghép nối ba tứ cực 11

1.3.4 Bộ phận phát hiện (detector) 12

1.4 TỔNG QUAN THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẤT CẤM TRONG MỸ PHẨM 12

1.4.1 Tính đặc hiệu - chọn lọc 13

1.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD) 13

1.4.3 Giới hạn định lượng (LOQ) 14

1.4.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 14

1.4.5 Độ chính xác 15

1.4.6 Độ đúng 15

1.4.7 Xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả 15

1.4.8 Khẳng định định tính 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17

2.2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất 17

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 18

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 18

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 20

2.3.3 Xác định các nhóm chất GC trong một số mẫu kem bôi da có mặt trên thị trường 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 24

3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định các GC 24

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 28

3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 31

3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội 32

3.1.5 Kết quả xây dựng phương pháp LC-MS/MS xác định các GC trong mỹ phẩm 33

3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 36

3.2.1 Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS 36

3.2.2 Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp 37

3.2.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 41

3.2.4 Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính 43

3.2.5 Độ đúng, độ lặp lại của phương pháp 45

3.2.6 Độ chính xác trung gian của phương pháp 46

3.2.7 Xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả 47

3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH GC TRONG CÁC MẪU MỸ PHẨM DẠNG KEM TRÊN THỊ TRƯỜNG 47

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 50

4.1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI 12 GC TRONG MỸ PHẨM

50

4.1.1 Lựa chọn phổ khối MS/MS cho phân tích nhóm GC 50

4.1.2 Phương pháp xử lý mẫu 51

4.1.3 Phương pháp sàng lọc sơ bộ các GC bằng kỹ thuật LC – MS/MS 51

4.1.4 Thẩm định phương pháp phân tích 51

4.2 KẾT QUẢ DƯƠNG TÍNH GIẢ, ÂM TÍNH GIẢ TRONG PHÂN TÍCH BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – MS/MS 52

4.3 KẾT QUẢ KIỂM TRA CÁC MẪU MỸ PHẨM TRÊN TRỊ TRƯỜNG 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

KẾT LUẬN 55

KIẾN NGHỊ 56

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ACD ASEAN Cosmetics Directive (Quy định về mỹ phẩm của ASEAN)

ACN Acetonitril

ASEAN Association of South East Asia’s Nations

(Liên hiệp các quốc gia Đông Nam Á)

BMD Betamethason dipropionat

BMV Betamethason valerat

CBP Clobetasol propionat

CTA Cortison acetat

DAD Diod array detector (Detector mảng diod)

DMPM Dung môi pha mẫu

DXA Dexamethason acetat

EC European community (Hội đồng Châu Âu)

ESI Electrospray ionization (Ion hóa kiểu phun sương điện)

FLA Fluocinolon acetonid

FN False negative (âm tính giả)

FP False positive (dương tính giả)

GBC Glibenclamid

GC Glucocorticoid

HCTA Hydrocortison acetat

HPLC High performance liquid chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

IS Internal standard (Chuẩn nội)

(Sắc ký lỏng khối phổ)

LC-MS/MS Liquid chromatography – Tandem mass spectrophometry

(Sắc ký lỏng khối phổ hai lần)

LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)

RA Relative abundance (Tỷ lệ cường độ ion )

RSD Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

TAA Triamcinolon acetonid

THF Tetrahydrofuran

TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng )

TLTK Tài liệu tham khảo

TT- BYT Thông tư- Bộ y tế

USFDA United state – Food and Drug administration

(Cục quản lý thực phẩm, dược phẩm Mỹ)

UV - VIS Ultraviolet-visible (tử ngoại – khả kiến)

v/v Volume/Volume (thể tích/thể tích)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nội dung quản lý mỹ phẩm của Châu Âu, Mỹ, Nhật và ASEAN 4

Bảng 1.2 Công thức cấu tạo của 12 GC nghiên cứu 6

Bảng 1.3 Tính chất lý hóa của các GC nghiên cứu 7

Bảng 1.4 Một số phương pháp định tính và định lượng GC 9

Bảng 1.5 Số lượng mẫu cần phân tích để xác định FP, FN 16

Bảng 2.1 Thông tin chất chuẩn sử dụng 17

Bảng 2.2 Nồng độ dãy đường chuẩn của các GC 21

Bảng 3.1 Chương trình gradient dung môi 33

Bảng 3.2 Điều kiện detector khối phổ 33

Bảng 3.3 Thông tin sử dụng phát hiện định tính các GC 36

Bảng 3.4 Sự phù hợp hệ thống LC-MS/MS 37

Bảng 3.5 So sánh thời gian lưu của pic thu được từ mẫu tự tạo và mẫu chuẩn 38

Bảng 3.6 Tỷ lệ cường độ ion của các pic thu được từ mẫu tự tạo và mẫu chuẩn 39

Bảng 3.7 Kết quả phân tích mẫu ở LOD 42

Bảng 3.8 LOD và LOQ của phương pháp 43

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát đường chuẩn của PRS, DXM, PRA, CTA 44

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát đường chuẩn của HCTA, TAA, DXA, FLA 44

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát đường chuẩn của CBP, BMV, BMD, MTF 45

Bảng 3.12 Kết quả độ đúng, độ lặp lại của phương pháp 46

Bảng 3.13 Kết quả chính xác trung gian của phương pháp 46

Bảng 3.14 Kết quả phân tích GC trong một số mẫu kem mỹ phẩm 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của GC 5

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ 11

Hình 1.3 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối ghép nối ba tứ cực 12

Hình 3.1 Phổ khối MS dung dịch chuẩn BMV với chế độ ESI (+) 24

Hình 3.2 Giản đồ tối ưu điện thế tập trung ion có số khối 477,24 Da 25

Hình 3.3 Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [BMV + H]+ 26

Hình 3.4 Giản đồ năng lượng phân mảnh ion m/z 477,24 → 355,14 27

Hình 3.5 Giản đồ năng lượng phân mảnh ion m/z 477,24 → 337,13 28

Hình 3.6 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C8 (2,1 x 100 mm, 1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,1 % (70:30) 29

Hình 3.7 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,1 % (70:30) 30

Hình 3.8 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng pha động MeOH : acid formic 0,1 % (72:28) 30

Hình 3.9 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng chương trình gradient 30

Hình 3.10 SKĐ mẫu tự tạo sử dụng dung môi ACN 32

Hình 3.11 SKĐ đại diện của độ đặc hiệu 40

Hình 3.12 Giá trị S/N tại LOD của một số chất đại diện 41

Hình 3.13 Giá trị S/N tại LOQ của một số chất đại diện 42

Hình 3.14 SKĐ đại diện một số mẫu kem có GC 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong quản lý chất lượng mỹ phẩm, kiểm soát tính an toàn là yêu cầu chính yếu nhất Chính vì vậy, hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm quy định rõ những chất, nhóm chất không được phép sử dụng trong mỹ phẩm, trong

đó có nhóm glucocorticoid [11] Tuy nhiên, do có thể tạo ra những kết quả có ích cho công bố tác dụng của một số sản phẩm mỹ phẩm như làm trắng da, glucocorticoid vẫn bị lạm dụng trái quy định trong sản phẩm mỹ phẩm [21], [22] Mặc dù hàm lượng glucocorticoid trong mỹ phẩm không cao như trong các dạng bào chế thuốc nhưng nó lại được dùng hàng ngày, trong thời gian dài và không có

sự kiểm soát của bác sĩ dẫn đến ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sử dụng [18], [22]

Như vậy, về góc độ quản lý mỹ phẩm, glucocorticoid là đối tượng cần quan tâm giám sát, và về góc độ kiểm nghiệm mỹ phẩm, các phương pháp đáng tin cậy

để phát hiện glucocorticoid trong mỹ phẩm là yêu cầu thực tế quan trọng Một số phương pháp phát hiện Glucocorticoid trong mỹ phẩm đã được phát triển sử dụng

kỹ thuật TLC [7] và HPLC-DAD [5] Kỹ thuật TLC thường sử dụng thiết bị đơn giản, chi phí thấp nhưng giới hạn phát hiện cao [7] Kỹ thuật HPLC-DAD có hạn chế về khẳng định định tính do độ đặc hiệu thấp của phổ hấp thụ UV-Vis nói chung

và của glucocorticoid nói riêng Như vậy, với nền mẫu mỹ phẩm phức tạp có thể dẫn đến kết quả dương tính giả, âm tính giả trong phân tích Những hạn chế trên cho thấy sự cần thiết cần phải nghiên cứu xây dựng một phương pháp có độ đặc hiệu cao hơn, đảm bảo kết quả tin cậy hơn để kiểm tra sự có mặt của các glucocorticoid trong mỹ phẩm [18], [19] So với HPLC-DAD, LC-MS/MS cung cấp nhiều thông tin đặc hiệu cho đối tượng phân tích hơn, cho phép cải thiện độ tin cậy khi kết luận định tính sự có mặt của glucocorticoid trong mẫu [16], [17] Vì vậy,

đây là kỹ thuật được lựa chọn để thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp sắc ký

1 Xây dựng được phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định

một số chất cấm nhóm glucocorticoid (Prednison, prednison acetat, dexamethason, dexamethason acetat, cortison acetat, hydrocortison acetat, triamcinolon acetonid,

fuocinolon acetonid, clobetasol propionat, betamethason valerat, betamethason dipropionat, mometason furoat) trong mỹ phẩm dạng kem

2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện glucocorticoid có mặt trái quy định trong các mẫu mỹ phẩm dạng kem trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ QUI ĐỊNH QUẢN LÝ MỸ PHẨM

1.1.1 Quản lý mỹ phẩm trên thế giới

* Mỹ:

Ở Mỹ, mỹ phẩm được quản lý theo quy định của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (USFDA) USFDA không yêu cầu các sản phẩm và thành phần của chúng phải được phê duyệt trước khi ra thị trường, trừ chất phụ gia màu phải được phê duyệt mục đích sử dụng Song có đưa ra một số quy định về quản lý mỹ phẩm

như [8]:

- Phải ghi nhãn mác đúng quy định

- Thông tin về sản phẩm rõ ràng, có hướng dẫn sử dụng

- Sản phẩm có chứa các thành phần có thể gây kích ứng da cần phải được

kiểm tra sơ bộ theo hướng dẫn kèm theo

- Sản phẩm không được chứa chất độc hại, chất gây ô nhiễm hoặc phân hủy

gây dị ứng cho người sử dụng

- Phụ lục IV: Danh mục các chất màu được phép sử dụng

- Phụ lục VI: Danh mục các chất bảo quản

- Phụ lục VII: Danh mục các chất lọc tia UV

Châu Âu yêu cầu tất cả các sản phẩm được bán trên thị trường phải đăng ký thông tin trên cổng thông tin sản phẩm mỹ phẩm Nhà sản xuất chịu trách nhiệm về

sự an toàn của các sản phẩm của mình

* Nhật Bản:

Nhật Bản quản lý mỹ phẩm theo luật Quản lý Dược – PAL (Pharmaceutical Affairs Law) được phê duyệt lần đầu tiên vào năm 1943, có sửa đổi vào những năm

1948, 1960 và 1979 Tuy nhiên, đến năm 2001, luật này đã được thay đổi nhiều và

có những quy định mới PAL bãi bỏ quy định các sản phẩm mỹ phẩm phải được phê duyệt hoặc cấp phép trước khi đưa ra thị trường Các nhà sản xuất, nhà phân phối phải có trách nhiệm đảm bảo tính an toàn của sản phẩm Đồng thời, phải thông báo tên của sản phẩm trước khi sản xuất hoặc nhập khẩu để các cơ quan có thẩm

quyền xác định được đặc điểm của từng sản phẩm [23]

* ASEAN:

Năm 2003, “Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm”

đã được các nước trong khối ASEAN thông qua, ký kết và cam kết thực hiện Hướng dẫn mỹ phẩm ASEAN (Asean Cosmetics Directive, gọi tắt là ACD) dựa trên quy định của Liên minh Châu Âu, cũng có quy định về danh mục các chất bị cấm trong mỹ phẩm (Phụ lục II), danh mục các chất được sử dụng có giới hạn về hàm lượng, nồng độ và điều kiện sử dụng (Phụ lục III), danh mục các chất màu sử dụng trong mỹ phẩm (phụ lục IV), danh mục các chất bảo quản (phụ lục VI), danh mục

các chất lọc tia UV (phụ lục VII) [11]

* Tóm tắt những quy định chính về mỹ phẩm của Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản và ASEAN [8], [23] được thể hiện ở bảng 1.1:

Bảng 1.1 Một số nội dung quản lý mỹ phẩm của Châu Âu, Mỹ, Nhật và ASEAN

Thông tin sản phẩm Có Không bắt buộc

Danh pháp quốc tế thành

phần mỹ phẩm

1.1.2 Quản lý mỹ phẩm ở Việt Nam

Ngày 02/9/2003, chính phủ Việt Nam đã ký “Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm Theo Hiệp định này, 10 nước ASEAN đã cam kết thực hiện tiến trình hòa hợp và từ ngày 01/01/2008, Hiệp định bắt đầu có hiệu lực [8] Gần đây nhất, ngày 20/1/2011, Bộ Y tế có thông tư số 06/2011/TT-BYT của của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành “Quy định về quản lý mỹ phẩm” gồm 11 chương, 53 điều Thông tư này qui định việc quản lý các sản phẩm mỹ phẩm sản xuất trong nước, mỹ phẩm nhập khẩu để lưu thông trong lãnh thổ Việt Nam, bao gồm: Công bố sản phẩm mỹ phẩm, hồ sơ thông tin sản phẩm, yêu cầu về an toàn sản phẩm, ghi nhãn mỹ phẩm, quảng cáo mỹ phẩm, xuất khẩu, nhập khẩu mỹ phẩm, lấy mẫu mỹ phẩm để kiểm tra chất lượng, kiểm tra, thanh tra và xử lý vi phạm, trách nhiệm của tổ chức, cá nhân sản xuất, buôn bán sản phẩm mỹ phẩm tại Việt

Nam phải tuân thủ các quy định về quản lý mỹ phẩm trong thông tư này [3]

1.2 TỔNG QUAN VỀ NHÓM CHẤT GLUCOCORTICOID

1.2.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

1.2.1.1 Công thức cấu tạo

- Các glucocorticoid (GC) có chung khung cấu trúc steroid như hình 1.1

Hình 1.1 C ng thức cấu tạo chung của GC

- Công thức cấu tạo của 12 GC nghiên cứu với các nhóm thế ở vị trí R6, R9,

2 Dexamethason

(DXM)

Nối đôi

3 Prednison

acetat (PRA)

Nối đôi

4 Cortison aceat

(CTA)

Bão hòa

5 Hydrocortison

acetat (HCTA)

Bão hòa

6 Triamcinolon

acetonid (TAA)

Nối đôi

7 Dexamethason

acetat (DXA)

Nối đôi

-H -F -OH -CH3 -OH -OCOCH3

8

Fluocinolon

acetonid (FLA)

Nối đôi

9 Clobetasol

propionat (CBP)

Nối đôi

-H -F -OH -CH3 -OCOC2H5 -Cl

10 Betamethason

valerat (BMV)

Nối đôi

-H -F -OH -CH3 -OCOC4H9 -OH

-H -F -OH -CH3 -OCOC2H5 -OCOC2H5

12 Mometason

furoat (MTF)

Nối đôi

Không tan trong nước, khó tan trong EtOH 96 % và methylen clorid

DXM C22H29FO5 392,5

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng

Không tan trong nước, hơi tan trong EtOH khan, khó tan trong methylen clorid

CTA C23H30O6 402,5

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình

Không tan trong nước, dễ tan trong methylen clorid, tan trong dioxan, hơi tan trong aceton, khó tan trong EtOH 96 % và MeOH HCTA C23H32O6 404,5

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng

Không tan trong nước, hơi tan trong EtOH khan và methylen clorid

TAA C24H31FO6 434,5

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình

Không tan trong nước, hơi tan trong EtOH 96 %

DXA C24H31FO6 434,5

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình

Không tan trong nước, dễ tan trong EtOH 96 %, khó tan trong methylen clorid FLA C24H30F2O6 452,5

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình

Tan trong aceton và EtOH, không tan trong nước

CBP C25H32ClFO5 467,0

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng

Không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong EtOH 96 %

BMV C27H37FO6 476,3

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng

Không tan trong nước, dễ tan trong aceton và methylen clorid, tan trong EtOH 96 %

BMD C28H37FO7 504,6

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng Không tan trong nước, dễ tan trong aceton và

methylen clorid, hơi tan trong EtOH 96 %

MTF C27H30Cl2O7 521,4

Bột kết tinh trắng hay gần như trắng

Không tan trong nước, tan trong aceton và methylen clorid, khó tan trong EtOH

96 %

* Nhận xét: Các GC không tan trong nước, tan được trong các dung môi như

ethanol, aceton và methanol Đây chính là cơ sở để lựa chọn dung môi chiết các GC trong quá trình xử lý mẫu mỹ phẩm

1.2.2 Tác dụng dƣợc lý

Glucocorticoid có nhiều tác dụng dược lý quan trọng như chống viêm, chống dị ứng và ức chế miễn dịch, nên được sử dụng trong nhiều chỉ định y khoa khác nhau [2], trong đó có chỉ định dùng tại chỗ để kiểm soát viêm da cơ địa, eczema và các viêm da khác [1]

1.2.3 Tác dụng không mong muốn

Các GC có thể gây ra nhiều tác dụng không mong muốn như loét dạ dày, tá tràng, phù, tăng huyết áp, tăng đường huyết, loãng xương, xốp xương, gây hội chứng Cushing, [2]

Đặc biệt, khi dùng tại chỗ (trong trường hợp điều trị các bệnh về da hoặc sử dụng mỹ phẩm có chứa corticoid) trong thời gian dài có thể gây ra nhiều tác dụng không mong muốn [1], [2], [16] như:

- Mỏng da, teo da

- Rạn da (nách, háng, bẹn)

- Xuất huyết dưới da

- Giãn mạch máu

- Rậm lông, lông mọc dài ra

- Viêm da quanh miệng, trứng cá đỏ do GC

- Vảy nến thể mủ

- Khi ngừng GC tại chỗ có thể gây ra các tổn thương như:

+ Da đỏ, bừng, nóng (viêm da so GC hoặc chứng phụ thuộc GC)

+ Viêm da sẩn, mụn mủ (trứng cá đỏ do GC, viêm da quanh miệng, viêm da quanh mắt)

Theo Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm, GC nằm trong danh mục các chất, nhóm chất bị cấm sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm (nhóm chất số 300, Annex II – Các chất, nhóm chất không được phép dùng trong

mỹ phẩm) [10]

1.2.4 Một số phương pháp định tính và định lượng GC trong mỹ phẩm

Hiện nay, đã có nhiều phương pháp như phương pháp TLC [7], [10], phương pháp HPLC với detector UV- VIS [5], [10], phương pháp LC – MS/MS [16], [19], [21], [22] đã được sử dụng để định tính và định lượng GC trong mỹ phẩm

Tóm tắt một số phương pháp định tính, định lượng GC được trình bày trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số phương pháp định tính và định lượng GC

(µg/ml)

LOD (µg/g)

LOQ (µg/g)

Thời gian phân tích (phút)

- Mẫu lỏng: chiết mẫu với

ethyl acetat → bay hơi trên

cách thủy → hòa tan cắn

cách thủy tới khô → Hòa

lại cắn trong 5 ml MeOH

60 [5]

LC-MS Mẫu được phân tán trong

THF → lắc siêu âm → pha

loãng với HH acid formic

0,1 %/ACN và acid formic

0,1%/Nước (20:80)

0,3- 100 12-35

(ng/ml)

35–95 (ng/ml)

0,005-0,109

0,085-0,212

0,102-10 [26]

LC-MS/MS

1 g mẫu được chiết với 20

ml MeOH có chứa 1 ml acid

formic 0,1 %, lắc siêu âm

hệ dung môi khác nhau với các phương pháp phát hiện khác nhau Do đó, thường chỉ sử dụng để sàng lọc sơ bộ và kiểm tra nhanh[7]

- Phương pháp HPLC độ đặc hiệu đã cải thiện hơn so với PP TLC Tuy nhiên, thời gian phân tích dài, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng còn cao [5], [10], chưa phù hợp để định lượng các chất cấm - thường được cho vào với hàm lượng nhỏ trong mỹ phẩm [22] Mặt khác, nền mẫu mỹ phẩm phức tạp nên việc tách các chất ra khỏi nền mẫu cũng gặp nhiều khó khăn

- Phương pháp LC – MS/MS có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp [13], [16], [26], [22], khoảng tuyến tính rộng và có thể cung cấp được thông tin cấu trúc các chất, phù hợp để phân tích các chất cấm trong mỹ phẩm Tuy nhiên, phương pháp của Fiori [16], Nam Sook Kim [21], Yun Sik Nam [22] và cộng sự thời gian phân tích còn dài

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa khả năng phân tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối

của detector khối phổ [4]

Trong số các kỹ thuật LC-MS, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ kiểu ghép nối ba tứ cực với bộ ion hóa kiểu phun điện (ESI) có

độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao [6]

Sơ đồ khối của một máy khối phổ được miêu tả như trong hình 1.2

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ

1.3.1 Bộ phận nạp mẫu

Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối phổ Với LC-MS, mẫu phân tích được nạp vào MS gián tiếp thông qua hệ thống HPLC [4]

1.3.2 Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện (ESI – Electro spray ionization)

Nguồn ion hóa là nơi diễn ra quá trình chuyển các hoạt chất cần phân tích thành các ion/tiểu phân mang điện ở pha khí bằng các kỹ thuật ion hóa khác nhau Trong nguồn ion sử dụng kĩ thuật ion hóa kiểu phun sương điện (ESI), tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi vào bộ phận phân tích khối Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị khối phổ [6]

1.3.3 Bộ phận phân tích khối ghép nối ba tứ cực

Bộ phân tích khối sẽ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng của điện trường

Liquid

Mass analyser Ion

source

Bộ phận phân tích khối kiểu ghép nối ba tứ cực gồm ba tứ cực Q1, Q2 và Q3nối tiếp nhau Mỗi tứ cực này được cấu tạo gồm có 4 thanh kim loại đặt song song

và sát nhau tạo thành hai cặp điện cực (hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối ghép nối ba tứ cực

Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực Dưới tác động của điện trường trong lòng ống điện cực, các ion

có số khối khác nhau di chuyển với tốc độ và quỹ đạo khác nhau Ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại [6]

Các hợp chất với cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như cơ chế phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau Vì vậy, có thể định tính, định lượng các hoạt chất cần phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS [6]

1.3.4 Bộ phận phát hiện (detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận này cho phép phát hiện và khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng Tín hiệu tạo ra sẽ được chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ

1.4 TỔNG QUAN THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẤT CẤM TRONG MỸ PHẨM

Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp phân tích nói chung và phương pháp phân tích mỹ phẩm nói riêng Mục đích của thẩm định phương pháp là chứng minh phương pháp có đủ độ đặc hiệu, tin cậy và lặp lại để phân tích các mẫu thực

Theo hướng dẫn của USFDA [25] các chỉ tiêu tối thiểu cần thực hiện khi thẩm định phương pháp phân tích chất cấm trong mỹ phẩm gồm: Độ đặc hiệu -

chọn lọc, giới hạn phát hiện, xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả và khẳng định định tính (confirmation of identity).

1.4.1 Tính đặc hiệu - chọn lọc

- Tính đặc hiệu - chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất

phân tích với các thành phần khác có trong mẫu Với phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác

- Cách thực hiện:

+ Phân tích mẫu trắng (mẫu placebo), lặp lại tối thiểu 6 lần Mẫu trắng phải không có tín hiệu của chất phân tích

+ Phân tích mẫu tự tạo ở nồng độ/hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần

So sánh với mẫu placebo, phải cho tín hiệu của chất phân tích

+ Phân tích mẫu chuẩn, các chất phân tích phải được nhận diện rõ ràng và không bị ảnh hưởng bởi các chất khác

- Với phương pháp LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật MRM, độ chọn lọc đạt yêu cầu khi:

+ Có 2 ion con đặc trưng và tỷ lệ cường độ tuyệt đối so với mẫu chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện không chênh lệch quá 10 % [24]

+ Hoặc ít nhất 3 ion con đặc trưng và tỷ lệ cường độ ion tuyệt đối so với mẫu chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện không chênh lệch quá 20 % [24]

1.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD)

- Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể

phát hiện được

- Để xác định LOD, có thể thực hiện theo nhiều cách:

+ Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu chuẩn hoặc mẫu tự tạo ở nồng độ khác nhau thấp dần Xác định tỷ lệ giữa tín hiệu chiều cao pic của

chất cần phân tích và cường độ nhiễu nền tại lân cận pic chất cần phân tích Nồng

độ chất cần phân tích tại đó S/N xấp xỉ 3 được coi là LOD [9]

+ Dựa trên đường chuẩn: LOD được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo [9]

LOD = 3,3 x SD/a

Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu

a: Độ dốc của đường chuẩn

1.4.3 Giới hạn định lượng (LOQ)

- LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử có thể định lượng

bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn

- LOQ cũng có thể xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu, dựa vào đường chuẩn hoặc dựa vào công thức: LOQ = 3,3 x LOD

1.4.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa

tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích Khoảng tuyến tính phải có tối thiểu 6 nồng độ khác nhau, bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) [9]

- Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đo của thiết bị và nồng

độ của chất phân tích có trong mẫu Có thể xây dựng đường chuẩn trên chuẩn tinh khiết, trên mẫu placebo thêm chuẩn hoặc trên mẫu thử thêm chuẩn

- Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

+ Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ r ≤ 1

+ Độ chệch của các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn: Không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20% [9] Tính các giá trị độ chệch theo công thức sau:

∆i = (Ct – Cc)/Cc x 100

Trong đó: ∆i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct : Nồng độ xác định được từ đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc : Nồng độ lý thuyết của các điểm chuẩn

1.4.5 Độ chính xác

Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian

- Độ lặp lại được xác định bằng cách phân tích lặp lại ít nhất tại 3 mức nồng

độ, mỗi nồng độ thực hiện ít nhất 6 lần lặp lại nếu thực hiện trên 1 nền mẫu và ít nhât 2 lần nếu thực hiện trên 3 nền mẫu Giá trị RSD của các kết quả phân tích phải đáp ứng yêu cầu của USFDA [25]

- Độ chính xác trung gian được tiến hành tương tự độ lặp lại nhưng khác ngày và khác kiểm nghiệm viên

1.4.6 Độ đúng

Độ đúng có thể được đánh giá qua việc xác định qua độ thu hồi, bằng cách thêm chuẩn vào nền mẫu không chứa chất phân tích ở ít nhất 3 mức nồng độ là mức thấp, mức trung bình và mức cao (tương ứng với 0,5 lần, 1 lần và 2 lần giới hạn cho phép), làm lặp lại 6 lần, tính độ thu hồi theo công thức:

R (%) = Ctt/Cc x 100 Trong đó: R (%): Độ thu hồi, %

Cc: Nồng độ chuẩn thêm vào (lý thuyết)

Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu nền thêm chuẩn (thực tế) Kết quả độ thu hồi phải đạt yêu cầu của USFDA [25]

1.4.7 Xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả

- Theo hướng dẫn của USFDA [25], với phân tích định tính cần xác định tỷ

lệ dương tính giả (FP), âm tính giả (FN) của phương pháp Để xác định tỷ lệ FP cần tiến hành xác định sự có mặt của các chất phân tích trong các mẫu đã được khẳng định là âm tính Để xác định tỷ lệ FN cần tiến hành xác định sự không có mặt của các chất phân tích trên các mẫu đã được khẳng định là dương tính

- Yêu cầu: Để đạt được tỷ lệ FP, FN với độ tin cậy như trong bảng 1.5, tất cả

các mẫu xác định tỷ lệ FP đều phải cho kết quả âm tính, tất cả các mẫu xác định tỷ

lệ FN đều phải cho kết quả dương tính [25]

1.4.8 Khẳng định định tính

Để khẳng định định tính, cần phân tích đặc điểm đặc trưng và cung cấp được thông tin cấu trúc hóa học của chất phân tích trong phạm vi của phương pháp [14], [25]

Với phương pháp LC-MS/MS, USFDA [25] đưa ra hướng dẫn để khẳng định định tính các chất như sau:

- Về phần sắc ký: yêu cầu tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) ≥ 3:1 và thời gian lưu của pic thu được từ mẫu thử so với pic thu được từ mẫu chuẩn không được chênh lệch quá 5 % [25]

- Về phần MS:

+ Với kỹ thuật full scan: phổ khối phải có ít nhất 3 ion đặc trưng và phổ thu được phải phù hợp với phổ của chất chuẩn trong cùng điều kiện [25]

+ Với kỹ thuật SRM: phải có 2 ion con đặc trưng và tỷ lệ cường độ tuyệt đối

so với mẫu chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện không chênh lệch quá 10 % Hoặc

ít nhất 3 ion con đặc trưng và tỷ lệ cường độ ion tuyệt đối so với mẫu chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện không chênh lệch quá 20 % [25]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Mẫu nền: là các mẫu kem mỹ phẩm không chứa các GC cần nghiên cứu được chuẩn bị bởi khoa Nghiên cứu phát triển, viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương Công thức bào chế các mẫu nền dựa trên công thức của 3 mẫu kem:

+ Kem dưỡng ẩm Cetaphil moisturizing cream

+ Kem dưỡng trắng và giảm nếp nhăn Rebirth

+ Kem dưỡng trắng và giảm thâm nám ban đêm Za true white ex night cream

- Mẫu tự tạo: là mẫu nền có chứa chuẩn GC bằng cách thêm các chuẩn này vào mẫu nền với các nồng độ khác nhau

- Chế phẩm thử: Một số mẫu mỹ phẩm có mặt trên thị trường (Thông tin chi tiết được thể hiện ở phụ lục 1)

2.2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất

- Chất chuẩn: Thông tin các chất chuẩn sử dụng trong quá trình nghiên cứu

Độ ẩm (%)

MTF USP IOL395 99,7 (nguyên trạng)

- Dung môi, hóa chất: Methanol (Merck), acetonitril (Merck), acid formic

(Fisher), amoniacetat (Fisher), nước RO đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC

và LC-MS

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích

- Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ kiểu ghép nối ba tứ cực Xevo TQD với nguồn ion hóa kiểu phun sương điện tử - ESI, Water

- Cân phân tích Mettler Toledo MS 105 (d = 0,01 mg)

- Máy li tâm Sigma 4 – 16 KS

- Máy lắc xoáy IKA MS3 basic

- Micropipet eppendorf: 10 – 100 µl, 100 – 1000 µl

- Bình định mức, pipet thủy tinh class A,…

Tất cả các thiết bị phân tích tại khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) đều được kiểm tra, hiệu chuẩn định kỳ đáp ứng tiêu chuẩn GLP và ISO/IEC 17025

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định các GC nghiên cứu và chuẩn nội

Sử dụng hệ thống LC – MS/MS với nguồn ion hóa kiểu ESI, tiến hành thực nghiệm như sau:

- Tối ưu hóa điều kiện cho Betamethason valerat (BMV):

Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn BMV trong hỗn hợp MeOH : H2O (9:1) nồng độ khoảng 1 µg/mL vào nguồn ESI của thiết bị Tiến hành phân tích phổ khối

lượng với chế độ quét toàn phổ (full scan) và quét chọn lọc ion (selected ion mornitoring – SIM) xác định mảnh phổ tương ứng với ion ban đầu của BMV

Sau khi xác định được số khối của ion mẹ, tiến hành tối ưu điều kiện nguồn ion hóa bao gồm: điện thế, nhiệt độ, tốc độ khí nitơ cung cấp cho nguồn ion để bay hơi dung môi pha động sắc ký; điện thế của bộ phận tập trung dòng ion… tới quá trình ion hóa BMV tại nguồn ESI

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn các điều kiện của nguồn ESI phù hợp để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối có cường độ tín hiệu (vạch phổ) cao và ổn định Tiến hành nghiên cứu quá trình phân mảnh mẹ ở tứ cực thứ 2 của thiết bị MS với các mức năng lượng thay đổi từ thấp đến cao để xác định cơ chế phân mảnh ion ban đầu; số khối của các ion tạo thành; số khối của ion con đặc trưng cho quá trình phân mảnh dùng để định tính, định lượng BMV trong phương pháp phân tích và mức năng lượng tối ưu cho quá trình phân mảnh ion mẹ ban đầu

- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ cho các GC còn lại: Tiến hành tương tự như

tối ưu hóa điều kiện khối phổ BMV

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa đồng thời các GC cần nghiên cứu trong MeOH : H2O (9:1) Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên các cột C18 hoặc C8 (100 × 2,1 mm; 1,7 µm và 50 × 2,1 mm; 1,7 µm, 150 × 4,6 mm; 5µm) của các hãng khác nhau, trên các hệ pha động gồm dung môi hữu cơ (ACN hoặc MeOH) phối hợp với dung dịch đệm (acid formic 0,001%; amoni format 2 mM) theo các tỷ

lệ khác nhau, các chương trình rửa giải khác nhau (đẳng dòng hoặc gradient)

2.3.1.3 Khảo sát dung m i pha mẫu

Dựa trên tính chất hoá lý của hoạt chất cần phân tích và các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát dung môi pha mẫu như: MeOH, hỗn hợp MeOH : H2O ở tỷ

lệ 9:1, hoặc 1:1 và ACN

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn dung môi pha mẫu có thể chiết các GC với độ thu hồi cao, ổn định và không gây ra ảnh hưởng của nền mẫu khi phân tích bằng

MS

2.3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội

Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của các chất để tiến hành lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp Chuẩn nội được lựa chọn phải đảm bảo bền vững, có thể tham gia quá trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng chuẩn Dự kiến chất chuẩn nội lựa chọn gồm có: glibenclamid, telmisartan, cloramphenicol, pyridoxin hydrochlorid

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích các chất cấm nhóm GC bằng

kỹ thuật LC-MS/MS theo hướng dẫn của USFDA về thẩm định phương pháp phân tích trong mỹ phẩm Các chỉ tiêu cần thẩm định gồm: độ đặc hiệu – chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đường chuẩn – khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ chính xác trung gian, tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả

Tiến hành thẩm định trên các mẫu chuẩn được pha trong dung dịch nền mẫu

mỹ phẩm và các mẫu tự tạo chứa chuẩn GC có nồng độ phù hợp Các mẫu để thẩm định được chuẩn bị như sau:

30 phút, ly tâm ở 10000 vòng trong 10 phút, hút lấy lớp dịch trong

- Chuẩn bị chuẩn nội:

Cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn nội vào bình định mức 100 ml, hòa tan

và vừa đủ bằng MeOH Hút chính xác 0,1 ml dung dịch vừa pha vào bình định mức

100 ml, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn nội gốc

có nồng độ 100 ng/ml

- Chuẩn bị mẫu chuẩn:

Cân chính xác khoảng 25,0 mg mỗi chất chuẩn GC vào mỗi bình định mức

250 ml Hòa tan và thêm vừa đủ MeOH để thu được các dung dịch chuẩn gốc của mỗi GC trong MeOH với nồng độ chính xác khoảng 100 µg/ml Từ các dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng với hệ số thích hợp bằng methanol cho mỗi GC để

thu được dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc có nồng độ các chất GC như sau: cortison

acetat 200 ng/ml, betamethason valerat 300 ng/ml, betamethason dipropionat 400 ng/ml, clobetasol propionat 600 ng/ml, prednison, dexamethason, prednison acetat, hydrocortison acetat, triamcinolon acetonid, fluocinolon acetonid 1000 ng/ml, dexamethason acetat 1500 ng/ml, mometason furoat 3000 ng/ml

Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc trong dung dịch nền mẫu có chứa chuẩn nội để thu được đường chuẩn theo bảng 2.2

Bảng 2.2 Nồng độ dãy đường chuẩn của các GC

- Chuẩn bị các mẫu tự tạo để thẩm định độ đúng và độ lặp lại:

Các mẫu tự tạo được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc độc lập với mẫu chuẩn Tiến hành chuẩn bị các mẫu tự tạo ở 3 nồng độ: thấp (LOQ), trung bình (MQC) và cao (HQC) như sau:

+ Mẫu tự tạo LOQ: Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm

0,1 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc và 1,0 ml dung dịch chuẩn nội gốc

+ Mẫu tự tạo MQC: Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm

1,0 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc và 1,0 ml dung dịch chuẩn nội gốc

+ Mẫu tự tạo HQC: Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm

2,0 ml dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc và 1,0 ml dung dịch chuẩn nội gốc

- Chuẩn bị các mẫu để xác định tỷ lệ dương tính giả (FP), âm tính giả (FN):

+ Mẫu xác định FP: là các mẫu nền (mẫu âm tính)

+ Mẫu xác định FN: Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm

40 µl dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc (mẫu dương tính)

2.3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Tiến hành phân tích mẫu chuẩn được pha trong nền mẫu ở nồng độ thấp dần, giá trị LOD được xác định tại nồng độ có S/N ít nhất bằng 3, giá trị LOQ được xác định tại nồng độ có S/N ít nhất bằng 10

2.3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của 12 GC với nồng độ thấp nhất là

LOQ, nồng độ cao nhất khoảng 10 – 20 lần LOQ

- Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

+ Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ r ≤ 1

+ Độ chệch của các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn: Không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%

2.3.3.4 Độ chính xác

Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian

- Độ lặp lại được xác định bằng cách phân tích lặp lại 6 lần mẫu tự tạo ở 3

mức nồng độ: nồng độ thấp (LOQ), nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC) Giá trị RSD của các kết quả phân tích phải đáp ứng yêu cầu của USFDA

- Độ chính xác trung gian được tiến hành tương tự độ lặp lại nhưng khác

ngày và khác kiểm nghiệm viên

2.3.3.5 Độ đúng

Độ đúng được xác định bằng cách xác định độ thu hồi của hoạt chất ở các mẫu tự tạo với 3 mức nồng độ: LOQ, MQC, HQC Kết quả độ thu hồi phải đạt theo yêu cầu của USFDA

2.3.3.6 Xác định tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả

- Để xác định tỷ lệ dương tính giả, tiến hành phân tích 30 mẫu âm tính

- Để xác định tỷ lệ âm tính giả, tiến hành phân tích 30 mẫu dương tính

- Kết luận tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả của phương pháp theo hướng dẫn của USFDA

2.3.3 Xác định các nhóm chất GC trong một số mẫu kem bôi da có mặt trên thị trường

Áp dụng phương pháp đã xây dựng được để kiểm tra các chất nhóm GC trong một số mẫu kem bôi da có mặt trên thị trường Các mẫu kem được mua ở các cửa hàng và các siêu thị trên địa bàn Hà Nội

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định các GC

3.1.1.1 Điều kiện khối phổ cho BMV

* Ion hóa BMV và phổ khối MS:

Phân tích phổ khối trên thiết bị LC-MS/MS với chế độ phân tích khối 1 lần,

sử dụng kỹ thuật ghi toàn phổ tại tứ cực Q1 (full scan) và khảo sát trên nguồn ion hóa ESI ở chế độ điện tích dương và điện tích âm Với chế độ ESI (+) trên phổ đồ của dung dịch chuẩn BMV 1 µg/ml, xuất hiện vạch phổ có cường độ lớn và ổn định với tỷ số m/z = 477,24 (hình 3.1) Vạch phổ phù hợp với cấu trúc phân tử BMV (CTPT: C27H37FO6, KLPT: 476,3 g/mol) nhận một proton và mang điện tích +1 ([BMV+H]+) Với chế độ ESI (-) trên phổ đồ của dung dịch chuẩn BMV 1 µg/ml, xuất hiện vạch phổ có cường độ lớn và ổn định với tỷ số m/z = 475,15 Vạch phổ phù hợp với cấu trúc phân tử BMV mất một proton và mang điện tích -1 ([BMV-H]-

) Tuy nhiên vạch phổ tỷ số m/z = 477,24 ở chế độ ESI (+) cho tín hiệu lớn hơn và

ổn định hơn vạch phổ tỷ số m/z = 475,15 ở chế độ ESI (-) Do vậy chế độ ESI (+)

và mảnh khối có m/z = 477,24 được lựa chọn để khảo sát các điều kiện khối phổ tiếp theo

Hình 3.1 Phổ khối MS dung dịch chuẩn BMV với chế độ ESI (+)

472.59 470.63 471.36 472.02 473.19 473.35 474.30 475.06 475.50 476.23

478.32

479.30

Tiến hành tối ưu hóa điện thế tập trung ion (Cone voltage), để các ion

[BMV+H]+ hình thành ở nguồn ESI được “tập trung” và đi vào bộ phận phân tích khối với số lượng nhiều nhất trong một thời gian ngắn Giản đồ mối quan hệ giữa điện thế tập trung ion và tỷ lệ tương đối số lượng ion có số khối 477,24 Da đi vào

bộ phận phân tích khối (hình 3.2) cho thấy ở mức điện thế 24 V các ion [BMV+H]+

“tập trung” đi vào bộ phận phân tích khối là tối ưu nhất

Hình 3.2 Giản đồ tối ưu điện thế tập trung ion có số khối 477,24 Da

Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ:

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: điện thế, nhiệt độ, tốc độ khí

nitơ cung cấp tại nguồn ESI theo các nội dung đã trình bày ở mục 2.3.1.1 Kết quả

khảo sát cho thấy:

- Khi điện thế đầu phun tăng trên 3 kV, cường độ vạch phổ 477,24 Da tăng nhưng đồng thời nhiễu đường nền tăng và ngược lại Điều này, có thể do khi điện thế tăng có nhiều phần tử được tích điện hơn (bao gồm cả BMV và tạp chất) làm cho dòng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối tăng lên đồng thời các ion khác đi vào bộ phận phân tích khối cũng tăng lên và ngược lại Khi điện thế dưới 2,5 V, thì cường độ vạch phổ 477,24 Da thấp, làm giảm độ nhạy của phương pháp

- Khi đặt nhiệt độ đầu phun tăng lên, cường độ tín hiệu tăng lên và ngược lại Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng cao trên 500oC hoặc hạ thấp dưới 300oC, cường độ tín

hiệu thu được đều thấp và không ổn định

- Khi tốc độ dòng khí hóa hơi ở mức dưới 900 l/h, có hiện tượng ngưng tụ hơi nước ở đầu phun nên cường độ tín hiệu thấp và không ổn định Khi tăng áp suất dòng khí hiện tượng ngưng tụ hơi nước giảm đi và cường độ tín hiệu tăng Tuy nhiên, khi tốc độ dòng khí trên 900 l/h thì cường độ tín hiệu của dòng ion mẹ giảm xuống, có thể do một phần ion mẹ bị thổi qua đường thải cùng với dung môi pha động làm giảm lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối

Từ kết quả thực nghiệm, các thông số của nguồn ESI (+) tối ưu cho phân tích BMV được xác định là: Điện thế đầu phun: 2,75 kV; nhiệt độ đầu phun: 500oC; tốc

độ khí hóa hơi 900 l/h

* Phân mảnh ion ban đầu và phổ khối MS/MS của BMV

Sau khi phân mảnh ion mẹ, phân tích khối lần thứ 2 được thực hiện tại tứ cực Q3 với chế độ ghi toàn phổ MS/MS để xác định số khối của các ion con tạo thành (hình 3.3)

Hình 3.3 Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [BMV + H] +

Trên phổ đồ phân mảnh ion [BMV+H]+ (hình 3.3) trong số các ion con tạo thành, hai ion có tỷ số m/z = 355,14 và 337,13 có cường độ cao nhất, ổn định, lặp

lại và đặc trưng cho quá trình phân mảnh BMV Vạch phổ 355,14 phù hợp với cấu trúc ion mẹ [BMV+ H]+ trong quá trình phân mảnh mất đi phân tử HF và gốc valerat [BMV+H-HF-CH3CH2CH2CH2COOH], ion con có tỷ số m/z = 337,13 phù hợp với cấu trúc ion có m/z = 355,14 mất tiếp 1 phân tử H2O Như vậy, các cặp ion

có m/z = 477,24 - 355,14 và 477,24 – 337,13 được lựa chọn cho các thực nghiệm tiếp theo Quá trình phân mảnh ion ban đầu có m/z = 477,24 tạo thành các ion con

có m/z = 355,14 và 337,13 phụ thuộc vào mức năng lượng được cung cấp

Hình 3.4 Giản đồ năng lượng phân mảnh ion m/z 477,24 → 355,14

Hình 3.5 Giản đồ năng lượng phân mảnh ion m/z 477,24 → 337,13

Hình 3.4 và 3.5 biểu diễn diễn sự phụ thuộc giữa số lượng ion m/z = 355,14

và m/z = 337,13 tạo thành với mức năng lượng phân mảnh từ ion [BMV+H]+ ban đầu Kết quả cho thấy mức năng lượng tối ưu để phân mảnh ion [BMV+H]+ thành ion con có số khối 355,14 và 337,13 Da là 10 V Trong 2 ion con tạo thành thì ion m/z = 355,14 có cường độ cao và ổn định hơn nên được làm ion định lượng

Từ kết quả thực nghiệm, xác định điều kiện khối phổ MS/MS phân tích BMV như sau: Các cặp ion đặc trưng cho phân tích BMV có số khối lần lượt là 477,24 Da (ion mẹ); 355,14 và 337,13 Da (các ion con) Điện thế tập trung ion mẹ

là 24 V và năng lượng phân mảnh ion mẹ là 10 V

3.1.1.2 Điều kiện khối phổ cho các GC còn lại

Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ của các GC còn lại tương tự như BMV thu được kết quả như bảng 3.2, mục 3.1.5

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

- Khảo sát trên các cột Sunfire C18 (125 mm x 2,1 mm; 3,5 µm), Phenomenex C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm), Acquity UPLC BEH C18 hoặc C8 (100 mm x 2,1 mm; 1,7 µm và 50 mm x 2,1 mm; 1,7 µm ) nhận thấy cột Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,7 µm) cho pic cân đối, đáp ứng pic cao hơn

và thời gian phân tích phù hợp hơn so các cột còn lại (hình 3.6 và hình 3.7)

- Khảo sát trên các hệ pha động là hỗn hợp của dung môi hữu cơ (ACN hoặc MeOH) và dung dịch đệm (acid formic 0,1%, amoni format 2mM hoặc amoni acetat 10 mM) Kết quả cho thấy: khi sử dụng hệ pha động gồm MeOH và acid formic 0,1% thì pic GC có hình dáng cân đối hơn so với các hệ còn lại Tiến hành thay đổi tỷ lệ pha động gồm MeOH và acid formic 0,1% ở cả chế độ đẳng dòng và gradient để các pic thu được có cường độ tín hiệu cao và ổn định Kết quả khảo sát cho thấy, với chế độ đẳng dòng, ở tỷ lệ MeOH-acid formic 0,1% (75:25), pic rửa giải sớm, tín hiệu cao nhưng hình dáng pic không cân đối; ở tỷ lệ MeOH-acid formic 0,1% (70:30) pic rửa giải muộn; ở tỷ lệ (72:28), tất cả các pic GC có hình dáng cân đối (hình 3.8), tuy nhiên cường độ tín hiệu còn thấp; ở chế độ gradient, các pic có hình dáng cân đối và cường độ tín hiệu cao hơn so với chế độ đẳng dòng

(hình 3.9) Do đó, chương trình gradient (Bảng 3.1, mục 3.1.5) được lựa chọn để

tiếp tục nghiên cứu

Hình 3.6 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C 8 (2,1 x 100 mm,

1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,1 % (70:30)

Hình 3.7 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C 18 (2,1 x 50 mm,

1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,1 % (70:30)

Hình 3.8 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng pha động MeOH : acid formic 0,1 % (72:28)

Hình 3.9 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng chương trình gradient