nghiên cứu quy trình chiết xuất và làm giàu egcg trong trà xanh (camellia sinensis)

Phương pháp tinh chế bằng dung môi hữu cơ ngày càng ít được sử dụng ở quy mô công nghiệp do khó kiểm soát được dư lượng trong cao cũng như độc hại và gây ô nhiễm môi trường nó đang dần đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ QUANG THÁI

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ LÀM GIÀU EGCG TRONG TRÀ XANH

(CAMELLIA SINENSIS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM

VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ 8720202

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tuấn Hiệp

TS Bùi Thị Thúy Luyện

HÀ NỘI 2020

LỜI CẢM ƠN

Trải qua một chặng đường dài nghiên cứu với rất nhiều khó khăn và thử thách ngoài nỗ lực bản thân thì chắc chắn tôi sẽ không thể hoàn thành luận văn nếu không được sự chỉ bảo, động viên, giúp đỡ dù ít hay nhiều, trực tiếp hay gián tiếp của thầy

cô, anh chị, gia đình, bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Tuấn Hiệp, TS Bùi Thị Thúy Luyện

những người thầy đã luôn chỉ bảo, đưa ra nhưng lời khuyên để tôi có những hướng

đi đúng đắn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn cao học

Xin gửi lời cảm ơn đến Khoa Công Nghệ Chiết Xuất, các đơn vị trong Viện

Dược Liệu, các bạn đồng nghiệp, các em sinh viên đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành tốt quá trình thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bố mẹ, anh chị tôi đã luôn động viên, tạo điều kiện cho tôi học tập Cảm ơn thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội với những tri thức và

tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quãng thời gian học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội ngày 04 tháng 04 năm 2020

Học Viên

Đỗ Quang Thái

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về cây trà 3

1.2 Thành phần hóa học lá trà xanh 3

1.3 Tác dụng sinh học và độ an toàn 6

1.4 Một vài nét cơ bản về nhựa hấp phụ macroporous 7

1.5 Phương pháp chiết xuất và làm giàu catechin trong trà xanh 11

1.5.1 Tính chất vật lý và hóa học của các catechin 11

1.5.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất catechin từ trà xanh 11

1.5.3 Một số phương pháp tinh chế catechin 13

1.5.4 Một số quy trình chiết xuất EGCG trà xanh 14

CHƯƠNG II - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên liệu 18

2.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp định lượng EGCG và caffein trong trà 19

2.3.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất EGCG 20

2.3.3 Nghiên cứu quy trình làm giàu EGCG 21

2.3.3 Ổn định quy trình chiết xuất và làm giàu EGCG 22

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng egcg và caffein trong trà xanh 24

3.1.1 Tính thích hợp của hệ thống 24

3.1.2 Tính chọn lọc của phương pháp 24

3.1.3 Khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 25

3.1.4 Độ lặp lại của phương pháp 26

3.1.5 Độ đúng của phương pháp 27

3.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất EGCG trà xanh 28

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố dung môi chiết 28

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố kích thước dược liệu 29

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết 31

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tỷ lệ dược liệu/dung môi 32

3.2.5 Khảo sát số lần chiết 33

3.3 Nghiên cứu quy trình làm giàu EGCG từ dịch chiết trà xanh 34

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất hấp phụ 35

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ hấp phụ 36

3.3.3 Khảo sát thời gian hấp phụ đẳng nhiệt 36

3.3.4 Khảo sát dung môi rửa giải 37

3.3.5 Khảo sát thể tích rửa giải 38

3.4 Ổn định quy trình chiết xuất và làm giàu EGCG 40

CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) EGCG Epigallocatechin gallate

SD Standard Deviation (độ lệch chuẩn)

RSD Relative Standard Deviation (độ lệch chuẩn tương đối)

SDVB Styrene Divinylbenzene

BV Bed volume (thể tích khối hạt)

SEM Scanning Electron Microscope (Kính hiển vi điện tử quét)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1 1 Thành phần của các thành phần chính trong lá trà [2], [11] 3

Bảng 1 2 Đặc tính vật lý của một số loại hạt nhựa macroporous [19] 9

Bảng 1 3 So sánh hiệu quả các phương pháp chiết xuất Catechin từ lá chè xanh [7] 16

Bảng 3 1 Kết quả tính thích hợp hệ thống 24

Bảng 3 2 Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính 25

Bảng 3 3 Kết quả đánh giá độ lặp của phương pháp 26

Bảng 3 4 Kết quả thẩm định độ đúng 27

Bảng 3 5 Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất và hàm lượng EGCG 31

Bảng 3 6 Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi trong 2 lần chiết 34

Bảng 3 7 Kết quả quá trình rửa giải EGCG trên cột nhựa hấp phụ ADS-7 39

Bảng 3 8 Kết quả quá trình chiết xuất và làm giàu (quy mô 100g/mẻ) 42

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Cấu trúc hóa học chính của các catechin 4

Hình 1 2 Công thức phân tử của các loại theaflavin chủ yếu trong trà xanh 5

Hình 1 3 Cấu trúc hóa học của caffeine 5

Hình 1 4 Một số flavonol chủ yếu trong chè xanh 6

Hình 1 5 (A, B)Ảnh SEM của hạt nhựa macroporous, (C) Polyme của acrylic (D) Polyme của styren divinylbenzen [8] 8

Hình 1 6 Sơ đồ chiết xuất cafein và catechin từ lá chè xanh của Vinachem đề nghị 14 Hình 1 7 Sơ đồ chiết xuất catechin từ lá chè xanh của nhóm tác giả Phùng Minh Dũng 15

Hình 1 8 So sánh các phương pháp chiết xuất Catechin từ lá chè xanh [7] 17

Hình 2 1 Mẫu trà xanh Thái Nguyên kích thước thô 18

Hình 2 2 Sơ đồ tóm tắt phương pháp nghiên cứu 19

Hình 3 1 Hình ảnh chồng phổ (1): mẫu Caffein chuẩn, (2): mẫu EGCG chuẩn, (3) mẫu thử, và (4) mẫu trắng 25

Hình 3 2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ dung dịch chuẩn 26

Hình 3 3 Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất và hàm lượng EGCG 29

Hình 3 4 Ảnh hưởng của kích thước dược liệu 30

Hình 3 5 Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi 33

Hình 3 6 Dung lượng hấp phụ EGCG và caffein của các hạt nhựa hấp phụ macroporous 35

Hình 3 7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến dung lượng hấp phụ hạt ADS-7 36

Hình 3 8 Động hoc quá trình hấp phụ EGCG và caffein trên nhựa ADS-7 ở điều kiện tĩnh 250C 37

Hình 3 9 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng rửa giải EGCG và caffein 38 Hình 3 10 Động hoc quá trình giải hấp phụ EGCG trên sử dụng nhựa ADS-7 39

Hình 3 11 Sắc ký đồ HPLC của các phân đoạn cao: (A) phân đoạn cao tổng cồn 20%; (B) phân đoạn rửa giải cồn 10% sau khi hấp phụ nhựa ADS-7; (C) phân đoạn rửa giải cồn 50% sau khi hấp phụ nhựa ADS-7 40

Hình 3 12 Sơ đồ quy trình chiết xuất và làm giàu EGCG 41

Hình 3 13 Ảnh sản phẩm cao sau quá trình làm giàu EGCG 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây trà hay cây chè có tên khoa học Camellia sinensis là một loài cây có giá trị

kinh tế và được trồng rộng rãi ở Việt Nam Theo số liệu tháng 10/2017, Việt Nam là nước sản xuất trà lớn thứ 7 và xuất khẩu lớn thứ 5 toàn cầu với 124.000ha diện tích trồng trà và hơn 500 cơ sở chế biến, sản xuất công suất tổng đạt trên 500.000 tấn trà khô/năm [4]

Trà xanh là sản phẩm của quá trình chế biến trà tươi sau khi đã diệt men và sấy khô với thành phần chính là các catechin (polyphenol) đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa, một vài nghiên cứu còn cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các catechin mạnh hơn cả vitamin C, vitamin E hay β-caroten [27] Không chỉ có vậy trà xanh còn được chứng minh có tác dụng ngăn ngừa một số bệnh ung thư, giảm nguy cơ béo phì và tiểu đường [22], [33] Với khả năng chống oxy hóa mạnh trà xanh

đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm trên thế giới [13] Để có thể đưa trà xanh thành các sản phẩm thì quá trình chế biến và chiết xuất là cực kỳ quan trọng do nó ảnh hưởng trực tiếp đến thành phần và hoạt tính của các catechin trong trà xanh

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu quy trình chiết xuất, tinh chế catechin trong trà xanh tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào một quá trình chiết xuất hoặc tinh chế mà ít có nghiên cứu nào đánh giá một cách tổng thể từ giai đoạn chiết xuất đến giai đoạn tinh chế Ở giai đoạn chiết xuất hầu hết các nghiên cứu mới chỉ đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình chiết mà chưa tối ưu hóa quy trình Ở bước tiếp theo tinh chế nhằm mục đích giảm hàm lượng caffein, tăng hàm lượng các catechin trong cao Phương pháp tinh chế bằng dung môi hữu cơ ngày càng ít được sử dụng ở quy mô công nghiệp do khó kiểm soát được dư lượng trong cao cũng như độc hại và gây ô nhiễm môi trường nó đang dần được thay thế bằng phương pháp sử dụng các chất hấp phụ như: nhựa macroporous, than hoạt, khoáng chất đất sét với nhiều ưu điểm như: sử dụng dung môi ít độc, thân thiện với môi trường; hiệu quả tinh chế cao, dễ dàng sử dụng, chi phí không quá cao và có thể tái

sử dụng Tuy nhiên đối với nước ta vài năm gần đây các công nghệ này mới bắt đầu được đưa vào nghiên cứu ứng dụng

Chính vì vậy “Nghiên cứu quy trình chiết xuất và làm giàu EGCG trong

trà xanh (camellia sinensis)” được tiến hành với mục tiêu hướng tới việc xây dựng

một quy trình từ giai đoạn chiết xuất đến tinh chế nhằm thu được một sản phẩm cao chiết trà xanh chứa hàm lượng cao EGCG bằng việc sử dụng các công nghệ xanh, thân thiện với môi trường và có khả năng đưa lên quy mô công nghiệp Đề tài được thực hiện với mục tiêu chính sau:

1 Xây dựng được quy trình chiết xuất EGCG trong trà xanh

2 Xây dựng được quy trình làm giàu EGCG từ dịch chiết trà xanh

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cây trà

Cây trà hay cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis là loài cây mà lá và

chồi được sử dụng để sản xuất các sản phẩm (khác với cây hoa trà – sử dụng hoa để làm trà) Trà là loại cây xanh mọc lâu năm thành bụi thông thường được xén tỉa để thấp hơn 2 mét khi trồng để lấy lá Trà xanh có nguồn gốc từ các nước Đông Á, Nam

Á và Đông Nam Á, nhưng ngày nay nó được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới [1] Ở Việt Nam trà được trồng tập trung nhất ở các tỉnh trung du, miền núi phía bắc như Sơn La, Thái Nguyên, Phú Thọ, Tuyên Quang và vùng Tây Nguyên như Lâm Đồng, Gia Lai [3]

Thông thường, trà được người dân thu hoạch bằng tay 1 tôm và 2-3 lá non để chế biến Tùy vào quy trình chế biến lá trà có lên men hay không mà trà được chia thành ba loại: trà xanh, trà đen và trà ô long [11] Trà xanh dùng để chỉ trà không lên men, trong quá trình sản xuất, men polyphenol oxidase có tác dụng oxy hóa các polyphenol bị bất hoạt bởi nhiệt độ nên toàn bộ hàm lượng polyphenol trong trà xanh không thay đổi so với hàm lượng polyphenol trong lá trà tươi Trà đen là trà lên men hoàn toàn và trà ô long là trà bán lên men Trong các loại trà này, quá trình oxy hóa hiếu khí các polyphenol lá trà được thực hiện dưới xúc tác enzyme để tạo thành theaflavin và thearubigins Màu nước pha trà đen có màu đỏ nâu sáng, vị dịu, hương thơm nhẹ [3], [11]

1.2 Thành phần hóa học lá trà xanh

Thành phần hóa học của lá trà bao gồm polyphenol, caffein, protein, tinh dầu, sắc tố, pectin, vitamin, chất khoáng, axit hữu cơ trong đó polyphenol, caffeine, sắc tố , dầu thơm, pectin là những thành phần quan troṇg quyết định màu sắc, hương vi của sản phẩm trà [2]

Bảng 1 1 Thành phần của các thành phần chính trong lá trà [2], [11]

Các thành phần Hàm lượng (%)

Các catechin trong trà xanh là những hợp chất có cấu trúc khung C6 - C3 - C6 gồm 3 vòng trong đó có 2 vòng benzen nối với nhau bởi một vòng pyrene Dựa vào cấu trúc catechin có bị ester hóa với axit gallic không người ta chia catechin thành 2 nhóm: catechin tự do và catechin ester Các catechin tự do gồm: catechin (C), gallocatechin (GC), epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC) Các catechin ester gồm: epigallocatechin gallate (EGCG), epicatechin gallate (ECG), gallocatechin gallate (GCG) và catechin gallate (CG) Hàm lượng tổng các catechin chiếm khoảng 30% khối lượng khô lá [11] Trong số các catechin EGCG, EGC, ECG và EC là bốn catechin chính được tìm thấy trong trà xanh; EGCG thường có mặt với hàm lượng cao nhất có thể chiếm tới > 50% tổng lượng catechin [31]

Hình 1 1 Cấu trúc hóa học chính của các catechin

Các catechin trong quá trình lên men chế biến sản phẩm trà đen bị oxi hóa và cộng hợp với nhau tạo ra các theaflavin và thearubigin Các chất này tạo nên màu đỏ cho nước trà Màu càng đậm chứng tỏ lượng catechin trong trà càng ít và lượng các theaflavin càng nhiều

H Galloy Theaflavin-3,3’-gallate

Hình 1 2 Công thức phân tử của các loại theaflavin chủ yếu trong trà xanh

Caffeine cũng là một thành phần chính của trà chiếm khoảng 2% - 5% trong

lá trà [23] Caffeine kích thích hệ thần kinh trung ương gây nên các tác dụng tích cực như: cải thiện tình trạng buồn ngủ, suy giảm nhận thức và mệt mỏi; Nhưng nó cũng

có các tác dụng tiêu cực bao gồm gây rối loạn giấc ngủ, tăng huyết áp và nguy cơ rối loạn tăng trưởng của thai nhi [5], [15]

Hình 1 3 Cấu trúc hóa học của caffeine

Các flavonol chủ yếu trong chè là các chất kaempferol, myricetin, và quercetin dưới dạng các mono-, di- và tri-O-glycoside của chúng Ít nhất có 14 chất đã được tìm thấy Các flavonol ít bị biến đổi trong quá trình lên men Chúng là các thành phần

có lợi cho sức khỏe trong chè mà không có độc tính Sau khi vào cơ thể chúng xuất hiện trong máu, thể hiện hoạt tính mà không tích lũy lại [2], [4]:

O O

Quercetin Kaemferol

Hình 1 4 Một số flavonol chủ yếu trong chè xanh 1.3 Tác dụng sinh học và độ an toàn

Tác dụng sinh học của trà xanh có được chủ yếu do hoạt tính chống oxy hóa

và hoạt tính dọn gốc tự do của các catechin Hoạt tính này được biểu hiện qua sự hiện diện của các nhóm phenolic hydroxy So sánh hoạt tính tính chống ôxy hóa của các catechin, có thể sắp xếp hoạt độ chống ôxy hóa của hợp chất này theo thứ tự EGCG

> ECG > EGC > EC [24] Rice-Evans đã chứng minh hoạt tính chống oxy hóa của EGCG mạnh hơn hẳn các vitamin C và E [27]

Trong ruột non, catechin ức chế một số enzym tiêu hóa như a-amylase và sucruse, vì vậy tránh sự tiêu hóa quá nhiều sacaroza Người ta đã chỉ ra rằng các

polyphenol trà xanh ức chế lipaza tiêu hóa trong điều kiện in vitro làm giảm khả năng

phân giải triglycerit, điều này có nghĩa là giảm sự tiêu hóa lipit trong cơ thể [33] Catechin cũng được chứng minh là có tác dụng tốt đối với hệ vi khuẩn đường ruột, làm tăng lượng vi khuẩn axit lactic và làm giảm vi khuẩn gây thối rữa Mặc dù cơ chế tác dụng cụ thể còn chưa được biết, nhưng người ta đã chỉ ra rằng các catechin trà xanh

làm tăng đáng kể lượng Lactobacilli và Bifidobacteria trong khi đó lại làm giảm lượng

lớn các mầm bệnh có khả năng mắc phải [18]

Trong thử nghiệm in vivo một lượng nhỏ catechin hấp thụ vào trong tĩnh mạch

từ ruột non được chuyển hóa tới gan và làm nhiệm vụ ngăn ngừa các chất sinh ung thư trong gan, phổi, lá lách, bàng quang Catechin trong hệ máu người cũng có khả năng ngăn ngừa sự peroxyt hóa LDL cholesterol, do đó hạ thấp khả năng giảm oxi hóa của hệ tuần hoàn máu Hiện nay chưa có nhiều thông tin về sự hấp thụ polyphenol trà xanh từ ruột và hàm lượng của nó trong máu Trong 6 phút sau khi uống 2 mg/kg trọng lượng cơ thể của chuột, thì người ta nhận thấy từ 30-40% catechin được hấp thu Độ phóng xạ cao nhất vào máu được quan sát thấy trong 1-2 giờ sau khi ăn [14]

1.4 Một vài nét cơ bản về nhựa hấp phụ macroporous

Hiện nay có rất nhiều loại chất hấp phụ như: than hoạt tính, silicagen, các polyme hoạt tính, các zeolít, đất sét hoạt tính, nhôm oxit, Nhựa hấp phụ macroporous

là một nhóm trong số các polyme Mỗi loại có những đặc tính tạo nên những vùng ứng dụng hiệu quả riêng từng loại

Nhựa hấp phụ macroporous có cấu tạo là các polymer hình cầu, thường màu trắng, có cấu trúc xốp với các lỗ xốp tương đối rộng (đường kính lỗ xốp > 50 Å) [19]

có thể cho các phân tử lớn đi qua; hấp phụ nhờ lực liên kết tự do Vander Waals hoặc liên kết hydro [12] Hiện nay hầu hết các loại nhựa hấp phụ được sản xuất từ polyme styrene divinylbenzene (SDVB) hoặc polyme của acrylic Ngoài ra trong quá trình sản xuất để tạo ra các lỗ xốp nhà sản xuất sẽ bổ sung thêm các chất gọi là porogens ( như toluene, n-heptane, iso-octane và isobutanol) được trộn lẫn với hỗn hợp monomer, không hoà tan polymer và có khả năng bay hơi ở những điều kiện nhất định sau khi kết thúc quá trình polymer hoá để lại những lỗ xốp trong cấu trúc

polymer Hình 1 5 mô tả hình dáng cấu trúc và cấu tạo của hạt nhựa hấp phụ

macroporous

Nhựa hấp phụ macroporous có thể được chia làm hai loại chính: Không phân cực và phân cực Trong đó hạt phân cực có thể được chia nhỏ hơn thành phân cực yếu, phân cực trung bình và phân cực mạnh [19]

Vì bản chất hạt nhựa macroporous là chất hấp phụ nên ba đặc tính quan trọng đặc trưng cho khả năng hấp phụ của các hạt macroporous là tổng diện tích bề mặt (bề

mặt bên trong và ngoài), đường kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt [19] Diện tích bề mặt hạt khô thường nằm trong khoảng từ 100 đến 1000 m2/g với đường kính lỗ xốp khoảng từ 50 đến 300 Å và độ phân cực của hạt thường được rải đều từ không phân cực, phân cực yếu, trung bình và mạnh tuỳ theo monomer được sử dụng trong quá trình polymer hoá hoặc các xử lý hoá học sau quá trình polymer hoá

Đại lượng đặc trưng cho khả năng hấp phụ của chất hấp phụ là dung lượng hấp phụ (Qe) hay hoạt độ hấp phụ được xác định bằng lượng chất bị hấp phụ tối đa bởi một đơn vị chất hấp phụ ở trạng thái cân bằng Giá trị dung lượng hấp phụ phụ thuộc nhiều yếu tố như: bản chất chất hấp phụ, chất bị hấp phụ, nồng độ chất bị hấp phụ, nhiệt độ và thành phần các cấu tử bị hấp phụ khác

Hình 1 5 (A, B)Ảnh SEM của hạt nhựa macroporous, (C) Polyme của acrylic (D)

Polyme của styren divinylbenzen [8]

Một số loại hạt macroporous phổ biến trên thị trường và các đặc tính cơ bản

của chúng đã được tóm tắt trong Bảng 1 2

Bảng 1 2 Đặc tính vật lý của một số loại hạt nhựa macroporous [19]

Tên hạt Độ phân

cực

Bản chất hạt

Diện tích

bề mặt (m 2 /g)

Đường kính lỗ xốp (Å)

Kích thước hạt (µm)

AB-8 Phân cưc

Ưu điểm của phương pháp làm giàu bằng nhựa hấp phụ macroporous: So với phương pháp làm giàu khác như chiết phân đoạn lỏng – lỏng hoặc rắn – lỏng thì phương pháp sử dụng thụ bằng nhựa macroporous có một số ưu điểm như:

 Sử dụng tiện lợi, dễ dàng nâng cấp lên quy mô công nghiệp

 Có khả năng làm giàu hợp chất lên từ 10% đến 90% Hiệu suất thu hồi sản phẩm cao hầu hết hiệu suất thu hồi được báo cáo ở mức hơn 70%

 Có thể tái sử dụng hạt so với các phương pháp sắc ký sử dụng chất hấp phụ như silicagel, than hoạt tính, các loại khoáng sét

 Tiêu thụ ít dung môi và sản phẩm cao không để lại dư lượng dung môi hữu cơ

do trong quá trình chủ yếu sử dụng hỗn hợp dung môi cồn nước

 Ngoài ra nhựa hấp phụ macroporous có thể biến đổi bằng cách gắn thêm các nhóm chức nhằm tăng tính chọn lọc đối với một số chất nào đó

Ứng dụng của nhựa hấp phụ macroporous:

Hiện này nhựa hấp phụ macroporous đã được ứng dụng trong việc tinh chế đường, hấp phụ khí, xử lý nước thải, tách và làm giàu các sản phẩm tự nhiên và tinh chế các chế phẩm sinh học khác

Đối với lĩnh vực làm giàu các sản phẩm tự nhiên nhựa hấp phụ macroporous được sử dụng để làm giàu các nhóm hợp chất bao gồm: flavonoid, polyphenol, glycoside, saponin, carotenoid, [19]

1.5 Phương pháp chiết xuất và làm giàu catechin trong trà xanh

1.5.1 Tính chất vật lý và hóa học của các catechin

Catechin là chất không màu, khi kết tinh có dạng hình kim hoặc hình lăng trụ Chúng có vị chát ở mức độ khác nhau, có hậu ngọt, riêng hai chất EGC và EGCG có

vị chát hơi đắng khi ở dạng tự do và chuyển thành vị chát dịu khi ngưng tụ thành các dicatechin

Các catechin tan được trong trong nước, các dung môi hữu cơ phân cực, không tan trong benzene và chloroform Tuy nhiên, độ hòa tan của từng catechin khác nhau

và phụ thuộc vào nhiệt độ và loại dung môi được sử dụng [2]

Các catechin có khả năng hấp phụ UV, EGCG, EGC, ECG và EC và hấp phụ tối đa ở các bước sóng 210nm và từ 269 đến 280 nm

Các catechin trà rất nhạy cảm với quá trình oxy hóa bởi enzyme, axit và nhiệt, các tác nhân tính khử mạnh [20], [31] Các catechin ổn định trong các dung dịch axit (pH <4) và kém ổn định trong môi trường du kiềm (pH > 8) [36] Do đó, axit thường được thêm vào để tăng tính ổn định của catechin Nồng độ các catechin trong dịch chiết nước cũng cho thấy ảnh hưởng đển độ bền của catechin ở 800C dung dịch có nồng độ cao có độ ổn định cao hơn dung dịch ở nồng độ thấp [20]

1.5.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất catechin từ trà xanh

Dựa trên tính chất hóa học đặc trưng của catechin là các hợp chất phân cực tan được trong nước nóng và các dung môi hữu cơ có độ phân cực cao như ethanol,

methanol, hoặc hỗn hợp của chúng với nước nên người ta thường chọn các dung môi này để chiết các catechin ở giai đoạn đầu tiên [28] Hiệu suất chiết của catechin phụ thuộc vào một số yếu tố như: loại dung môi, phương pháp chiết, kích thước dược liệu,

tỷ lệ dung môi/dược liệu, độ pH

Các dung môi thường được sử dụng để chiết xuất catechin từ trà là nước, dung môi hữu cơ phân cực và hỗn hợp dung môi hữu cơ với nước Perva- Uzunalic và cộng

sự đã báo cáo rằng việc chiết xuất catechin từ trà chỉ sử dụng nước cho hiệu suất chiết thấp nhất so với các dung môi hữu cơ phân cực như acetone, acetonitril, ethanol hoặc methanol ở trạng thái tinh khiết hoặc dưới dạng hỗn hợp [26] Myoung-Gun Choung

và cộng sự cũng tiến hành so sánh hiệu suất chiết catechin của nước và các nồng độ cồn kết quả cũng cho thấy hiệu suất chiết catechin của nước là thấp nhất đạt 37,2mg/g

và cao nhất là ethanol 40% đạt 87,68mg/g dược liệu khô [9] Nước là dung môi rẻ tiền và an toàn, không có tồn dư dung môi độc hại như các dung môi hữu cơ khác tuy nhiên hiệu suất chiết catechin trà vẫn còn thấp so với các dung môi khác, việc chiết xuất bằng dung môi hữu cơ phân cực cho hiệu suất, hàm lượng cao tuy nhiên có thể

để lại dư lượng dung môi hữu cơ độc hại (ngoại trừ ethanol được coi là dung môi hữu

cơ ít độc) [34]

Hiệu suất chiết của các catechin trong trà cũng phụ thuộc vào nhiệt độ chiết Nhiệt độ chiết cao cải thiện hiệu suất chiết vì nhiệt làm cho thành tế bào dễ thấm dung môi đồng thời làm giảm độ nhớt dung môi, tăng độ tan và tốc độ chuyển khổi của hoạt chất do đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết [31] Tuy nhiên, nhiệt độ chiết quá cao có thể làm tăng thêm chi phí và cũng có thể gây ra sự epimer hóa catechin [32] Quan V Vuong và cộng sự đã báo cáo quá trình chiết nước tối ưu ở nhiệt độ 800C việc tăng nhiệt độ chiết có thể dẫn đến hiện tượng epimer hóa tuy nhiên nó còn phụ thuộc vào thời gian catechin chịu tác động của nhiệt độ [32] Min-Jung Ko và cộng sự (2016)

sử dụng phương pháp chiết ASE đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết đến hiệu suất chiết các catechin kết quả cho thấy hiệu suất chiết catechin của dung môi nước ở nhiệt độ 1500C/ 5 phút cao hơn so với các dung môi truyền thống như methanol, ethanol, hầu hết các catechin đều bị epimer hóa ở nhiệt độ cao tuy nhiên có thể giảm quá trình này bằng giảm thời gian chiết [17]

Kích thước dược liệu cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất các catechin Việc giảm kích thước dược liệu làm tăng diện tích tiếp pha, giảm quãng đường khuếch tán, tăng tỉ lệ tế bào bị phá vỡ từ đó làm tăng tốc độ chiết Tuy nhiên kích thước dược liệu quá nhỏ có thể gây khó khăn cho quá trình lọc và dược liệu nếu không đảo trộn tốt có thể vón cục, thấm dung môi kém Quan V Vuong và cộng sự trong nghiên cứu của mình đã so sánh hiệu suất chiết các catechin trong 30 phút bằng dung môi nước ở các kích thước khác nhau từ 0,25mm đến 4mm kết quả thu được cho thấy kích thước dược liệu tối ưu là 1mm [32]

1.5.3 Một số phương pháp tinh chế catechin

Phương pháp tinh chế truyền thống để tinh chế catechin trong trà xanh là sử dụng các dung môi hữu cơ Clorofrom hoặc ethylhexanoat thường được sử dụng đầu tiên để loại bỏ caffeine trong dịch chiết trà xanh trước khi sử dụng ethylacetat hay proypylacetat để tách lấy EGCG [9] Chiết xuất CO2 siêu tới hạn cũng được nghiên cứu sử dụng để loại bỏ caffeine trong trà xanh Tuy nhiên, phương pháp này lại chiết xuất hơn 37% EGCG từ trà xanh [25]

Hiện nay, phương pháp sử dụng các loại chất hấp phụ ngày càng được sử dụng nhiều trong quá trình tinh chế do nó có ưu điểm sử dụng dung môi ít độc, thân thiện với môi trường, chi phí hạt không quá cao và có thể tái sử dụng [19] Zhao và cộng

sự đã sử dụng một chất hấp phụ đa phân tử từ N-vinyl-2-pyrrolidinone, ethylene glycol dimethacrylate, và trallyl isocyanurat để tinh chế chọn lọc catechin từ hỗn hợp với caffeine Kết quả sau quá trình rửa giải bằng ethanol thu được sản phẩm chứa 98% catechin và 2% caffein [35] Polyamide cũng đã được sử dụng để tách catechin khỏi caffeine trong dịch chiết trà xanh Bailey và cộng sự phân lập catechin từ trà xanh cột Polyamide CC6 để hấp thụ catechin Sau quá trình rửa giải bằng nước để loại caffeine và sử dụng ethanol thực phẩm để thu phân đoạn catechin Sản phẩm thu được chứa ít hơn 1% caffein và 70% catechin tổng [6] Xin Jin và cộng sự kết hợp sử dụng nhựa hấp phụ macroporous và polyamide để tinh chế EGCG thu được sản phẩm cao chứa 74,8% EGCG [16] Ngoài các chất hấp phụ tổng hợp một số chất hấp phụ

có nguồn gốc tự nhiên cũng được sử dụng để tinh chế catechin trong dịch chiết trà

như than hoạt, silicagel hay các khoáng chất đất sét Montmorillonite (MMT) thành phần chính của bentonit một khoáng chất đất sét trong tự nhiên đã được Takashi Shiono và cộng sự sử dụng để loại bỏ caffein ra khỏi dịch chiết trà xanh Kết quả cho thấy MMT có chọn lọc hấp phụ caffein so với các catechin trong dịch chiết xuất trà xanh, và độ chọn lọc của nó cao hơn nhiều so với sử dụng than hoạt [29]

1.5.4 Một số quy trình chiết xuất EGCG trà xanh

Trong công bố nghiên cứu của tập đoàn Vinachem về chiết xuất và xác định tác dụng chống oxi hóa của polyphenol từ lá chè xanh đã cho kết quả khả năng chiết xuất cafein vào khoảng 2-2,1% và polyphenol vào khoảng 7-8% so với lượng mẫu chè khô Quy trình như sau :

Hình 1 6 Sơ đồ chiết xuất cafein và catechin từ lá chè xanh của Vinachem đề nghị

Năm 2005, nhóm tác giả Phùng Minh Dũng của trường đại học Dược Hà Nội

đã chiết xuất lấy các catechin trong lá chè xanh, đã qua diệt men bằng cồn ẩm và dùng phương pháp chiết ngám kiệt với methanol, tại nhiệt độ phòng để chiết Quy trình cụ thể [13] :

âm, chiết vi sóng, chiết siêu tới hạn… Ta có sự so sánh các kết quả thí nghiệm

Phương pháp 1: MAE ( Microwave-assisted Extraction – chiết xuất có vi sóng

hỗ trợ), sử dụng sóng vi ba với công suất 400w trong 1 phút, cho hiệu suất trung bình 97.46mg catechin trên 1g dược liệu khô [4]

Phương pháp 2: HRE (Heat reflux extraction – chiết nóng hồi lưu ), sử dụng

phương pháp chiết nóng ở nhiệt độ sôi với các dung môi khác nhau như acetone 80%, ethanol và methanol 80% Kết quả cho thấy chiết bằng acetone có kết quả tốt nhất với hiệu suất trung bình 9.8g catechin thu được trên 100g mẫu khô [7]

Phương pháp 3: UAE (Ultrasound-assisted extraction – chiết xuất có siêu âm

hỗ trợ ), sử dụng phương pháp RSM để tính tối ưu cho quá trình chiết siêu âm thu

được kết quả: ở tần số 40 kHz, ở nhiệt độ 24°C trong 26.4 phút và 19.7% ethanol làm

dung môi Phương pháp này cũng dùng để hạn chế tối đa lượng cafein và chiết xuất

tối đa lượng catechin trong mẫu chiết Kết quả thu được hiệu suất chiết catechin trung bình 82.7 % [7]

Phương pháp 4: HWE ( Hot water Extraction- Chiết nóng bằng nước): Có

nhiều tác giả đã tìm cách chiết xuất catechin bằng cách phương pháp khác nhau với

dung môi là nước đã khử ion, được kết quả như trong các bảng dưới đây [5], [6], [7]

Các phương pháp trên đều có ít nhiều điểm chưa rõ ràng như: Việc thu hồi cao chiết từ dung môi mà không bị phân hủy hoạt chất catechin, nhiệt độ sử dụng trong quá trình, ảnh hưởng khả năng chiết xuất do tủa của các chất khác như protein, các chất nhựa, pectin, diệp lục… trong dung môi sử dụng, yếu tố pH có tác dụng gì trong chiết xuất các catechin… Ngoài ra, các phương pháp chiết hiện đại có lượng năng lượng cung cấp khác nhau và khó áp dụng quy mô lớn Các vấn đề trên đều cần phải nghiên cứu làm rõ trước và trong khi thực hiện đề tài

Bảng 1 3 So sánh hiệu quả các phương pháp chiết xuất Catechin từ lá chè xanh [7]

Tỷ lệ dược liệu khô/

dung môi (g/mL) Dung môi xử lý

pH <3

80°C/40

B1:Ethyl acetat 1:5 B2: Acid citric loãng: 1:5

Chiết nước 2

bước

H2O 100%

B1: 50°C/10 phút B2: 80°C/10 phút

B1: 1/30 B2: 1/30

B1: CHCl3 1:1 B2: Ethyl acetat 1:1

Tiền xử lý

nhiệt

H2O 100%

B1: 100°C/ 3 phút B2: 80°C/40 phút

B1: 1/30 B2: 1/20

B1: CHCl3 1:1 B2: Ethyl acetat 1:1

Chiết nước

nóng

H2O 100%

80°C/ 40

B1: CHCl3 1:1 B2: Ethyl acetat 1:1

Hình 1 8 So sánh các phương pháp chiết xuất Catechin từ lá chè xanh [7]

CHƯƠNG II - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Mẫu trà xanh có nguồn gốc từ Thái Nguyên được thu mua tháng 2/2019 Mẫu khi mua ở dạng khô được bảo quản trong túi PE ở nhiệt độ phòng Sau đó mẫu được nghiền bằng máy xay sinh tố và sử dụng rây bột kích thước mắt 0,25 và 1,4mm để phân loại kích thước Mẫu sau khi phân loại được xác định hàm ẩm đạt 8,47 ± 0,07% với hàm lượng EGCG đạt 4,632% và hàm lượng caffein đạt 3,253%

Hình 2 1 Mẫu trà xanh Thái Nguyên kích thước thô

 Dung môi khác: Ethanol, methanol (Trung Quốc)

 Cồn công nghiệp (Vietchem, Việt Nam)

Thiết bị nghiên cứu

 Hệ thống HPLC Shimadzu, Nhật Bản

 Máy đo hàm ẩm OHAUS, Thụy Sỹ

 Máy cất quay DaiHan: dung tích bình cất từ 100ml, 250ml, 1L, 5L

 Bể điều nhiệt Daihan Cr-8

 Tủ sấy thường Binder – FD 115 dung tích 100 lít

 Cân phân tích 4 số AND, Nhật Bản

 Các dụng cụ khác: Nồi cách thủy, bình định mức, micropipet 1-200µl, 1000µl, bình tam giác, Ống đong

100- Cột thủy tinh các loại: 1,68×80; 2,5 x 80; 3,7×80cm (đường kính × chiều cao)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Trà xanh Hàm lượng EGCG > 4%

- Đánh giá so sánh một số chất hấp phụ

- Khảo sát thông số quy trình tinh chế

Chiết xuất EGCG

Hình 2 2 Sơ đồ tóm tắt phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng EGCG và caffein trong trà

Sử dụng phương pháp HPLC để định lượng thành phần EGCG và cafein trong trà xanh dựa theo tài liệu [30] có một số hiệu chỉnh trên hệ thống sắc ký HPLC của Shimadzu, điều kiện chạy sắc ký:

2.3.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất EGCG

Tiến hành: Lấy chính xác khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón 250mL Sử

dụng phương pháp khảo sát đơn yếu tố để đánh giá ảnh hưởng các yếu tố đến quá trình chiết

 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol: Nước, Ethanol 20%, 40%, 60%, 80%

 Ảnh hưởng của kích thước dược liệu: kích thước thô; 0,25-1,4mm; <0,25mm

 Ảnh hưởng của phương pháp chiết: chiết ngâm lạnh, chiết nóng 600C; Chiết hồi lưu

 Ảnh hưởng của tỉ lệ dược liệu/dung môi: 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:50 g/mL

Đánh giá: Dựa vào thông số hiệu suất chiết EGCG và hàm lượng EGCG thu

được để xác định các thông số tối ưu

HS EGCG (%): Hiệu suất chiết EGCG

HL EGCG (%): Hàm lượng EGCG

M : khối lượng EGCG chiết được

M : khối lượng EGCG trong dược liệu khô

M : khối lượng cao chiết được

2.3.3 Nghiên cứu quy trình làm giàu EGCG

- Phương pháp xử lý hạt

Hạt nhựa hấp phụ được ngâm trong cồn 96% trong vòng 24h Sau đó rửa sạch bằng nước đến khi hết mùi cồn Hạt sau quá trình xử lý (độ ẩm 70%) được bảo quản trong lọ thủy tinh kín, ở nhiệt độ phòng

- Phương pháp xử lý dịch chiết

Dịch chiết được đem cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (< -0,9atm); nhiệt

độ 600C đến tỷ lệ khoảng 1/2 thể tích ban đầu Dịch sau đó được pha loãng với nước đến thể tích ban đầu Dịch sau đó được sử dụng để để nghiên cứu thông số quá trình làm giàu bằng hạt nhựa hấp phụ

- Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất hấp phụ

Tiến hành: Đánh giá ảnh hưởng của một số loại nhựa macroporous (D101;

AB-8; ASD-7) Lấy khoảng 10g nhựa hấp phụ cho vào bình nón 250mL Thêm 100mL dịch chiết trà xanh Đặt trong một máy lắc ở 120rpm trong 12h ở điều kiện phòng (250C) Lọc tách hạt ra khỏi dịch chiết Xác định dung lượng hấp phụ EGCG

m: khối lượng chất hấp phụ khô (g)

Cd: nồng độ EGCG và caffein trong dịch ban đầu(mg/mL)

Cs: nồng độ EGCG và caffein sau quá trình hấp phụ (mg/mL)

Vd: thể tích dịch dịch hấp phụ (mL)

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến dung lượng hấp phụ

Tiến hành: Sau khi xác định được loạt chất hấp phụ phù hợp Lấy 10g chất hấp phụ thêm 100mL dịch chiết trà xanh vào bình nón 250mL Đặt trong một bể điều nhiệt ở các nhiệt độ 50C , 250C, 450C Lắc đều sau mỗi 30 phút, sau 12 giờ lấy mẫu

Lọc tách hạt ra khỏi dịch chiết Xác định dung lượng hấp phụ EGCG và caffein của hạt

- Khảo sát động học quá trình hấp phụ đẳng nhiệt

Tiến hành: Sau khi xác định được nhiệt độ hấp phụ phù hợp Lấy 10g chất hấp phụ thêm 100mL dịch chiết trà xanh vào bình nón 250mL Đặt trong một máy lắc ở 120rpm Xác định biến thiên giá trị Qe ở các khoảng thời gian từ 15  240 phút bằng HPLC Tính toán và xây dựng đường cong hấp phụ đường đẳng nhiệt

- Khảo sát dung môi rửa giải

Tiến hành: Chuẩn bị 8 mẫu mỗi mẫu 10g chất hấp phụ cho hấp phụ 100mL dịch chiết trà xanh Rửa bằng nước khử ion 3 lần sau đó rửa giải hạt với 100mL dung dịch ethanol 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80, 90% Trong bình nón ở bằng máy lắc ở 120rpm trong 12h ở 250C Xác định nồng độ EGCG và caffein đối với mỗi dung môi Xác định dung môi để loại caffein và dung môi để thu lấy EGCG

-Khảo sát thể tích rửa giải

Tiến hành: 80g hạt đã xử lý được hấp phụ với 500mL dịch Hạt sau hấp phụ

được đưa lên cột Rửa giải với các dung môi rửa giải đã khảo sát với thể tích từ 1BV đến 8BV (BV: Bed volume là thể tích khối hạt nhựa trong cột), ở tốc độ 2BV/h Xác định nông độ EGCG và caffein ở mỗi BV xây dựng đường cong giải hấp phụ

Đánh giá: Dựa vào các thông số hiệu suất thu hồi EGCG, caffein và hàm lượng

EGCG trong cao thu được để lựa chọn thông số phù hợp

Hiệu suất thu hồi EGCG/caffein =Khối lượng EGCG/caffein thu được

Khối lượng EGCG/caffein đầu vào × 100%

2.3.3 Ổn định quy trình chiết xuất và làm giàu EGCG

Tiến hành: Thực hiện chiết ở điều kiện tối ưu lặp lại thí nghiệm 3 lần

Đánh giá: Dựa vào thông số hiệu suất chiết và hàm lượng EGCG để đánh giá

độ ổn định của quy trình

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

- Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần lấy kết quả trung bình

- Tính toán số liệu và vẽ đồ thị được thực hiện bằng chương trình Microsoft Excel 2013