nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số thành phần trong quế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trên thế giới đã có nhiều phương pháp nghiên cứu một hoặc một số các thành phần có trong quế như: HPLC-PDA, LC-MS/MS,… Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện chưa có phương pháp tiêu chuẩn để xác

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ VIỆT NGÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN

TRONG QUẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ VIỆT NGÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN

TRONG QUẾ QUẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Đình Chi và PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo đã luôn tâm huyết và tận tình hướng

dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới PGS TS Nguyễn Thị Ánh Hường đã cho tôi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và

tạo điều kiện tối đa giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Vũ Thị Trang cùng các anh chị, các bạn

khoa Dinh dưỡng và phụ gia thực phẩm – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực

phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện

luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học,

bộ môn Hóa phân tích – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người đồng hành không thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và khích

lệ tôi những ngày qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2020

Sinh viên

LÊ VIỆT NGÂN

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về quế 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 3

1.1.2 Bộ phận dùng 5

1.1.3 Thành phần hoá học 5

1.1.4 Tác dụng dược lý của quế 5

1.1.5 Tính vị, công năng, công dụng của quế 8

1.2 Tổng quan một số hoạt chất trong quế 10

1.2.1 Coumarin 10

a Độc tính trên động vật 10

b Độc tính trên con người 11

1.2.2 Acid cinnamic 11

1.2.3 Cinnamyl alcohol 12

1.2.4 Cinnamaldehyd 12

1.2.5 Eugenol 13

1.2.6 Cinnamyl acetat 14

1.2.7 Acid 2-hydroxycinnamic 14

1.3 Tổng quan về phương pháp xác định một số thành phần trong quế 15 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Nguyên vật liệu – thiết bị 20

2.2.1 Nguyên vật liệu 20

2.2.2 Thiết bị 21

2.2.3 Nội dung nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích các chất bằng HPLC 22

2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 23

2.3.3 Thẩm định quy trình 23

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích một số chất trong quế bằng phương pháp HPLC 25

3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện 25

3.1.2 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 27

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 29

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 30

3.2.2 Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu 30

3.2.3 Khảo sát thời gian chiết mẫu 31

3.2.4 Khảo sát cách chiết mẫu 32

3.2.5 Khảo sát cách làm sạch mẫu 32

3.3 Thẩm định phương pháp 34

3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc 34

3.3.2 Độ thích hợp hệ thống 35

3.3.3 Khoảng tuyến tính 36

3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 38

3.3.5 Độ lặp lại 39

3.3.6 Độ thu hồi 43

3.4 Kết quả phân tích trên một số mẫu quế và thực phẩm chứa quế 47

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 50

4.1 Lựa chọn phương pháp 50

4.2 Điều kiện xử lý mẫu 50

4.3 Xây dựng phương pháp định lượng 51

4.4 Kết quả mẫu thực 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Communities

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức

LC-UV/MS

Liquid chromatography coupled to diode array UV detection and mass spectrometry

sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò mảng diode UV và khối phổ

Rugged, Safe

Nhanh chóng, dễ dàng, rẻ tiền, hiệu quả, chắc chắn

và an toàn

ngày

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của chất chuẩn acid

2-hydroxycinnamic, coumarin, acid cinnamic, cinnamyl alcohol,

cinnamyl acetat

37

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của eugenol và

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV-Vis của các chất theo thứ tự từ trên xuống: acid

2-hydroxycinnamic, coumarin, acid cinnamic, cinnamyl alcohol,

cinnamaldehyd, eugenol, cinnamyl acetat

26

Hình 3.14: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của acid

2-hydroxycinnamic, coumarin, acid cinnamic, cinnamyl alcohol, cinnamyl

acetat

37 Hình 3.15: Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của

ĐẶT VẤN ĐỀ

Quế là một chi các loài thực vật thuộc họ Long não (Lauraceae) Quế là một trong

những loại gia vị quan trọng được sử dụng tại nhiều quốc gia trên thế giới Quế chủ yếu chứa các loại dầu quan trọng chẳng hạn như cinnamaldehyd, acid cinnamic và cinnamat Ngoài khả năng chống oxy hóa, chống viêm, trị đái tháo đường, kháng khuẩn, chống ung thư, hạ lipid và hợp chất hạ thấp bệnh tim mạch, quế còn được báo cáo có hoạt động chống lại các rối loạn thần kinh, như bệnh Parkinson và Alzheimer [20] Ngoài những chất có tác dụng có lợi thì quế cũng chứa coumarin là một chất có khả năng gây độc cho gan và gây ung thư khi sử dụng trong thời gian dài Có rất nhiều dữ liệu thí nghiệm về coumarin có độc tính trên gan của động vật và cũng có dữ liệu lâm sàng về nhiễm độc gan trên người từ các bệnh nhân được điều trị bằng coumarin Dữ liệu này cho thấy một nhóm nhỏ của quần thể người dễ bị ảnh hưởng đến gan hơn các loài động vật được thí nghiệm Nguyên nhân của sự nhạy cảm cao hiện chưa được biết Dựa trên các dữ liệu sẵn có, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu đã chấp nhận lượng dung nạp hàng ngày (TDI) của coumarin là 0,1 mg/kg bw/ngày [7]

Hiện nay, trên thị trường có nhiều sản phẩm bổ sung quế nhưng thực chất chỉ bổ sung hương quế chỉ chứa một số thành phần trong quế Do đó, cần có một phương pháp

có thể đánh giá việc sử dụng quế trên thị trường hiện nay là sử dụng quế tự nhiên hay chỉ sử dụng hương quế nhắm giúp cơ quan kiểm tra có sự đánh giá chính xác việc ghi nhãn thành phần của sản phẩm Quế tự nhiên sẽ có các thành phần chính như cinnamaldehyd, acid cinnamic, coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamyl acetat, acid 2-hydroxycinnamic, eugenol với tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào loài và khu vực trồng, còn hương quế chỉ có cinnamaldehyd

Trên thế giới đã có nhiều phương pháp nghiên cứu một hoặc một số các thành phần có trong quế như: HPLC-PDA, LC-MS/MS,… Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện chưa

có phương pháp tiêu chuẩn để xác định hàm lượng một số hoạt chất trong quế trên nền mẫu thực phẩm và thực phẩm chức năng có thành phần quế

Do đó, từ tác dụng không mong muốn khi sử dụng dài quế đồng thời góp phần đánh giá hàm lượng và chất lượng quế trên thị trường góp phần vào việc quản lý sử dụng

quế hay hương quế trong sản phẩm có ghi nhãn chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

xây dựng phương pháp xác định một số thành phần trong quế bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao”, với các mục tiêu sau:

- Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số thành phần trong quế và sản phẩm chứa quế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Ứng dụng phương pháp được nghiên cứu để phân tích thành phần một số mẫu quế và sản phẩm chứa quế trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về quế

Chi Quế (tên khoa học: Cinnamomum) là một chi các loài thực vật thuộc họ Long não (Lauraceae) Lá và vỏ cây các loài thuộc chi này có tinh dầu thơm, với khoảng hơn

300 loài, phân bố chủ yếu tại các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của Châu Mỹ, châu

Á và châu Đại Dương

Các loài quế quan trọng trong chi bao gồm quế quan (Cinnamomum verum hay C

zeylanicum, còn gọi là "quế thật" hay quế Ceylon, quế Tích Lan), quế Trung Quốc (C aromaticum hay C cassia), long não (C camphora), quế thanh (C loureiroi, hay quế

Thanh Hóa, quế Quỳ), Malabathrum (C tamala, còn gọi là C tejpata; tejpat hay tej pat

theo tiếng Hindi) [3]

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cinnamomum cassia là cây to, cao 10 – 20 m; cành hình trụ, nhẵn, màu nâu; lá mọc

so le, dày cứng và dai, hình mác, dài 12 – 25 cm, rộng 4-8 cm, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt trên nhẵn, màu lục sẫm bóng, mặt dưới màu xám tro, hơi có lông lúc còn non; gân 3, hình cung, nổi rõ ở mặt dưới, gân bên kéo dài đến đầu lá, gân phụ nhiều, song song; cuống lá to, dài 1,5 – 2 cm, có rãnh ở mặt trên [3]

Cụm hoa mọc ở kẽ lá gần đầu cành thành chùy dài 7 – 15 cm; bao hoa gồm 6 phiến gần bằng nhau, màu trăng, dài 3mm, mặt ngoài có lông nhỏ [3]

Quả hạch, hình trứng hoặc hình bầu dục, có cạnh dài 1,2 – 1,3 cm, nằm trong đài tồn tại nguyên hoặc chia thùy Vỏ và lá vò ra có mùi thơm Mùa hoa: tháng 4-7; mùa quả: tháng 10 - 12 [3]

Cây có cùng công dụng: Ngoài loài quế nêu trên, nhiều loài khác cũng được gọi là quế như quế quan, quế Thanh, quế rành [3]

Quế quan (Cinnamomum zeylanicum Blume, C verum J S Presl), tên khác: quế

ống, quế Srilanca, quế khâu Cây có kích thước trung bình Cành non có 4 cạnh, hơi dẹt

có lông nhỏ rải rác Lá mọc đối hoặc gần đối (ít khi so le), hình bầu dục, gân lá 3 – 5, gồ

lên ở cả hai mặt Cụm hoa dài hơn lá; bao hoa dài 5-6 mm, màu vàng Quả dài 1,3 – 1,7

cm, có đài tồn tại to Mùa hoa quả: tháng 5-9 [3]

Quế Thanh (Cinnamomum loureirii Nees, C obtusifolium Nees var loureirii Perrot

et Eberh.), tên khác: quế quỳ, de bầu, quế tử, quế lá tù, ngọc quế Cây to, cành non có cạnh, có lông, sau nhẵn Lá thuôn đến mác thuôn, có mũi nhọn mềm, mặt dưới phủ vảy nhỏ, gân bên không kéo dài đến đầu lá, gân phụ mờ Hoa trắng, bao hoa đài 3 mm Quả dài 8 – 10mm, đài tồn tại nhỏ [3]

Quế rành (Citinamomum burmannii (Nees) Blume), tên khác: quế bì, quế xanh, trèn

trèn, quế lợn, âm hương Cây có dạng đẹp, vỏ nhẵn, màu xám Lá thuôn, màu lục sẫm ở

cả hai mặt Cụm hoa ngắn, mảnh Quả gần hình cầu, có mũi nhọn Mùa hoa: tháng 7 [3]

Cinnamomum Blume là một chi lớn gồm khoảng 270 loài, hầu hết là cây gỗ; phân

bố tập trung ở vùng nhiệt đới châu Á Ở Ấn Độ có 20 loài; Trung Quốc 12 loài và Việt Nam 40 loài Ở Việt Nam, nhiều loài mang tên quế, trong đó, có 3 loài là cây trồng, còn lại là mọc hoang dại [3]

Quế cũng được trồng ở một số tỉnh Vân Nam, Quảng Tây của Trung Quốc Quế có nguồn gốc ở Việt Nam, cách đây khoảng hơn 2000 năm, các triều đại phong kiến đã coi

“quế Giao Chỉ” (Giao Chỉ là tên nước Việt cổ) như là sản vật quý để trao đổi và triều cống (Lê Trần Đức, 1990) Song, hiện nay vẫn chưa xác định cụ thể cây được trồng từ bao giờ Nhiều vùng quế đã được hình thành từ lâu đời ở Yên Bái; Quảng Ninh; Thanh Hoá (Thường Xuân); Quảng Nam (Trà My, Phước Sơn) và Quảng Ngãi (Trà Bồng)… Quần thể quế mọc hoang dại được phát hiện trong các kiểu rừng kín thường xanh còn nguyên sinh hay tương đối nguyên sinh ở độ cao 500 m (miền Bắc) – 700m (miền Nam) trở lên Tuy nhiên, do quá trình chọn lọc và trổng trọt lâu dài, giữa quế mọc tự nhiên và các giống quế trồng hiện có nhiều sai khác về phẩm chất dược liệu [3]

Quế là cây gỗ ưa sáng và chịu bóng, nhất là thời kỳ cây còn nhỏ (1-5 năm) Cây ưa khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm, nhiệt độ trung bình năm cho cây sinh trưởng phát triển mạnh là 22 – 23°C; độ ẩm không thí trung bình khoảng 80%; lượng mưa hàng năm

khoảng 1.600 mm hoặc hơn Cây mọc được trên nhiều loại đất ẩm, nhiều mùn và tơi xốp, pH: 4,5 – 5,5 Quế có bộ rễ cọc khoẻ, cắm sâu xuống đất nên ít bị đổ khi có gió bão [3]

1.1.2 Bộ phận dùng

Vỏ thân, vỏ cành non được phơi hoặc sấy khô (Quế chi) Vỏ thân được phơi khô trong bóng râm (Quế nhục) Tinh dầu được sản xuất từ cành hoặc lá Hình 1.1 thể hiện quế thành phẩm được sử dụng trong dược liệu

Hình 1.1: Hình ảnh dược liệu quế

Cinnamomum cassia là loài được trồng nhiều ở Việt Nam Vỏ chứa tinh dầu 1- 2%,

tannin, chất nhựa, đường, calci oxalat, chất nhầy và coumarin [3]

Tinh dầu quế chứa aldehyd cinnamic 75- 90%, salicylaldehyd, methylsalicylaldehyd, methyleugenol, eugenol (vết) [3]

Theo quy định của Dược điển Việt Nam, vỏ quế phải chứa ít nhất 1% tinh dầu và tinh dầu phải chứa ít nhất 90% aldehyd toàn phần [3]

1.1.4 Tác dụng dược lý của quế

Tinh dầu quế chứa cinnamaldehyd là thành phần chủ yếu có tác dụng diệt khuẩn in vitro đối với một số vi khuẩn ở độ pha loãng cao Tác dụng kháng khuẩn đối với các

giống vi khuẩn khác nhau, theo thứ tự hoạt tính giảm dần: Salmonella typhi, tụ cầu vàng,

Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, Candida albicans, Shigella ßexneri, liên cầu khuẩn

tan máu, trực khuẩn lao, Sh dysenteriae, phế cầu khuẩn Tác dụng mạnh đối với phẩy khuẩn tả, nồng độ ức chế tối thiểu đối với các giống phẩy khuẩn tả Eltor, Inaba và Ogawa

là 2/10.000 Tác dụng diệt Entamoeba moshkowskii với nồng độ ức chế tối thiểu 1/2.560

Còn có tác dụng ức chế cả đối với siêu vi khuẩn Tác dụng ức chế tương đối yếu hơn đối

với các giống vi khuẩn: Sh shigae, Sh sonnei, trực khuẩn coli, trực khuẩn mủ xanh Tinh dầu quế có tác dụng diệt nấm với Trichophyton mentagrophytes Hoạt chất cinnamaldehyd có tác dụng với Microsporum audouini, Aspergillus nidurans,

Cryptococcus neoformans, Penicillium rugulosum, Sporothrix schenckii, Trichophyton rubrum, T.mentagrophytes T.violaceum, Microsporum gypseum, Histoplasma capsulation và Blastomyces dermatitidis; tác dụng ứcc chế chủ yếu do phản ứng của

aldehyd với các nhóm thiol tham gia vào sự sinh trưởng của nấm [3]

Cinnamaldehyd tác dụng hiệp đồng với natri clorid Cinnamaldehyd có tác dụng an thần, làm giảm hoạt động tự nhiên của chuột nhắt và có tác dụng đối kháng với hoạt động vận động gây bởi apomorphin hoặc methamphetamin ở chuột nhắt, có tác dụng kéo dài giấc ngủ gây bởi hexobarbital, tác dụng hạ nhiệt và chống sốt ở chuột nhắt Tác dụng

ức chế và kích thích trung tâm của cinnamaldehyd có thể do tương tác với các nơron đáp ứng với monoamin ở hệ thần kinh trung ương, và có vai trò quan trọng trong tác dụng điều trị của vỏ thân hoặc cành quế [3]

Ở chó và chuột lang gây mê, cinnamaldehyd có tác dụng hạ áp, có thể chủ yếu do giãn mạch ngoại biên Sự giãn mạch này vẫn tồn tại ỏ chó sau khi huyết áp đã phục hồi Trên hồi tràng chuột lang cô lập, có tác dụng chống co thắt cơ trơn gây bởi acetylcholin và histamin, và cũng có tác dụng trực tiếp trên cơ trơn và gây giãn kiểu papaverin Trên tim chuột lang cô lập, cinnamaldehyd làm tăng lực co cơ và nhịp tim, tuy vậy việc dùng nhắc lại dẫn đến giảm dần những tác dụng này và ức chế tim Cinnamaldehyd gây giải phóng

catecholamin từ tuyến thượng thận của chó, tác dụng tăng lực co cơ và nhịp tim trên tim chuột lang cô lập được truyền dịch có lẽ do giải phóng catecholamin nội sinh [3] Cao nước quế cho chuột cống trắng bị viêm thận uống có tác dụng dự phòng sự tăng nồng độ protein trong nước tiểu, nhưng không ảnh hưởng trên sự phục hồi của tình trạng thiếu máu gây bởi mất máu cấp tính, và trên số lượng bạch cầu và tế bào lympho Tác dụng chặn miễn dịch được quy cho cao này Tiêm phúc mạc cao nước quế cho chuột cống trắng với liều 100 mg/kg có tác dụng dự phòng loét do stress khi để chuột trong bầu không khí lạnh (3 – 5°C), hoặc ngâm trong nước Cao này cũng ức chế mạnh loét dạ đày do tiêm dưới da serotonin cho chuột cống trắng, và làm tăng lưu lượng máu ở niêm mạc dạ dày, cho thấy tác dụng chống loét của quế là do ức chế những yếu tố tấn công và tăng cường những yếu tố bảo vệ [3],

Tinh dầu quế và cao quế còn có tác dụng chống chứng huyết khối, chống viêm, chống

dị ứng, làm tăng lượng protein toàn phần và gamma – globulin trong máu và làm giảm

tỷ lệ vỡ dưỡng bào do nhỏ dung dich noc rắn mang bạnh lên mạc treo ruột hoặc do tiêm tĩnh mạch nọc rắn cho chuột lang Cinnamaldehyd với nồng độ 4,8 µg/mL ức chế sự phát triển của tế bào bệnh bạch cầu L1210 trong nuôi cấy 50% Tác dụng ức chế này được quy cho nhóm aldehyd của cinnamaldehyd Chất này ức chế sự phát triển của khối u VV2K-11 gây bởi SV40 ở chuột nhắt trắng và cũng được thử nghiệm về hoạt tính chống đột biến đối vối các chất hóa học gây đột biến hoặc chiếu tia tử ngoại Liều chết LD50 của cinnamaldehyd trên chuột nhắt trắng bằng đưòng tiêm tĩnh mạch là 132 mg/kg; tiêm phúc mạc: 610 mg/kg; đường uống: 2.225 mg/kg Nồng độ tinh dầu quế tiêu diệt 100% trong thử nghiệm in vitro trên 2 chủng Trichomonas vaginalis nuôi cấy trong môi trường

là 50 ng/mL [3]

Đã có nghiên cứu điều trị 58 trường hợp viêm khớp dạng thấp bằng bài thuốc trong

có quế chi và một số dược liệu khác Kết quả điều trị cho thấy thuốc có tác dụng làm ổn định giảm viêm, tác dụng chậm nhưng bền vững Kết quả tốt nhất trong trường hợp chức năng khớp còn tổn thương ít Một chế phẩm thuốc cổ truyền Nhật Bản có quế và 7 dược

liệu khác được coi là có tác dụng chống xơ cứng động mạch, đã được trộn với cholesterol

và cho động vật uống Thuốc đã có tác dụng ngăn chặn sự tăng cholesterol toàn phần, phospholipid và colagen trong máu và phòng ngừa sự phát triển xơ vữa động mạch do tăng lipid máu ở động vật thí nghiệm [3]

Một thuốc cổ truyền Nhật Bản khác gồm 10 dược liệu trong đó có quế, có nhiều hoạt tính kích thích miễn dịch Cao chiết với nước nóng của vỏ quế có tác dụng hoạt hóa bổ thể mạnh Quế bì có trong thành phần một bài thuốc cổ truyền Trung Quốc được đùng

để điều trị các bệnh viêm mạn tính và các bệnh tự miễn dịch Trên thực nghiệm, bài thuốc này tăng cường tính kích thích miễn dịch của một số hóa dược kích thích miễn dịch như phorbol myristat acetat phytohemagglutinin [3]

Một bài thuốc bổ dương Trung Quốc gồm quế và phụ tử có tác dụng làm tăng lượng adenosin cyclic monophosphoric acid (có vai trò trong điều hòa sự vận chuyển điện giải

và nước trong cơ thể) trong huyết tương chuột đã gây thiểu năng thực nghiệm tuyến giáp hoặc vỏ thượng thận Một bài thuốc cổ truyền Trung Quốc khác được dùng chữa bệnh phụ khoa trong đó có quế và một số dược liệu khác, đã có tác dụng đối kháng với Iuteotrophin và kháng oestrogen yếu trong thực nghiệm trên động vật [3]

Một tài liệu cho biết 3 loài quế: C cassia, C iroureirii và C zeylanicum có tác dụng

chống đái tháo đường Chất acid hydroxyphenyl propanoic phân lập từ vỏ quế bì và glucosid của nó có tác dụng phòng ngừa loét dạ dày gây bởi serotonin ở chuột cống trắng [3]

1.1.5 Tính vị, công năng, công dụng của quế

Quế có vị ngọt, cay, mùi thơm, tính rất nóng, có tác dụng bổ hỏa, hồi dương, ấm thận

tỳ, thông huyết mạch, trừ hàn tích [3]

Quế được dùng làm thuốc cấp cứu bệnh do hàn như chân tay lạnh, mạch chậm nhỏ, hôn mê, đau bụng trúng thực, phong tê bại, chữa tiêu hóa kém, tả lỵ, thũng do tiểu tiện bất lợi, kinh bế, rắn cắn, ung thư Ngày dùng 1- 4 g dưới dạng thuốc hãm, hoàn tán hoặc

mài vối nước mà uống Kiêng kỵ: Những người âm hư, dương thịnh và phụ nữ thai nghén không nên dùng [3]

Theo tài liệu, vỏ quế bì được dùng trong y học để chữa những chứng bệnh sau: [3] Cảm lạnh, phối hợp với nhân sâm, hoàng kỳ, thục địa

Tiêu chảy, phối hợp với mộc hương, phục linh, nhục đậu khấu

Đau vùng hông, phối hợp vói phụ tử, địa hoàng

Đau đạ dày, đau bụng, đau kinh, phối hợp với đương quy, hương phụ

Mụn nhọt lâu lành, phối hợp với ma hoàng, cao nhung, bạch giới tử Liều dùng mỗi ngày: 2 – 7,5g, sắc nước uống Hoặc tán bột, mỗi lần uống 0,5 – 2g, ngày uống 1-2 lần

Vỏ cành quế trị: [3]

Cảm mạo, sốt, ra mồ hôi, sợ lạnh, phối hợp với bạch thược, cam thảo, sinh khương, hồng táo

Phong hàn thấp, đau khớp, phối hợp với phụ tử, sinh khương, cam thảo

Tim hồi hộp, tức ngực, ho có đờm loãng, phối hợp với phục linh, bạch truật, cam thảo

Bế kinh đau bụng, thống kinh, phối hợp với xuyên khung, đương quy, ngô thù du, xích thược

Sốt rét, phối hợp với xuyên khung, bạch chỉ, thương truật Liều lượng: ngày 2 -1 lg, dạng thuốc sắc

Vết thương chảy máu, dùng bột rắc

Gãy xương, dùng bột làm thành hồ, bôi bên ngoài Liều dùng: mỗi ngày 2 – 11g, dạng

thuốc sắc Hoặc dạng bột, mỗi ngày 1 – 2 g

1.2 Tổng quan một số hoạt chất trong quế

1.2.1 Coumarin

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của coumarin

Tên IUPAC: 2H-chromen-2-on

Tên khác: 1-benzopyran-2-on

Tính chất vật lý, hóa học

Trạng thái: Tinh thể không màu hoặc màu trắng

Mùi: Mùi thơm dễ chịu, có mùi hoa quế

Độ hòa tan trong nước: 0,17 g/100 mL

Độ hòa tan: Rất tan trong ether, diethyl ether, chloroform, dầu, pyridin hòa tan trong cồn

a Độc tính trên động vật

Trong số các tác dụng quan sát được trên vivo, các đặc tính gây ung thư và gây độc cho gan có tầm quan trọng lớn Nhiễm độc gan đã được quan sát không chỉ ở loài gặm nhấm,

mà còn ở nhiều loài động vật có vú khác Sự hình thành khối u đã được quan sát trong các thí nghiệm dài với các loài gặm nhấm Ung thư biểu mô chỉ được tìm thấy ở liều cao hơn 100 mg/kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày [16] [15]

Sau khi đánh giá dữ liệu về chất liên kết DNA năm 2004 [14], [22], EFSA kết luận rằng với thí nghiệm in vivo, coumarin không liên kết theo kiểu cộng hóa trị với DNA của các

cơ quan đích và do đó tác dụng gây ung thư không có cơ chế đột biến gen [15]

b Độc tính trên con người

Coumarin đã được phê duyệt từ những năm 1970 ở nhiều quốc gia khác nhau như

là một sản phẩm thuốc để điều trị bệnh phù do tĩnh mạch (suy tĩnh mạch mạn tính) và bạch huyết, có thể thông qua kích thích phân giải protein bởi đại thực bào mô Ngoài ra, khả năng chống khối u trực tiếp đã được báo cáo, và chất này được sử dụng để điều trị ung thư biểu mô tế bào thận và các khối u khác, với liều lên tới 7000 mg mỗi ngày [19] Một số bệnh nhân bị nhiễm độc gan nặng (nhiễm độc gan, viêm gan, suy gan trong một vài trường hợp) từ vài tuần đến 6 tháng sau khi bắt đầu điều trị [13], [9]

1.2.2 Acid cinnamic

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của acid cinnamic

Tên IUPAC: (2 E ) -3-Phenylprop-2-enoic acid

Tên khác: Acid cinnamic, acid trans -Cinnamic

logP 2,13

pKa: 4,44

Độ hòa tan trong nước: 0,05 g/100 mL

Độ hòa tan: Tan trong ether, diethyl ether, chloroform, dầu, pyridin hòa tan trong cồn

1.2.3 Cinnamyl alcohol

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của cinnamyl alcohol

Tên IUPAC: (2E)-3-phenylprop-2-en-1-ol

Tên khác Cinnamyl alcohol, Styryl carbinol, Phenylallyl alcohol, Cinnamic alcohol

Độ hòa tan trong nước: Kém tan trong nước

Độ hòa tan: Tan trong ethanol, aceton, dichlomethan

1.2.4 Cinnamaldehyd

Hình 1.5: Công thức cấu tạo của Cinnamaldehyd

Công thức phân tử: C9H8O(M = 132,16 g/mol)

Tên IUPAC: (2E)-3-Phenylprop-2-enal

Tên khác: Cinnamaldehyd, Cinnamic aldehyd, trans-Cinnamaldehyd

Độ hòa tan trong nước: Kém tan trong nước

Độ hòa tan: Hòa tan trong ether, chloroform

1.2.5 Eugenol

Hình 1.6: Công thức cấu tạo của Eugenol

Tên IUPAC: 2-Methoxy-4-(prop-2-en-1-yl)phenol

Tên khác: 4-Allyl-2-methoxyphenol, 2-Methoxy-4-(2-propenyl)phenol, Eugenic acid, Caryophyllic acid, 1-Allyl-3-methoxy-4-hydroxybenzene, Allylguaiacol, 2-Methoxy-4-allylphenol, 4-Allylcatechol-2-methyl ether

Tính chất vật lý, hóa học

Trạng thái: Tinh thể không màu hoặc màu trắng

Nhiệt độ nóng chảy: -7,5 °C (18,5 °F; 265,6 K)

Nhiệt độ sôi: 254 °C (489 °F; 527 K)

pKa: 10,19

logP: 2,61

Độ hòa tan trong nước: Kém tan trong nước

Độ hòa tan: Hòa tan trong dung môi hữu cơ

1.2.6 Cinnamyl acetat

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của cinnamyl acetat

Tên IUPAC: 3-phenylprop-2-enyl acetat

Tên khác: Cinnamyl acetat; 3-Phenylprop-2-en-yl acetat; 3-Phenylallyl acetat; Acetoxy-3-phenyl-2-propen

Hình 1.8: Công thức cấu tạo của acid 2-hydroxycinnamic

Tên IUPAC: (E)-3-(2-Hydroxyphenyl)prop-2-enoic acid

Tên khác: ortho-Coumaric acid, acid 2-hydroxycinnamic

Độ hòa tan trong nước: ít tan trong nước

Độ hòa tan: Tan trong ethanol, diethyl ether

1.3 Tổng quan về phương pháp xác định một số thành phần trong quế

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về xác định hàm lượng coumarin cũng như các hợp chất khác có nguồn gốc từ quế trong nhiều nền mẫu khác nhau: quế, thực phẩm, thực phẩm chức năng…bằng nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau (Bảng 1.1)

như sử dụng HPLC-PDA, LC-MS, LC-UV/MS, GC-MS,

Bảng 1.1: Một số phương pháp xác định các chất trong quế

TLT

K

Kỹ thuật

sử dụng

Đối tượng phân

HPLC-PDA

cinnamaldehyd trong quế và thực phẩm chứa quế

Tốc độ dòng 0,7 ml/phút + Detector UV: 275 nm

PDA

Coumarin trong thực phẩm chứa quế

- Phương pháp chiết: Siêu âm

Tốc độ dòng: 0,2 mL/phút + Detector UV: 275 nm

safrol trong quế

- Dung môi chiết: CH3COOC2H5

- Phương pháp chiết: nhiệt độ

- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: Capillary GC Column (30

m × 0,25 mm, 0,25 μm) + Pha động: khí heli + Sử dụng chương trình nhiệt độ: 110°C giữ 1 phút, tăng 3°C/phút đến 130°C, tăng 5°C/phút đến 160°C, tăng 20°C/phút đến 280°C

- Coumarin trong thực phẩm chứa quế

- Phương pháp chiết: QuEChERS

- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: Agilent VF-5ms capillary column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)+ Pha động: Khí heli

giữ 2 phút, tăng 25°C/phút đến 150°C, tăng 10°C/phút đến 240°C và tăng 50°C đến 310°C giữ 1 phút

[24]

UV/MS

LC Coumarin, acid cinnamic,

cinnamaldehyd, eugenol,

cinnamyl acetat, cinnamyl alcohol

- Phương pháp chiết: Siêu âm

- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: Acquity HPLC BEH C18(2,1 × 100 mm; 1,7 µm )

trong quế và thực phẩm chức năng chứa quế

HCOOH 0,1%

Tốc độ dòng: 0,23 mL/phút Chương trình dung môi: 37% B đến 67% B trong 5.5 phút tăng lên 100% B trong 1,5 phút tiếp theo

+ Bước sóng phát hiện: 280 nm

[8]

UHPLC-QqQLIT-

- Phương pháp chiết: Soxhlet

- Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: Acquity HPLC BEH C18 (50 mm × 2,1 mm , 1,7µm)

+ Pha động: CH3CN: HCOOH 0,1% Chương trình dung môi: tăng từ 5–85%

B trong 3 phút; giữ 85% B trong 1 phút quay lại 5% B và giữ 2,5 phút

Từ các bài báo tham khảo các phương pháp đa dạng từ sắc ký lỏng, sắc ký khí với detector MS, UV-VIS, PDA, MS/MS,

Với tính chất cần xác định nhanh, chính xác và khả năng ứng dụng tốt tại các phòng thí nghiệm thì phương pháp HPLC-PDA là phổ biến hơn cả Do đó, chúng tôi lựa chọn HPLC-PDA để nghiên cứu khả năng phân tích các chất trong quế

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong nước việc hiện nay với nguồn cung cấp quế đa dạng với số lượng nhiều nhưng các nghiên cứu chỉ đánh giá tác dụng sinh học của cây quế nhưng tác dụng sinh học của quế phụ thuộc vào thành phần các chất có trong quế Về mặt định lượng, hiện nay chỉ đánh giá hàm lượng tinh dầu quế chủ yếu theo phương pháp chuẩn độ, sắc ký lớp mỏng

Do đó, độ chính xác hàm lượng các chất có trong nền sẽ không bằng khi phân tích trên HPLC

Coumarin là thành phần trong quế nhưng được quan tâm hơn các thành phần khác vì dược liệu trong tự nhiên hiện nay có chứa rất nhiều các dẫn xuất từ coumarin có tác dụng sinh học tốt Do đó có một số bài báo về xác định và thử hoạt tính của một số dẫn chất của coumarin trong một số loại cây như:

Theo tác giả Phạm Ngọc Quế [5], sử dụng phương pháp chiết nóng với cồn 90° trong nền mẫu dược liệu khương hoạt, sau đó phân lập theo các giai đoạn khác nhau để thu được hỗn hợp coumarin được tách ra khỏi nền Định tính coumarin bằng các kỹ thuật chuẩn độ và sắc ký lớp mỏng

Theo tác giả Đỗ Thị Tố Uyên [4], sử dụng phương pháp chiết hồi lưu với triclomethan

để chiết thành phần coumarin trong dược liệu bạch chỉ, sau đó định tính bằng sắc ký lớp mỏng và phân lập các coumarin có trong nền bằng sắc ký cột điều chế Sử dụng LC-MS

để sơ bộ kết luận về hoạt chất coumarin có trong cây bạch chỉ

Theo tác giả Đinh Thị Lan Hương và cộng sự [2], sử dụng phương pháp chiết với ethanol, sau đó bay hơi một phần dung dịch Dung dịch sau đó được định tính bằng phương pháp chuẩn độ và phương pháp sắc ký lớp mỏng Sau đó sẽ đánh giá hoạt tính kháng sinh của hoạt chất chiết được

Theo tác giả Dương Thu Hương [1], đã phân tích 2 chất thuộc nhóm coumarin là scopoletin và xanthotoxin có trong đương quy di thực Phương pháp đạt được độ thu hồi

và lặp lại tốt với Hàm lượng xanthotoxin trong các mẫu đương quy di thực nằm trong khoảng từ 10 ppm đến 45 ppm, hàm lượng scopoletin đạt từ 31 ppm đến 110 ppm và hàm lượng xanthotoxin đạt từ 35 ppm đến 47 ppm

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamaldehyd, acid cinnamic, eugenol, cinnamyl acetat, acid 2-hydroxycinnamic

Đối tượng mẫu: Các mẫu quế, thực phẩm và thực phẩm chức năng có bổ sung quế

2.2 Nguyên vật liệu – thiết bị

2.2.1 Nguyên vật liệu

- Chất chuẩn Eugenol (Sigma – Aldrich, Số lô: E51791; ≥ 99 %)

- Chất chuẩn Coumarin (Sigma – Aldrich, Số lô: W526509; ≥ 98 %)

- Chất chuẩn trans-cinnamaldehyd (Sigma – Aldrich, Số lô: C80687; ≥ 99%)

- Chất chuẩn acid 2-hydroxycinnamic (Sigma – Aldrich, Số lô: H22809; ≥ 97%)

- Chất chuẩn acid trans-cinnamic (Sigma–Aldrich, Số lô: C80857; ≥99%)

- Chất chuẩn Cinnamyl alcohol (Sigma–Aldrich, Số lô: 108197; ≥98%)

- Chất chuẩn Cinnamyl acetat (Sigma–Aldrich, Số lô: 166170; ≥ 99%)

(PSA) (Merck)

- Nước cất 2 lần

Dung dịch chất chuẩn gốc Coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamaldehyd, acid cinnamic, eugenol, cinnamyl acetat, acid 2-hydroxycinnamic 10000 mg/L : Cân chính

phòng (25°C ± 5°C) , lắc kỹ Bảo quản ở điều kiện 2°C - 8°C, tránh ánh sáng

Bảng 2.1: Khối lượng chuẩn cân

(mg)

Độ tinh khiết (%)

Thể tích định mức (mL)

Nồng độ chuẩn gốc (mg/L) acid 2-

Dung dịch chuẩn trung gian 1000 mg/L : Hút chính xác 1 mL từng dung dịch chuẩn

nhiệt độ phòng (25°C ± 5°C) , lắc kĩ ta được dung dịch chuẩn nồng độ 1000 mg/L Bảo quản ở điều kiện lạnh, tránh ánh sáng

Dung dịch chuẩn làm việc: Khảo sát đường chuẩn khoảng nồng độ từ 200 mg/L trở

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,00001 g

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy lắc siêu âm Elma (Germany)

- Máy ly tâm HermLe Z326K

- Máy lắc xoáy IKA

- Máy xay Philips 600W

- Máy lắc ngang Yamato

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 5 mL, 10 mL, 20 mL, 50 mL, cốc có mỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μL, 200 μL, 5000 µL

- Ống ly tâm 50 mL, 25 mL, 100 mL, bình cầu có nút mài, lọ thủy tinh có nắp kín

- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm

2.2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát xây dựng điều kiện phân tích trên HPLC, để phân tích Coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamaldehyd, acid cinnamic, eugenol, cinnamyl acetat, acid 2-hydroxycinnamic

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết Coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamaldehyd, acid cinnamic, eugenol, cinnamyl acetat, acid 2-hydroxycinnamic trong quế và sản phẩm chứa quế

- Đánh giá (thẩm định) quy trình phân tích và xử lý mẫu

- Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu với một số sản phẩm trên thị trường

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Dựa vào các bài báo tham khảo [8], [18], [21], [24] chúng tôi cố định một số thông

số chạy sắc ký sau:

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 5 µL

- Detector: Bước sóng lấy sắc ký đồ: 250 nm và 280 nm

Dải bước sóng quét phổ UV – Vis: 190 – 400 nm

2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích các chất bằng HPLC

Thành phần pha động ảnh hướng rất nhiều tới quá trình tách sắc ký Pha động khác nhau sẽ có độ phân cực khác nhau Dựa vào các bài báo tham khảo [21], [24] chúng tôi chọn pha động A và B như sau:

- Pha động: khảo sát dung môi với các pha động

Bảng 2.2: Danh mục các pha động HPLC khảo sát

Đẳng dòng, Gradient

2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Dựa khả năng hòa tan của các chất phân tích và tham khảo các bài báo nghiên cứu [8], [18], [21], [24], chúng tôi khảo sát khả năng chiết các chất trong quế từ nền mẫu

± 5°C) , 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, sử dụng cách chiết (sử dung máy lắc ngang, lắc tay và

sử dụng bể rung siêu âm), thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút Khảo sát khả năng loại tạp chất màu trong dung dịch sau khi chiết bằng bột PSA, C18,

- Cân chính xác khoảng 0,5 -5 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL

- Thêm khoảng 35 mL dung môi chiết vào ống ly tâm

- Lắc trong 30 phút tại nhiệt độ phòng (25°C ± 5°C)

- Ly tâm 3 phút, tốc độ 6000 vòng/phút

- Chuyển dịch vào bình định mức 50 mL

- Lặp lại quy trình chiết với 15 mL dung môi chiết

- Định mức đến vạch bằng dung môi chiết

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm

- Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần)

2.3.3 Thẩm định quy trình

Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích các chất trong quế bằng HPLC được thẩm định về các tiêu chí [6]:

trắng (CH3OH), mẫu thử và mẫu trắng thêm chuẩn trên hệ thống HPLC Đánh giá

sự xuất hiện của pic sắc ký

- Độ lặp lại hệ thống: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn Đánh giá RSD(%) của thời gian lưu và tín hiệu chất phân tích

- Khoảng tuyến tính: Xác định khoảng tuyến tính của chất phân tích bằng cách tiêm nồng độ chuẩn tăng dần từ 0,1 µg/mL

- Độ lặp lại phương pháp: Phân tích lặp lại 6 lần 1 mẫu quế và 1 mẫu thực phẩm chứa quế

- Độ thu hồi: Thêm chuẩn tại mức 50%, 100%, 200% hàm lượng chất phân tích có trong mẫu

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ): Pha loãng chuẩn bằng dung dịch mẫu thực không chứa chất phân tích và phân tích cho tới khi thu được chiều cao chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích một số chất trong quế bằng phương pháp HPLC

Để lựa chọn bước sóng thích hợp ghi sắc ký đồ khi phân tích đồng thời Coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamaldehyd, acid cinnamic, eugenol, cinnamyl acetat, acid 2-hydroxycinnamic chúng tôi chọn detector PDA để phát hiện Quét phổ trong khoảng 190 – 400 nm, chọn cực đại hấp thụ cho mỗi chất và thu được kết quả như bảng 3.1 và hình 3.1:

Bảng 3.1: Bước sóng hấp thụ cực đại của các chất phân tích

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV-Vis của các chất theo thứ tự từ trên xuống là: acid hydroxycinnamic, coumarin, acid cinnamic, cinnamyl alcohol, cinnamaldehyd,

2-eugenol, cinnamyl acetat

Để giảm ảnh hưởng của dung môi và tạp chất nhưng vẫn đảm bảo được độ nhạy của phương pháp khi phân tích 7 chất trên chúng tôi quyết định chọn bước sóng phát hiện tại

250 nm để phân tích cnnamyl alcohol, cinnamyl acetat và 280 nm để phân tích acid

8.543 coumarin

276.7

0.00 0.20 0.40

9.584 cinnamic acid

0.00 0.20 0.40

11.028 cinnamyl alcohol

250.6

0.00 0.50

13.624 eugenol

281.5

0.00 0.20 0.40

15.919 cinnamyl acetat

250.6

0.00 0.20 0.40

nm 250.00 300.00 350.00

3.1.2 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký

Qua tham khảo tài liệu chúng tôi sử dụng các điều kiện sắc ký thông dụng dưới đây

cố định trong toàn bộ nghiên cứu:

hệ thống HPLC ở mỗi điều kiện pha động Những kết quả nghiên cứu sơ bộ cho thấy phân tích ở chế độ đẳng dòng tuy tách được pic các chất chuẩn nhưng thời gian lưu ngắn nhỏ hơn 4 phút cho chất đầu tiên Vì vậy, việc sử dụng chế độ gradient dung môi là bắt buộc để có được thời gian lưu không quá ngắn, đồng thời cho thời gian phân tích vừa phải (khoảng 20 – 30 phút) Một số quy trình được khảo sát cho kết quả sau đây:

quả là các pịc bị dính vào nhau không tách ra được (Hình 3.2)

Hình 3.2: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn 7 chất với pha động 1

- Hệ pha động 2: Dung dịch CH3COONH4 30 mM – CH3CN : CH3OH (50:50), tỷ lệ

60 : 40 Kết quả là pic tách tốt, nhưng thời gian lưu rất lâu (trên 50 phút nhưng chỉ

ra được 4 chất (Hình 3.3)

Hình 3.3: Sắc ký đồ dung dịch dung dịch 7 chất chuẩn với hệ pha động 2

Với hệ pha động này các pic tách tốt do đó sẽ tiến hành khảo sát chương trình gradient dung môi với hệ pha động nói trên

- Chương trình gradient – hệ pha động 2: Với chương trình gradient như ở bảng

Như vậy, trong các hệ pha động được khảo sát có hệ pha động 2: CH3COONH4 30

tách tốt, pic sắc ký gọn và cân xứng nhất Từ kết quả tối ưu hóa pha động, chúng tôi đi tới quy trình phân tích 7 chất trong quế và sản phẩm chứa quế bằng phương pháp HPLC với điều kiện cụ thể như sau:

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Để xác định các thành phần có trong quế yêu cầu dung môi phải chiết các chất tối ưu cho tổng lượng chất chiết ra khỏi nền mà không phải tối ưu cho từng thành phần Do đó các khảo sát sẽ được đánh giá dựa trên tổng diện tích thu được trên sắc ký đồ trên 1 gam mẫu phân tích

Dựa khả năng hòa tan của các chất phân tích và tham khảo các bài báo nghiên cứu [8], [18], [21], [24], chúng tôi khảo sát khả năng chiết các chất trong quế từ nền mẫu

± 5°C) , 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, sử dụng cách chiết (sử dung máy lắc ngang, lắc tay và

sử dụng bể rung siêu âm), thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút Quy trình chiết cho đối tượng phân tích là quế và sản phẩm chứa quế gồm các bước sau:

- Đồng nhất mẫu: Nghiền, xay mẫu

- Cân chính xác khoảng 0,5 -5 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL

- Thêm khoảng 35 mL dung môi chiết vào ống ly tâm

- Sử dụng máy lắc ngang trong 30 phút tại nhiệt độ phòng (25°C ± 5°C)

- Ly tâm 3 phút, tốc độ 6000 vòng/phút

- Chuyển dịch vào bình định mức 50 mL

- Lặp lại quy trình trên với 15 mL dung dịch chiết

- Định mức đến vạch bằng dung môi chiết

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 µm

- Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần)

Các chất trong quế có khả năng tan được trong dung môi hữu cơ Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các loại dung môi chiết khác nhau được sử dụng để làm dung môi

Kết quả khảo sát thể hiện trong hình 3.5:

Hình 3.5: Kết quả khảo sát dung môi chiết mẫu

các khảo sát tiếp theo

0 500000

1000000

1500000

2000000

2500000

metanol etanol acetonitril nước cất

Dung môi chiếtKhảo sát dung môi chiết

coumarin acid 2-hydroxycinnamic acid cinnamic

Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu theo quy trình dự kiến với dung môi chiết mẫu là CH3OH

quả khảo sát thể hiện trong hình 3.6

Hình 3.6: Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết mẫu

Với tính chất là nhóm tinh dầu bay hơi, do đó khi nhiệt độ càng cao khả năng bay hơi của tinh dầu càng tốt Như vậy theo kết quả thu được thì từ nhiệt độ 40°C trở xuống cho

kiện nhiệt độ phòng (25°C ± 5°C) trong các khảo sát tiếp theo

Khảo sát thời gian chiết mẫu theo quy trình dự kiến là 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút đối với nền mẫu thực Kết quả khảo sát thể hiện trong hình 3.7:

Hình 3.7: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu

6500000 7000000 7500000 8000000 8500000

0 50000

Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu

Coumarin Acid 2-hydroxycinnamic Acid cinnamic

9000000 9500000 10000000 10500000 11000000

0 50000 100000 150000 200000 250000

10 phút 20 phút 30 phút 40 phút 50 phút 60 phútkhảo sát thời gian chiết mẫu

Coumarin Acid 2-hydroxycinnamic Acid cinnamic