phát hiện đột biến gen glucose 6 phosphat dehydrogenase trong hồng cầu người ở một số dân tộc phía bắc việt nam

Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện đột biến gen gây thiếu hụt glucose-6-phosphat dehydrogenase trong hồng cầu người ở một số dân tộc phía Bắc Việt Nam” với 2 mục tiêu:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGHIÊM THỊ THANH NGA

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN GLUCOSE-6-PHOSPHAT DEHYDROGENASE TRONG HỒNG CẦU NGƯỜI Ở MỘT SỐ DÂN

TỘC PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGHIÊM THỊ THANH NGA

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN GEN GLUCOSE-6-PHOSPHAT DEHYDROGENASE TRONG HỒNG CẦU NGƯỜI Ở MỘT SỐ DÂN

TỘC PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 8.72.02.08

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Tuyên

TS Đào Thị Mai Anh

HÀ NỘI - 2020

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên – Trưởng

phòng công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam

và TS Đào Thị Mai Anh - giảng viên Đại Học Dược Hà Nội Hai cô là người

đã hướng dẫn tận tình, dìu dắt, dạy bảo tôi từ khi tôi bắt đầu làm đề tài và đã hướng dẫn để tôi hoàn thành được luận văn này Cô không chỉ trang bị cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm chuyên môn quý báu, mà còn luôn tạo điều kiện để tôi có thể học hỏi không ngừng, phấn đấu hoàn thiện bản thân

Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn tới TS.BS Quách Xuân Hinh - Bệnh Viện Quân Y Trung ương 108 Bác sĩ là người đã giúp đỡ tận tình cho tôi trong việc tổ chức và tạo điều kiện cho việc lấy máu của một số dân tộc Sự giúp đỡ quý báu này đã hỗ trợ cho tôi hoàn thành nội dung nghiên cứu đề tài

Tôi xin cảm ơn các cán bộ phòng công nghệ sinh học Enzym – Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, những người đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi về trang thiết bị và kỹ thuật trong quá trinh thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và làm đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người luôn động viên tôi vượt qua khó khăn trong suốt chặng đường

Hà Nôi, ngày tháng năm 2020

Học viên

Nghiêm Thị Thanh Nga

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Glucose-6-phosphat dehydrogenase 3

1.1.1 Danh pháp 3

1.1.2 Cấu trúc 3

1.1.3 Cơ chế hoạt động 4

1.1.4 Vai trò của G6PD trong hồng cầu người 5

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến G6PD 6

1.2 Bệnh thiếu hụt G6PD 7

1.2.1 Định nghĩa 7

1.2.2 Dịch tễ 8

1.2.3 Cơ sở di truyền học 10

1.2.4 Cơ chế bệnh sinh 12

1.2.5 Biểu hiện lâm sàng 12

1.2.6 Phân loại 14

1.2.7 Điều trị và phòng bệnh 16

1.3 Các phương pháp xác định đột biến gen G6PD 16

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 19

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 21

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 21

2.1.3 Cỡ mẫu 21

2.1.4 Hóa chất 22

2.1.5 Thiết bị và dụng cụ 24

2.2 Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 24

2.2.2 Các phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu đề tài 26

2.3 Đạo đức nghiên cứu 33

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Kết quả sàng lọc tình trạng thiếu hụt G6PD ở một số dân tộc phía Bắc Việt Nam 35

3.1.1 Kết quả sàng lọc thiếu hụt G6PD bằng kĩ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng 35

3.1.2 Mức độ thiếu hụt enzym G6PD ở một số dân tộc xác định bằng phương pháp đo hoạt độ enzym 36

3.2 Phát hiện đột biến gen trong các trường hợp thiếu hụt G6PD bằng kĩ thuật PCR- MPTP 37

3.2.1 PCR – MPTP tìm đột biến gen G6PD 37

3.2.2 Kết quả đọc trình tự tìm đột biến gen G6PD 43

3.2.3 Phát hiện đột biến mới trên gen G6PD ở Việt Nam 46

Chương 4: BÀN LUẬN 48

4.1 Về tình trạng thiếu hụt G6PD của một số dân tộc phía bắc Việt Nam 48 4.2 Về phát hiện đột biến gen trong các trường hợp thiếu hụt G6PD bằng kĩ thuật PCR- MPTP 50

KẾT LUẬN 54

KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

CI Chlorfrom Isoamyl Chlorfrom Isoamyl

dNTP Deoxyribonucleotid triphosphate Deoxyribonucleotid triphosphat EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid Axit etylenediaminetetraacetic G6P Glucose – 6 – phosphate Glucose – 6 – phosphat

G6PD Glucose - 6 - phosphate dehydrogenase Glucose–6–phosphat

dehydrogenase GSH Glutathion Glutathion dạng khử

GSSG Oxidized glutathione Glutathion dạng oxi hóa

GPx Glutathion peroxidase Glutathion peroxidase

PCR-MPTP

PCR using Multiplex Tandem forward Primer

PCR đa mồi xuôi song song

NADP+ Nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate

NADP + dạng oxy hóa

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate dihydro

NADPH dạng khử PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen

RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic

mRNA messenger RNA ARN thông tin

WHO World Health Orrganization Tổ chức Y tế thế giới

EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid Axit Ethylen diamin tetraacetic

TBE Tris borate EDTA Tris borat EDTA

TAE Tris acetate EDTA Tris acetat EDTA

DANH MỤC BẢNG BIỂU

1 Bảng 1.1: Một số thuốc cần tránh cho bệnh nhân thiếu hụt G6PD 7

2 Bảng 1.2: Một số dạng đột biến phổ biến 11

3 Bảng 1.3: Phân loại thiếu hụt G6PD 15

4 Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đề tài 22

5 Bảng 2.2: Bảng các dung dịch đệm trong nghiên cứu đề tài 23

6 Bảng 2.3: Các thiết bị và dụng cụ trong nghiên cứu 24

7 Bảng 2.4: Trình tự mồi của exon 2, 9 và exon 11-12 trên

9 Bảng 3.1: Tỷ lệ thiếu hụt G6PD ở các dân tộc trong nghiên cứu 34

10 Bảng 3.2: Mức độ thiếu hụt G6PD ở các dân tộc trong nghiên

12 Bảng 3.4: Các dạng đột biến gen G6PD trên các exon 2, 9, 11,

12 trong nghiên cứu

41

13 Bảng 3.5: Các dạng đột biến gen G6PD trên một số dân tộc

trong nghiên cứu

41

5 Hình 1.5: Vai trò của G6PD trong hồng cầu 6

6 Hình 1.6: Bản đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD trên thế giới 9

7 Hình 1.7: Vị trí nhiễm sắc thể X và phân bố đột biến tg trình tự

9 Hình 2.2: Cơ chế phản ứng MTT tạo thành vòng Formazan 26

10 Hình 2.3: Nguyên tắc của phản ứng Formazan 26

11 Hình 2.4: Sản phẩm vòng Formazan trong khay 40 mẫu 28

12 Hình 3.1: Ảnh sản phẩm điện di ADN của PCR xác định exon 2

của 6 bệnh nhân thiếu hụt G6PD 38

13 Hình 3.2: Kết quả sản phẩm điện di PCR- MPTP xác định đột

biến Gaohe của exon 2 ở các mẫu bệnh nhân thiếuhụt G6PD

38

14 Hình 3.3: Sản phẩm điện di ADN của PCR trên exon 9 ở các

mẫu bệnh nhân thiếu hụt G6PD 39

15 Hình 3.4: Kết quả sản phẩm điện di PCR- MPTP xác định đột

biến Viangchan của exon 9 ở các mẫu bệnh nhân thiếu hụt G6PD

39

16 Hình 3.5: Sản phẩm điện di ADN của PCR trên exon 11-12 của

những bệnh nhân thiếu hụt G6PD 40

17 Hình 3.6: Sản phẩm điện di PCR-MPTP xác định đột biến Silent

ở exon 12 (A) và exon 11 (B) ở các mẫu bệnh nhân thiếu hụt G6PD

41

18 Hình 3.7: Kết quả đọc trình tự exon 2 ở người thiếu hụt G6PD 43

19 Hình 3.8 : Kết quả đọc trình tự exon 9 ở người thiếu hụt G6PD

ĐẶT VẤN ĐỀ

Glucose - 6 - phosphat dehydrogenase là một enzym oxy hóa khử, đóng vai trò then chốt trong quá trình chuyển hóa glucose theo con đường hexose monophosphat trong hồng cầu Con đường này tuy chỉ tạo ra năng lượng không đáng kể nhưng lại đảm bảo hai chức năng quan trọng là cung cấp ribose cho quá trình sinh tổng hợp acid nucleic và tạo ra NADPH, một chất khử vô cùng quan trọng Trong hồng cầu người, chất này tham gia vào quá trình chống lại các tác nhân oxy hóa, loại bỏ H2O2, giúp bảo vệ màng hồng cầu được bền vững, bảo vệ cấu trúc hemoglobin, cấu trúc các enzym có trong hồng cầu để duy trì sự sống cho tế bào hồng cầu Chính vì vậy, khi cơ thể thiếu hụt enzym này, hồng cầu sẽ bị phá hủy khi gặp tác nhân oxy hóa

Thiếu hụt G6PD là bệnh lý enzym hồng cầu hay gặp nhất ở người đặc biệt hay gặp ở những nhóm dân tộc sống trong vùng sốt rét lưu hành [1,6,8] Trên thế giới có hơn 400 triệu người mắc bệnh thiếu hụt G6PD [65], chiếm 1/10 dân số thế giới [31] Cơ sở di truyền học của bệnh thiếu hụt G6PD là do đột biến xảy ra trên gen mã hóa G6PD Gen này nằm trên nhánh dài, v ng 2, băng 8 của nhiễm sắc thể giới tính X (Xq28), không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y nên gặp nhiều ở nam hơn ở nữ Với sự phát triển của công nghệ sinh học, trình tự các exon hay toàn bộ trình tự của gen G6PD đã được xác định, đồng thời bằng các phương pháp như PCR, MPTP – PCR, giải trình tự…các đột biến mới của gen G6PD cũng liên tục được tìm ra Năm 2016 trên thế giới có 217 đột biến trong gen G6PD được xác nhận trong đó có 31 đột biến là đột biến mới [28]

Trong số 54 nhóm dân tộc của Việt nam, tình trạng thiếu G6PD là tương đối phổ biến ở các dân tộc đã được điều tra [1,6,7] Nghiên cứu G6PD ở mức độ phân tử tuy đã được bắt đầu nhưng còn chưa nhiều và chưa hoàn chỉnh [34,46] Việc bổ sung các dữ liệu về tần suất thiếu hụt

2

enzym G6PD và phát hiện đột biến mới, do đó là hết sức cần thiết Chính

vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện đột biến gen gây thiếu hụt glucose-6-phosphat dehydrogenase trong hồng cầu người ở một số dân tộc phía Bắc Việt Nam” với 2 mục tiêu:

1 Khảo sát tình trạng thiếu hụt G6PD trong hồng cầu người thuộc một

số dân tộc ở phía Bắc Việt Nam

2 Phát hiện các đột biến gen trên exon 2, 9, 11, 12 ở các cá thể người thiếu hụt G6PD

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Glucose-6-phosphat dehydrogenase

1.1.1 Danh pháp

Glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PD) là một enzym oxy hóa khử nằm trong hệ thống enzym oxy hóa, có kí hiệu quốc tế là EC 1.1.1.49 Enzym này còn có các tên gọi khác như: 6-phosphoglucose dehydrogenase, beta-D-glucose-6-phosphate; NADP oxidoreductase, Entner-Doudoroff enzym, NADP-dependent glucose 6-phophate dehydrogenase… [65]

1.1.2 Cấu trúc

G6PD là một enzym có tính không đồng nhất và đa dạng phân tử Bằng phương pháp phân tích hóa sinh người ta đã mô tả có 442 dạng phân tử khác nhau của enzym này Tính không đồng nhất của G6PD thể hiện ở sự chuyển dạng cấu trúc tùy thuộc vào điều kiện môi trường [30,40]

Dạng monomer của G6PD được cấu tạo từ chuỗi polypeptid gồm 515 acid amin, có khối lượng phân tử 59256 Daltons Kết quả giải mã trình tự acid amin của cả chuỗi cho thấy, tính đồng nhất của trình tự acid amin thay đổi theo tùy từng v ng V ng có tính đồng nhất cao được cho là vùng có chức năng quan trọng Ở người vùng này thuộc acid amin 188-291 [30]

Trong sự có mặt của NADP+ và nhóm –SH, hai phân tử monomer của G6PD có thể trùng hợp với nhau để tạo thành dạng dimer Đồng thời 2 phân

tử dimer cũng lại có thể tiếp tục trùng hợp với nhau để tạo thành dạng tetramer Sự chuyển dạng tetramer phụ thuộc vào pH môi trường và nồng độ các cation hóa trị 2 (Hình 1.1) Kết quả trên vi ảnh điện tử chỉ ra rằng, dạng tetramer chiếm ưu thế ở pH< 6, còn dạng dimer thì chiếm ưu thế ở pH > 8 [12,62]

Hình 1.1: Sự chuyển dạng cấu trúc của G6PD

cấu trúc là: Cys 385, Lys 386, Arg 387, Arg

393 Acid amin liên quan đến vị trí gắn NADP+

xúc tác là Lys 47 Ngoài ra, còn hai vị trí cũng liên quan đến việc gắn NADP+ nữa là acid amin 242-248

6-Hình 1.3 Phản ứng Glucose-6-phosphate Dehydrogenase [66]

Cơ chế của phản ứng này được nghiên cứu kỹ nhất trên vi khuẩn

Leuconostoc mesenteroides G6PD của vi khuẩn này sử dụng cặp electron tự

do của nguyên tử nitơ ở vòng imidazol của Histidin chuỗi bên như một tác nhân ái nhân để tấn công carbon bán acetal số 1 của phân tử G6P Nguyên tử này từ dạng aldehyd sẽ bị oxi hóa thành este vòng là lacton Điều này cho phép chuyển 1 proton H+ từ vị trí C1 của G6P sang vị trí C4 của khung nicotinamid của NADP+ và biến chất này thành NADPH (Hình 1.4) [66]

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng của G6PD [66]

Vì phân tử Histidin chuỗi bên này được bảo tồn trong trình tự G6PD ở nhiều loài khác nhau nên cơ chế xúc tác mô tả ở trên có thể là cơ chế chung cho tất cả các G6PD

1.1.4 Vai trò của G6PD trong hồng cầu người

G6PD là enzym then chốt mở đầu và điều khiển tốc độ cho con đường pentose phosphat (pentose phosphate pathway- PPP) Đây là con đường quan

6

trọng nhất cung cấp NADPH, nhân tố, đóng vai trò chính trong việc bảo vệ hồng cầu chống lại tác nhân gây oxy hóa Cụ thể là, NADPH hoạt động thông qua phản ứng chuyển GSSG thành GSH với sự tham gia của enzym glutathion reductase GSH được tạo thành sẽ ngăn cản quá trình peroxid trong hồng cầu, trực tiếp bảo vệ hồng cầu trước sự tấn công của các tác nhân oxy hóa Khi NADPH bị oxy hóa, GSSG bị khử thành GSH, NADPH sẽ chuyển thành NADP + và G6PD tiếp tục hoạt động và khử NADP+ thành NADPH Do glutathione peroxidase (GPX) và catalase (Cat) loại bỏ peroxid khỏi các tế bào hồng cầu bằng cách sử dụng GSH làm cơ chất, trong khi NADPH có vai trò làm giảm GSSG bị oxy hóa (Hình 1.5) nên chuỗi phản ứng này tạo liên hệ mật thiết với nhau để bảo vệ hồng cầu Sự tương quan giữa hoạt độ G6PD với

độ bền vững của hồng cầu có quan hệ mật thiết với nhau [35]

Thiếu enzym G6PD có ảnh hưởng đến việc sản xuất NADPH mà biểu hiện lâm sàng là hồng cầu dễ vỡ, nhất là khi dùng các thuốc oxy hóa

Nhiệt độ: enzym bắt đầu biến tính nhẹ từ 40oC, đến 60o

C thì hoạt tính của enzym còn lại không đáng kể

Độ pH: pH kiềm nhẹ sẽ làm cho nồng độ dạng dimer nhiều và enzym sẽ hoạt động tốt nhất, bởi vậy có mặt một lượng nhỏ NaHCO3 sẽ giúp enzym phản ứng tốt hơn pH tối ưu của G6PD là 8,0

Nồng độ của của các chất nội bào như cơ chất, các chất đồng yếu tố, chất tạo thành cũng tuân theo quy luật của các phản ứng hoá học khác Ion Mg2+ là ion đặc hiệu cho hồng cầu người, với nồng độ 0,01 mol/l thì hoạt độ enzym là 100%, ion kim loại này đóng vai trò tạo phức hợp giữa enzym và cơ chất Khi ở ngoài cơ thể thì để đảm bảo cho enzym hoạt động được tốt thì vấn

đề bảo quản là hết sức quan trọng vì G6PD là một enzym rất nhạy cảm, không bền vững, nhưng nếu hồng cầu được rửa và bảo quản nguyên vẹn trong dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ lạnh (4oC) ngay sau 24h thì hoạt độ enzym chưa bị thay đổi Trái lại chỉ bảo quản theo tiêu chuẩn trữ máu ở 20o

C thì sau 24h sẽ giảm 17% hoạt tính [5]

1.2 Bệnh thiếu hụt G6PD

1.2.1 Định nghĩa

Thiếu hụt G6PD là một bệnh lý di truyền làm suy giảm hoạt động của enzym G6PD trong hồng cầu Sự suy giảm enzym quan trọng này khiến cho hồng cầu dễ bị phá hủy có thể dẫn tới tình trạng thiếu máu tan huyết đặc biệt

là sau khi bệnh nhân ăn một số loại thực phẩm và thuốc

Danh sách các thuốc thông thường có thể gây thiếu máu tan huyết ở bệnh nhân thiếu hụt G6PD được trình bày trong bảng 1.1 [67]

Bảng 1.1: Một số thuốc cần tránh với bệnh nhân thiếu hụt G6PD

Thuốc giảm đau, hạ sốt, chốngviêm

Tỷ lệ cao nhất đươc thống kê là ở Châu Phi, Châu Á, Địa Trung Hải và Trung Đông [26,52] (Hình 1.6)

Hình 1.6: Bản đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD trên thế giới [28]

Các đột biến G6PD thường được phân loại theo mức độ nghiêm trọng của sự thiếu hụt G6PD đi kèm với hoạt động của enzym và thông số huyết học của bệnh nhân, từ các biểu hiện nghiêm trọng nhất với hoạt động G6PD còn lại dưới 5% (lớp I) đến dạng nhẹ nhất (lớp V) [28] Độ thiếu hụt này phân

bố không đồng đều giữa các quốc gia, với tần suất từ 2% đến 20% ở Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ và Ý; nhưng tăng tới 70% trong các nhóm người Do Thái người Kurd [26] Ở châu Mỹ Latinh (LA), tỷ lệ thiếu hụt G6PD thấp hơn so với các khu vực khác như châu Phi cận Sahara hoặc châu Á [35,44] Sự thiếu hụt G6PD ở LA thay đổi đáng kể từ vùng này sang vùng khác ngay cả trong cùng một quốc gia Sự khác biệt này có thể là do sự không đồng nhất di truyền giữa các quần thể cũng như các phương pháp chẩn đoán được sử dụng trong mỗi nghiên cứu Các nghiên cứu cũng cho thấy sự thiếu hụt G6PD thường gặp ở nam nhiều hơn nữ [37,45,58] Tại Hoa Kỳ, sự thiếu hụt này chủ yếu ảnh hưởng đến nam giới có nguồn gốc dân tộc châu Phi và Địa Trung Hải, với tỷ

1.2.3 Cơ sở di truyền học

1.2.3.1 Gen mã hóa

Ở người, gen mã hóa cho G6PD nằm ở nhánh dài của nhiễm sắc thể X

vị trí v ng 2 băng 8 (dải Xq28) [11,41,55] Vùng này gắn với rất nhiều nhóm gen khác nhau như: gen mã hóa hội chứng nhiễm sắc thể X, hemophillia A, nhìn màu ( Hình 1.7)

Hình 1.7 Vị trí trên nhiễm sắc thể X và phân bố đột biến trong trình tự

mã hóa gen G6PD [28]

Gen này có kích thước 18,5 Kb, bao gồm 13 exon và 12 intron Exon

13 dài khoảng 800 nucleotid và chứa một bộ ba mã kết thúc [14] Vùng mã hóa protein được chia thành 12 phân đoạn, có kích thước từ 12 đến 236 bp [58] Exon đầu tiên không chứa chuỗi mã hóa Intron 2 giữa exon 2 và 3 có

kích thước dài nhất tới 9,857 bp mARN của G6PD gồm 2269 nucleotid

tương ứng 2,4kb Cũng như những gen khác, 600 bp đầu tiên của vị trí đầu 5’ tương ứng với exon 1 và một phần của exon 2 không làm nhiệm vụ mã hóa do

đó bộ ba mã hóa khởi đầu ATG nằm ở vị trí 127 bp của exon 2 Đây là một vùng giàu guanin và cytosin (CpG) với mức độ cao (80%) Vùng CpG này được bảo tồn ở người và chuột [11,59]

Bảng 1.2 Một số dạng đột biến phổ biến

Đột biến Thay thế

nucleotide cDNA

Vị trí

mã hóa

Axit amin thay thế

Exon Nguồn

gốc

TLTK

Đột biến đơn Việt Nam 1 7G> A 3 Glu → Lys 2 Việt Nam [34] Bahia 197T> A 66 Phe → Thr 4 Brazil [52] Việt Nam 2 197T> G 66 Phe → Cys 4 Việt Nam [34] Tunis 920A> C 307 Glu → Pro 9 Tunisia [23]

12

Nefza 968T> C 323 Leu → Pro 9 Tunisia [23] Karachi 973G> A 325 Asp → Asn 9 Pakistan [51] Tennessee 1465C> G 422 Leu → Val 10 Hoa Kỳ [50]

Đột biến nhiều điểm Viangchan +

Union

871G > A 1360C > T

291

454

Val → Met Arg → Cys

X trong tế bào nữ từ giai đoạn sớm của quá trình phát triển của phôi Sau đó, theo sự phân bào nó được nhân lên tạo thành dạng khảm giữa tế bào có nhiễm sắc thể lành và mang bệnh với các tỷ lệ khác nhau Vì vậy, những người này

có hai quần thể hồng cầu: một nhóm hồng cầu bình thường và một nhóm thiếu G6PD Người nữ đồng hợp tử gen đột biến hiếm gặp Người nam chỉ cần mang một gen đột biến là đã thể hiện sự thiếu hụt G6PD Do đó, tỉ lệ trẻ nam được phát hiện bệnh cao hơn trẻ nữ

1.2.5 Biểu hiện lâm sàng

1.2.5.1 Biểu hiện lâm sàng

Khác với các nguyên nhân gây thiếu máu tan máu khác, những người bị thiếu hụt G6PD thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng Chỉ khi tiếp xúc với tác nhân oxy hoá, triệu chứng lâm sàng thường thể hiện chủ yếu là

những cơn tan máu Tuỳ thuộc vào loại đột biến mà hoạt độ G6PD của người bệnh khác nhau, cùng với tính chất của từng tác nhân oxi hóa và các bệnh di truyền đồng thời khác mà các triệu chứng lâm sàng khác nhau

- Do dùng thuốc: Ở một số người thiếu máu tan máu có thể liên quan

từ việc sử dụng thuốc, mặc dù không phải là tình trạng tan máu vĩnh viễn Tán huyết do thuốc là tác dụng gây bệnh đầu tiên và được biết đến nhiều nhất khi thiếu G6PD Triệu chứng tan máu dẫn đến tan máu thường xảy ra vào ngày thứ 2, 3 sau khi dùng thuốc Trong tan huyết nặng, bệnh nhân có thể gặp phải các triệu chứng về đau lưng và dạ dày và nước tiểu chuyển sang màu tối [18]

- Tan máu trong bệnh đái tháo đường: giai đoạn bắt đầu nhiễm toan đái tháo đường có thể dẫn đến tan máu ở những người thiếu G6PD [18]

- Do nhiễm trùng: Nhiễm trùng có lẽ là nguyên nhân phổ biến nhất của tan huyết ở những người bị thiếu G6PD Có rất nhiều báo cáo về tầm quan trọng của nhiễm trùng trong việc gây thiếu máu tan huyết Một số lượng lớn các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, virus và rickettsia đã được báo cáo là yếu

tố ảnh hưởng Viêm gan truyền nhiễm (viêm gan A), viêm phổi và sốt thương hàn được biết là gây ra tan máu Liên quan đến đường hô hấp trên và hệ tiêu hóa, nhiễm virus đã được báo cáo là nguyên nhân gây tan máu nặng hơn [43]

- Vàng da sơ sinh: Một trong những hậu quả đe dọa nhất của thiếu G6PD là vàng da sơ sinh [18] Vàng da ở trẻ bị thiếu men G6PD có thể nhẹ hoặc nặng đến mức gây ra bệnh Kernicterus, một loại bại não co cứng và thậm chí có thể gây tử vong [43] Vàng da sơ sinh có hai loại là sinh lý và bệnh lý Vàng da sinh lý thường diễn ra trong ba ngày đầu và kết thúc tối đa

là 10 ngày, mức độ vàng da nhẹ Vàng da bệnh lý xuất hiện khi nồng độ bilirubin trong máu cao hơn 20mg/dl

- Hội chứng Favism (Luzzatto, 2001) [18,43]: là bệnh lý thiếu máu đã được biết đến từ thời kì Pythagoras, khi đó người ta nhận thấy rằng việc ăn đậu fava sau khoảng 24 giờ thì xuất hiện tình trạng tan máu, có khi rất dữ dội Sau đó thì cũng có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng tình trạng này có liên quan

14

đến thiếu hụt G6PD Trong đậu Fava thành phần liên quan trực tiếp gây ra hiện tượng tan máu là glucosidevicin và dividin Aglycon của chúng được thay thế bởi prymidin đến tổn thương oxi hóa cho xu hướng oxi hóa tự phát ở những bệnh nhân này thường thấy Hemoglobin niệu trong vài ngày Bệnh nhân có thiếu máu cấp: da xanh, niêm mạc nhợt, nhịp tim nhanh, gan, lách có thể

to Trường hợp nặng có thể suy tim, suy thận Ngoài ra hiện tượng tan máu còn được biết đến sau khi bệnh nhân sử dụng một số loại thức ăn có tính oxi hóa cao như long não, rượu vang đỏ, các sản phẩm từ đậu tương, đậu nành

1.2.5.2 Cận lâm sàng

Lúc khởi phát cơn tan máu cấp: hemboglobin giảm nhanh

Nếu tan máu nặng: Hb được giải phóng ồ ạt, không chuyển hóa kịp, Hemoglobin tự do có thể xuất hiện trong huyết tương và trong nước tiểu, hồng cầu giảm hồng cầu lưới tăng

Khi soi hồng cầu không nhuộm thì phát hiện được thể Heinz

Hoạt độ enzym G6PD giảm

Tuy nhiên sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn luôn rõ ràng

1.2.5.3 Chẩn đoán

Thiếu G6PD cần được xem xét thông qua dịch tễ và tiền sử: vùng có tỉ lệ thiếu hụt G6PD, vùng có sốt rét lưu hành; tiền sử vàng da, thiếu máu cấp hoặc mạn tính; các triệu chứng lâm sàng xuất hiện sau khi dùng các thuốc hoặc các thực phẩm có tính oxi hóa mạnh

Việc chẩn đoán xác định sẽ dựa vào việc đánh giá thiếu hụt G6PD bằng phương pháp định tính, bán định lượng hay định lượng Ngoài ra có thể sử dụng kĩ thuật phân tích gen để phát hiện nguyên nhân, dạng đột biến gen từ

đó có thể hướng tới dự phòng và tiên lượng

1.2.6 Phân loại

Dựa vào hoạt độ của enzym trong hồng cầu và những biểu hiện lâm sàng của chúng, WHO đã chia các biến thể của thiếu hụt G6PD thành 5 lớp (Bảng 1.3) [15]:

Bảng 1.3 : Phân loại thiếu hụt G6PD

Lớp Hoạt độ enzym và một số biệu hiện lâm sàng

I Hoạt độ enzym < 1% (Thiếu enzym nặng với biểu hiện thiếu máu tan máu hồng cầu hình không tròn mạn tính.)

II Hoạt độ enzym < 10% so với bình thường (thiếu G6PD nặng)

III Hoạt độ enzym từ 10-60% so với bình thường (thiếu G6PD từ nhẹ

Các đột biến lớp II bị thiếu hụt enzym nghiêm trọng, không bị thiếu máu tan huyết không đặc hiệu mãn tính: G6PD Mediterrian, G6PD Canton, G6PD Union, G6PD Kaiping

Các đột biến loại III bao gồm thiếu hụt enzym trung bình hoặc nhẹ, với hoạt động ở mức 10-60% G6PD B +: G6PD Aˉ

Các đột biến lớp IV có sự thiếu hụt hoặc không, có enzym hoạt động là 60-90%: G6PD A +

Các đột biến lớp V đã tăng hoạt động của enzym: G6PD Hektoen [20] Tuy nhiên sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn rõ ràng Một vài đột biến được liệt kê trong lớp một do chúng gây ra những rối loạn chức

năng nghiêm trọng, nhưng nếu xét về mặt hoạt độ enzym in vitro thì thậm chí

lại cao hơn một số biến thể lớp III [15,47]

Khi tan máu xảy ra cần ngưng d ng thuốc, nếu tình trạng thiếu máu do tan máu nặng cần được truyền máu, lưu ý không d ng những loại thiếu máu G6PD

1.2.7.2 Phòng bệnh

Tùy vào từng tình trạng mà việc phòng bệnh cũng khác nhau :

Trường hợp những bệnh nhân đang có biểu hiện tan máu cần theo dõi chặt chẽ tránh các biến chứng có thể xảy ra : vàng da, suy thận

Trường hợp những bệnh nhân khi có chỉ định dùng thuốc có tính oxy hóa (aspirin, primaquinin ) cần thận trọng, nếu có dấu hiệu tan máu cần được xét nghiệm G6PD

Trường hợp những bệnh có tiền sử thiếu hụt G6PD thì cần tránh những thực phẩm và thuốc có tính chất oxy hóa

1.3 Các phương pháp xác định đột biến gen G6PD

Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định biến thể ở gen G6PD Bao gồm: giải trình tự gen, phương pháp ARMS-PCR, phương pháp MPTP-PCR…

Bảng 1.4: Các phương pháp phát hiện đột biến G6PD Phương

pháp

điểm

Đột biến G6PD Giải

của máy là trong suốt quá

trình điện di, mỗi khi có một

vạch điện di đi qua ch m tia

laser thì vạch điện di sẽ phát

sáng lên và sự phát sáng này

sẽ được con mắt cảm quang

ghi nhận và lưu lại thành một

đỉnh cường độ sáng trong

biểu đồ Từ biểu đồ của các

đỉnh cường độ sáng này, máy

tự

Kinh phí cao Thời gian xác định đột biến khá lâu( mất khoảng 1 ngày)

Kaiping Canton Gaohe Silent Viangchan Chatham Union Chinese-5

nucleotid của primer ở đầu 3’

thiết kế cho các alen khác

nhau Chính vì vậy ARMS

còn có một số tên gọi khác

nữa căn cứ vào bản chất của

kỹ thuật: PCR đặc hiệu alen

(allele specific PCR - ASP),

khuếch đại PCR của các alen

Thời gian xác định đột biến ngắn khoảng 4h

từ khâu PCR đến khi có kết quả

Một số thay đổi nucleotid không bị phát hiện -Thay đổi nucleotid chỉ được định vị gần đúng trong

Kaiping Canton

18

đặc hiệu (PCR amplification

of specification of specific

alleles - PASA) hay khuếch

đại allele đặc hiệu (allele

specific amplification - ASA)

Phương pháp nhanh gọn, tiết kiệm thời gian chi phí thấp

gen đích của G6PD được

khuếch đại, sau đó sản phẩm

này được sử dụng làm khuôn

tiến hành với nhiều primer

xuôi chiều Những primer

xuôi chiều nối đuôi nhau phủ

toàn bộ v ng gen đích và một

primer ngược thông thường

làm khuếch đại từng đoạn

“theo bậc thang” Sự thay đổi

nucleotid trong v ng “rà soát”

Phương pháp đơn giản, dễ phát hiện các đột biến gen đặc biệt với người thiếu hụt G6PD

-Kinh phí thấp phù hợp ở các nước đang phát triển

Phải PCR lần 1

để xác định vùng

khuếch đại

và MPTP lần

PCR-2

Kaiping Canton Gaohe Silent Viangchan Chatham Union Chinese-5

của primer dẫn đến việc thiếu

một hay hai sản phẩm khuếch

đại Lợi ích của kỹ thuật này

là hầu hết trình tự đột biến

trong v ng đích của gen trên

nhiễm sắc thể có thể được khu

trú lại một vùng nhỏ và được

phát hiện sau hai bước PCR

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có trên 400 triệu người bị thiếu hụt G6PD [41], vì vậy việc phân tích và tìm kiếm các đột biến mới vẫn đang được nghiên cứu mở rộng

và bổ sung Năm 2012 theo thống kê các đột biến cũ và mới, Municci và cộng sự cho thấy có đến 186 biến thể gen G6PD Trong đó, 159 biến thể tìm thấy là biến thể điểm chiếm 85,4%, 15 (8%) biến thể thay thế 2 hay nhiều nucleotid, 10 (5,3%) biến thể xóa đoạn và 2 (1%) biến thể xảy ra trên intron [48]

Đến năm 2016, Gómez Manzo và cộng sự cập nhập thêm 31 đột biến mới của enzym G6PD Lúc này số lượng biến thể G6PD được báo cáo là 217 đột biến trong đó: 182 (83,9%) là các thay thế nucleotid đơn, 19 (8,7%) là nhiều biến thể (2 hoặc nhiều nucleotid thay thế), 11 (5,1%) là xóa đoạn và 5 (2,3%) biến thể ảnh hưởng đến các intron Các đột biến chủ yếu thuốc lớp 1 trên các exon 6,7,8,10 [28] Những dạng đột biến thuộc phân lớp này thường dẫn đến kiểu hình nghiêm trọng, thiếu máu tan máu hồng cầu không hình cầu mạn tính với hoạt tính enzym dưới 10% so với người bình thường Vì vậy việc xác định cá thể mắc bệnh thuộc phân lớp này thường dễ dàng hơn so với phân lớp khác trong dân số nói chung Các loại đột biến được tìm thấy thường

20

phân bố có tính khu vực

Ở Phương Đông người ta tìm thấy một số biến thể như: Gaohe, Chinese-4 ở Trung Quốc, Ube và Konan ở Nhật, Chinese-3 ở Philippin, Mahidol ở Đông Nam Á, Trung Quốc Đài Loan Viangchan ở một số dân tộc

di cư từ Ấn Độ, Lào và Philipin Chatham ở Philipin Caton ở Trung Quốc, Kaiping ở Lào, Trung Quốc Union ở Lào, Trung Quốc và Nhật Bản [36,64]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Các dạng đột biến thường gặp trong các nghiên cứu tại Việt Nam như: Viangchan, Canton, Kaiping, Union thuộc lớp II; Gaohe, Chatham thuộc lớp III; Chinese - 5 chưa phân lớp Các biến thể trên thuộc các exon 2, 9, 11, 12 Một biến thể khác dạng Silent cũng xuất hiện trên exon 11, 1311C>T bộ ba TAC TAT cùng mã hóa cho Tyrosine nên không làm biến đổi thứ tự acid amin, biến thể này thường xuất hiện đồng thời cùng một số biến thể khác như Viangchan và Canton với tần suất tương đối cao [1] Việt Nam cũng đã đóng góp vào cơ sở dữ liệu đột biến trên gen G6PD với các biến thể phát hiện gặp lần đầu tiên như G6PD Bao Loc (118 Tyr > His), Vietnam1 (3Glu > Lys), Vietnam2 (66Phe >Cys), Vietnam3 (73Ser > Ser) [34,46]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Những người tự nguyện tham gia nghiên cứu Có sức khỏe, không có dị tật bẩm sinh Không có bệnh mạn tính Trạng thái thần kinh ổn định, tâm sinh

lý bình thường Các đối tượng thuộc các dân tộc Kinh, Thái, Hà Nhì, Mường,

độ tuổi 1759 tuổi, có thời gian định cư trên 10 năm (theo nghị quyết số 51/2001/QH10) Tự nguyện tham gia nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

Các đối tượng bị thiếu máu cấp và mạn tính Không tự nguyện tham gia nghiên cứu

cỡ mẫu ước lượng với từng dân tộc là:

- Người Mường: 328 người

22

- Người Thái: 204 người

- Người Kinh: 17 người

- Người Hà Nhì: 183 người

Như vậy cần ít nhất 732 người để đáp ứng đủ cỡ mẫu nghiên cứu sàng lọc thiếu hụt G6PD Thực tế chúng tôi tiến hành sàng lọc được 1800 đối tượng tham gia nghiên cứu

2.1.4 Hóa chất

Các hóa chất và dung dịch đệm sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1 và Bảng 2.2

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đề tài

1 Bộ kit dùng cho phản ứng PCR Fermantas,Mỹ

2 Bộ kit d ng để tách ADN từ thạch agarose QUIAGEN, Mỹ

3 Bộ kit cho phản ứng PCR giải trình tự Fermantas, Mỹ

4 Bộ kit d ng để tinh sạch sản phẩm PCR giải

trình tự

Fermantas, Mỹ

5 Bộ kit định lượng hoạt động G6PD Randox, Anh

18 Digitonin Việt Nam

28 Một số hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phòng thí

6 Đệm pha mẫu ADN –

loading buffer 5x

Tris HCl 1M, pH8,0 1 ml EDTA 0,5M, pH8,0 0,2ml Glycerol 2 ml Bromophenol blue 1% 2 ml

7 Dung dịch nhuộm

ethidium bromide

Đệm TAE 1x 100 ml Ethidium bromide 2,5 µl

24

2.1.5 Thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phòng Công nghệ Sinh học Enzym, Viện Công nghệ Sinh học được liệt kê trong Bảng 2.3

Bảng 2.3: Các thiết bị và dụng cụ trong nghiên cứu

STT Tên dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc

1 Tủ lạnh thường Sanyo, Nhật Bản

2 Tủ lạnh âm sâu-80o Sanyo, Nhật Bản

4 Máy li tâm thường Beckman, Đức

5 Máy li tâm lạnh Beckman, Đức

6 Máy PCR 100 MJ.Research Inc, Mỹ

7 Máy soi gel Dolphin- Doc Weateach, Mỹ

8 Lò vi song Electrolux, Thụy Điển

9 Máy ổn nhiệt Haake SWB, Đức

10 Máy Vortex Rotolab, OSI

11 Máy giải trình tự tự động ABI

Avant Genetic Analyzer 3100

ABI, Mỹ

13 Micropipet Mettler Toledo, Mỹ

14 Miếng lót mềm Việt Nam

15 Ống thủy tinh chia vạch Việt Nam

16 Thiết bị điện di Bio-Rad, Mỹ

17 Một số dụng cụ, thiết bị khác

2.2 Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được các mục tiêu của đề tài, quá trình nghiên cứu bao gồm

những nội dung chính sau (Hình 2.1):

Hình 2.1: Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát tình trạng thiếu hụt G6PD ở một số dân tộc phía bắc Việt Nam

- Phát hiện thiếu hụt bằng kĩ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng: Thu thập mẫu: lấy mẫu máu ở đầu ngón tay hoặc tĩnh mạch của đối tượng nghiên cứu, vào buổi sáng lúc đói, nhỏ vào vòng tròn đã định sẵn trên giấy Whatman-3 Để khô ở nhiệt độ phòng, lưu trữ trong 7 ngày cho đến lúc làm xét nghiệm (tốt nhất là giữ lạnh trong 4o C) Sàng lọc thiếu hụt G6PD bằng kĩ thuật Formazan bán định lượng tại phòng Công nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Xác định tỉ lệ thiếu hụt G6PD bằng cách định lượng: Một số trường hợp dương tính trong kết quả sàng lọc sẽ được lấy máu lần 2, xác định mức

độ hoạt tính G6PD bằng kĩ thuật định lượng hoạt độ G6PD

 Phát hiện các đột biến gen ở các cá thể người thiếu hụt G6PD

- Phát hiện đột biến đã biết bằng phương pháp PCR-MPTP [59]

- Xác định dạng đột biến kiểm tra và tìm đột biến mới bằng cách giải trình tự bằng máy tự động 3100 của hang Applied Biosystems

26

2.2.2 Các phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu đề tài

2.2.2.1 Phát hiện thiếu hụt bằng kĩ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng

Tình trạng thiếu hụt G6PD được xác định bằng kĩ thuật tạo vòng Formazan bán định lượng [13]

 Nguyên tắc:

Dựa vào nguyên tắc của phản ứng thông qua xúc tác của G6PD, NAPD+

bị khử thành NAPDH NADPH tạo thành sẽ khử với 2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, màu vàng) thành phức hợp formazan (màu xanh) dưới sự xúc tác của phenazin methosulphat Phản ứng xảy ra khi H+ của NADPH gắn vào vị trí N1 vòng tetrazol của MTT dẫn đến

3-[4,5-dimethylthiazol-mở vòng tetrazol khi đó MTT bị khử thành formazan (Hình 2.2)

Hình 2.2: Cơ chế phản ứng của MTT tạo thành Formazan[68]

Diện tích và độ đậm của vòng sản phẩm của phản ứng một thời gian nhất định tỷ lệ thuận với hoạt tính của enzym G6PD trong mẫu thử (Hình

MTT

(Màu vàng)

G6PD

PMS

 Kĩ thuật tiến hành

Chuẩn bị mẫu thử: Máu lấy từ tĩnh mạch hoặc từ đầu ngón tay, vào buổi

sáng, khi đối tượng chưa ăn sáng; nhỏ 3 giọt máu vào giấy S&S#903, để khô

và bảo quản ở nhiệt độ thấp từ 4o

C20oC, trong thời gian 7 ngày

Tạo đĩa gel (kích thước 14cm10cm2 cm)

Cho 400mg agar cho vào 30 ml dung dịch đệm Tris-HCl 0,1M đã bổ sung MgCl2, đun sôi cho tan hết, để nguội đến 55o

C Hoà tan G6PNa2, NADP+, MTT, PMS trong 10ml dung dịch đệm còn lại Trộn đều 2 dung dịch trên với nhau, sau đó đổ vào khay nhựa (chú ý dàn đều bản gel và tránh tạo bọt trong gel) Bản gel sau khi đông đặc cần bảo quản ở chỗ mát và tránh ánh sáng Tra mẫu vào bản gel và duy trì điều kiện của phản ứng

Các mẫu máu thấm trên giấy khô được cắt bằng kìm, bấm lấy 1 mẩu hình tròn có đường kính 3mm, đặt úp mẩu giấy trên mặt gel tại các vị trí đã được định vị sẵn, sau đó ấn nhẹ cho mẩu giấy tiếp xúc hoàn toàn với mặt gel

Có thể sử dụng các khay lớn (kích thước 24cm  24cm  2 cm) có 196 vị trí đặt mẫu, bao gồm: 01 chứng âm, 01 chứng dương và 194 mẫu thử, khi số lượng mẫu lớn

Khay mẫu thử được ủ ở 37oC và tránh ánh sáng Kết quả được đọc sau

8 giờ

 Nhận định kết quả phản ứng

Sản phẩm của phản ứng là formazan có màu xanh tím Diện tích và độ đậm của vòng màu sản phẩm (sau một thời gian nhất định) tỉ lệ với hoạt tính của enzym trong mẫu thử ( Hình 2.1):

28

Hình 2.4: Sản phẩm vòng Formazan trong khay 40 mẫu

Vòng màu có màu xanh tím với đường kính D  7mm, là mẫu bình thường (âm tính)

Vòng màu có màu xanh tím với đường kính D (5mm<D <7mm), là mẫu dương tính 1+

Vòng màu có màu xanh tím với đường kính D (với D < 5mm), là mẫu dương tính 2+

Vòng màu không có màu xanh tím hoặc màu xanh tím rất nhạt chỉ có màu gen hoặc màu của Hb, là mẫu dương tính 3+

2.2.2.2 Kĩ thuật định lượng hoạt độ G6PD

Hoạt độ G6PD được định lượng theo kit của hãng Randox [69,70]:

 Nguyên tắc

Hoạt độ G6PD được xác định dựa trên sự thay đổi của phổ hấp thụ tại bước sóng 340nm của coenzym NADPH sinh ra trong quá trình phản ứng

Hoạt độ G6PD tỉ lệ thuận với độ hấp thụ của NADPH

G6P + NADP+ Gluconate-6-P + NADPH + H

 Các bước tiến hành

Lấy máu tĩnh mạch (1ml), vào buổi sáng, khi đối tượng chưa ăn sáng, chống đông bằng EDTA hoặc heparin Mẫu có thể bảo quản lạnh 1 tuần ở nhiệt độ thấp từ 2oC đến 8o

C

Tiến hành tách hồng cầu để lấy dịch chứa enzym G6PD: Rửa 0,2 ml máu với 2ml dung dịch NaCl 0,9%, sau đó li tâm trong 10 phút, tốc độ 3000 vòng/phút Rửa 3 lần Bỏ dịch nổi lấy cặn tủa, thêm 0,5 ml dung dịch 4, để yên trong 15 phút ở 4oC Li tâm một lần nữa Lấy 0,05 ml dịch nổi để xác định hoạt độ G6PD

 Cách tính kết quả

Hoạt độ G6PD (IU/l/37oC) = A/phút 33650

Hoạt độ G6PD (IU/1012HC/37oC) = A/phút 33650/số lượng hồng cầu trong một lít (đơn vị tính là 1012

HC) Hoạt độ G6PD (IU/gHb/37oC) = A/phút 33650/nồng độ Hb trong một lít (đơn vị tính là gHb)

 Kết quả

Hoạt tính bình thường ≥ 100 UI/1012 HC

Thiếu G6PD nhẹ và trung bình : 40 - 100 UI/1012 HC

Thiếu G6PD nặng ≤ 40 UI/1012 HC