bước đầu nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học viên nén paracetamol 500 mg giải phóng nhanh

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Trang Bảng 1.1: Tóm tắt phương pháp định lượng PARA trong huyết tương và các thông số dược động học của PARA trong một số nghiên cứu 10 Bảng 3.2: Kết quả thẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NÉN PARACETAMOL 500 MG GIẢI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC VIÊN NÉN PARACETAMOL 500 MG

GIẢI PHÓNG NHANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đoàn Cao Sơn

TS Tạ Mạnh Hùng

HÀ NỘI 2020

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đoàn

Cao Sơn và TS Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tận

tình hướng dẫn và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Hóa Phân tích -

độc chất đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã

tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn tới toàn thể cán bộ khoa Thiết lập Chất Chuẩn

& Chất Đối Chiếu và Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm

nghiệm thuốc Trung ương đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp

đỡ và động viên để tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận văn

Hà nội, ngày 03 tháng 05 năm 2020

Học viên: Nguyễn Thị Hồng

1.1.1 Khái niệm sinh khả dụng và tương đương sinh học 3 1.1.2 Đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học 3 1.1.3 Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học 4

1.2.4 Phương pháp định lượng PARA trong huyết tương và các thông số dược động

1.3 Phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học 14

1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 17

2.3.1 So sánh độ hòa tan in vitro của viên nén Para 500 mg giải phóng nhanh so với

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC định lượng paracetamol trong huyết

2.3.3 Đánh giá SKD và TĐSH viên nén paracetamol 500mg giải phóng nhanh 23

3.1 So sánh độ hòa tan in vitro của viên nén paracetamol 500 mg giải phóng nhanh

3.1.1 Thẩm định phương pháp HPLC xác định độ hòa tan PARA 27

3.1.2 So sánh độ hòa tan in vitro của viên nén paracetamol 500 mg giải phóng

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích paracetamol trong huyết tương người 35

3.2.1 Khảo sát phương pháp phân tích định lượng paracetamol trong huyết tương 35

3.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích PARA trong huyết tương người 39

3.3 Đánh giá SKD và TĐSH viên nén paracetamol 500 mg giải phóng nhanh 56

3.3.3 Định lượng nồng độ PARA trong máu người tình nguyện sau khi uống thuốc

3.3.4 Thống kê sinh học đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học 57

4.1 Đánh giá thử nghiệm in vitro thử độ hòa tan 63

4.1.1 Thẩm định phương pháp định lượng PARA trong phép thử độ hòa tan 63

4.2 Phương pháp phân tích paracetamol trong huyết tương 63

4.3 ĐÁnh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học 65

4.3.2 Định lượng nồng độ paracetamol trong huyết tương NTN và xác định các

thông số dược động học 65

4.3.3 Kết quả đánh giá tương đương sịnh học của viên nén paracetamol 500 mg giải

4.3.4 Đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm trong nghiên cứu đánh giá SKD và

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

1 ASEAN Association of South East Asian Nations

(Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)

2 AUC Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian

3 BCS Biopharmaceutics Classification System

(Hệ thống phân loại sinh dược học)

4 Cmax Nồng độ dược chất tối đa trong máu

5 CV Coefficient of variation

(Hệ số biến thiên)

6 FDA Food and Drug Administration

(Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ)

7 GCP Good clinical practice (Thực hành lâm sàng tốt)

8 GLP Good laboratory practice

13 LLOQ Lower limit of quantification (Giới hạn định lượng dưới)

15 LQC Low quanlity control (Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp)

16 MQC Middle quanlity control (Mẫu kiểm chứng nồng độ trung

20 TĐSH Tương đương sinh học

21 Tmax Thời gian đạt được nồng độ dược chất tối đa trong máu

22 WHO Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Trang

Bảng 1.1: Tóm tắt phương pháp định lượng PARA trong huyết tương và các

thông số dược động học của PARA trong một số nghiên cứu 10 Bảng 3.2: Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống

Bảng 3.3 : Kết quả thẩm định độ chính xác

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng PARA trong thử độ

hòa tan

Bảng 3.5: Điều kiện phân tích PARA trong phép thử độ hòa tan

Bảng 3.6: Kết quả thử độ hòa tan của viên thử và viên chứng Panadol ActiFast

trong môi trường pH 1,2

Bảng 3.7: Kết quả thử độ hòa tan của viên thử và viên chứng Panadol ActiFast

trong môi trường pH 4,5

Bảng 3.8: Kết quả thử độ hòa tan của viên thử và viên chứng Panadol ActiFast

trong môi trường pH 6,8

Bảng 3.9: Điều kiện khảo sát sắc ký ban đầu trong phân tích PARA trong huyết

tương

Bảng 3.10: Các điều kiện sắc ký định lượng PARA và IS

Bảng 3.11: Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương

Bảng 3.12: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ trong huyết tương

Bảng 3.13: Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với Rt của PARA và IS

Bảng 3.15: Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát 5 đường chuẩn PARA theo mô hình weighting 1/x 2

Bảng 3.17: Giới hạn LLOQ của PARA

Bảng 3.18: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát độ chính xác khác ngày (n=3)

Bảng 3.20: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của IS

Bảng 3.21: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của PARA

Bảng 3.22: Kết quả độ ổn định dung dịch IS- thời gian ngắn, nhiệt độ phòng

Bảng 3.23: Kết quả độ ổn định dung dịch IS- thời gian dài, nhiệt độ 2ºC - 8ºC

Bảng 3.24: Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn PARA gốc- thời gian ngắn, nhiệt

độ phòng

Bảng 3.25: Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn PARA gốc- thời gian dài, nhiệt

độ 2-8 0

C

Bảng 3.26: Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông– rã

Bảng 3.27: Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương- thời gian ngắn, nhiệt độ

phòng

Bảng 3.28: Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương trong thời gian dài (LQC)

Bảng 3.29: Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương trong thời gian dài (HQC)

Bảng 3.30: Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý- bảo quản trong autosampler

Bảng 3.31: Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo

Bảng 3.32: Các thông số dược động học của NTN sau khi uống thuốc thử

Bảng 3.33: Các thông số dược động học của NTN sau khi uống thuốc chứng

Bảng 3.34: Tóm tắt số liệu sinh khả dụng của thuốc thử và thuốc chứng

Bảng 3.35: Phân tích phương sai giá trị C max , AUC last , AUC inf

Bảng 3.36: Tóm tắt số liệu so sánh sinh khả dụng bằng test ANOVA

Bảng 3.37: So sánh giá trị T max theo phương pháp thống kê phi tham số

Hình 3.3 - Đồ thị biểu diễn độ hòa tan trung bình của viên thử và viên chứng

Hình 3.4 - Đồ thị biểu diễn độ hòa tan trung bình của viên thử và viên chứng

Hình 3.5 - Đồ thị biểu diễn độ hòa tan trung bình của viên thử và viên chứng

trong môi trường pH 6,8

Hình 3.6- SKĐ của PARA và IS khi sử dụng các thành phần pha động khác

nhau

H nh .7- SKĐ các mẫu huyết tương xử lý bằng các phương pháp tủa

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay việc nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học (TĐSH) đã được thực hiện khá phổ biến nhằm đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của thuốc được lưu hành trong nước Nhà nước đã ban hành các quy chế quy định về nghiên cứu SKD hoặc TĐSH như: Quy định đối với thuốc mới hồ sơ đăng kí phải có đầy đủ kết quả nghiên cứu SKD [5], đối với thuốc generic thì có quy định danh mục các thuốc phải đánh giá TĐSH [7]

Paracetamol (PARA) có tác dụng chủ yếu hạ nhiệt và giảm đau, hầu như không có tác dụng kháng viêm so với các thuốc NSAID Nó được sử dụng khá phổ biến thay thế cho aspirin để hạ sốt và giảm đau ở mức độ trung bình Khi sử dụng ở liều chỉ định PARA

an toàn, không có tác dụng phụ ở đường tiêu hóa như các NSAID Mặc dù vậy, độc tính cấp do sử dụng quá liều PARA, cố tình hay vô tình, gây hoại tử gan nghiêm trọng, thậm chí là tử vong

Paracetamol được sản xuất dưới nhiều dạng bào chế, hàm lượng khác nhau: viên nén, viên nang, viên sủi, bột sủi, thuốc tiêm truyền với các hàm lượng 80mg, 150 mg, 250

mg, 325 mg, 500 mg và 650 mg Hiện nay tại thị trường Việt Nam chưa có chế phẩm viên nén PARA giải phóng nhanh, nhóm nghiên cứu của Viện Kiểm nghiệm Thuốc trung ương đang thực hiện dự án “HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VIÊN NÉN PARACETAMOL 500 mg GIẢI PHÓNG NHANH” với công nghệ sát hạt ướt cải tiến từ tháng 06/2018 đến tháng 11/2020

Ngoài những nội dung nghiên cứu về công thức, quy trình bào chế viên nén PARA

500 mg giải phóng nhanh cần phải nghiên cứu so sánh sinh khả dụng và tương đương sinh học với thuốc đối chứng tương đương bào chế để chứng minh sự phù hợp về công nghệ

và tính hiệu quả điều trị của sản phẩm đề tài

Một trong những nội dung quan trọng để thực hiện nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH là xây dựng quy trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu ) Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thấp, nền mẫu chứa nhiều tạp chất gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích Chính vì vậy, phương pháp phân tích phải

được thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng để đảm bảo kết quả thử nghiệm đúng

và chính xác

Mặt khác, việc hòa tan của dược chất sau khi giải phóng phụ thuộc vào môi trường, vào ảnh hưởng của tá dược Với dược chất ít tan như PARA, nếu độ tan và tốc độ hòa tan

bị giảm thì có thể ảnh hưởng đến SKD, do đó đánh giá độ hòa tan in vitro rất quan trọng

trước khi tiến hành đánh giá SKD và TĐSH, giúp nhà sản xuất đánh giá sơ bộ, có thể thay đổi để tìm ra được công thức bào chế tối ưu trước khi tiến hành đánh giá SKD và TĐSH nhằm tiết kiệm chi phí

Từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học viên nén paracetamol 500 mg giải phóng nhanh” với mục tiêu nghiên cứu sinh khả dụng, tương đương sinh học của viên nén

paracetamol 500 mg giải phóng nhanh so với viên đối chứng Panadol ActiFast (paracetamol 500 mg) Để đạt đươc mục tiêu này, đề tài được thực hiện với các nội dung sau:

1 So sánh độ hòa tan in vitro của viên nén paracetamol 500 mg giải phóng nhanh

so với viên đối chứng Panadol ActiFast

2 Thẩm định phương pháp HPLC-DAD định lượng paracetamol trong huyết tương người

3 Đánh giá khả dụng và tương đương sinh học viên nén paracetamol 500 mg giải phóng nhanh so với thuốc đối chứng Panadol ActiFast

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

1.1.1 Khái niệm sinh khả dụng và tương đương sinh học

Theo cơ quan quản lý dược và thực phẩm của Mỹ (FDA), sinh khả dụng là tốc độ và

mức độ dược chất hoặc chất chuyển hóa của dược chất có tác dụng điều trị được hấp thu

và trở nên sẵn sàng phát huy vai trò sinh học tại nơi tác dụng [17] Tuy nhiên để đánh giá nồng độ dược chất hoặc chất chuyển hóa ở cơ quan đích rất khó khăn và không thể thực

hiện được với nhiều thuốc nên người ta chấp nhận định nghĩa sau về sinh khả dụng: Sinh khả dụng là đại lượng chỉ tốc độ và mức độ hấp thu dược chất từ một chế phẩm bào chế

vào tuần hoàn chung một cách nguyên vẹn và đưa đến nơi tác dụng Trong đó, mức độ hấp thu được biểu thị bằng diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC) và nồng

độ thuốc tối đa (Cmax); tốc độ hấp thu được xác định bằng thời gian đạt đến nồng độ thuốc tối đa (Tmax) SKD tuyệt đối là tỷ lệ giữa SKD của cùng một thuốc đưa qua đường uống so với đưa qua đường tiêm tĩnh mạch SKD tương đối là tỷ lệ so sánh giữa 2 giá trị SKD của chế phẩm thuốc cần đánh giá với dạng dung dịch thuốc uống chứa cùng một liều dược chất [6]

Theo FDA, tương đương sinh học được định nghĩa là không có sự khác biệt đáng kể

về tốc độ và mức độ mà thành phần có hoạt tính trong các chế phẩm tương đương bào chế hoặc thế phẩm bào chế có sẵn tại nơi tác dụng khi dùng cùng liều mol trong cùng điều

kiện thử nghiệm [17] Hay nói cách khác tương đương sinh học là khái niệm dùng để chỉ

hai hay nhiều chế phẩm tương đương bào chế có sinh khả dụng tương tự nhau trong cùng điều kiện thử nghiệm Nghĩa là ở cùng điều kiện thử nghiệm, các chế phẩm này phải có các thông số dược động học AUC, Cmax và Tmax tương đương nhau

1.1.2 Đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

Để đánh giá sinh khả dụng của thuốc, người ta dùng sinh khả dụng in vitro và sinh khả dụng in vivo Sinh khả dụng in vitro đánh giá giai đoạn giải phóng, hòa tan của dược chất từ dạng thuốc [6] Do mới chỉ đánh giá giai đoạn đầu tiên (giải phóng, hòa tan) của quá trình sinh dược học nên sinh khả dụng in vitro chưa phải là sinh khả dụng thực sự Sinh khả dụng in vivo đánh giá giai đoạn hấp thu dược chất từ chế phẩm bào chế vào tuần hoàn chung

Đánh giá độ hòa tan in vitro, nhằm mục đích xác đính tốc độ giải phóng dược chất theo thời gian vào trong môi trường hòa tan, từ đó tìm ra công thức bào chế tối ưu, tiết kiệm chi phí cho giai đoạn nghiên cứu in vivo Khi đánh giá độ hòa tan in vitro, cần xem xét 2 thông số: % hoạt chất được hòa tan và thời gian đạt được % hoạt chất hòa tan tối đa Khi phân tích đồ thị nồng độ thuốc trong máu để đánh giá sinh khả dụng in vivo người ta thường xem xét 3 thông số dược động học: diện tích dưới đường cong (AUC) biểu thị mức độ hấp thu của dược chất từ chế phẩm; nồng độ cực đại (Cmax) và thời gian đạt nồng độ cực đại (tmax) [6]

Đánh giá tương đương sinh học là so sánh khả năng sinh học của chế phẩm nghiên cứu so với chế phẩm đối chiếu trong cùng điều kiện thử Một nghiên cứu tương đương sinh học về cơ bản là nghiên cứu so sánh sinh khả dụng, được thiết kế để thiết lập sự tương đương của thuốc thử với thuốc đối chứng

Có hai phương pháp đánh giá tương đương sinh học:

 Đánh giá tương đương sinh học in vitro: thường dùng phép thử độ hòa tan, so sánh tốc độ và mức độ hòa tan hoạt chất của thuốc thử với thuốc đối chứng

 Đánh giá tương đương sinh học in vivo: So sánh một số thông số dược động học hoặc hiệu quả sinh học trên cơ thể sống, có thể thực hiện trên người tình nguyện hoặc trên động vật thí nghiệm

1.1.3 Quy định về đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

1.1.3.1 Các nguyên tắc chung

a) Các thuốc generic có tác dụng toàn thân thì thiết kế nghiên cứu đánh giá tương

đương sinh học phải đơn liều, thực hiện trên người tình nguyện khỏe mạnh, dựa trên

sự so sánh các thông số dược động học của dược chất có trong thuốc (còn gọi là chất

mẹ) được hấp thu vào tuần hoàn chung

b) Chỉ được thử trên người tình nguyện là bệnh nhân trong trường hợp thuốc chứa dược chất có tác dụng rất mạnh hoặc rất độc ngay cả khi sử dụng ở liều thấp hơn liều cao nhất trên người tình nguyện khỏe mạnh, gây ảnh hưởng dược lý nghiêm trọng trên người tình nguyện khỏe mạnh

c) Chỉ chấp nhận báo cáo nghiên cứu tương đương sinh học với thiết kế nghiên cứu đa liều thay thế cho thiết kế nghiên cứu đơn liều đối với một trong các trường hợp sau:

 Khi không thể tiến hành nghiên cứu trên người tình nguyện khỏe mạnh như đã nêu

 Khi độ nhạy của các kỹ thuật phân tích trong dịch sinh học hiện tại không cho phép

đo được chính xác nồng độ thuốc trong dịch sinh học sau khi dùng một liều đơn trong khi lại có thể đo được nồng độ thuốc trong dịch sinh học ở trạng thái ổn định sau khi dùng đa liều

d) Chỉ chấp nhận nghiên cứu tương đương sinh học dựa trên so sánh các thông số dược động học của chất chuyển hoá đối với một trong các trường hợp sau:

 Dược chất có trong thuốc (chất mẹ) là chất không có hoạt tính trước khi được chuyển hoá thành chất có hoạt tính trong cơ thể và nồng độ chất mẹ trong dịch sinh học thấp và bị thải trừ rất nhanh gây khó khăn trong việc chứng minh tương đương sinh học dựa vào các thông số dược động học của chất mẹ Trong trường hợp này chấp nhận đánh giá tương đương sinh học dựa trên các thông số đo được từ chất chuyển hoá có hoạt tính chính

 Khi độ nhạy của các kỹ thuật phân tích trong dịch sinh học hiện tại không cho phép

đo được chính xác nồng độ của chất mẹ trong dịch sinh học ngay cả khi nếu lựa chọn thực hiện nghiên cứu trên một liều cao hơn một liều đơn, nhưng lại có thể đo được chính xác nồng độ chất chuyển hoá

e) Chỉ chấp nhận nghiên cứu tương đương sinh học sử dụng số liệu nồng độ thuốc thải trừ qua nước tiểu thay thế cho nồng độ thuốc trong máu để xác định mức độ hấp thu thuốc vào tuần hoàn chung khi không có khả năng đo được chính xác nồng độ thuốc hấp thu theo thời gian, và đã có các số liệu nghiên cứu chứng minh sự thải trừ của thuốc qua nước tiểu phản ánh được mức độ hấp thu thuốc vào tuần hoàn chung

f) Chỉ chấp nhận sử dụng nghiên cứu tương đương khác thay thế báo cáo cáo nghiên cứu tương đương sinh học để thiết lập tương đương điều trị giữa thuốc generic và thuốc đối chứng khi các kỹ thuật phân tích hiện tại không đủ độ nhạy và độ chính xác để xác định được chính xác nồng độ thuốc và/ hoặc chất chuyển hóa trong dịch sinh học (máu, huyết thanh, huyết tương hoặc nước tiểu)

g) Báo cáo nghiên cứu tương đương sinh học của các thuốc phối hợp cố định liều phải thiết lập được tương đương sinh học của tất cả các thành phần dược chất có trong thuốc h) Nghiên cứu tương đương sinh học cần được thiết kế và thực hiện tuân thủ các nguyên tắc về thực hành tốt lâm sàng (GCP), trong đó pha phân tích của nghiên cứu phải được thực hiện tuân thủ các nguyên tắc thực hành tốt phòng thí nghiệm (GLP) áp dụng cho phân tích dịch sinh học [24]

1.1.3.2 Quy định về thuốc thử nghiệm và thuốc đối chứng

 Thuốc đối chứng là thuốc biệt dược gốc với đầy đủ các số liệu đã được thiết lập về

chất lượng, an toàn và hiệu quả, đã được cấp phép và đang được lưu hành tại Việt Nam,

có trong danh mục các thuốc đối chứng đã được cấp số đăng ký tại Việt Nam do Bộ Y tế ban hành [4]

 Thuốc thử nghiệm phải được sản xuất theo các quy định GMP Với dạng thuốc rắn

dùng đường uống, thuốc thử thường được lấy từ lô nghiên cứu sản xuất công nghiệp với

cỡ lô ít nhất bằng 1/10 quy mô sản xuất hoặc 100.000 đơn vị [4]

1.1.3.3 Thiết kế nghiên cứu

Theo nguyên tắc chung, nghiên cứu tương đương sinh học được thực hiện theo mô hình đơn liều Mô hình thiết kế trong nghiên cứu này là mô hình thiết kế nghiên cứu chéo,

2 chế phẩm, 2 trình tự, 2 giai đoạn theo sơ đồ sau :

Người tình nguyện trong các nghiên cứu tương đương sinh học được chọn sao cho

có thể hạn chế đến mức tối thiểu sự biến thiên và cho phép phát hiện được sự khác biệt giữa các dược phẩm [4] Nói chung nên chọn người tình nguyện là nam giới, khỏe mạnh, trong độ tuổi từ 18-55, có cân nặng trong khoảng trung bình tính theo bảng giá trị BMI với người châu Á là 18 - 25 [4]

Người tình nguyện cần được kiểm tra lâm sàng, xem xét tiền sử bệnh và các xét nghiệm toàn diện Để giảm thiểu ảnh hưởng của các yếu tố khác ngoài mẫu thuốc thử nghiệm, chế độ ăn, uống và hoạt động thể lực của người tình nguyện cần được tiêu chuẩn hóa [4]

1.1.3.5 Thời điểm lấy mẫu

Thiết kế thời điểm lấy mẫu có ý nghĩa quan trọng để thu được đường cong SKD đáp ứng yêu cầu Đường cong SKD phải thể hiện rõ pha hấp thu và pha thải trừ Với hầu hết

các thuốc, chỉ lấy 12-18 mẫu là đủ, ví dụ 1 điểm lúc thời gian bằng 0, 2 điểm trước Cmax, 4-5 điểm xung quanh Cmax, và 7-8 điểm trong pha thải trừ Tuy nhiên khi thời gian bán thải của thuốc quá dài, nên lấy mẫu máu ít nhất 72 giờ [4]

1.1.3.6 Tiêu chuẩn đánh giá tương đương sinh học

a) Các thông số dược động học cơ bản:

 Cmax và Tmax thu được trực tiếp từ kết quả thí nghiệm

 AUClast (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0 đến thời điểm t) được tính theo phương pháp hình thang, với t là thời điểm lấy mẫu cuối cùng có thể định lượng được

 (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm 0 đến vô cùng) được tính theo công thức:

Trong đó: Cm là nồng độ thuốc tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng

z là hằng số tốc độ thải trừ

z được tính bằng hệ số góc đường hồi quy giữa lg[nồng độ] và thời gian

b) Tiêu chuẩn đánh giá tương đương sinh học

Trong các nghiên cứu xác định tương đương sinh học phải sử dụng phương pháp thống kê để xác định khoảng tin cậy 90% của các tỷ lệ giá trị trung bình thuốc thử/ thuốc đối chứng với các thông số cần quan tâm

Khoảng chấp nhận cho các thông số chính như sau:

 Tỷ lệ AUC: khoảng tin cậy 90% trong khoảng 0,80 – 1,25 Với các thuốc có khoảng điều trị hẹp, khoảng chấp nhận này có thể phải hẹp hơn [4]

 Tỷ lệ Cmax: Khoảng tin cậy 90% trong khoảng 0,80 – 1,25 Với các thuốc có khoảng điều trị hẹp, khoảng chấp nhận này có thể phải hẹp hơn [4]

Các thông số khác như tmax chỉ yêu cầu với thuốc giải phóng nhanh, hoặc liên quan đến hiệu quả phụ

1.2 TỔNG QUAN VỀ PARACETAMOL

1.2.1 Công thức cấu tạo và tính chất hoá lý

 Công thức hóa học : C8H9NO2 p.t.l: 151,2

 Tên khoa học: p – (N-acetyl) amino phenol; N – (4-hydroxyphenyl) acetamid; 4′- Hydroxyacetanilide

 Tính chất vật lý: Ít tan trong nước, dễ tan trong ethanol, rất ít tan trong metylen

chlorid Nhiệt độ nóng chảy: 168 °C - 172 °C [1]

1.2.2 Tác dụng dược lý và dược động học

1.2.2.1 Dược lý và cơ chế tác dụng

PARA có tác dụng giảm đau hạ sốt, nhưng không có tác dụng chống viêm Paracetamol làm giảm thân nhiệt ở người bệnh bị sốt, nhưng hiểm khi làm giảm nhân nhiệt ở người bình thường Thuốc tác động lên vùng dưới đồi gây hạ nhiệt, làm tăng tỏa nhiệt do giãn mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên

Với liều điều trị, paracetamol ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không làm thay đổi cân bằng acid – base, không gây kích ứng, loét hoặc chảy máu dạ dày như các NSIAD Paracetamol không có tác dụng trên sự kết tập tiểu cầu hoặc thời gian chảy

máu[3]

1.2.2.2 Dược động học

Hấp thu: PARA được hấp thu nhanh và hầu như hoàn toàn qua đường tiêu hóa Thức

ăn giàu carbonhydrat làm giảm tỷ lệ hấp thu của PARA Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được trong vòng 30 – 60 phút sau uống với liều điều trị

Phân bố: PARA phân bố nhanh và đồng đều trong các mô, liên kết protein huyết

tương khoảng 25 %

Thải trừ: t1/2 khoảng 1,25 – 3 giờ, có thể kéo dài ở bệnh nhân suy gan PAR chuyển hóa bởi CYP450 tạo nên N- acetyl-benzoquinonimin (NAPQ), một chất trung gian có tính phản ứng cao Chất chuyển hóa này bình thường phản ứng với các nhóm sulfhydryl trong glutathion và bị khử hoạt tính Tuy nhiên, nếu uống liều cao PARA, chất chuyển hóa này được tạo thành với lượng đủ để làm cạn kiệt glutathion của gan; trong quá trình đó, chất

NAPQ không được liên hợp với glutathion gây độc cho tế bào gan, dẫn đến viêm và có

thể dẫn đến hoại tử gan [3]

1.2.3 Chỉ định và chống chỉ định

Chỉ định: Paracetamol được dùng rộng rãi trong điều trị các chứng đau và sốt từ nhẹ

đến vừa

Chống chỉ định: người quá mẫn với paracetamol, suy gan nặng [3]

1.2.4 Phương pháp định lượng PARA trong huyết tương và các thông số dược động học của PARA trong một số nghiên cứu

Bảng 1.1: Tóm tắt phương pháp định lượng PARA trong huyết tương và các thông số dược động học của

PARA trong một số nghiên cứu

Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký LLOQ

(µg/ml)

Khoảng tuyến tính (µg/ml)

Cmax (µg/ml)

Tmax (h)

(µg.h/ml)

AUC inf (µg.h/ml)

T 1/2 (h)

Tài liệu tham khảo

0,55 ± 0,22 62,8 ± 20 68,2 ± 23,6 [12]

1,5

[22]

- Pha động: chạy gradient + Pha A: 0,1 % acid formic + Pha B: MeOH

- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút

- Thể tích tiêm: 5µl

- Thời gian phân tích: 7 phút

- Điều kiện khối phổ: Triple

1 1 – 100

µg/ml

13,0 (± 6.2) (liều đơn 1g)

[18]

Quadrupole MS/MS, nguồn ion hóa ESI (+)

(20: 80)

- Detector: PDA = 254 nm

0,02 0,02 - 20

3,7 ± 1,2 (liều đơn 500 mg)

1,4 ± 0,7 16,5 ± 5,8 17,4 ± 6,0 6,1 ±

2,0

[23]

- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

- Thời gian phân tích: 10

phút

 Nhận xét: với nghiên cứu [12], mặc dù uống liều đơn 500 mg PARA, nhưng nồng độ

Cmax đạt được rất cao (32,7 µg/ml), Tmax = 0,32 h Nghiên cứu [23] cũng uống liều đơn

500 mg PARA, nhưng Cmax = 3,7 µg/ml), Tmax = 1,4 h Có thể do viên trong nghiên cứu [12] là viên giải phóng nhanh, viên trong nghiên cứu [23] là viên nén thông thường, qua

đó ta có thể thấy giá trị Cmax và Tmax giữa viên nén quy ước và viên giải phóng nhanh có

sự chênh lệch rất lớn

 Adriana Domı´nguez R và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá TĐSH của các chế phẩm viên nén paracetamol trên thị trường Mexico bằng cách định lượng paracetamol và các chất chuyển hóa của paracetamol có trong nước tiểu của những người tình nguyện trong

24h sau khi uống thuốc [13]

1.3 PHƯƠNG PH P PH N T CH THU C TRONG D CH SINH HỌC

Do mẫu sinh học thường có nồng độ hoạt chất thấp, nền mẫu phức tạp (chứa muối

vô cơ, lipid, protein, chất nội sinh,…), lượng mẫu ít và số lượng mẫu phân tích nhiều nên các phương pháp phân tích cần phải có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn định lượng dưới thấp, độ lặp lại tốt và thời gian phân tích cho một mẫu đủ ngắn Trên cơ sở đó, khi tiến hành xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học, nội dung quan trọng đầu tiên là kỹ thuật xử lý mẫu, sau đến là phương pháp phân tích phải được thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng nhằm bảo đảm độ tin cậy của phương pháp

1.3.1 K thu t ử lý mẫu

Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu…) thường có nồng độ dược chất thấp và chứa một tỷ lệ lớn các protein, các chất nội sinh làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược chất Vì vậy mẫu cần được tách chiết, xử lý để loại bỏ các tạp chất và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích để tăng độ nhạy của phương pháp Ba kỹ thuật thường được áp dụng: tủa protein, chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn

1.3.1.1 Kỹ thuật tủa protein

Nguyên tắc: sử dụng tác nhân gây tủa protein để loại đi phần lớn lượng protein có trong mẫu huyết tương trước khi phân tích Một số tác nhân gây tủa:

 Thêm dung môi hữa cơ có thể trộn lẫn với nước: MeAC, MeOH làm giảm hằng số điện môi của dung dịch

 Thêm acid mạnh: acid percloric, acid tricloroacetic… để làm thay đổi pH của dung dịch

 Thêm muối: amoni sulphat, natri clorid hoặc các ion kim loại như Cu, Zn, Fe để làm thay đổi lực ion

 Đun nóng mẫu làm biến tính protein

 Lọc hoặc siêu lọc

Trên thực tế, để xử lý mẫu huyết tương dùng cho phân tích định lượng người ta hay dùng kỹ thuật tủa protein bằng dung môi hữu cơ hoặc acid Sau khi lắc để kết tủa protein, tiến hành ly tâm tốc độ cao, lấy dịch lọc trong, lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiêm sắc ký Phương pháp này có ưu điểm: tiến hành đơn giản, sử dụng lượng dung môi ít và kinh

tế Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là mẫu bị pha loãng khi tủa bằng dung môi hữu cơ hoặc hoạt chất bị biến đổi khi thêm acid vào mẫu Ngoài ra dung dịch thu được

đem tiêm sắc ký thường không sạch nên làm giảm tuổi thọ của cột [20]

1.3.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Nguyên tắc: chuyển chất cần phân tích từ nền mẫu huyết tương (pha nước) sang dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước, đồng thời tách được chất phân tích ra khỏi tạp có trong nền mẫu

Để chiết được mẫu phân tích trong huyết tương và loại được tạp trong nền mẫu, cần phải chọn được dung môi chiết có khả năng hòa tan chất phân tích nhưng ít hòa tan tạp chất và dễ bay hơi khi cô đặc Còn mẫu phân tích trong huyết tương (pha nước) cần chuyển dạng trung tích trước khi chiết để tang khả năng hoàn tan chất phân tích trong dung môi chiết

Các dung môi hay được lựa chọn để chiết: diethylether, chloroform, diclomethan… Các dung môi bay hơi có thể dùng riêng rẽ hay trộn lẫn với nhau theo tỷ lệ thích hợp tùy thuộc vào chất phân tích Sau khi chọn được dung môi chiết, chiết chất phân tích trong huyết tương bằng cách lắc, ly tâm, hút lớp dung môi có thể tích xác định đem cô, thu được cắn, hòa tan cắn trong pha động, tiêm sác ký

So vơi kỹ thuật tủa protein, kỹ thuật chiết lỏng – lỏng phức tạp hơn, trải qua nhiều bước tiến hành, có thể cho độ thu hồi thấp hơn, nhưng phương pháp này lại cho mẫu thu được sạch hơn và có thể làm giàu mẫu Vì vậy có thể kết hợp đồng thời 2 kỹ thuật trên để làm sạch nền mẫu và tăng khả năng thu hồi chất phân tích tốt hơn

Hiện nay chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật xử lý mẫu được dùng phổ biến để chiết chất

phân tích trong nền mẫu huyết tương [20]

1.3.1.3 Kỹ thuật chiết pha rắn

Nguyên tắc: dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật tách sắc ký có sự khác nhau về ái lực của chất phân tích và các tạp chất với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng

Quá trình này gồm bốn bước sau:

 Hoạt hóa cột bằng các dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm thích hợp

 Nạp mẫu: mẫu được hòa tan trong dung môi và cho qua cột

 Rửa loại tạp: dùng dung môi hoặc dung dịch đệm cho qua cột để rửa loại tạp

 Rửa giải: dùng dung môi thích hợp để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột

Lấy dung dịch rửa giải, tiến hành bay hơi dung môi thu được cắn Hòa tan cắn trong pha động và tiêm sắc ký

Ngoài ra, người ta cũng có thể chiết tách mẫu theo phương pháp lưu giữ tạp chất trên cột và cho hoạt chất đi qua

Để xây dựng 4 bước quy trình chiết trên cần xác định: hiệu quả của dung môi rửa giải chất phân tích và hiệu lực tách chất phân tích của pha rắn Tùy thuộc vào bản chất của từng chất phân tích mà người ta sử dụng các loại cột có bản chất khác nhau và các hệ thống dung môi khác nhau để chiết tách

So với hai kỹ thuật trên, kỹ thuật chiết pha rắn phức tạp và chi phí tốn kém hơn, nhưng nền mẫu thu được sạch hơn và có thể làm giàu mẫu Tuy nhiên, do chi phí tương đối cao nên hiện nay kỹ thuật này ở Việt Nam chưa được sử dụng nhiều để chiết mẫu huyết tương

Sau khi khảo sát, căn cứ vào hiệu suất chiết hoạt chất, độ lặp lại giữa các lần chiết, thời gian chiết, tính kinh tế… để lựa chọn quy trình xử lý mẫu huyết tương tối ưu nhất

[20]

1.3.2 Lựa chọn phương pháp phân tích

Do mẫu sinh học có nồng độ dược chất thấp, nền mẫu phức tạp nên các phương pháp phân tích sắc ký có độ nhạy cao hay được ứng dụng để định lượng nồng độ dược chất trong mẫu Hiện nay, phương pháp phổ biến hay dùng là sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc

ký lỏng khối phổ Tùy thuộc vào nồng độ dược chất, cấu trúc phân tử, tính chất hóa lý, khả năng hấp thụ UV – VIS, khả năng phát huỳnh quang… của chất nghiên cứu để chọn phương pháp định lượng thích hợp

Đối với những mẫu dịch sinh học có nồng dược chất ở ngưỡng thấp (ng/ml), hiện nay phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ, đặc biệt kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2

lần (LC – MS/MS) vì có khả năng tăng độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp lên

nhiều lần [20]

1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Phân tích hàm lượng dược chất trong dịch sinh học là phương pháp đánh giá sinh khả dụng trực tiếp và chính xác nhất Mẫu sinh học thường có nhiều tạp chất, lượng mẫu

ít và nồng độ chất phân tích thường rất thấp Do vậy phương pháp phân tích trong dịch sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu Mục đích của thẩm định phương pháp là chứng minh phương pháp có đủ độ nhạy, tin cậy và lặp lại tốt

Hiện nay ở Việt Nam, thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học được tiến hành theo US-FDA, EMA… và gồm các chỉ tiêu sau: Độ chọn lọc, tính thích hợp hệ thống, giới hạn định lượng dưới, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng độ chính

xác trong ngày và khác ngày, độ nhiễm chéo, độ ổn định và tỷ lệ thu hồi [24]

CHƯƠNG 2 Đ I TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU

2.1 Đ I TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thuốc nghiên cứu

2.1.1.1 Thuốc thử

Viên nén Paracetamol 500 mg giải phóng nhanh sản xuất tại Công ty cổ phần tập đoàn Merap, số lô 0319, ngày sản xuất 26/05/201, cỡ lô: 300000 viên

2.1.1.2 Thuốc đối chứng

Viên nén Panadol ActiFast (paracetamol 500 mg), sản xuất tại công ty dược phẩm

GlaxoSmithKline, UK; Số lô: YW7X, Hạn sử dụng: 06/2021

2.1.2 Mẫu huyết tương

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

 Chất chuẩn và nội chuẩn (IS):

 Paracetamol (PARA): Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, SKS: C0619019.06; Hàm lượng : 100,29 % (nguyên trạng)

 Cafein: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, SKS: 0418099.04 ; Hàm lượng : 99,82 % (nguyên trạng)

 Dung môi, hóa chất: Methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC; acid percloric, kali dihydrophosphat, kali clorid, acid hydrocloric đạt tiêu chuẩn PA, nước RO

 Huyết tương trắng: các lô huyết tương trắng P0905193059; P0905133049; P0905193208; P0906113089; P0907313082; P0904353063; 16P015551; 16P015558 được cung cấp bởi Viện Huyết học và truyền máu Trung ương

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị

2.2.2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng trong phân tích

Tất cả các thiết bị phân tích đều được chuẩn hóa theo qui định của ISO/IEC

17025-2017 và GLP, bao gồm:

 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, Nhật Bản

 Thiết bị thử hòa tan 8 cốc LOGAN UDT

 Cân phân tích Metller; Sartorius

 Máy ly tâm Sartorius Sigma 4-16KS

 Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP scientific

 Tủ lạnh sâu -35 oC ± 5oC, MDF-U5412, Panasonic – Nhật Bản

 Micropipet Eppendorf loại 10 -100 μl, 100 -1000 μl, 1000 – 5000 μl

 Ống ly tâm bằng teflon chụi được lực ly tâm lớn

 Bình định mức, pipet thủy tinh đạt tiêu chuẩn class A

2.2.2.2 Dụng cụ, thiết bị dùng trong lâm sàng (xét nghiệm, lấy mẫu máu NTN)

 Các xét nghiệm lâm sàng (sinh hóa, huyết học, nước tiểu, miễn dịch) tiến hành tại Công ty TNHH Medelab Việt Nam, số 86-88 Nguyễn Lương Bằng, Hà Nội

 Các dụng cụ lấy mẫu: kim luồn, bơm và kim tiêm vô khuẩn dùng 1 lần

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU

2.3.1 So sánh độ hòa tan in vitro của viên nén Paracetamol 500 mg giải phóng nhanh so với thuốc đối chứng Panadol ActiFast

2.3.1.1 Điều kiện thử hòa tan

 Thiết bị : Loại 2 (cánh khuấy)

 Tốc độ quay : 75 vòng/phút

 Môi trường thử : 900 ml môi trường đệm HCl pH 1,2; đệm acetat pH 4,5 và đệm phosphat pH 6,8

 Nhiệt độ môi trường: 37 0C ± 0,5 0C

 Thời điểm hút mẫu: 2, 5, 10 và 15 phút

Cách chuẩn bị các môi trường đệm [26]:

 Đệm HCl pH 1,2: 250 ml dung dịch KCl 0,2M + 425 ml dung dịch HCl 0,2M, thêm

nước vừa đủ 1000ml Kiểm tra lai pH, điều chỉnh về pH 1,2 bằng HCl 0,2M nếu cần

 Đệm acetat pH 4,5: 2,99 g NaC2H3O2.3H2O + 17,7 ml dung dịch acid acetic 2M, thêm nước vừa đủ 1000 ml Kiểm tra lai pH, điều chỉnh về pH 4,5 nếu cần

 Đệm pH 6,8: hòa tan 6,8 g KH2PO4 trong 250 ml nước + 112 ml dung dịch NaOH 0,2M, thêm nước vừa đủ 1000 ml Kiểm tra lai pH, điều chỉnh về pH 6,8 nếu cần.

2.3.1.2 Phương pháp đinh lượng

a) Phương pháp định lượng:

Dựa trên phương pháp định lượng trong chuyên luận viên nén paracetamol [26], tiến

hành định lượng PARA sau khi thử độ hòa tan với các điều kiện sắc ký như sau:

 Phương pháp thử: HPLC

 Pha động: Methanol – nước = 1 – 3

 Hệ thống sắc ký: Cộ C18 25cm x 4,6 mm; 5µm; tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; bước sóng phát hiện: λ = 243 nm; thể tích tiêm mẫu: 10 µl

 Dung dịch chuẩn: 0,01 mg/ml paracetamol chuẩn trong pha động

 Dung dịch thử: Hút 1,0 ml dung dịch đã được thử độ hòa tan, pha loãng bằng pha động vừa đủ 50,0 ml

b) Thẩm định phương pháp: theo yêu cầu của Cục quản lý Dược và yêu cầu về thẩm định phương pháp của ICH, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng PARA với các yêu cầu: Độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ đúng và độ chính xác của phương pháp

2.3.1.3 Phương pháp tiến hành

Tiến hành thử độ hoà tan của thuốc thử và thuốc chứng trong cùng điều kiện Thử độ hoà tan của 12 đơn vị thử riêng biệt đối với cả thuốc thử và thuốc chứng (1 viên/đơn vị thử) trong môi trường thử hoà tan

Xác định phần trăm hoà tan so với lượng ghi trên nhãn, phần trăm hoà tan trung bình, độ lệch chuẩn (SD) và độ biến thiên (CV%) cho từng thuốc và tại từng thời điểm hút mẫu

Trong đó: n: số thời điểm lấy mẫu

Rt: % hòa tan trung bình của thuốc chứng tại thời điểm t

Tt:% hòa tan trung bình của thuốc thử tại thời điểm t

 Điều kiện áp dụng: số điểm lấy mẫu n ≥ 3, độ hòa tan dược chất trong 15 phút < 85

Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của US-FDA và EMA

về thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học trên các chỉ tiêu sau:

2.3.2.2 Sự phù hợp của hệ thống sắc ký (SST)

Chuẩn bị 01 mẫu MQC trong huyết tương để làm mẫu SST Xử lý mẫu theo qui trình thẩm định Tiêm lặp lại 6 lần mẫu SST Ghi lại toàn bộ sắc ký đồ và đáp ứng pic

2.3.2.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Tiến hành phân tích 06 mẫu huyết tương trắng và 06 mẫu chuẩn trong huyết tương

có chứa PARA ở nồng độ thấp nhất của đườn chuẩn (khoảng 1/40 – 1/50 giá trị Cmax) Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/ mẫu chuẩn tại thời gian lưu

của PARA Xác định nồng độ PARA có trong mẫu dựa vào tỷ lệ đáp ứng pic của chuẩn/IS và đường chuẩn xây dựng cùng Xác định độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách

so sánh nồng độ định lượng được với nồng độ thực

2.3.2.4 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Tiến hành chuẩn bị và phân tích 6-8 mẫu chuẩn PARA trong huyết tương có nồng độ

từ LLOQ đến ULOQ trong đó các mẫu LLOQ có nồng độ bằng khoảng 1/40 – 1/50 giá trị

Cmax và mẫu ULOQ có nồng độ khoảng 2 -3 lần giá trị Cmax Ghi lại sắc ký đồ và tính tỷ

lệ đáp ứng pic chuẩn/IS tại các nồng độ tương ứng Xây dựng phương trình hồi quy giữa

tỷ lệ đáp ứng pic chuẩn/IS và nồng độ chuẩn có trong mẫu sử dụng hệ số tỷ trọng (weighting factor) phù hợp Xác định độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng

độ định lượng được với nồng độ thực

2.3.2.5 Độ độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 4 mức nồng độ khác nhau: LLOQ, LQC (có nồng độ bằng khoảng 3 lần LLOQ), MQC (có nồng độ bằng khoảng 50% nồng

độ cao nhất của đường chuẩn), HQC (có nồng độ bằng khoảng 70% - 90% nồng độ cao nhất của đường chuẩn) Mỗi lô mẫu gồm ít nhất 05 mẫu độc lập Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic Tính nồng độ chuẩn có trong các mẫu dựa trên tỷ lệ đáp ứng pic của chuẩn/IS và đường chuẩn được phân tích cùng Độ đúng được xác định bằng cách so sánh nồng độ định lượng được so với nồng độ thực Độ chính xác được xác định bằng cách tính CV (%) giữa nồng độ định lượng được của các mẫu trong cùng một lô mẫu

Độ đúng và độ chính xác trong ngày được xác định khi tiến hành phân tích các lô mẫu trong một ngày Độ đúng và độ chính xác khác ngày được xác định bằng cách tiến hành lặp lại cách xác định độ đúng và độ chụm trong ngày trong ít nhất 3 ngày phân tích khác nhau

2.3.2.6 Độ nhiễm chéo

Tiến hành chuẩn bị và phân tích 6 mẫu huyết tương trắng, 6 mẫu chứa IS và chuẩn

có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (LLOQ) và mẫu chứa IS và chuẩn có nồng độ cao nhất trên đường chuẩn (ULOQ) Tiêm mẫu LLOQ trước, sau đó tiêm xen kẽ từng mẫu blank sau khi tiêm mẫu ULOQ Độ nhiễm chéo được xác định qua tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu LLOQ và mẫu trắng

2.3.2.7 Tỷ lệ thu hồi của hoạt chất

Tỷ lệ thu hồi của hoạt chất được xác định trên 3 mức nồng độ (thấp, trung bình và cao) với ít nhất 5 mẫu độc lập ở mỗi nồng độ trong huyết tương và trong nền mẫu Xác định tỷ lệ thu hồi của hoạt chất bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu huyết tương qua chiết tách với các mẫu pha trong nền mẫu không qua chiết tách tại thời gian lưu của hoạt chất

2.3.2.8 Độ ổn định của mẫu huyết tương

Đánh giá độ ổn định của mẫu huyết tương ở các điều kiện phân tích và bảo quản khác nhau: như độ ổn định ở nhiệt độ phòng, trong thời gian ngắn; độ ổn định ở nhiệt độ bảo quản, trong khoảng thời gian từ ngày đầu tiên lấy mẫu đến ngày phân tích cuối cùng;

độ ổn định sau ba chu kỳ đông và rã đông; độ ổn định của mẫu sau xử lý tính từ khi để trong autosampler đến khi được phân tích

2.3.3 Đánh giá SKD và TĐSH viên nén paracetamol 500mg giải phóng nhanh

2.3.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu chéo, ngẫu nhiên, đơn liều, nhãn mở, 2 thuốc, 2 trình tự, 2 giai đoạn Uống thuốc sau khi nhịn ăn ít nhất 10 giờ Thời gian nghỉ giữa 2 giai đoạn ít nhất 03 ngày Nghiên cứu thực hiện trên 18 NTN

 T : Viên nén Paracetamol 500 mg giải phóng nhanh

 R : Viên nén Panadol ActiFast (paracetamol 500 mg)

Trong thiết kế nghiên cứu chéo 2 x 2, NTN được chia ngẫu nhiên làm 2 nhóm 1, 2 tiến hành cho uống thuôc chia làm 2 giai đoạn sau :

 Giai đoạn 1: nhóm 1 uống viên nén Paracetamol 500 mg giải phóng nhanh; nhóm 2 uống viên nén Panadol ActiFast

 Giai đoạn 2: nhóm 1 uống viên uống viên nén Panadol ActiFast; nhóm 2 uống viên

nén Paracetamol 500 mg giải phóng nhanh

2.3.3.2 Tuyển chọn người tình nguyện

Người tình nguyện là nam hoặc nữ khoẻ mạnh, chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu, tuổi từ đủ 18 – 45 tuổi, chỉ số BMI từ 18,5 – 25,0 kg/m2; kết quả khám tổng quát đạt yêu cầu; các kết quả xét nghiệm lâm sàng nằm trong giới hạn bình thường hoặc nằm trong khoảng sai lệch cho phép (khoảng chấp nhận) và được bác sĩ đánh giá là không

có ý nghĩa lâm sàng Các xét nghiệm lâm sàng bao gồm:

 Huyết học: Tổng phân tích máu, nhóm máu ABO

 Sinh hoá máu: Creatinin, urea, glucose, AST (GOT), ALT (GPT)

 Kháng thể HIV và kháng nguyên viêm gan B (HbsAg)

 Tổng phân tích nước tiểu

 Phát hiện cồn trong hơi thở: Trong ngày tuyển chọn và trong buổi tối tập trung trước khi uống thuốc mỗi giai đoạn

 Xác định chất gây nghiện trong nước tiểu trong buổi tối tập trung mỗi giai đoạn bằng que thử nhanh: Morphin (MOP); Marijuana (THC); Amphetamin (AMP); Methylenedioxymethamphetamin (MDMA)

 Xác định tình trạng mang thai (với nữ giới): Bằng que thử nhanh, trong ngày tuyển chọn và trước khi uống thuốc ở mỗi giai đoạn

Nếu NTN tham gia nghiên cứu dương tính với một trong các test thanh, NTN đó sẽ

bị dừng tham gia nghiên cứu

Tiến hành tuyển chọn NTN sau khi được Hội đồng đạo đức thông qua và trong vòng

1 tuần trước khi bắt đầu giai đoạn 1 NTN tự nguyện đăng ký tham gia nghiên cứu, tự

nguyện ký vào Bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu sau khi đã được phổ biến

đầy đủ nội dung nghiên cứu Sau đó, NTN được đánh giá và lựa chọn theo các tiêu chuẩn quy định trong đề cương

2.3.3.3 Uống thuốc

 Trình tự uống thuốc của từng NTN được xác định bằng phương pháp ngẫu nhiên hóa, sử dụng phần mềm Excel Các cán bộ tham gia phân tích mẫu NTN không được biết trình tự uống thuốc của từng NTN

 Trước ngày uống thuốc mỗi giai đoạn, thuốc được chuẩn bị và dán nhãn cho từng NTN Nhãn bao gồm các thông tin: số nghiên cứu, mã số NTN, giai đoạn, thông tin thuốc

 Liều dùng: Liều đơn, 1 viên x 500 mg thuốc Thử hoặc thuốc Chứng cho mỗi giai đoạn với 240 mL nước ấm

 Trong vòng 2 giờ sau khi uống thuốc, NTN không được nằm

 Trong vòng 1 giờ trước và sau uống thuốc, NTN không được uống nước

2.3.3.4 Lấy mẫu máu

Lấy 1 mẫu điểm 0 giờ (trong vòng 1,5 giờ trước khi uống thuốc) và các thời điểm sau khi uống thuốc như sau: 3 phút; 6 phút; 9 phút; 12 phút; 15 phút; 20 phút; 30 phút; 45 phút; 1 giờ; 2 giờ; 4 giờ; 6 giờ; 8 giờ

Tổng cộng, mỗi NTN sẽ lấy 28 mẫu máu cho cả 2 giai đoạn

Lấy khoảng 5 ml máu vào các ống đã có sẵn chất chống đông EDTA, đậy nắp và lắc bằng cách lật ngược ống 3 - 4 lần ngay sau khi cho máu vào, ly tâm và tách lớp huyết tương, bảo quản huyết tương ở nhiệt độ –35 ± 5oC cho đến khi phân tích

2.3.3.5 Định lượng nồng độ PARA trong huyết tương NTN

Định lượng nồng độ PARA trong các mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc bằng phương pháp phân tích đã được thẩm định Phân tích mẫu được bắt đầu ngay sau khi kết thúc lấy mẫu giai đoạn 2 của tất cả NTN, thời gian từ khi lấy mẫu đầu tiên đến khi kết thúc quá trình phân tích nằm trong khoảng thời gian độ ổn định của mẫu huyết tương Các mẫu huyết tương của cùng 1 NTN được phân tích trong cùng 1 ngày ở cùng điều kiện

2.3.3.6 Xác định các thông số DĐH, đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của viên nén Paracetamol

 Từ nồng độ thuốc đã định lượng được trong các mẫu huyết tương, vẽ đường cong nồng độ thuốc – thời gian của từng cá thể Xác định các thông số dược động học sau đây:

 Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương (Cmax): Xác định trực tiếp trên giá trị đo được

 Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa (Tmax): Xác định trực tiếp trên giá trị đo được

 Diện tích dưới đường cong: Xác định bằng phương pháp hình thang, theo mô hình

dược động học tuyến tính, không ngăn

∑ ( ) ( )

Với Ci là nồng độ PARA tại thời điểm lấy mẫu ti

⁄ Với Cn là nồng độ PARA tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng và z là hệ số thải trừ Phân tích thống kê và đánh giá tương đương sinh học theo hướng dẫn của ASEAN:

 So sánh giá trị C max và AUC: Phân tích ANOVA, xác định khoảng tin cậy 90% (CI)

cho tỷ lệ thuốc thử so với thuốc chứng, tính trên số liệu đã chuyển sang logarit; sử dụng phần mềm WinNonlin

 So sánh giá trị T max: Theo phương pháp phân tích phi tham số của Wilcoxon (Wilcoxon signed-rank test), dựa trên việc xác định tổng giá trị xếp hạng dương và âm

hoặc xác định mức ý nghĩa p của phương pháp theo giá trị Z theo cách sau:

| ( ) |

√ ( )( ) Trong đó: R là tổng xếp hạng (dương hoặc âm)

N là số cặp giá trị Tmax của thuốc thử và thuốc chứng có sai khác

Từ giá trị Z, tra bảng Cumulative normal distribution để xác định giá trị Area, giá trị

p = 1 – Area

 Tiêu chuẩn tương đương sinh học:

 Khoảng tin cậy 90% của thuốc thử so với thuốc chứng, tính trên giá trị Cmax và AUC trung bình nằm trong giới hạn 80,0 – 125,0%

 Giá trị Tmax của thuốc thử và thuốc chứng khác nhau không có ý nghĩa thống kê (giá trị tổng xếp hạng dương và giá trị tổng xếp hạng âm – sum of possitive/negative rank) đều lớn hơn giá trị tra bảng theo số n (n là số lượng gặp giá trị Tmax thuốc thử và thuốc chứng có sai khác) hoặc giá trị p-value > 0,05

2.4 THÔNG QUA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC

Để đảm bảo vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Y – sinh học, toàn bộ nội dung đề tài bao gồm đề cương nghiên cứu và các biểu mẫu liên quan, sẽ được nhóm nghiên cứu đệ trình lên HĐĐĐ theo đúng các qui định và hướng dẫn về GCP Nghiên cứu chỉ được tiến hành sau khi nhận được sự chấp thuận của HĐĐĐ [7]

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 SO S NH ĐỘ HÒA TAN IN VITRO CỦA VIÊN NÉN PARACETAMOL 500

mg GIẢI PHÓNG NHANH SO VỚI THU C Đ I CHỨNG

Phương pháp sắc ký dùng để định lượng PARA sau khi thử độ hòa tan được mô

Hình 3.1: SKĐ của các mẫu chuẩn, thử PARA và mẫu trắng, placebo

Kết luận: Phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độ đặc hiệu

243nm,4nm (1.00)

Nhận xét: Kết quả thẩm định cho thấy, phương pháp đạt yêu cầu về thẩm định độ

thích hợp hệ thống của phương pháp phân tích (N > 1000 ; T < 2,0 ; CVS < 2,0 % ; CVTr

<1,0%)

3.1.1.3 Xác định độ tuyến tính của phương pháp

Pha dãy các dung dịch chuẩn của Paracetamol với nồng độ 0,00315 mg/ml ; 0,00526 mg/ml ; 0,00841 mg/ml ; 0,01051 mg/ml ; 0,01261 mg/ml và 0,01577 mg/ml tương ứng với 30; 50; 80; 100; 120 và 150 % nồng độ dung dịch chuẩn Xây dựng đường chuẩn thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính của giá trị diện tích pic vào nồng độ PARA (mg/ml) Khoảng tuyến tính phải chứa tất cả các nồng độ PARA có thể có khi định lượng PARA trong môi trường hòa tan

Kết quả thể hiện qua hình 3.2

Hình 3.2: Đồ thị tuyến tính của PARA

Nhận xét : Hệ số tương quan r giữa nồng độ paracetamol (mg/ml) với diện tích pic 

1,0000 Phương pháp đạt yêu cầu về độ tuyến tính

0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000

Nhận xét : Với điều kiện sắc ký đã chọn, phương pháp có độ chính xác tốt, CV < 2,0 %, có thể áp dụng phương pháp đã thẩm định để định lượng PARA sau khi thử độ hòa tan.

100 % và 120 % nồng độ dung dịch chuẩn Mỗi nồng độ, tiến hành 3 mẫu thử

Kết quả : % thu hồi được thể hiện quả bảng 3.4

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng PARA trong thử độ

Nhận xét: % thu hồi từ 98,5 % đến 99,9 %, nằm trong khoảng (98,0 % - 102,0 %);

CV = 0,5 % < 2,0 % Phương pháp có độ thu hồi tốt

Phương pháp phân tích đã được thẩm định đạt yêu cầu với điều kiện sắc ký như sau:

Bảng 3.5 : Điều kiện phân tích PARA trong phép thử độ hòa tan