đánh giá tác dụng và tìm hiểu cơ chế hóa sinh của cao chiết cồn từ cây thạch tùng răng cưa (huperzia serrata (thunb ) trevis) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh alzheimer

Ở Việt Nam, cây Thạch tùng răng cưa mọc hoang dại ở nhiều nơi, được người dân sử dụng điều trị một số bệnh như suy nhược thần kinh, động kinh, mất trương lực cơ, cầm máu.... Hướng nghiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ DUYÊN

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG VÀ TÌM HIỂU CƠ CHẾ HÓA SINH CỦA CAO CHIẾT CỒN TỪ

CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA

(HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS)

TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG BỆNH ALZHEIMER

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẶNG THỊ DUYÊN

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG VÀ TÌM HIỂU CƠ CHẾ HÓA SINH CỦA CAO CHIẾT CỒN TỪ

CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƢA

(HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS)

TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG BỆNH ALZHEIMER

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 8720208

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Phạm Thị Nguyệt Hằng

2 PGS TS Nguyễn Thị Lập

HÀ NỘI 2020

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị đồng nghiệp, gia đình và tập thể bạn

bè

Đầu tiên, bằng tất cả sự kính trọng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới

PGS TS Phạm Thị Nguyệt Hằng và PGS TS Nguyễn Thị Lập, hai người thầy

luôn tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu này

Tiếp đến, em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị tại khoa dược lý – sinh hóa – Viện Dược Liệu Quốc Gia đã giúp đỡ, hướng dẫn em về

kĩ thuật cũng như tạo điều kiện để em có thể hoàn thành được nghiên cứu thực nghiệm tại khoa

Và em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, phòng sau đại học và toàn thể các thầy cô giáo trường Đại Học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài nghiên cứu này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn ở bên ủng hộ, động viên và giúp đỡ em vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức bản thân có hạn, đề tài nghiên cứu này còn nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy

cô để đề tài này hoàn thiện hơn

Em xin trân trọng cảm ơn tất cả những giúp đỡ quý báu này

Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2020

Học viên

Đặng Thị Duyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về bệnh Alzheimer 3

1.1.1 Sơ lược bệnh Alzheimer 3

1.1.2 Dịch tễ 3

1.1.3 Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di truyền học 4

1.1.4 Yếu tố nguy cơ và yếu tố bảo vệ: 5

1.1.5 Cơ chế bệnh sinh 6

1.1.6 Đặc điểm lâm sàng 10

1.1.7 Một số mô hình nghiên cứu về bệnh Alzheimer 11

1.1.8 Các thuốc điều trị 12

1.2 Tổng quan về Thạch Tùng Răng Cưa: 16

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây Thạch tùng răng cưa: 16

1.2.2 Bộ phận dùng 17

1.2.3 Thành phần hóa học 17

1.2.4 Tác dụng dược lý 19

1.3 Tổng quan về ruồi giấm chuyển gen 22

1.3.1 Tên gọi, vị trí phân loại 22

1.3.2 Đặc điểm 22

1.3.3 Ưu điểm sử dụng ruồi giấm trong phòng thí nghiệm 22

1.3.4 Chu kì vòng đời 24

1.3.5 Hệ thống GAL4/UAS 25

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang bệnh Alzheimer 31

2.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện bệnh Alzheimer của cao chiết cồn TTRC trên mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer bằng thử nghiệm hành vi 32

2.2.3 Bước đầu tìm hiểu cơ chế tác dụng của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis): 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43

3.1 Đánh giá hiệu quả cải thiện bệnh của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzhiemer bằng thử nghiệm hành vi 43

3.2 Bước đầu tìm hiểu cơ chế tác dụng của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer 53

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 57

4.1 Về mô hình nghiên cứu 57

4.1.1 Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer 57

4.1.2 Về việc lựa chọn protein tiền chất amyloid và enzym acetylcholinesterase 58

4.1.3 Về việc lựa chọn mức liều 2mg/ml và 4mg/ml 60

4.2 Về các kết quả nghiên cứu 60

4.2.1 Đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm 60

4.2.2 Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm 61

4.2.3 Đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành 62

4.2.4 Bước đầu tìm hiểu cơ chế tác dụng của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) cưa trên mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng anh Viết đầy đủ tiếng việt

2 AchE Acetylcholinesterase Acetylcholinesterase

4 AHRQ Healthcare Research and Quality

Nghiên cứu chăm sóc sức khỏe và chất lượng

6 ApoE Apolipoprotein E Apolipoprotein E

Amyloid beta (A4) precursor protein

Protein tiền chất amyloid

8 ATCI Acetylthiocholin iodid Acetylthiocholin iodid

10 BACE1 β-site APP-cleaving 1 β-site APP-cleaving 1

12 BuchE Butyrylcholinesterase Butyrylcholinesterase

Association

Viện quốc gia về rối loạn thần kinh và giao tiếp và đột quỵ - hiệp hội bệnh

Alzheimer và các rối loạn liên quan

18 NINDS

National Institute of Neurological Disorders and Stroke

Viện rối loạn thần kinh và đột quỵ quốc gia

19 NMDA N-methyl D- aspartate N-methyl D- aspartat

23 PVDF Polyvinyllidene difluoride Polyvinyllidene difluoride

24 TTRC Huperzia serrata (Thunb.) Trevis Thạch tùng răng cưa

Điện di gel polyacrylamide với SDS

và Tacrin Error! Bookmark not defined

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 1 1 Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào [14] 8

Hình 1.2 Sự hình thành đám rối thần kinh [14] 9

Hình 1 3 Công thức cấu tạo của các chất ức chế cholinesterase [56] 13

Hình 1 4 Cây Thạch Tùng Răng Cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) 16

Hình 1 5 Huperzin A và các hợp chất ức chế Enzym Acetylcholinesterase 19

Hình 1 6 Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) 22

Hình 1 7 Chu kì vòng đời của ruồi giấm [50] 25

Hình 1.8 Hệ thống biểu hiện GAL4/UAS với UAS-hAPP 26

Hình 2 1 Hình ảnh phân biệt ruồi đực, cái 31

Hình 2 2 Mô hình kiểm tra trí nhớ ngắn hạn của ruồi giấm 34

Hình 2 3 Mô hình đánh giá khả năng kéo dài tuổi thọ của ruồi giấm trưởng thành 37

Hình 3 1 Giá trị PREFAM kết hợp với phần thưởng Giá trị được biểu diễn với giá trị trung vị là đường thẳng ở giữa các hộp 44

Hình 3 2 Giá trị PREFOCT kết hợp với phần thưởng Giá trị được biểu diễn với giá trị trung vị là đường thẳng ở giữa các hộp 44

Hình 3 3 Chỉ số học tập LI LI được tính theo giá trị PREFAM và PREFOCT, được biểu diễn bằng biểu đồ box-and-whisker plot (n=192); * p<0,05, ** p<0,01 so với lô chứng bệnh lý 45

Hình 3 4 Tốc độ di chuyển của ấu trùng ruồi giấm ở các lô điều trị với cao chiết cồn TTRC so với lô chứng bệnh lý (không được điều trị với cao chiết cồn TTRC) *p<0,05, ** p<0,01 so sánh với lô bệnh lý 47

Hình 3 5 Biểu đồ thể hiện điểm leo trèo trung bình của lô ruồi sau khi nở được 3 ngày của các lô được điều trị với cao chiết cồn TTRC so với lô chứng bệnh lý **: p< 0,01 so sánh với lô chứng bệnh lý 49

Hình 3 6 Biểu đồ thể hiện điểm leo trèo trung bình của lô ruồi sau khi nở được 7 ngày của các lô được điều trị với cao chiết cồn TTRC so với lô bệnh lý; **: p< 0,01 so sánh với lô chứng bệnh lý 50

Hình 3 7 Biểu đồ thể hiện điểm leo trèo trung bình của lô ruồi sau khi nở được 10 ngày, của các lô được điều trị với cao chiết TTRC so với lô bệnh lý; *: p<0,05, **: p< 0,01 so sánh với lô chứng bệnh lý 51 Hình 3 8 Biểu đồ đánh giá khả năng kéo dài tuổi thọ của ruồi theo ngày 52 Hình 3 9 Sự biểu hiện của protein tiền chất Amyloid theo cường độ tín hiệu hóa phát quang thu được 53 Hình 3 10 So sánh mức độ biểu hiện APP ở các nhóm ruồi *: p<0,05, **: p<0,01

so sánh với lô bệnh lý 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Alzheimer (Alzheimer's disease hay AD), chứng mất trí nhớ ở tuổi già,

là một rối loạn thoái hóa thần kinh liên quan đến tuổi với các triệu chứng lâm sàng như suy giảm nhận thức tiến triển liên quan đến suy giảm trong các hoạt động của cuộc sống hàng ngày và rối loạn hành vi tiến triển trong suốt quá trình bệnh Điều nguy hiểm là các triệu chứng của sa sút trí tuệ tiến triển một cách âm thầm và ngày càng trở nên tồi tệ hơn theo năm tháng Người bệnh phải được chăm sóc bởi những người thân trong gia đình Đây quả thực là những áp lực rất lớn về mặt xã hội, tâm

lý, sức khỏe, kinh tế đối với cuộc sống của những người chăm sóc [7], [6]

Dựa trên các nghiên cứu của các nhà dịch tễ trên thế giới thì tỷ lệ mắc bệnh Alzheimer tăng dần theo tuổi và đã chia Alzheimer lâm sàng thành nhóm khởi phát sớm trước 65 tuổi và nhóm khởi phát muộn là các bệnh nhân từ 65 tuổi trở lên Vào năm 2017 là 44 triệu người mắc Alzheimer trên toàn thế giới Ước tính có khoảng

75 triệu người mắc Alzheimer trên toàn thế giới vào năm 2030 Các nhà khoa học cũng ước tính rằng Alzheimer sẽ là một bệnh toàn cầu vào năm 2050, khi số lượng

cá nhân bị ảnh hưởng bởi Alzheimer sẽ tăng lên 135 triệu người [19] Bệnh Alzheimer luôn đi kèm với một khoản ngân sách điều trị khổng lồ và một gánh nặng về thể chất cũng như tinh thần lên bệnh nhân và người thân của họ [6], [30] Các thuốc điều trị Alzheimer gồm các thuốc chính là: Thuốc ức chế cholinesterase, thuốc đối kháng trên thụ thể NMDA, thuốc tác dụng trên amyloid bệnh lý Các thuốc này đều có giá thành cao và tác dụng không mong muốn Vì vậy, nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ và điều trị bệnh Alzheimer là rất cần thiết [77]

Thạch tùng răng cưa, có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis là

cây thuốc được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Quốc làm thuốc bổ thần kinh, tăng cường trí nhớ, trị bệnh động kinh, điều trị bệnh truyền nhiễm [1], [4] Ở Việt Nam, cây Thạch tùng răng cưa mọc hoang dại ở nhiều nơi, được người dân sử dụng điều trị một số bệnh như suy nhược thần kinh, động kinh, mất trương lực cơ, cầm máu theo kinh nghiệm dân gian Việc nghiên cứu tác dụng trên trí nhớ, khả năng học tập của cây Thạch tùng răng cưa đã được nghiên cứu trên thế giới và bước đầu Thạch tùng răng cưa được nghiên cứu ở Việt Nam [54], [9], tuy nhiên vẫn chưa

được đầy đủ cả về số lượng và chất lượng kết quả nghiên cứu Hướng nghiên cứu trên ruồi giấm đang được quan tâm, do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: ―Đánh giá hiệu quả cải thiện bệnh Alzheimer và bước đầu tìm hiểu cơ chế của cao chiết cồn từ

cây Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata (Thunb.) Trevis trên mô hình ruồi giấm

chuyển gen mang bệnh Alzheimer‖ nhằm cung cấp thêm bằng chứng về tác dụng của cây Thạch tùng răng cưa ở Việt nam trên mô hình ruồi giấm

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Đánh giá tác dụng cải thiện bệnh Alzheimer của cao chiết cồn từ cây Thạch

tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mô hình ruồi giấm chuyển

gen mang bệnh Alzheimer

2 Bước đầu tìm hiểu được cơ chế tác dụng thông qua đánh giá mức độ biểu

hiện protein tiền chất amyloid (Amyloid precursor protein – APP) và tác dụng ức

chế enzym acetylcholinesterase của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa (Huperzia

serrata (Thunb.) Trevis)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Sơ lược bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer (Alzheimer disease –AD) là một chứng mất trí phổ biến nhất,

được phát hiện lần đầu tiên năm 1906 bởi bác sĩ tâm thần và thần kinh học người Đức Alois Alzheimer (1864-1915)

Ngày 03 tháng 11 năm 1906, tại cuộc họp lần thứ 37 của Hiệp hội các nhà tâm thần học vùng Tây Nam nước Đức tại Tubingen, Alois Alzheimer đã lần đầu tiên mô

tả đặc điểm lâm sàng và giải phẫu thần kinh học của một bệnh suy giảm lớp vỏ não Ông đã mô tả một bệnh nhân nữ 50 tuổi (Auguste D.) sau 5 năm theo dõi với tình trạng rối loạn giấc ngủ, hoang tưởng và rối loạn trí nhớ đến khi bà tử vong Người phụ nữ này đã được chẩn đoán mắc một dạng bệnh mất trí nhớ bao gồm một nhóm các triệu chứng chủ yếu là liên quan đến suy giảm trí nhớ [7], [34]

1.1.2 Dịch tễ

Dựa trên nghiên cứu của các nhà dịch tễ thì tỷ lệ mắc bệnh Alzheimer tăng dần theo tuổi, vào năm 2017 là 44 triệu người mắc trên toàn thế giới Ước tính có khoảng 75 triệu người mắc Alzheimer trên toàn thế giới vào năm 2030 Các nhà khoa học cũng ước tính rằng Alzheimer sẽ là một bệnh toàn cầu vào năm 2050, khi

số lượng cá nhân bị ảnh hưởng bởi Alzheimer sẽ tăng lên 135 triệu người [19] Bệnh Alzheimer luôn đi kèm với một khoản ngân sách điều trị khổng lồ và một gánh nặng về thể chất cũng như tinh thần lên bệnh nhân và người thân của họ [30]

Ở Việt Nam có hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer [7]

Các dân tộc khác nhau có tỷ lệ mắc bệnh cũng khác nhau Người da trắng ít mắc bệnh hơn người Mỹ gốc Phi hoặc Tây Ban Nha Người châu Á cũng ít mắc bệnh hơn những người ở nơi khác Một số quan điểm còn cho rằng bệnh chịu ảnh hưởng của yếu tố môi trường Ví dụ: người Nhật sống tại Mỹ có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn người Nhật sống tại Nhật [6], [66]

Tăng huyết áp tâm thu và tăng cholesterol máu sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer hơn những người bình thường [6] Người bị hội chứng Down sẽ bị

Alzheimer khi sống đến 40 tuổi và những bà mẹ sinh con bị Down sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer [6]

1.1.3 Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di truyền học

Nguyên nhân chính xác của bệnh Alzheimer còn chưa nghiên cứu được, nhưng một số yếu tố di truyền và môi trường được xác định gây ra bệnh Alzheimer chiếm khoảng dưới 1% số trường hợp Các trường hợp Alzheimer khởi phát sớm có liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể số 1, 14 hoặc 21, trong đó đa số các trường hợp do đột biến một gen sản xuất perseniline 1 trên nhiễm sắc thể 14 Ngoài ra còn

có perseniline 2 có cấu trúc tương tự perseniline 1 được sản xuất bởi gen trên nhiễm sắc thể số 21 Cả 2 gen này đều mã hóa cho protein màng tế bào tham gia quá trình hình thành protein tiền chất amyloid (APP) Các nhà khoa học đã xác định được hơn 160 đột biến trong các gen perseniline làm giảm hoạt động của γ-secretase, hình thành β – amyloid (Aβ) APP được mã hóa bởi gen trên nhiễm sắc thể số 21 và chỉ số ít trường hợp khởi phát sớm liên quan đến đột biến gen mã hóa cho APP [20] Các trường hợp Alzheimer khởi phát muộn chủ yếu liên quan đến Apolipoprotein E (ApoE) Có 3 loại ApoE là ApoE2, ApoE3, ApoE4 trong đó ApoE4 đóng vai trò nhiều trong Alzheimer khởi phát muộn thông qua kết hợp với các yếu tố nguy cơ khác như bất thường ty lạp thể, rối loạn chức năng thành tế bào

và tiêu thụ glucose kém Nguy cơ mắc bệnh Alzheimer cao gấp 3 lần ở người

có 1 ApoE4 và cao gấp 12 lần ở người có 2 ApoE4 so với người không có ApoE [8], [11], [20]

Ngoài các nguyên nhân trên, còn một số yếu tố khác dẫn đến hình thành Alzheimer:

Yếu tố nhiễm độc nhôm: tình trạng nhiễm độc nhôm dường như có liên quan đến sự tăng lắng đọng protein Aβ và số lượng các đám rối sợi thần kinh trung ương não bệnh nhân Alzheimer [6]

Yếu tố nhiễm trùng (virus chậm) giống như bệnh creutzfeld-Jakob [6]

Các rối loạn chuyển hóa: phản ứng oxy hóa quá mức dẫn đến tăng các gốc tự

do Các gốc tự do này được cho là có liên quan đến sự kết hợp và tăng lắng đọng protein Aβ gây chết tế bào thần kinh Sự giảm lưu lượng máu não, rối loạn sinh

tổng hợp các yếu tố dinh dưỡng thần kinh cũng được giả định là có vai trò trong cơ chế gây bệnh Alzheimer [6]

1.1.4 Yếu tố nguy cơ và yếu tố bảo vệ:

1.1.4.1: Yếu tố nguy cơ:

Mặc dù các nhà khoa học đã biết rằng bệnh Alzheimer liên quan đến sự tổn thương không ngừng của các tế bào não, thì nguyên nhân dẫn đến tình trạng này vẫn còn là điều bí ẩn Tuy nhiên, họ đã xác định được các yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng tiến triển của bệnh Alzheimer

Tuổi là yếu tố nguy cơ rất lớn với bệnh Alzheimer Ở người trên 60 tuổi, cả tỷ

lệ mắc chung và tỷ lệ mới mắc bệnh Alzheimer cứ sau 5 năm lại tăng lên gấp đôi: Ở nhóm tuổi 65-69 số người bị bệnh là 2%, ở nhóm tuổi 80-85 số người bị bệnh là 30-40% [6]

Bệnh mạch máu não gồm nhồi máu xuất huyết (hemorrhagic infarcts), nhồi máu thiếu máu (ischemic infarcts), viêm mạch máu ngoại biên (vasculopathies) và thay đổi chất trắng (white matter changes) làm tăng nguy cơ sa sút trí tuệ

Tăng huyết áp (40-60 tuổi) làm tăng nguy cơ suy giảm nhận thức giai đoạn cuối Tuy nhiên, tuổi càng cao nguy cơ này càng giảm

Cân nặng cơ thể quá cao hoặc quá thấp đều làm tăng nguy cơ suy giảm nhận thức và Alzheimer

Nồng độ lipid máu, hội chứng chuyển hóa, hút thuốc lá và chấn thương sọ não

có thể làm tăng hoặc giảm nguy cơ sa sút trí tuệ với các bằng chứng ở nhiều nghiên cứu khác nhau

Đái tháo đường tuýp 2 tăng gần gấp đôi nguy cơ Alzheimer

Tiền sử gia đình có người bị bệnh Alzheimer: Các thành viên trong gia đình này có thể mang những biến đổi di truyền đã được xác định rõ (ở nhiễm sắc thể 21,

14, 1 ) hoặc mang các kiểu gen làm tăng cơ địa dễ bị bệnh như ApoE4 Tần số xuất hiện bệnh là 50% trong số các bệnh nhân Alzheimer – cao gấp 4 lần so với những người không có tiền sử gia đình bị bệnh này [7]

Giới: Nhiều tác giả cho là phụ nữ thường sống lâu hơn so với nam giới, do vậy phụ nữ có thể được thấy nhiều hơn trong quần thể các bệnh nhân Alzheimer [7]

1.1.4.2 Yếu tố bảo vệ:

Chế độ ăn kiêng của người vùng Địa Trung Hải, trong đó bao gồm nhiều rau, quả, bánh mì, cá, ít thịt với dầu oliu là nguồn cung cấp chất béo chính cùng lượng vừa phải rượu vang đỏ làm giảm nguy cơ mắc Alzheimer và sa sút trí tuệ [62] Ngoài ra, việc cung cấp caroten, vitamin C, vitamin E làm giảm nguy cơ suy giảm nhận thức vẫn còn nhiều tranh cãi

Những người tham gia các hoạt động kích thích trí não như học tập, đọc sách, chơi trò chơi hội đồng, câu đố ô chữ, nghe nhạc, thường xuyên tương tác xã hội làm giảm nguy cơ sa sút trí tuệ ở mọi lứa tuổi [59]

1.1.5 Cơ chế bệnh sinh

Cho đến nay, người ta đã thừa nhận Alzheimer là một bệnh thoái hóa não do nhiều nguyên nhân gây ra, không đồng nhất về mặt di truyền, phát sinh và tiến triển theo những cơ chế không hoàn toàn giống nhau giữa các bệnh nhân Tuy nhiên, người ta đã đưa ra 1 giả thuyết để liên kết vai trò của tất cả các thành tố cơ bản trong bệnh nguyên, đó là giả thuyết Beta amyloid [6]

Giả thuyết Beta amyloid:

β - amyloid peptid (βAP) là những sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa bao gồm 36-43 acid amin, βAP42 ít phổ biến hơn so với các βA nhưng lại dễ bị kết tụ và hình thành mảng bám Sự mất cân bằng giữa sản xuất, thanh thải của các peptid làm cho các βAP dư thừa tích lũy và kết tụ lại gây độc cho tế bào Giả thuyết chỉ ra sự tích tụ βAP được coi là độc tố làm ngăn cản quá trình cân bằng ion calci,

ức chế chức năng của một số enzym và khả năng sử dụng glucose của tế bào thần kinh đồng thời kích hoạt sự chết theo chương trình (apoptosis) [23] Người ta vẫn chưa biết chính xác sự biến đổi trong việc sản xuất βAP đến mức độ nào thì gây ra suy giảm trí nhớ

Sự hình thành mảng bám amyloid

Các gen APP mã hóa cho một protein gọi là protein tiền thân amyloid Protein này được tìm thấy trong nhiều mô và cơ quan, bao gồm não và tủy sống (hệ thần kinh trung ương) [65].

Hơn 50 đột biến khác nhau trong gen APP có thể gây ra bệnh Alzheimer khởi

phát sớm, bắt đầu trước tuổi 65 Những đột biến này chịu trách nhiệm cho ít hơn 10 phần trăm của tất cả các trường hợp khởi phát sớm [65]

Biến đổi APP phổ biến nhất thay đổi một trong các acid amin của protein tiền thân amyloid Đột biến này thay thế valine bằng isoleucine ở vị trí protein 717

(Val717Ile hoặc V717I) Các đột biến trong gen APP có thể dẫn đến tăng lượng β

peptide amyloid hoặc tạo ra một dạng peptide dài hơn và dính hơn Khi những mảnh protein này được giải phóng khỏi tế bào, chúng có thể tích tụ trong não và tạo thành các khối gọi là mảng amyloid Những mảng này là đặc trưng của bệnh Alzheimer Sự tích tụ các mảng βAP và amyloid độc hại có thể dẫn đến cái chết của

tế bào thần kinh và các dấu hiệu và triệu chứng tiến triển của chứng rối loạn này [65] [57]

Mảng bám amyloid là sự phân giải của protein tiền thân amyloid (amyloid precursor protein – APP) một glycoprotein xuyên màng, chức năng chưa rõ APP gồm 770 acid amin, protein này biểu hiện trong nhiều mô nhưng đặc biệt trong các khớp thần kinh cuả các neuron APP bị phân cắt bởi 3 enzym: α, β và γ secretase Trước hết, APP bị cắt cạnh tranh bởi α và β-secretase Nhiều nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa làm giảm hoạt tính của α-secretase, làm tăng cường biểu hiện và kích hoạt β-secretase Con đường α-secretase tạo ra sAPPα, các sAPPα hòa tan này liên quan đến sự dẫn truyền thần kinh bình thường ở synap và C83 Con đường β-secretase sinh ra sAPPβ và C99 Các sản phẩm C83 và C99 này bị cắt một lần nữa nhờ γ-secretase (γ-secretase là một phức hợp đa enzym có chứa preseniline 1,2 Đột biến preseniline được tìm thấy ở bệnh nhân Alzheimer sớm có tính chất gia đình) Riêng với C99 dưới tác dụng của γ-secretase sẽ tạo thành hai phân đoạn không hòa tan Amyloid β peptid 40 (βAP40) và Amyloid β peptid 42 (βAP42) βAP42 có tính chất độc hơn và nhiều hơn βAP40 Các monomer này trải qua một sự thay đổi đáng

kể về cấu hình ở nồng độ cao để hình thành cấu trúc bậc ba của dạng monomer Những monomer này sau đó kết hợp lại thành các oligomer (là dimer hoặc trimer),

chúng dường như là các chất độc thần kinh, không hòa tan xung quanh các tế bào thần kinh và dần dần thành các mảng beta amyloid (Hình 1.1) [8], [35]

Hình 1 1 Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào [14]

Ngoài beta amyloid, mảnh protein tiền chất vùng nội bào (fragment: amyloid precursor protein intracellular domain – AICD) cũng có tác dụng phá vỡ sự truyền tin giữa các nơ-ron trong quá trình tiến triển của bệnh Alzheimer Nội dung này đã được Pousinha trình bày tại Hội nghị Khoa học thần kinh học diễn ra từ ngày 17 đến 21/ 10 /2015 tại Chicago [8]

Giả thuyết đám rối sợi thần kinh (Neurofibrilary Tangles - NFTs)

Đám rối thần kinh - NFTs thường được tìm thấy trong các tế bào vùng hải mã

và vỏ não ở người bệnh Alzheimer NFTs được hình thành từ protein tau phosphoryl hóa bất thường Protein tau có vai trò ổn định cấu trúc vi ống, giúp hệ thống vi ống thực hiện chức năng nâng đỡ tế bào, chức năng vận chuyển và vận động tế bào chất Khi sợi tau bị phosphoryl hóa bất thường tại một vị trí cụ thể, chúng không thể liên kết một cách hiệu quả với các vi ống làm chức năng của

chúng bị gián đoạn dẫn tới gây chết tế bào (Hình 1.2) Mật độ của các NFTs tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh mất trí nhớ bởi chúng là một dấu hiệu về

sự chết đi của các tế bào thần kinh NFTs cũng được tìm thấy trong bệnh sa sút trí tuệ khác ngoài bệnh Alzheimer [66]

tế bào thần kinh cholinergic và số lượng các thụ thể nicotinic trong vùng hải mã và

vỏ não giảm xuống Thụ thể nicotinic trước synap có vai trò kiểm soát việc giải phóng của acetylcholin, cũng như các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng khác cho bộ nhớ và tâm trạng, bao gồm: glutamat, serotonin và norepinephrin Giả thuyết cholinergic lý giải việc mất tế bào cholinergic là nguyên nhân suy giảm nhận thức trong bệnh Alzheimer, do đó, việc tăng chức năng hệ cholinergic có thể cải thiện triệu chứng mất trí nhớ [66], [21]

Các chất trung gian gây viêm

Giả thuyết cho rằng, khi βAP tích tụ, các thực bào tiểu thần kinh đệm (microglia) được kích hoạt và tăng cường phản ứng của các tế bào hình sao với các mảng bám Các thực bào tiểu thần kinh đệm làm giảm βAP bằng cơ chế thực bào Các tế bào hình sao đưa βAP vào tế bào chất gián tiếp qua receptor và vận chuyển βAP vào tuần hoàn chung, do đó cũng làm giảm βAP Tuy nhiên việc kích hoạt mạn tính các tiểu thần kinh đệm dẫn tới giải phóng các cytokine như interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) và các yếu tố hoại tử u (TNF-α), nitric oxyd… làm tổn thương các tế bào thần kinh và thúc đẩy quá trình viêm liên tục Trên thực tế, nhiều cytokine và chemokine tăng lên trong não bệnh nhân Alzheimer, và một số kiểu đa hình gen tiền viêm được báo cáo là có liên quan với bệnh Alzheimer [66]

1.1.6 Đặc điểm lâm sàng

Bệnh Alzheimer trở nên trầm trọng hơn theo thời gian Các chuyên gia sử dụng

thuật ngữ ―giai đoạn‖ để mô tả mức độ biến chuyển về năng lực của người bệnh so với chức năng thông thường khi bệnh Alzheimer tiến triển

Giai đoạn 1: Không có biểu hiện suy yếu (chức năng bình thường)

Người bệnh khỏe mạnh, không gặp vấn đề gì về trí nhớ và không có biểu hiện rõ ràng khi được chuyên gia y tế thăm khám

Giai đoạn 2: Sự suy giảm nhận thức nhẹ

Người bệnh có thể cảm thấy trí nhớ của họ bị giảm sút, đặc biệt là họ hay quên các từ ngữ hoặc tên gọi quen thuộc, quên vị trí để chìa khóa

Giai đoạn 3: Sự suy giảm nhận thức nhẹ

Bệnh Alzheimer giai đoạn đầu có thể được chẩn đoán trong một vài người, nhưng không phải tất cả, những khó khan phổ biến bao gồm:

- Khó khăn trong việc tìm kiếm tên hoặc từ ngữ

- Thiếu hiệu quả trong môi trường làm việc và xã hội

- Hay quên, giảm khả năng lên kế hoạch tổ chức

Giai đoạn 4: Ở giai đoạn này khi thăm khám sức khỏe sẽ phát hiện được những

thiếu sót như:

- Giảm khả năng hiểu biết về các việc gần đây hay những sự kiện hiện nay

- Giám khả năng thực hiện các phép tính đòi hỏi tư duy

- Người bệnh tỏ ra thờ ơ, lãnh đạm trong bối cảnh phải giao tiếp và tư duy

Giai đoạn 5: Sự suy giảm nhận thức tương đối nghiêm trọng

- Bệnh nhân suy giảm trí tuệ diễn ra nhanh chóng, rõ rệt Nhân cách của người bệnh cũng bắt đầu có những biến đổi

Giai đoạn 6: Sự suy giảm nhận thức nghiêm trọng

- Thường gặp các triệu chứng biểu hiện tổn thương thùy đỉnh: Rối loạn ngôn ngữ, rồi loạn tri giác, rồi loạn hành vi, thay đổi tính cách

- Các rối loạn ngoại tháp đặc trưng là rối loạn tư thế, dáng điệu, tăng rtuowng lực

cơ và có các triệu chứng giống Parkinson

Giai đoạn 7: Sự suy giảm nhận thức rất nghiêm trọng

- Giai đoạn cuối cùng: Bệnh nhân có thể nằm liệt giường, rối loạn đại tiểu tiện, các triệu chứng loạn thần (hoang tưởng, ảo giác…)

- Có thể xuất hiện các rối loạn thần kinh như liệt nhẹ nửa người co cứng, bệnh nhân nằm co quắp, run tay chân, có các phản xạ như nắm mút

- Các cơn động kinh toàn thể (cơn lớn) gặp trong nhiều trường hợp

- Sút cân nhanh chóng, mặc dù vẫn ăn ngon miệng [75]

1.1.7 Một số mô hình nghiên cứu về bệnh Alzheimer

Mô hình sàng lọc đầu tiên phải kể đến là nghiên cứu các chất có tác dụng ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase Đây là mô hình đơn giản, dễ làm và ít tốn kém Về nguyên tắc có thể định lượng acetylcholin (ACh) và acetylcholinesterase (AChE) thông qua trung gian enzym cholin oxidase xúc tác các phản ứng ACh sẽ bị enzym AChE chuyển thành cholin, sau đó nó bị

10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tạo chất có màu hồng Đo cường độ huỳnh quang ở

563 nm Cường độ huỳnh quang của 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tỷ lệ thuận với nồng độ ACh và AChE Từ đó có thể định lượng được nồng độ ACh và hoạt tính của AChE Hoặc có thể đánh giá khả năng ức chế hoạt tính của enzym

AChE trên mô hình ex vivo theo nguyên tắc của Ellman và cộng sự: cơ chất

acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân bởi AChE tạo thành thiocholin và acid acetic Thiocholin thu được cho phản ứng với thuốc thử Ellman (DTNB) tạo ra accid 5-thio-2-nitro benzoic (RS) có màu vàng, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng

412 nm Chuột sẽ bị giết và tách vùng vỏ não để tiến hành định lượng hoạt tính enzym AChE theo phương pháp của tác giả Ellman và cộng sự Có thể đánh giá khả

năng ức chế hoạt tính của AChE trên mô hình in vitro với nguyên tắc tiến hành theo

phương pháp của Ellman và cộng sự nhưng sử dụng AChE có sẵn [22], [18]

Hệ thống tế bào, như các dòng tế bào thần kinh (NG 108-15) hoặc tế bào thần kinh vỏ não được nuôi cấy nguyên phát cũng được sử dụng để đánh giá thuốc điều trị Alzheimer, bằng cách gây độc các tế bào này bởi protein beta-amyloid hoặc glutamat, sử dụng mẫu nghiên cứu để bảo vệ tế bào thần kinh đó, định lượng lượng

tế bào sống sót [41], [39], [42] Thuốc điều trị Alzheimer sẽ được sử dụng để ngăn chặn hoặc làm giảm bớt độc tính của protein beta-amyloid hoặc glutamat trên tế bào thần kinh NG 108-15 nuôi cấy, có khả năng phục hồi tổn thương hoặc làm tăng khả năng sống sót của tế bào thần kinh

Trên mô hình động vật, người ta sử dụng một số loại chuột chuyển gen gây bệnh Alzheimer như chuột Tg2576, PSAPP (hiện nay đang được sử dụng trên thế giới) Nghiên cứu trên mô hình động vật chuyển gen mang bệnh ở người là cần thiết

để hiểu rõ về cơ chế phân tử và thúc đẩy nghiên cứu tiền lâm sàng Bệnh Alzheimer

đã được gây trên mô hình chuột chuyển gen thế hệ đầu tiên (Tg), trên chuột chuyển gen này có sự biểu hiện quá mức của protein có liên quan đến bệnh Alzheimer có tính chất gia đình, hoặc sử dụng mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 là APP mang đột biến protein tiền thân amyloid (APP), hoặc đột biến cả APP và presenilin (PS) Các chủng chuột chuyển gen này thể hiện bệnh lý Alzheimer nhưng mô hình biểu hiện quá mức có thể dẫn tới các kiểu hình bổ sung không liên quan đến Alzheimer Mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 APP chứa các trình tự gen người

và đột biến gen APP nội sinh trên lâm sàng Những chuột này cho thấy sự tích tụ amyloid không có kiểu hình liên quan đến biểu hiện quá mức nhưng chưa phải là biểu hiện Alzheimer trên lâm sàng của người [60]

β-Một số mô hình gây mất trí nhớ cho chuột bằng hóa chất như tiêm scopolamin bằng đường phúc mạc, hoặc truyền colchicin vào não chuột cống cũng được sử dụng [68], [49], [23]

1.1.8 Các thuốc điều trị

1.1.8.1 Chất ức chế cholinesterase

Acetylcholin là một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng cho quá trình ghi nhớ và học hỏi Chất ức chế cholinesterase giúp ngăn ngừa sự giảm nồng độ acetylcholine Bằng cách giữ cho nồng độ acetylcholine ở mức cao, những loại thuốc này sẽ hỗ trợ cho quá trình truyền tín hiệu giữa các tế bào thần kinh

Hình 1 3 Công thức cấu tạo của các chất ức chế cholinesterase [56]

Trong số các chất ức chế cholinesterase (Hình 1.3), Tacrine là thuốc đầu tiên được sử dụng để điều trị Alzheimer, tuy nhiên do có nhiều tác dụng phụ nên hiện nay không còn được sử dụng [6]

Vào đầu những năm 1980, các nhà nghiên cứu đã bắt đầu đánh giá phương pháp ức chế quá trình thủy phân acetylcholine thông qua sự ức chế có hồi phục cholinesterase để tăng cường hoạt động của hệ cholinergic đối với bệnh nhân Alzheimer

Ngày nay, thuốc kháng enzym acetylcholinesterase được xem là nhóm thuốc chính trong điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác, nhóm thuốc này

đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác khi được sử dụng ở giai đoạn bệnh nhẹ hay trung bình, tuy nhiên các thuốc này không ngăn chặn được diễn tiến tự nhiên của bệnh [5]

- Các thuốc điều trị như: Donepezil, Rivastigmin, Tacrin…

1.1.8.2 Các chất tác dụng trên Amyloid bệnh lý

Tuy dòng thác amyloid (amyloid cascade) là một trọng tâm nghiên cứu trong điều trị suy giảm trí nhớ nhưng đến nay vẫn chưa có thuốc đối kháng amyloid nào được phê duyệt, mặc dù nhiều chất đang ở pha cuối thử nghiệm lâm sàng [28]

- Giảm sản xuất Aβ:

+ Sử dụng các chất ức chế β-secretase: Amyloid được hoạt hóa bởi β-secretase

hoặc enzym β-site APP-cleaving 1 (BACE1) Nhóm thiazolidindion trong điều trị đái tháo đường typ 2 gồm rosiglitazon và pioglitazon được sử dụng chủ yếu đề điều chỉnh chuyển hóa glucose và lipid, cũng có thể ức chế β-secretase và tiền chất amyloid (APP) thông qua kích thích peroxisom prolifrator activated receptor γ (PPARγ) hạt nhân

Những ảnh hưởng của rosiglitazon trên nhận thức đã bước đầu được nghiên cứu

và thử nghiệm ở pha II Mặc dù khuyến cáo thực hiện những thử nghiệm lớn hơn để tiếp tục kiểm tra hiệu quả của pioglitazon trong giai đoạn đầu Alzheimer, nhưng vẫn chưa có thử nghiệm pha III nào cho các chất ức chế β-secretase [28]

+ Sử dụng các chất ức chế γ-secretase: Tác động của γ-secretase lên β-secretase

trong quá trình phân cắt protein APP là bước cuối cùng trong sản xuất Aβ Semagacestat là chất ức chế γ-secretase duy nhất được nghiên cứu trong điều trị Alzheimer, có tác dụng giảm sản xuất Aβ ở hệ thần kinh trung ương phụ thuộc liều [28]

+ Sử dụng các chất hoạt hóa α-secretase: α-secretase là enzym cạnh tranh với

β-secretase trong phân cắt APP, hoạt hóa con đường không amyloid tạo ra các sản phẩm hòa tan có tác dụng bảo vệ thần kinh, cải thiện trí nhớ và giảm sự chết tế bào (anti-apotosis) Một số chất ảnh hưởng lên hoạt động của α-secretase thông qua các chất dẫn truyền thần kinh khác (glutamat, serotonin), hormon (estrogen, testosteron)

và các statin đã được nghiên cứu Tuy nhiên, hiện tại chưa có chất tác động lên secretase nào được thử nghiệm pha III [28]

Giảm kết tập Aβ: Gần đây, các oligome tan được (soluble oligomer) của Aβ

được biết tới có mối liên hệ chặt chẽ với độc tính trên thần kinh và synap hơn so với các sợi fibrin Aβ Các chất ức chế kết tập hoặc làm mất ổn định của oligome Aβ có thể làm thay đổi triệu chứng bệnh Liệu pháp này có thể kiểm soát các monomer để làm giảm sự hình thành các oligome và các mảng bám lão hóa(senile plaque) [28]

1.1.8.3 Chất đối kháng trên receptor NMDA

Nhóm này có memantin là thuốc đối kháng không cạnh tranh trên thụ thể

N-methyl D-aspartat (NMDA của hện thống glutamate với ái lực vừa phải, do có hiện tượng tăng hoạt hóa thụ thể NMDA làm tổn thương các neuron thần kinh trong các bệnh lý thoái hóa thần kinh Việc sản xuất glutamate quá mức khiến các receptor NMDA hoạt động quá mức, gây tăng nhập canci vào tế bào, dẫn đến trạng thái kích thích do nhiễm độc (excitotoxicity) có liên quan đến suy giảm trí nhớ trong bệnh Alzheimer Do phụ thuộc vào điện thế và có động lực học nhanh nên memantin giảm ức chế receptor NMDA ở lượng glutamate sinh lý và tăng ức chế receptor này

ở lượng glutamate bệnh lý, do đó cải thiện trí nhớ và chức năng nhận thức

Năm 2002, memantin lần đầu tiên được chấp thuận ở châu âu để điều trị bệnh Alzheimer mức độ nặng và đến năm 2005, được dùng để điều trị cả Alzheimer mức

độ vừa và nặng Năm 2003, memantin được phòng thí nghiệm lâm sàng (Forest laboratories) cấp phép lưu hành ở Hoa Kỳ Các bằng chứng cho thấy memantin cải thiện đáng kể chức năng nhận thức, hành vi và các hoạt động hang ngày ở bệnh nhân Alzheimer vừa và nặng [28]

- Các thuốc điều trị như: Menmatin…

1.1.8.4 Các chất tác dụng dinh dưỡng thần kinh

Cerebrolysin được cấp phép cho điều trị Alzheimer và các thể sa sút trí tuệ khác

ở nhiều quốc gia châu âu và châu á Cerebrolysine là hợp chất chứa các peptid nhỏ

và acid amin đơn có thể vượt qua hang rào máu não, được sản xuất từ protein não tinh khiết dựa trên phương pháp dùng enzym cắt đoạn chuẩn hóa có kiểm soát [28]

Dữ liệu từ các thử nghiệm lâm sàng khuyến khích sử dụng cerebrolysin cho các trường hợp Alzheimer nhẹ và vừa Tuy nhiên cần tiến hành các nghiên cứu đối chứng với các giả dược có quy mô lớn hơn và các nghiên cứu so sánh để đánh giá tốt hơn hiệu quả và độ an toàn của cerebrolysin, cũng như so sánh mức dộ dung nạp thuốc qua đường tiêm bắp hay tiêm tĩnh mạch với các thuốc đường uống hiện có [28]

1.1.8.5 Chất tác dụng trên protein tau bệnh lý

Tau là một protein liên kết với tubulin để ổn định cấu trúc vi ống sợi trục, đóng vai trò quan trọng trong bệnh Alzheimer Các protein tau tách ra khỏi vi ống khiến

quá trình phosphoryl hóa bất thường, các vi ống xoắn lại hình thành các đám dối thần kinh Vì suy giảm nhận thức liên quan đến đám rối thần kinh nên thoái hóa thần kinh có thể do thiếu sự bảo vệ cấu trúc khung tế bào và sự tích lũy gây độc sợi thần kinh Ức chế quá trình phosphoryl hóa tau và tháo rối sợi thần kinh là 2 chiến lược trong phương pháp điều trị bệnh [28]

1.1.8.6 Thuốc chống viêm

Các chất gây viêm như cytokine và COX-2 có liên quan đến mảng bám và đám rối tìm thấy trong Alzheimer Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy NSAIDS có tác dụng bảo vệ và làm giảm tỷ lệ mắc Alzheimer Tuy nhiên, thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả điều trị Alzheimer của các thuốc kháng viêm không thành công

1.2 Tổng quan về Thạch Tùng Răng Cƣa:

1.2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây Thạch tùng răng cưa:

Thạch tùng răng cưa (cây Thông đất) có tên khoa học Huperzia serrata

(Thunb.) Trevis [1]

Tên tương tự: Lycopodium Serrata (Thunb.) Trevis

Hình 1 4 Cây Thạch Tùng Răng Cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis)

*Vị trí phân loại của loài Huperzia serrata trong hệ thống phân loại thực vậy:

Ngành: Thạch Tùng (Lycopodiophyta);

Lớp: Thạch Tùng (Lycopodiopsida);

Phân bố: cây Thạch tùng răng cưa thường bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá, đất mùn ở dưới tán rừng quanh năm ẩm ướt, độ mùn cao, ở độ caotrên 1000m so với mặt nước biền Loài thực vật này được biết nhiều ở Trung Quốc dưới tên gọi là Qian Ceng Ta, trong các bài thuốc chữa các bệnh như: Bầm máu, rách cơ, sốt và tâm thần phân lập [46] Còn ở các nước phương tây, đặc biệt là Hoa

Kỳ, thạch tùng răng cưa được sử dụng như thức ăn bổ trợ, bán rộng rãi trên thị trường Ở Đài Loan, loài cây này đang được xem là ―thần dược‖, có khả năng tuyệt diệu trong việc chữa bệnh teo não, nhất là căn bệnh mất trí nhớ Alzheimer Ở Việt Nam cây Thạch tùng răng cưa được tìm thấy nhiều ở Phú Yên Langbiang - Lâm Đồng, Sapa – Lào Cai hoặc ở Nghệ An [1]

Trong nhóm các Alkaloid, thành phần hóa học có tác dụng lên hoạt động của

hệ thần kinh, tác dụng hướng thần hoặc chống lại chứng mất trí nhớ là Huperzin A,

Huperzin A có tên khoa học là: (1R,9S,13E)- 1- Amino- 13-ethylidene- 11-

methyl - 6- azatricyclo[7.3.1.02,7]trideca- 2(7),3,10- trien- 5- one) Huperzin A

được tìm thấy trong phần chiết ra của loài Thạch tùng răng cưa là một alcaloid có khả năng ức chế mạnh enzym acetylcholinesterase (AChE) nên sự có mặt của Huperzine A làm giảm lượng enzym AchE có trong não Nhờ đó, hàm lượng

Acetylcholin tăng lên làm cải thiện trí nhớ cho bệnh nhân Alzheimer Một số báo cáo lâm sàng cũng nhận định, Huperzin A tạo điều kiện dẫn truyền thần kinh cholinergic bằng cách tăng nồng độ acetylcholine trong hệ thần kinh trung ương có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh [1], [54]

Nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc phân lập được 2 alkaloid là Huperzin A và Huperzin B [63] Các nghiên cứu tiếp theo phân lập được các alkaloid: Huperzin E

và F , Huperzin G, Huperzin I, Huperzin J, Huperzin K và Huperzin L, Huperzin R, Huperzin P , Huperzin Q và N-oxyhuperzin Q, Huperzin S, T và U, Huperzin O, Huperzin W, Huperzin B

Chang-Heng Tan và cộng sự đã phân lập được 9 alkaloid: Huperzin P, fawcettimine và phlegmariunin B [64] Huperzin Q N-oxyhuperzin Q serratadine, 6f- hydroxycerratadin, 4f – hydroxyserratadin và 4f,6f- dihydroxycerratidin, Phlegmariurin B, 2f – hydroxyphlegmariurin B, 2- oxyphlegmariuni B và 11- oxophlegmariurin

Nhóm nghiên cứu tại Nhật Bản đã phân lập được 17 alkaloid: Lycoposerramin-C, -D, -E, -P, -Q, -S, -U [63] Lycoposerramin –G, -H, -I, -J, -K, -

M, -N, và –O

Kazuaki Katakawa và cộng sự phân lập được 8 alkaloid: Lycothunin, Serratin, Serratanidin, 11alpha – hydrofawcettidin, 2alpha,11alpha-dihydroxy-fawcettidin,

8alpha-hydroxylycothunin [36] Sau đó nhóm tiếp tục phân lập được 7 alkaloid khác từ cây gồm Lycoposerramin-R, -T, dẫn chấy N-methyl và N-formyl của Lycoposerramin-

T, -N-dimethyl-beta-obscurin, lycodin và fawcettimin

Hiromitsu Takayama và cộng sự phân lập được 5 alkaloid: Huperzin A, B, Lycodin, Serratidin và Lycoposerramin-A

Hình 1 5 Huperzin A và các hợp chất ức chế Enzym Acetylcholinesterase

Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy một số alkaloids có cấu trúc tương tự

với Huperzine A trong Huperzia serrata (Thunb.) Trevis như Huperzine B,

Carinatumin A, Carinatumin B, Lycoperine A đã được chứng minh có khả năng gây

ức chế AchE (Hình 1.5) [54]

Một số thành phần khác

Ngoài các thành phần hoạt chất chính là Huperzin A đã phân lập và xác định cấu trúc, một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong Thạch tùng răng cưa như Triterpene, Flavonoid, đường khử, Tanin và những acid Phenoliques [76]

1.2.4 Tác dụng dược lý

1.2.4.1 Theo y học cổ truyền

Thạch tùng răng cưa là loại dược liệu quý có vị đắng tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng Toàn cây Thạch tùng răng cưa được dùng để chữa suy nhược thần kinh, mất trương lực cơ, động kinh, mất tiếng, khản tiếng, viêm phế quản cấp, ho, hen, chữa bí tiểu, viêm gan, thấp khớp, thiếu máu, kinh nguyệt không đều Ngày dùng 10 gam dạng

thuốc sắc Dùng ngoài rửa vết thương bằng nước sắc hoặc dung bột rắc Phụ nữ mang thai không được dùng [1]

1.2.4.2 Theo y học hiện đại

Theo các nghiên cứu trên thế giới, Thạch tùng răng cưa có một số tác dược lý chính như sau:

Tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng nhận thức và học hỏi: Huperzin A có tác

dụng cải thiện trí nhớ có thể là do khả năng làm tăng tuần hoàn não bằng cách ức chế quá trình oxy hóa ở não, đồng thời tăng nồng độ serotonin ở não

Huperzin A có tác dụng tăng cường dẫn truyền thần kinh, ngăn chặn hình thành các mảng bám, đám rối trong não, nuôi dưỡng tế bào não từ đó có đáp ứng rất tốt với bệnh Alzheimer, teo não và sa sút trí tuệ và các bệnh có liên quan đến tổn thương tế bào thần kinh não bộ Hoạt chất này có khả năng xuyên qua màng hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lượng rất thấp tính bằng microgam Sau khi xâm nhập vào não, Huperzin A sẽ ức chế việc sinh ra acetylcholinesterase – là một enzym phá hủy chất trung gian dẫn truyền thần kinh acetylcholine, giúp trí nhớ phục hồi và các chức năng nhận thức được cải thiện Huperzin A lần đầu tiên được phân lập từ Thạch tùng răng cưa bới Liu J.S và cộng sự (1986) với hoạt tính ức chế AChE [44] so với các loại thuốc Tacrine, Rivastigmin và Galantamin thì Huperzin A và chất bán tổng hợp của nó là ZT-1 có tác dụng ức chế AChE tốt hơn, thời gian tác dụng dài, sinh khả dụng đường uống cao hơn và ít tác dụng ko mong muốn hơn [47] Huperzin A tăng cường khả năng học tập và ghi nhớ của chuột nhờ kích hoạt con đường PKC/MAPK, γ-secretases, enzym beta-site APP cleaving (BACE), và phosphoryl hóa GSK-3β [70] Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của Huperzin A còn liên quan đến việc giảm mảng bám amyloid và nồng độ oligomeric Aβ ở võ nào và vùng đồi hải mã Thuốc

―Shuangyiping‖ có thành phần là Huperzin A được chiết xuất từ Thạch tùng răng cưa, phát triến vảo năm 1996 và đã được chấp nhận như là một loại thuốc mới điều trị triệu chứng của Alzheimer ở Trung Quốc [47] Huperzin A cũng đã được FDA chấp nhận là thực phẩm chức năng và được bán trên thị trường Hoa Kỳ dung dưới dạng viên nén hoặc dạng viên nang (200-400µg/ngày) cho tình trạng suy giảm trí nhớ [47] N-methylhuperzin B và Huperzinin phân lập từ Thạch tùng răng cưa

cũng được chứng minh có tác dụng ức chế AChE Ngoài ra, nghiên cứu của Yang

YE và cộng sự năm 2010 phân lập được 12-deoxyhuperzin O (một alkaloid lycopudium) từ Thạch tùng răng cưa và chứng minh được tác dụng đối kháng thụ

Đã có một vài nghiên cứu đánh giá về khả năng cải thiện trí nhớ in vitro và in vivo

của cao chiết Thạch tùng răng cưa

Ở Việt Nam, Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự đã đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết cồn (ethanol) Thạch tùng răng cưa thu hái tại Đà lạt – Lâm Đồng thông qua test hành vi trên mô hình chuột nhắt cho thấy: ở mức liều 0,533g/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị gây suy giảm trí nhớ bằng Scopolamin dùng đường uống (1mg/kg) [3] Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thu

và cộng sự đã đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của các phân

đoạn dịch được chiết từ lá và thân cây Thạch tùng răng cưa thu hái tại Sapa, Lào Cai Kết quả cho thấy phân đoạn dịch chiết EtOAc có tác dụng ức chế enzym mạnh

Tác dụng chống oxy hóa: Năm 2018, Ju-Yeon Park và cộng sự đã chứng minh

dịch chiết EtOH Thạch tùng răng cưa có tác dụng dọn dốc tự do ROS và NO qua quá trình phosphoryl hóa AMPK [55]

Tác dụng chống ung thư: Năm 2012, Ham YM và cộng sự cho thấy dịch

chiết EtOH Thạch tùng răng cưa có tác dụng ức chế tăng sinh và điều hòa quá trình chết theo chương trình (apotosis) của tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người

Năm 2018, Ju-Yeon Park và cộng sự đã chứng minh dịch chiết EtOH Thạch tùng răng cưa có tác dụng ức chế sự di căn của tế bào u thần kinh đệm C6 (glicoma) thông qua tác động lên enzym Matrix Metalloproteinase-9

Tác dụng kháng khuẩn: Nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học Ấn Độ cho

thấy dịch chiết methanol của Thạch tùng răng cưa và một số loài trong chi Huperzia cho hiệu quả kháng khuẩn tốt với các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và Bacillus cereus

Tuy nhiên, trên thế giới Huperzin A chưa có nhiều nghiên cứu trên mô hình ruồi giấm, mà chủ yếu được nghiên cứu trên chuột Và kết quả cho thấy Huperzin A

có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn… Điều đó có nghĩa khi thử nghiệm trên ruồi giấm cũng có thể cho kết quả tương tự

1.3 Tổng quan về ruồi giấm chuyển gen

1.3.1 Tên gọi, vị trí phân loại

Drosophila melanogaster là một loại ruồi trong họ Drosophilidae, phân bố ở

tất cả các châu lục, bao gồm cả các đảo

Hình 1 6 Ruồi giấm (Drosophila melanogaster)

1.3.2 Đặc điểm

Ruồi giấm có màu vàng nâu và có các vòng đen ngang bụng Con cái trưởng thành dài khoảng 2.5mm, con đực nhỏ hơn một chút với lưng tối hơn Con đực dễ dàng phân biệt được với con cái dựa trên sự khác biệt về màu sắc, với một mảng đen khác biệt ở bụng [13]

1.3.3 Ưu điểm sử dụng ruồi giấm trong phòng thí nghiệm

Ruồi giấm (Drossophila melanogaster) là sinh vật được sử dụng trong lĩnh

vực di truyền học với lịch sử nghiên cứ hơn 100 năm Nó được nhà di truyền học người Mỹ T.H Morgan sử dụng trong nghiên cứu của mình từ những năm đầu thế

kỉ XX Ngày nay, ruồi giấm là loài được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm di truyền Nó được coi là sinh vật mô hình có khả năng ứng dụng rộng rãi nhất trong việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử, hay các vấn đề của sinh học cơ bản từ sinh lý cho đến thần kinh, chuyển hóa Ruồi giấm được coi là mô

hình tuyệt vời được thiết lập trong phòng thí nghiệm với các đặc tính và ưu điểm sau:

gen có chức năng tương đồng với người

mã quy trình sinh học phức tạp như lão hóa, bệnh liên quan đến các thế hệ, phả hệ

lọc di tuyền trở lên dễ dàng

lợi thế trong nghiên cứu về chuyển hóa và dinh dưỡng

trong nghiên cứu tế bào gốc và ung thư

tiềm năng sang lọc dược chất và thuốc

Hiện nay trên thế giới có nhiều trung tâm bảo tồn các dòng ruồi biến đổi gen dành cho nghiên cứu, trong đó phải kể đến các trung tâm lớn nhất bao gồm trung tâm Bloomington, Indiana, Mỹ; DGRC của học viện kỹ thuật Kyoto, Nhật bản; NIG-FLY thuộc viện di truyền quốc gia Nhật Bản; VDRC của Viena, Australia; TRIP thuộc trương Y của Đại Học Harvard, Mỹ… Tại các trung tâm này rất nhiều các dòng ruồi đã được biến đổi gen, chúng được tạo mã và kèm theo là các thông số biến đổi di truyền Các phòng thí nghiệm có thể nhận được dòng ruồi biến đổi gen

mà họ quan tâm từ các trung tâm này với kinh phí rất nhỏ Ngược lại, bất kì các nghiên cứu tạo ra các nguồn gen mới đều có thể gửi đến các trung tâm này để duy trì và cung cấp cho các nhà nghiên cứu khác trên thế giới [29]

Nhận thức được tính cần thiết của việc nghiên cứu bệnh, tạo mô hình để nghiên cứu, cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu và sử dụng ruồi giấm làm mô hình nghiên cứu bệnh trên người trong đó có bệnh thoái hóa thần kinh, ví

dụ như công bố của nhóm nghiên cứu Parsa Kazemi-Esfarjani, Seymour Benzer

trong việc ức chế độc tính của polyglutamine trên mô hình ruồi giấm [37] [38] Nhóm tác giả của John M Warrick (năm 2005) thì ứng dụng mô hình tương tự cho

nghiên cứu tác dụng ức chế polyglutamine của Ataxin-3 [71] Nhóm Botella và

cộng sự năm 2009 và 2011 đã dùng ruồi giấm làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson [27] Các nhà nghiên cứu Nhật Bản, nhóm tác giả Hideya Mizuno (năm 2011) cũng đã dùng mô hình ruồi giấm chuyển gen alpha-synuclein làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson và các yếu tố liên quan [51] Nhóm tác giả Masamitsu Yamaguchi (2017) và một số nhóm nghiên cứu khác đã dùng mô hình ruồi giấm đột biến gen ATP binding cassette subfamily A member 13 (ABCA13) làm mô hình nghiên cứu bệnh tự kỷ [67]

1.3.4 Chu kì vòng đời

Chu kì phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: Trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành Ruồi cái dài khoảng 3cm và đẻ khoảng 750-1500 trứng trong suốt vòng đời Trứng sau khi được thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24h Các phôi sẽ trải qua liên tiếp các thay đổi để trở thành ấu trùng bậc 1, bậc 2 và bậc 3 (tương ứng với một, hai và ba ngày tuổi) Giai đoạn ấu trùng được đặc trưng bởi sự tiêu thụ thức ăn trong khoảng 5 ngày trước khi phát triển thành nhộng Sau khoảng

4 ngày nhộng sẽ lột xác phát triển thành ruồi trưởng thành Do vậy, chỉ mất khoảng

10 ngày để thu được ruồi trưởng thành từ phôi ở nhiệt độ 25°C Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm khi nuôi ở điều kiện nhiệt độ 29°C là khoảng 30-40 ngày [61]

Hình 1 7 Chu kì vòng đời của ruồi giấm [50]

1.3.5 Hệ thống GAL4/UAS

Năm 1993, Brand và Perrimon lần đầu tiên sử dụng hệ thống GAL4/UAS có

nguồn gốc từ nấm men Saccharomyces cerevislae trong việc định hướng biểu hiện

các gen ở ruồi giấm Từ đó hệ thống này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu trên ruồi [12] Hệ thống GAL4-UAS là một phương pháp sinh hóa được

sử dụng để nghiên cứu biểu hiện và chức năng gen trong các sinh vật như ruồi giấm

Nó cũng đã được điều chỉnh để nghiên cứu các chức năng liên kết hóa học trong

nuôi cấy tế bào trong ống nghiệm Hệ thống này có hai phần: gen GAL4, mã hóa

protein hoạt hóa phiên mã GAL4 và UAS (Chuỗi kích hoạt ngược dòng)

Đối với nghiên cứu ở Drosophila, gen GAL4 được đặt dưới sự kiểm soát của một promoter hoặc gen điều khiển, trong khi UAS kiểm soát biểu hiện của gen mục tiêu GAL4 sau đó chỉ được biểu hiện trong các tế bào nơi gen điều khiển của nó được kích hoạt [29], [12] Bên cạnh đó, GAL4 chỉ kích hoạt phiên mã gen khi có UAS GAL4 và UAS rất hữu ích để nghiên cứu biểu hiện gen ở ruồi giấm vì chúng

không biểu hiện ở cơ thể bình thường và biểu hiện của chúng không can thiệp vào các quá trình khác trong tế bào Ví dụ về hệ thống biểu hiện GAL4/UAS trên mô

hình ruồi giấm chuyển gen hAPP được thể hiện ở Hình 1.8

Hình 1.8 Hệ thống biểu hiện GAL4/UAS với UAS-hAPP

Trong dự án FIRST ―Hợp tác nghiên cứu sàng lọc dƣợc liệu có tác dụng

ngăn ngữa/ hỗ trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng” do PGS

TS Phạm Thị Nguyệt Hằng làm chủ nhiệm với mục tiêu ứng dụng mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer để sàng lọc dược liệu GS Masamitsu Yamaguchi, Giám đốc trung tâm ruồi giấm, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản là một trong những thành viên của dự án, đã cung cấp một số chủng ruồi giấm chuyển gen phục vụ công tác nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng hỗ trợ/ điều trị bệnh Alzheimer

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa Huperzia

serrata (Thunb.) Trevis là đề tài trong dự án FIRST ―Hợp tác nghiên cứu sàng lọc

dược liệu có tác dụng ngăn ngữa/ hỗ trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng” do PGS TS Phạm Thị Nguyệt Hằng – Trưởng khoa Dược Lý - Sinh

Hóa Viện Dược Liệu làm chủ nhiệm đề tài

Nguồn gốc:

Cây Thạch tùng răng cưa được thu hái tại rừng ở Phú Yên – Việt Nam (tháng 05/2019) Dược liệu được thu hái và giám định mẫu bởi Tiến sĩ Phạm Thị Thanh Huyền nhà thực vật học tại Viện Dược Liệu quốc gia Việt Nam

Dược liệu thu hái rửa sạch được phơi khô, sau đó bảo quản ở nhiệt độ 25 – 26°C

Chuẩn bị mẫu nghiên cứu:

Phần trên mặt đất của cây Thạch tùng răng cưa (TTRC) được sấy khô, cắt thành mảnh nhỏ có chiều dài 1-2 cm sấy khô ở 40-50°C và bảo quản trong túi kín Khi chiết xuất bột dược liệu được ngâm với ethanol 90% ở nhiệt độ thường 2 lần, mỗi lần 5 ngày Các dịch chiết được gộp lại và thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn Sau đó được làm bay hơi ở 50°C thu được cao chiết cồn Hiệu suất chiết là 5,18%

Nồng độ dự kiến sử dụng cho nghiên cứu: 2 mg/ml, 4 mg/ml

Khi sử dụng, cao chiết cồn TTRC được hòa tan trong nước rồi phối hợp với thức ăn của ruồi giấm với thể tích thích hợp để tạo ra các nồng độ như dự kiến

Cơ sở tính liều: Đối tượng nghiên cứu được thử với dải nồng độ từ 1-10 mg/ml Căn cứ vào khả năng sống sót của ruồi giấm và các kết quả công bố trước đây [47], [3] chúng tôi đã chọn ra 2 loại nồng độ thích hợp cho nghiên cứu là 2 mg/ml và 4 mg/ml

2.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.2.1.Động vật

Trong các thí nghiệm chúng tôi sử dụng hai dòng ruồi giấm (Drosophila melanogaster) mang phức hợp gen Alav-GFP (hay còn gọi là Elav, Elva-

GAL4) và UAS-hAPP (hay con gọi là hAPP, hAPP64385) Trong đó Elav là

chủng ruồi hoang dại bình thường mang gen GAL4 ở nhiễm sắc thể thứ 3, do được gắn thêm gen GAL4, chủng ruồi Elav có tập tính sinh hoạt cũng như các đặc điểm sinh học tương tự ruồi bình thường Ruồi giấm chuyển gen hAPP trong các giai đoạn của chu kì phát triển do GS Masamitsu Yamaguchi, giám đốc trung tâm ruồi giấm, viện công nghệ Kyoto, Nhật Bản cung cấp Ruồi giấm được nuôi trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 25±1°C với chu kì sáng - tối 12 giờ (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ

2.1.2.2 Hóa chất nghiên cứu và dụng cụ thiết bị

* Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2 1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đề tài ST

T Tên hóa chất

Nguồn gốc

(Jinan), Trung Quốc

(Jinan), Trung Quốc

16 Sữa gầy Natrel - Mỹ

nuôi ấu trùng

Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng và bước đầu tìm hiểu cơ chế tác dụng của cao chiết

cồn từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên

mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer

Đánh giá tác dụng dựa trên thử nghiệm

hành vi của ruồi giấm

Đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành

Bước đầu tìm hiểu cơ chế tác dụng của cao chiết cồn từ cây

Thạch tùng răng cưa (Huperzia

serrata (Thunb.) Trevis)

Đánh giá mức độ biểu hiện protein (APP)

Đánh giá tác dụng

ức chế enzym AChE chiết tách từ

mô não ruồi của cao chiết cồn Thạch tùng

răng cưa

Đánh giá tác dụng

ức chế enzym AChE của cao chiết cồn trên

mô

hình in

vitro