TriệNGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HBVRNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNHu thị nguyệt luận văn thạc sỹ ĐHKHTN final

Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay được cấp phép là PegIFN α2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside (nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir, Tenofovir. PegIFN vừa có tác dụng điều hòa miễn dịch vừa có tác dụng kháng virus trực tiếp, nhờ đó có thể duy trì sự ức chế HBV DNA sau khi ngừng điều trị ở một nhóm bệnh nhân. Ngược lại, việc sử dụng NAs làm giảm mạnh HBV DNA và các biến chứng ở hầu hết các bệnh nhân. Tuy nhiên NAs sẽ không ảnh hưởng tới sự tổng hợp RNA tiền bộ gen (pgRNA) của HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính hay tổng hợp protein virus như HBsAg vì cccDNA không bị ảnh hưởng và vẫn giữ nguyên hoạt tính phiên mã. Hệ quả là, ngừng điều trị NAs thường dẫn tới bệnh tái phát và hầu hết các bệnh nhân cần điều trị cả đời. Không may là việc điều trị bằng thuốc NAs (như lamivudine) trong một khoảng thời gian dài có thể dẫn đến các đột biến kháng thuốc và một số nguy cơ nghiêm trọng khác liên quan tới gan. Chính vì vậy, việc đánh giá được nồng độ của cccDNA ở các bệnh nhân điều trị NAs là vô cùng quan trọng giúp xác định thời điểm và hiệu quả của các loại thuốc kháng virus. Tuy nhiên, việc đánh giá cccDNA lại yêu cầu phải sử dụng các mẫu mô sinh thiết, gây khó khăn trong quá trình đánh giá lâm sàng.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-TRIỆU THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Triệu Thị Nguyệt

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

HBV-RNA HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MẠN TÍNH

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu Y Dược Học Quân sự - HVQY

TS Mai Thị Đàm Linh – Đại học Khoa học Tự nhiên

Hà Nội – Năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS Hồ Hữu Thọ - Viện nghiên cứu YDược học quân sự - Học viện Quân Y, người thầy đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo vàhướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Mai Thị Đàm Linh- Trường Đại họcKhoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người thầy đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và anh chị trong Phòng Công nghệ gen và Ditruyền tế bào - Viện nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y vì cácthầy cô và anh chị đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài tại phòng.Tôi đặc biệt cảm ơn CN Vũ Nguyễn Quỳnh Anh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trongsuốt quá trình hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, các cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học cùngcác thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốcgia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình học tập

và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ vàtạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Hà Nội, 10 tháng 12 năm 2019 Học viên

Triệu Thị Nguyệt

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC HÌNH 9

DANH MỤC BẢNG 11

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về HBV 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại HBV 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái HBV 4

1.1.3 Cấu trúc hệ gen HBV 5

1.1.4 Các protein HBV 7

1.1.5 Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe 10

1.1.6 Chu trình nhân lên của HBV 12

1.1.7 Con đường lây nhiễm của virus HBV 14

1.2 Tổng quan về viêm gan B mạn tính 15

1.2.1 HBV và viêm gan B 15

1.2.2 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới 16

1.3 Tình hình nghiên cứu HBV 18

1.3.1 Trên thế giới 18

1.3.2 Trong nước 21

1.4 Tính mới và tính sáng tạo của đề tài 23

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu 26

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.2 Vật liệu, hóa chất 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 28

2.2.2 Thu thập, bảo quản mẫu 29

2.2.3 Tách chiết acid nucleic 29

2.2.4 Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương 29

2.2.5 Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 32

Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược: 33

Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược 35

Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 35

Tối ưu thời gian luân nhiệt 35

Tối ưu nồng độ mồi 37

Tối ưu nồng độ probe 37

Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR 37

2.2.6 Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 38

2.2.7 Phân tích, xử lý số liệu 39

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 40

3.1.1 Nghiên cứu thiết lập chứng dương pgRNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh 40

3.1.2 Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn

trước khi hoàn thiện 40

3.1.3 Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 41

3.1.4 Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA 43

3.2 Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 46

3.2.1 Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR 46

3.2.2 Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA polymerase, nồng độ mồi và probe Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm 53

3.2.3 Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA 55

3.3 Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR 56

3.3.1 Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét nghiệm Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 56

3.3.2 Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB 60

3.4 Đánh giá quy trình RT-qPCR trên mẫu bệnh nhân CHB 63

KẾT LUẬN 66

KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO………85

4 CV Coefficient of Variation - Hệ số biến thiên

5 ER Endoplasmic Reticulum – Mạng lưới nội chất

6 HBeAg Hepatitis B envelope Antigen – Kháng nguyên e

9 HBV Hepatis B Virus – Virus viêm gan B

10 HBsAg Hepatitis B surface Antigen – Kháng nguyên vỏ

của HBV

12 ORF Open Reading Frame – Khung đọc mở

14 RT-qPCR Reverse Transcription Realtime - quantitative

Polymerase Chain Reaction

15 rcDNA Relaxed circular DNA – DNA dạng vòng không

kín

16 SD Standard Deviation – Độ lệch chuẩn

18 UNG Uracil Deoxyribonucleic Acid Glycosylase

Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [47] 14

Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S 30

Hình 6: Kết quả phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe 42

Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR 43

Hình 8: Panel độ nhạy 44

Hình 9: Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy 45

Hình 10: Kết quả dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy 45

Hình 11: Kết quả bộ panel độ đặc hiệu 46

Hình 12: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 45℃ 47

Hình 13: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 50℃ 48

Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút 49

Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút 50

Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63 ℃ 51

Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57 ℃ 51

Hình 18: Kết quả ở thời gian gắn mồi 15 giây 52

Hình 19: Kết quả ở thời gian gắn mồi 30 giây 52

Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mồi 53

Hình 21: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,2 µM 54

Hình 22: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,1 µM 54

Hình 23: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn 58

Hình 24: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tuần 60

Hình 25: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau một tháng 61

Hình 26: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tháng 61

Hình 27: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau ba tháng 62

DANH MỤC BẢ

Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị 27

Y Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu 27

Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCR 31

Bảng 4: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR 31

Bảng 5: Thành phần phản ứng RT-qPCR 34

Bảng 6: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR với hai nhiệt độ khác nhau ở bước phiên mã ngược 34

Bảng 7: Thành phần tối ưu của một phản ứng RT-qPCR 55

Bảng 8: Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng RT-qPCR 55

Bảng 9: Kết quả đánh giá quy trình định lượng trên dải nồng độ 104 – 1,25 copy/phản ứng trong 10 lần chạy 56

Bảng 10: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn 58

Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua các chỉ số SD, CV, độ lệch phép đo (ME) 59

Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR 62

Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR 62

Bảng 13: Nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn tính

ở nhóm HBeAg dương tính và âm tính 63

MỞ ĐẦU

Nhiễm Hepatitis B virus (HBV) là một vấn đề y tế toàn cầu Mặc dù đã có sựphát triển các vaccine ngăn chặn bệnh hiệu quả cao từ những năm 1980 và việc bổsung chương trình tiêm chủng vaccine mở rộng tại hơn 168 quốc gia, bệnh gan donhiễm mạn tính HBV vẫn là gánh nặng khổng lồ đối với toàn xã hội Tính đến thờiđiểm hiện nay, trên thế giới, nhiễm HBV là nguyên nhân của 30% bệnh nhân xơgan và 53% trong số họ tiến triển thành HCC, với khoảng hơn 200,000 và 300,000người mang HBsAg chết mỗi năm tương ứng do xơ gan và ung thư gan

Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay được cấp phép là Peg-IFN 2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside(nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir,Tenofovir Peg-IFN vừa có tác dụng điều hòa miễn dịch vừa có tác dụng khángvirus trực tiếp, nhờ đó có thể duy trì sự ức chế HBV DNA sau khi ngừng điều trị ởmột nhóm bệnh nhân Ngược lại, việc sử dụng NAs làm giảm mạnh HBV DNA vàcác biến chứng ở hầu hết các bệnh nhân Tuy nhiên NAs sẽ không ảnh hưởng tới sựtổng hợp RNA tiền bộ gen (pgRNA) của HBV ở bệnh nhân viêm gan B mạn tínhhay tổng hợp protein virus như HBsAg vì cccDNA không bị ảnh hưởng và vẫn giữnguyên hoạt tính phiên mã Hệ quả là, ngừng điều trị NAs thường dẫn tới bệnh táiphát và hầu hết các bệnh nhân cần điều trị cả đời Không may là việc điều trị bằngthuốc NAs (như lamivudine) trong một khoảng thời gian dài có thể dẫn đến các độtbiến kháng thuốc và một số nguy cơ nghiêm trọng khác liên quan tới gan Chính vìvậy, việc đánh giá được nồng độ của cccDNA ở các bệnh nhân điều trị NAs là vôcùng quan trọng giúp xác định thời điểm và hiệu quả của các loại thuốc kháng virus.Tuy nhiên, việc đánh giá cccDNA lại yêu cầu phải sử dụng các mẫu mô sinh thiết,gây khó khăn trong quá trình đánh giá lâm sàng

α-Chức năng cơ bản của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất

cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợptạo ra các DNA của virion Do đó, nồng độ của cccDNA lại được phản ánh bởi

RNA Được phát hiện vào những năm 1996 trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễmviêm gan B, HBV pgRNA gần đây đã được báo cáo là một dấu ấn sinh học mới đầyhứa hẹn trong tiên lượng và đánh giá đáp ứng điều trị ở bệnh nhân CHB.

Việt Nam nằm trong khu vực có tỉ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng vàoloại cao nhất trên thế giới, nhiễm HBV mạn tính là một vấn đề y tế nặng nề tại nước

ta Sự cấp thiết trong việc tìm ra hay thiết lập các công cụ theo dõi, kiểm soát điềutrị cũng như quản lý sự lây nhiễm trong cộng đồng là rất rõ ràng trong bối cảnh phổbiến của nhiễm HBV mạn tính Hiện nay, chưa có một nghiên cứu nào trong nước

đề cập đến dấu ấn tiềm năng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân CHB Chính vì

vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu: Xây dựng và tối ưu quy trình

RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao trên đối tượng là các bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng các đồng đẳng nucleoside ở Việt Nam.

Chương 1 - TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về HBV

1.1.1 Đặc điểm phân loại HBV

Hepatitis B virus (HBV) là một thành viên của họ Hepadnaviridae Sở dĩ họ

virus này có tên như vậy là bởi vì những virus này là nguyên nhân gây ra các bệnh

về viêm gan (hepatitis) và genome là DNA Một số virus thuộc họ này có khả nănglây nhiễm ở các động vật có vú và chim; ví dụ bao gồm woodchuck HBV và heronHBV HBV được biết đến nhiều nhất là virus có khả năng lây nhiễm ở người, và làmột trong những nguyên nhân gây bệnh gan ở người [46]

Các virus thuộc họ Hepadnaviridae đều có những đặc điểm chung như sau [121]:

- Hệ gen là DNA sợi đôi không hoàn chỉnh bao gồm 2 sợi: sợi âm đầy

đủ và sợi dương không đầy đủ

- Enzyme DNA polymerase

- Nhân lên thông qua mạch khuôn là pre-genomic RNA (pgRNA)

- Có mức độ đặc trưng về mô và loài cao

Việc nghiên cứu về các HBV từ lâu đã được quan tâm vì hai lý do Thứ nhất,các virus này có bộ gen rất nhỏ, tuy nhiên chúng vẫn có khả năng mã hóa cácprotein của virus và kiểm soát sự biểu hiện gen của virus Thứ hai, bộ gen DNA củacác virus được nhân lên thông qua trung gian RNA Nói cách khác, sự nhân lên củavirus bao gồm quá trình phiên mã ngược, vì vậy các virus thuộc nhóm này khácbiệt rất lớn với các virus có bộ gen là DNA có khả năng nhân lên một cách trực tiếp.DNA của virus được nhân lên thông qua trung gian RNA còn được tìm thấy ở cácloài thực vật Những virus này, cùng với HBV còn được gọi là Pararetrovirus [46]

Các nghiên cứu về giải trình tự nucleotide của HBV được phân lập ở ngườitrên khắp thế giới đã được thiết lập, 8 tuýp của virus HBV đã được xác định (A-H)dựa trên sự khác biệt về trình tự lớn hơn 8% và không vượt quá 17% [61, 102] Các

tuýp này có sự phân bố khác nhau, như tuýp A và D thường xuất hiện ở Châu Phi,Châu Âu và Ấn Độ; tuýp B và C thường phân bố ở Châu Á; tuýp E được tìm thấy ởTây Phi, và tuýp F xuất hiện ở cả Trung và Nam Mỹ Sự phân bố của tuýp G vàtuýp H vẫn chưa rõ ràng, nhưng đã có những báo cáo cho rằng hai tuýp này đã xuấthiện ở Trung Mĩ và Nam Âu [54] Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng

có sự xuất hiện của các tuýp virus mới, như tuýp I là tuýp có độ tương đồng lớn vớituýp C là tuýp được phát hiện ở một số nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào vàĐông Ấn [106]; và tuýp J được phát hiện ở một người Nhật Bản sống ở Borneo, làdạng tái tổ hợp giữa tuýp C và HBV ở vượn [102] Các tuýp A, B, C, D, F, I có thểđược phân ra thành các nhóm nhỏ hơn dựa trên sự khác biệt khoảng 4% nucleotide

Có 44 nhóm các tuýp phụ: A1–6, B1–9, C1–16, D1–7, F1–4 và I1–2 [54, 84] Thêmvào đó, còn có một số dạng tái tổ hợp của các tuýp như đã kể trên, nhưng phần lớn

là các dạng tái tổ hợp B/C và C/D, trong khi các tái tổ hợp giữa các tuýp khác xảy ra

ít hơn các trường hợp kể trên [8]

1.1.2 Đặc điểm hình thái HBV

Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khácnhau (Hình 1): tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm, tiểu thểhình ống (tubµLar particle) kích thước 22nm có chiều dài 40 - 400nm và tiểu thểhình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Tiểu thể hình cầu nhỏ vàhình ống là thành phần vỏ của HBV mà trong quá trình nhân lên tổng hợp dư thừa.Đây chính là kháng nguyên bề mặt (HBsAg) Các tiểu thể này có thể đứng riêng rẽhay đứng hợp với nhau thành từng đám, chúng không có khả năng lây truyền bệnh[48] Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Đây chính làhạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp:

- Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein Lớp này có các khángnguyên bề mặt (HBsAg) [28]

- Lớp lõi: Capsid đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõi HBcAg.Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòng không kín,enzyme phiên mã ngược polymerase và protein kinase [28, 34].

Hình 1: Ba loại tiểu thể của virus HBV [100].

(A) Tiểu thể hình cầu lớn (tiểu thể Dane); (B) Tiểu thể hình cầu nhỏ; (C)

Tiểu thể hình ống

1.1.3 Cấu trúc hệ gen HBV

Cấu trúc nucleocapsid HBV chứa bộ gen với chiều dài khoảng 3,2 kilobase(kb) và là phân tử DNA sợi đôi không hoàn chỉnh dạng vòng không kín hoàn toàn(relaxed circular DNA - rcDNA) [11, 17] Nucleocapsid là một cấu trúc nhị thậpdiện đều được hình thành bởi 240 phân tử protein capsid của virus với đường kínhkhoảng 27 nm, và mỗi một nucleocapsid chứa một bản sao DNA của virus vàenzyme polymerase liên kết cộng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm [17, 58] Một vài

protein của tế bào bao gồm protein kinase cũng được đóng gói vào trong cấu trúcnucleocapsid [17] Một trong những đặc điểm độc đáo của hệ gen HBV đó chính làcấu trúc bất đối xứng giữa hai sợi Sợi âm được tổng hợp đầy đủ và có chiều dàibằng kích thước hệ gen, còn sợi dương bổ sung với sợi âm lại có sự khác biệt vềchiều dài, chiều dài của sợi dương cho đến nay vẫn chưa được nghiên cứu chínhxác, thay đổi theo từng tuýp, từng dòng [30] Ngoài ra, cả sợi âm và sợi dương đều

có chung một điểm đặc biệt đó là cả 2 sợi đều là DNA dạng thẳng nhưng nhờ sự bổsung giữa 2 sợi mà hình thành cấu trúc vòng rcDNA

Hệ gen của virus có chứa các khung đọc mở (open reading frame - ORF) xếpchồng lên nhau kí hiệu là S, C, P và X mã hóa cho bốn protein khác nhau [58] Cấutrúc xếp chồng lên nhau của các vùng mã hóa khiến cho virus có thể sử dụng hệ genvới hiệu suất 150% (Hình 2) [124]

- Gen PreS1/PreS2 và S (mã hóa cho 3 protein vỏ L-, M- và S)

- Gen precore/core (mã hóa cho protein nucleocapsid; HBcAg và các protein

không cấu trúc; HBeAg)

- Gen polymerase (enzyme reverse transcriptase, RNase H)

- Gen X (mã hóa cho protein điều hòa X)

Các gen S và C nằm ở các ORF riêng có các bộ ba mã mở đầu khác nhau,tổng hợp các sản phẩm gen có chức năng khác nhau [30, 58] Các ORF S và C lầnlượt kéo dài đến preS1 (preS1 và preS2) và vùng preC ở đầu 5’ Ở các vùng ORFxếp chồng lên nhau có sự xuất hiện của các gen điều hòa là 4 vùng khởi động (preC/

C, preS1/S và X) và 2 trình tự tăng cường, các gen này cho phép sự biểu hiện của 7protein khác nhau được phiên mã từ các bộ ba mã mở đầu khác nhau bởi ít nhất 5mRNA khác nhau với đuôi tự do Sản phẩm phiên mã đầu tiên có chiều dài 0,7 kb

mã hóa cho protein HBx; các sản phẩm phiên mã có chiều dài 2,1 kb và 2,4 kb lầnlượt mã hóa cho M- và S-HBsAg, L-HBsAg [30] Sản phẩm phiên mã mã hóa cho

cả protein core và polymerase là pregenomic RNA (pgRNA) Pregenomic RNA làmạch khuôn cho quá trình tổng hợp virus HBV và được phiên mã ngược để hình

thành nên hệ gen DNA của HBV Như chúng ta đã biết, hệ gen của virus có chiềudài 3,2 kb, và chiều dài của pgRNA là 3,5 kb, tức là dài hơn hệ gen của virus, đóchính là bản sao “dự phòng” của hệ gen virus [75, 95] Hai vùng gen với 11 nu lặplại được gọi là DR1 và DR2 nằm ở đầu 5’ ở cả sợi âm và sợi dương và hai gen này

có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của DNA virus [33, 58] Hai trình tựtăng cường (enhancer) kí hiệu là Enh1 và Enh2, giúp tăng biểu hiện của các sảnphẩm gen virus đặc hiệu với tế bào gan [58]

Vùng ORF S mã hóa cho các protein bề mặt của virus, HBsAg có cấu trúcđược phân chia và phân hóa tại các vùng preS1, preS1 và S với 3 bộ ba mã mở đầuAUG khác nhau [92] Trong khi L HBsAg có vai trò chính trong liên kết với các thụthể được dịch mã từ mRNA preS1 có chứa các domain preS1, preS2 và S; protein

M và S HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA S [30, 33, 107]

Hình 2: Cấu trúc hệ gen HBV

1.1.4 Các protein HBV

Hệ gen HBV mã hóa cho 7 protein: HBx, core, polymerase, L-, M- và HBsAg Trong số các protein này, HBx là protein điều hòa không tham gia vào hìnhthành cấu trúc của virus, HBeAg không tham gia vào cấu trúc của virion và proteinnày được giải phóng một cách riêng biệt khỏi tế bào, polymerase chịu trách nhiệmcho quá trình nhân lên của cả hệ gen, và protein core và HBsAg có chức năng hình

S-thành cấu trúc của virion Chức năng của từng protein của virus HBV sẽ được nhắcđến chi tiết hơn ở phần dưới đây

từ các tế bào nhiễm HBV [113]

Kháng nguyên bề mặt

HBsAg là protein vỏ của virion HBV Như sự tồn tại của HBsAg ở cácvirion trưởng thành, người lành mang HBV có chứa một lượng dư các tiểu thể hìnhcầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAg không có khả năng gây nhiễm cũng tồn tạitrong huyết thanh của họ Những tiểu thể này được tiết ra nhiều hơn (100 -100,000lần) khi so với số lượng các virus trưởng thành được tiết ra [107] Có một số báocáo đã chỉ ra rằng lý do các tiểu thể hình cầu nhỏ và các tiểu thể hình ống HBsAgđược tổng hợp với số lượng gấp hàng nghìn lần so với tiểu thể Dane có thể là cáibẫy dành cho hệ miễn dịch, từ đó, sự nhiễm mạn tính có thể được hình thành [30,35] HBsAg không chỉ được tạo ra bởi quá trình dịch mã của mRNA mà còn từ cácDNA tích hợp với bộ gen của người Điều kiện này có thể giúp chúng ta biết đượctrạng thái nhiễm của bệnh nhân một cách toàn diện hơn [107]

Chức năng chính của các kháng nguyên bề mặt đó là hình thành nên lớp vỏcủa virus Ba dạng khác nhau của hạt virus được giải phóng từ tế bào nhiễm HBV làkết quả của quá trình biểu hiện không đồng đều của ba kháng nguyên bề mặt này S-HBsAg là protein có mức biểu hiện cao nhất trong các kháng nguyên bề mặt củavirus HBV và protein này chính là thành phần chính cấu thành nên vỏ virus [25]

Protein lõi (protein core)

Protein core (protein lõi) (21 kD) hay còn gọi là HBcAg, là protein có vai tròđịnh hình cho virion Khi được biểu hiện trong tế bào, protein này thường tồn tại ởdạng nhị hợp, hoặc ở dạng capsid nhị thập diện đều T = 3 hoặc T = 4 Khoảng 95%các nucleocapsid được phân lập từ tiểu thể Dane có chứa capsid T = 4 tạo nênkhoảng 120 lõi nhị hợp, với 5% còn lại là các capsid T = 3 với 90 nhị hợp

Protein lõi được dịch mã từ pgRNA và 149 axit amin đầu tiên hình thành nên

vùng lắp ráp, có chức năng cho sự hình thành in vitro của capsid, capsid này sẽ có

sự khác biệt với capsid được phân lập từ tiểu thể Dane [16] Khoảng 34 - 36 axitamin còn lại sẽ tạo nên vùng C-terminal giàu Arginine (CTD); quá trình phosphorylhóa của một số axit amin trong vùng CTD có chức năng điều hòa một số giai đoạntrong chu trình sống của virus [57, 65, 73, 81]

Polymerase/Reverse transcriptase (RTase)

Không lâu sau khi xác định được dạng virus giống HBV ở vịt [69], mô hìnhDHBV đã được sử dụng để xác định bộ gen của DHBV có trải qua trung gian RNA,cho thấy HBV nhân đôi thông qua quá trình phiên mã ngược (RT) [99] Trong khiquá trình phiên mã ngược là một cơ chế đã được nhiều virus sử dụng, HBV trải quaquá trình sao chép bộ gen với nhiều đặc điểm độc đáo Protein polymerase (reversetranscriptase/RTase/Pol/P) là protein 90kD và có khoảng 838 axit amin được tạothành từ 3 vùng chức năng và một vùng đệm thay đổi Ở vùng N-terminal là vùng

TP (terminal protein), là vùng có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trìnhsao chép bộ gen virus Mặc dù vùng này có vai trò quan trọng giúp polymerase bámvào pgRNA, đóng gói RNA, liên kết các protein [9, 119, 129], vùng TP là mộtdomain độc đáo không có ở các virus RT không thuộc nhóm HBV Một vùng đệmthay đổi có khả năng phân chia TP domain từ RT domain, và đã có một số nghiêncứu cho thấy gần như tất cả axit amin thuộc vùng đệm này có thể bị đột biến màkhông làm thay đổi chức năng của P [86] Thực tế là, chỉ có 3 phân tử cysteine nằmtrong vùng C-terminal của vùng đệm, cùng với một phần tư của đầu N-terminal của

RT domain là quan trọng đối với chức năng của enzyme RTase/polymerase [53].

RT domain có vai trò trong quá trình nhân lên của bộ gen virus bằng cách phiên mãngược pgRNA để hình thành sợi âm trong DNA của bộ gen virus và sau đó sợi âmnày được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp sợi dương của DNA Domainnày có độ tương đồng cao đối với các loại retrovirus khác [122] Hiện nay domain

RT là liệu pháp đích duy nhất chống lại HBV [91], dựa trên hiệu quả của các loạithuốc NAs có khả năng ức chế khả năng của enzyme RTase của virus HIV Thực tế

là, các thành phần trong HBV RTase có thể được thay thế bằng các thành phầnđồng hợp của HIV RTase [116]

Domain cuối cùng, P, là domain của enzyme RNase H Domain này chịutrách nhiệm cho việc cắt bỏ mạch khuôn pgRNA trong suốt quá trình tổng hợp sợi

âm của hệ gen DNA Sự định hướng của các liên kết ion kim loại là rất quan trọngđối với hoạt tính của RNase H, đạt được qua 4 carboxylate được bảo toàn [103].Một vài nghiên cứu về domain RNase H cho thấy vai trò quan trọng của domainnày trong việc đóng gói pgRNA [10]

Protein X

HBx là protein có chức năng điều hòa duy nhất được mã hóa bởi HBV.Protein này gồm có 154 axit amin, 17 kD và được mã hóa bởi ORF nhỏ nhất củaHBV Đã có rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy những bằng chứng xác thực về vai tròcần thiết của HBx trong suốt quá trình nhân lên của HBV Đặc biệt, có một vàinghiên cứu đã chỉ ra rằng HBx liên kết với cccDNA [13], và HBx là yếu tố cần choquá trình phiên mã từ cccDNA [94] Ngoài ra còn một số nghiên cứu về các HBV ởđộng vật có vú cho thấy vai trò của các protein X đối với quá trình nhân lên của bộgen virus [128] Những thử nghiệm về việc ức chế HBx đều cho thấy sự suy giảm

về mức độ nhân lên của virus HBV đã cho chúng ta thấy một điều rằng có thể HBxkhông thật sự cần thiết cho quá trình nhân lên của virus nhưng không thể nghi ngờ

gì về khả năng tăng cường mức độ nhân lên của virus [108] Quan trọng là, sự cần

thiết của HBx đã được chứng minh trong các tế bào gan của người trực tiếp nhiễmHBV kiểu dại hoặc HBV có gen HBx bị bất hoạt [64]

1.1.5 Lựa chọn vùng gen cho thiết kế mồi, probe

a) Lựa chọn vùng trình tự ổn định, đặc hiệu cho HBV pgRNA làm đích thiết mồi/probe.

HBV là virus rất được quan tâm từ nhiều thập kỷ trước, tuy nhiên cho đếnnay HBV vẫn còn là một bí ẩn do hệ gen của HBV chứa nhiều biến dị di truyền vàđột biến ngẫu nhiên Do đó, bước quan trọng trước khi lựa chọn vùng trình tựpgRNA để thiết kế mồi, probe là phân tích tính đa dạng di truyền, các đột biến trong

hệ gen HBV để từ đó xác định được vùng gen ổn định, đặc hiệu nhất

Đa dạng di truyền của virus viêm gan B:

Như các virus khác, biến dị di truyền và sự tiến hóa của hệ gen là những yếu

tố quan trọng trong chu trình sống của virus HBV Tuy nhiên, khác với những virus

có hệ gen là DNA khác, HBV có những đặc tính riêng biệt làm chúng trở nên khácbiệt với các virus đó Đáng chú ý là enzyme polymerase của HBV thiếu đi chứcnăng đọc sửa, và virus này có một bước trung gian qua RNA (pgRNA) trong chutrình nhân lên của chúng Hai đặc điểm này làm tăng khả năng xảy ra những sai sốngẫu nhiên trong suốt quá trình nhân lên của hệ gen virus, dẫn đến sự biến đổi của

hệ gen [19, 51, 52] Nói chung, tỉ lệ đột biến thay thế nucleotide của HBV ước tínhvào khoảng 1,4 – 5,0 × 10−5 trên từng vị trí mỗi năm, gấp gần 10 lần so với nhữngvirus có bản chất hệ gen là DNA và RNA [76] Mặt khác, nhờ vào cấu trúc xếpchồng phức tạp của các khung đọc mở (open reading frame - ORFs) trong hệ gencủa HBV, thuận lợi cho việc phát sinh các biến dị [74, 77]

Đột biến ngẫu nhiên:

Đột biến điểm ngẫu nhiên có thể xuất hiện ở những cá thể tùy thuộc vào áplực chọn lọc khác nhau, như đã đề cập đến ở trên, hoặc xuất hiện trong quá trìnhnhân lên của hệ gen, phân cắt hoặc nối hệ gen virus hoặc quá trình ghép nối và sửachữa của pgRNA [29, 98, 112] Các đột biến ở những vùng khác nhau trên hệ gen

xuất hiện xuyên suốt các pha đặc hiệu trong quá trình lây nhiễm, ví dụ như đột biếnxảy ra ở vùng precore (đột biến PC), ở vùng lõi nền vùng khởi động (đột biến BCP),thêm hoặc mất ở gen C, preS1 hoặc preS2, thay thế yếu tố quyết định kháng nguyên

‘a’ của HBsAg, đột biến kháng thuốc lamivudine hay các loại thuốc kháng virus

khác xảy ra ở protein Pol và đã được nghiên cứu xuyên suốt Những loại đột biếnnày giúp cho virus có thể sống dai dẳng trong các tế bào gan và có khả năng trốnthoát khỏi hệ thống miễn dịch và áp lực của điều trị Dù sao, dựa trên lý thuyết làchủng dại (wild type) sẽ không bị thay thế dù trải qua hàng trăm năm của quá trìnhtiến hóa, cho đến khi chúng vẫn là những kiểu gen không gây hại, ít nhất là ở nhữnggiai đoạn đầu của pha dung nạp miễn dịch, trong khi chúng được thay thế sau đóbởi các biến dị ở các giai đoạn sau của quá trình lây nhiễm [37]

Mặc dù hệ gen của HBV tồn tại nhiều biến dị, đột biến ngẫu nhiên song vẫntồn tại một số vùng bảo thủ cho thiết kế mồi, probe Các vùng bảo thủ trong cácvùng gen của HBV đã được khảo sát từ nhiều nghiên cứu trước Karinova và cộng

sự [50] đã tìm ra hai vùng được bảo thủ trong vùng gen S và X Hai vùng gen này

có liên quan đến sự sao chép của HBV và lây nhiễm tế bào gan Đặc biệt, vùng gen

X có liên quan mật thiết với HCC Trong nghiên cứu này, vùng gen S được lựachọn là vùng có tỉnh ổn định và đặc hiệu cho HBV, vùng đích thiết kế mồi, probecho phản ứng RT-qPCR

b) Đánh giá sơ bộ tính đa hình, đột biến của vùng gen dự định thiết kế mồi/probe của HBV trên người Việt Nam.

Vùng gen S được đánh giá là vùng trình tự pgRNA ổn định, đặc hiệu Tuynhiên, không phải tất cả vùng S đều ổn định Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sátvùng trình tự ổn định nhất thuộc gen S trên đối tượng người Việt Nam Các nghiêncứu trên thế giới cho thấy vùng trình tự đầu N-terminal là vùng bảo thủ nhất của gen

S Ngoài ra, vùng này cần thiết cho sự lắp ráp và bài tiết các hạt virus, tương tác vớikháng nguyên bề mặt [85] Do đó, vùng đầu N-terminal của gen S được lựa chọnlàm vùng gen đích cho thiết kế mồi, probe trong phản ứng RT-qPCR định lượngHBV RNA

1.1.6 Chu trình nhân lên của HBV

HBV là một tác nhân truyền nhiễm chủ yếu qua đường máu và dịch cơ thể.Qua tương tác với thụ thể vận chuyển nhân tế bào và protein nhận, lõi capsid vàrelaxed circular HBV DNA (rcDNA) (hệ gen virus) được chuyển vào tế bào gan[47] Tuy nhiên, trước đó rcDNA được cải biến để chuyển thành dạng cccDNA(DNA dạng vòng mạch kép) Cơ chế chuyển đổi như sau: Đầu tiên, rcDNA đượcgắn với polymerase để khởi động quá trình Sau đó, loại RNA primer ở đầu 5’ sợidương, loại trình tự thừa r và protein P ở đầu 5’ sợi âm Bước tiếp theo là hoàn thiệnsợi dương không hoàn chỉnh Cuối cùng, lai sợi âm và sợi dương với nhau hìnhthành cccDNA, cccDNA được chuyển vào trong tế bào gan [31]

Qua sự hình thành cccDNA trong lây nhiễm tế bào gan, sự nhân lên của virustrong tế bào gan như sau: cccDNA là khuôn phiên mã ra 5 loại RNA của virus cầnthiết choc ho việc tạo các kháng thể và quá trình nhân lên của virus Sau đó, quátrình diễn ra trong bào tương phiên mã ngược pgRNA trong các nucleocapsid mớihình thành RcDNA có chứa nucleocapsid tiếp theo được bao gói trong hạt virus vàđược tiết ra dòng máu [115]

Hoạt tính phiên mã của cccDNA có thể được xác định qua đo tải lượngpgRNA trong tế bào gan Để tránh sinh thiết gan, các marker tự do trong huyếttương được sử dụng để đánh giá hoạt tính phiên mã của cccDNA trong dự báo đápứng điều trị CHB Thêm vào đó, HBV RNA được xác định có mặt trong máu ngoại

vi bệnh nhân CHB và quan trọng nhất là pgRNA được bao gói trong hạt virus.PgRNA huyết tương phản ánh lượng pgRNA trong tế bào gan, vì vậy pgRNA tronghuyết tương gián tiếp phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA trong tế bào gan[7]

Hình 3: Chu trình nhân lên của virus HBV [49].

Hình 4: Mô hình nhân lên của hệ gen virus [49].

1.1.7 Con đường lây nhiễm của virus HBV

Theo WHO, HBV có thể tồn tại bên ngoài cơ thể ít nhất 7 ngày Trongkhoảng thời gian đó, virus vẫn có khả năng lây nhiễm nếu như virus có thể xâmnhập vào cơ thể của một người không được bảo vệ bởi vaccine Quá trình ủ bệnhcủa virus HBV trung bình khoảng 75 ngày, nhưng có thể nằm trong khoảng từ 30

đến 180 ngày Virus có thể được phát hiện trong khoảng từ 30 đến 60 ngày sau khi

bị nhiễm virus và có thể kéo dài dai dẳng và phát triển thành viêm gan B mạn tính

Ở các vùng có mật độ lây nhiễm cao, HBV thường có xu hướng lây truyền từ

mẹ sang con trong khoảng thời gian mang thai, hoặc qua truyền thẳng (lây nhiễmqua máu người mang virus), đặc biệt là từ trẻ nhiễm virus sang trẻ không nhiễmtrong khoảng 5 năm đầu Sự phát triển của viêm gan B mạn ở trẻ sơ sinh thường là

do người mẹ truyền sang trong khoảng thời gian mang thai hoặc trong 5 năm đầuđời

HBV còn lan truyền qua da hoặc niêm mạc với máu của người bị nhiễm bệnh

và một số dịch cơ thể, ví dụ như nước bọt, kinh nguyệt, dịch âm đạo và tinh dịch.Lây truyền qua đường tình dục cũng có thể xảy ra, đặc biệt là người nam chưa tiêmvaccine có quan hệ tình dục với nhiều người người đồng giới và khác giới NhiễmHBV ở người trưởng thành có ít hơn 5% là dẫn đến hình thành tình trạng viêm ganmãn tính Sự lây truyền của virus còn có thể xảy ra qua việc sử dụng lại kim và ốngtiêm ở các trung tâm chăm sóc sức khỏe Thêm vào đó, sự lây nhiễm có thể xảy ratrong quá trình phẫu thuật, chăm sóc sức khỏe hay nha khoa, thông qua xăm hìnhhoặc qua sử dụng dao cạo hoặc những vật dụng tương tự có nhiễm với máu củangười mang virus

1.2 Tổng quan về viêm gan B mạn tính

 Nồng độ ALT/AST tăng cao liên tục và kéo dài

 Sinh thiết gan cho thấy mức độ viêm gan vừa hoặc nặng

Viêm gan B mạn tính là hiện tượng viêm hoại tử gan do nhiễm HBV kéo dàitrên 6 tháng Viêm gan B mạn tính chia thành 2 thể là HBeAg dương tính vàHBeAg âm tính Viêm gan B mạn tính nếu không được điều trị có thể tiến triểnthành xơ gan hay HCC [63]

Các triệu chứng lâm sàng thường không nhiều và đôi khi khá mờ nhạt, gồmmệt mỏi, đau hạ sườn phải, vàng da và ngứa khi có tắc mật Khám lâm sàng thấygan to mức độ vừa, đôi khi đau, có thể thấy lách to

1.2.2 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Nhiễm HBV là một vấn đề sức khỏe mang tính toàn cầu, ước tính khoảng

248 triệu người mang virus này trên toàn thế giới, trong đó tỉ lệ tử vong có thể lênđến 600,000 người/năm do các bệnh lý liên quan đến HBV [70, 78] Mặc dù đã có

sự phát triển của các vaccine ngăn chặn bệnh với hiệu quả cao từ những năm 1980

và việc bổ sung chương trình tiêm chủng vaccine mở rộng tại hơn 168 quốc gia,bệnh gan do nhiễm mạn tính HBV vẫn là gánh nặng khổng lồ đối với toàn xã hội

Hepatitis B virus (HBV) là virus thuộc họ Hepadnviridae và có đặc tính

phiên mã ngược từ RNA giống như các retrovirus Virus viêm gan B (HBV) lànguyên nhân gây ra nhiễm thoáng qua và mạn tính ở gan Nhiễm thoáng qua có thểgây nên một số bệnh lý nghiêm trọng, khoảng 0,5% người nhiễm thoáng qua có khảnăng tử vong, viêm gan cấp tính Nhiễm viêm gan B mạn tính có thể có những hậuquả nghiêm trọng như: khoảng 25% bệnh nhân nhiễm viêm gan B mạn tính có thểtiến tới ung thư gan [12] Số bệnh nhân tử vong do ung thư gan liên quan đến HBVtrên toàn thế giới có thể lên đến một triệu người mỗi năm [79]

Hiện nay trên thế giới ước tính có khoảng hai tỷ người đã từng nhiễm HBV,trong đó có 248 triệu người nhiễm viêm gan B mạn tính (dương tính với khángnguyên bề mặt HBsAg) [78, 93] Tỷ lệ dương tính với HBsAg theo báo cáo là 3,6%,tuy nhiên tỷ lệ này có thể thay đổi tùy thuộc vào từng khu vực địa lý khác nhau Tỷ

lệ của viêm gan B mạn tính thấp hơn 2% ở các khu vực như Mỹ, Canada và TâyÂu; các nước có tỷ lệ trung bình (2-7%) như các nước ở Địa Trung Hải, Nhật Bản,

Trung Á, Trung Đông và một vài nước Nam Mĩ; và các nước có tỷ lệ cao (trên 8%)

là các nước ở Tây Phi, Nam Sudan [78, 93, 125]

Sự khác biệt dẫn đến tỷ lệ nhiễm viêm gan B mạn tính khác nhau ở từng khuvực trên thế giới phần lớn liên quan đến độ tuổi có mối liên quan nghịch với nguy

cơ tiến triển thành mạn tính Tỷ lệ tiến triển từ nhiễm HBV cấp tính sang mạn tính

là khoảng 90% đối với trường hợp nhiễm khi còn trong thai kỳ của người mẹ [97],khoảng từ 20 - 50% cho trẻ em từ 1 đến 5 tuổi [101, 117] và nhỏ hơn 5% ở giaiđoạn trưởng thành [101]

1.2.3 Tình hình nhiễm HBV tại Việt Nam

Ở Việt Nam có rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV nước tađứng hàng cao nhất thế giới Tần suất HBsAg dương tính ở người lớn từ 15 đến21% thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu ngườimang HBV mạn tính [2] Tỷ lệ mang anti-HBs trên 60%, tuy vậy tỷ lệ nhiễm HBV

ở từng nhóm đối tượng, từng vùng theo từng tác giả cũng khác nhau

HBV là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh liên quan đến gan và nó cóthể dẫn đến viêm gan cấp tính và mạn tính [92] HBV có thể gây ra các biến chứngmuộn như viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan; do đó nó vẫn

là một vấn đề sức khỏe mang tính toàn cầu [127]

Hiện nay, interferon-α (IFN) thông thường, interferon-α duy trì (Peg-IFN) vàcác thuốc kháng virus đồng đẳng nucleot(s)ide (NAs - nucleos(t)ide analogs) là cácloại thuốc được chấp nhận cho điều trị viêm gan B mạn tính (CHB) Trong khi IFN

có khả năng kháng virus, chống sự tăng sinh của virus và hiệu ứng miễn dịch thì cácloại thuốc kháng virus đồng đẳng nucleoside (như lamivudine, entecavir,telbivudine) và các loại thuốc kháng virus đồng đẳng nucleotide (như adefovir,tenofovir) lại có khả năng ức chế hoạt tính của DNA polymerase của virus HBV vàkhiến cho quá trình phiên mã ngược từ RNA sang DNA bị dừng lại [109] Mặc dù,các loại thuốc kháng virus đồng đẳng như vậy ức chế sự nhân lên của HBV, giảmquá trình gây viêm gan và liên quan đến sự thuyên giảm bệnh gan, không có loại

thuốc đang được sử dụng hiện nay có khả năng chữa khỏi nhiễm HBV do các loạithuốc đó đều hiếm khi có thể loại bỏ virus hoàn toàn [15, 109] Việc tìm ra phân tửđích hiệu quả của các loại thuốc kháng HBV mới hiện nay là vô cùng cần thiết để

có thể chữa trị khỏi cho bệnh nhân nhiễm HBV Các phân tử đích đó có thể là cácphân tử nằm trong quá trình nhiễm và nhân lên của virus HBV [118] Vì vậy, việchiểu về bản chất sinh học của virus HBV cũng như chu trình sống của virus này làrất cần thiết cho việc xác định những phân tử đích của các loại thuốc kháng virus vàphát triển các loại thuốc kháng virus mới có khả năng chữa trị khỏi và loại bỏ hoàntoàn virus HBV

Anti-HBs: là kháng thể sinh ra do đáp ứng với kháng nguyên bề mặt của

HBV Anti-HBs là dấu ấn phản ánh tình trạng đã khỏi bệnh hoặc đã miễn nhiễm.Anti-HBs xuất hiện khoảng 3 tháng sau khi bệnh khởi phát và thường khoảng 1-10tuần sau khi HBsAg âm tính

 HBcAg: là kháng nguyên cấu trúc của phần nucleocapsid (kháng nguyên lõi),

thường phát hiện trong nhân tế bào gan nhiễm HBV và không bao giờ xuất hiệntrong máu

 Anti-HBc: là dấu ấn rất quan trọng để khẳng định bệnh nhân đã từng nhiễm

HBV, anti-HBc không được tạo ra trong tiêm chủng Đồng thời các lớp kháng thểcủa anti-HBc còn có ý nghĩa trong chẩn đoán giai đoạn cấp hay mạn tính của nhiễmHBV Trong giai đoạn viêm gan B cấp tính, anti-HBc IgM dương tính ở nồng độ

cao, sau đó sẽ giảm dần và biến mất trong giai đoạn mạn tính, lúc này chỉ còn HBc IgG dương tính Tuy nhiên anti-HBc IgM (+) trong các đợt kịch phát cấp tínhcủa viêm gan B mạn tính.

anti- HBeAg: có cùng nguồn gốc gen với HBcAg, HBeAg được tổng hợp vượt trội

trong giai đoạn nhân lên của virus, vì vậy kháng nguyên này có ý nghĩa trong đánhgiá tình trạng tiến triển hay tiềm tàng của HBV trong cơ thể người bệnh và khảnăng lây nhiễm (vợ/chồng, con)

 Anti-HBe: sự chuyển đảo huyết thanh xảy ra khi anti-HBe từ âm tính chuyển

sang dương tính và HBeAg từ dương tính chuyển sang âm tính Hiện tượng nàyphản ánh sự nhân lên của HBV giảm dần hoặc chấm dứt

HBV DNA: dương tính trong các giai đoạn virus đang hoạt động và nhân lên

mạnh ở tế bào ký chủ Trong thực hành điều trị lâm sàng viêm gan B mạn tính, chỉ

số nồng độ HBV DNA có ý nghĩa quan trọng, là một trong các chỉ số quyết địnhliên quan đến quyết định điều trị, phác đồ điều trị cũng như tiên lượng sau điều trị

b) Các xét nghiệm định lượng hiện nay về dấu ấn virus học

 Định lượng HBV DNA

Phần lớn các xét nghiệm định lượng HBV DNA được sử dụng trên lâm sàngđều dựa trên nguyên lý khuếch đại chuỗi phản ứng polymerase (PCR) với ngưỡngphát hiện 50 – 200 IU/ml (250-1000 copy/ml) [80], và dải đo lên tới 4-5 log10

IU/mL Gần đây, công nghệ PCR xét nghiệm HBV DNA với độ nhạy cải thiện

(5-10 IU/mL), cho phép mở rộng dải đo lên tới 8-9 log10 IU/mL [120] Tải lượng HBVDNA là một dấu ấn chủ yếu để đánh giá bệnh nhân viêm gan B mạn tính và làm cơ

sở để đưa ra biện pháp điều trị chống virus hiệu quả

Một khó khăn trong việc sử dụng nồng độ HBV DNA trong huyết tương đểđánh giá là tìm ra giới hạn có ý nghĩa được sử dụng để xác định các chỉ định điều trị

và sự đáp ứng Do HBV DNA tồn tại trong cả huyết thanh của những người đã khỏisau khi nhiễm HBV cấp tính [88], nồng độ HBV DNA thấp có thể không liên quan

đến sự tiến triển của bệnh gan và sự loại bỏ hoàn toàn virus là một một mục tiêuđiều trị không thực tế Một giá trị chuẩn 20,000 IU/mL (105 copy/mL) được lựachọn như một tiêu chuẩn chẩn đoán viêm gan B mạn tính tại hội nghị NIH 2000[62] Tuy nhiên, viêm gan B mạn tính, xơ gan và HCC đã gặp ở những bệnh nhân

có nồng độ HBV DNA dao động nhiều từ không xác định được cho đến nồng độ >2,000,000 IU/mL [26]

 Định lượng HBeAg và HBsAg

Ngoài nồng độ HBV DNA, một số khảo sát lâm sàng đã cung cấp bằngchứng cho thấy mối quan hệ giữa các kháng nguyên khác với virus, ví dụ như khángnguyên e (HBeAg) và kháng nguyên bề mặt (HBsAg) với quá trình tiến triển tựnhiên của bệnh cũng như bệnh nhân đáp ứng với điều trị kháng virus [14, 40, 89,121] Theo đó, sự phát triển của những xét nghiệm định lượng các kháng nguyênquan trọng của virus bao gồm cả HBeAg và HBsAg đã trở thành một trọng tâm củagiai đoạn tiếp theo trong nghiên cứu lâm sàng

Trong quá trình nhân lên của HBV, các sản phẩm protein như HBsAg có thểđược tổng hợp dư thừa dẫn đến hiện tượng ở một số bệnh phẩm chúng ta thấy cáctiểu thể kích thước nhỏ (32nm) hình cầu hoặc hình ống Đây là một trong nhữngnguyên nhân giải thích tại sao việc định lượng nồng độ HBsAg trong máu ít có giátrị trong việc đánh giá mức độ hoạt động của HBV Tất cả các hạt HBV hoàn chỉnhcũng như các tiểu thể không hoàn chỉnh đều có trong máu và lưu hành trong hệ tuầnhoàn

c) Phát hiện về dấu ấn phân tử HBV pgRNA huyết tương và vai trò của dấu

virus có tái tạo trong các tế bào hay không Sau đó, Colucci và CS đã sử dụngphương pháp lai Southern blot [27] và Hadchouel cùng CS sử dụng kỹ thuật lai tạichỗ (in-situ hybridization) đã phát hiện HBV pgRNA không chỉ có ở những bệnhnhân HBsAg dương tính mà còn có ở những bệnh nhân HBsAg âm tính [38] Tuynhiên, các phương pháp này chưa đủ độ nhạy để phát hiện các bản sao phiên mã ởnhững bệnh nhân bị nhiễm HBV với nồng độ thấp trong máu ngoại vi [38] Ngoài

ra, cũng có một số báo cáo về việc phát hiện HBV pgRNA trong máu ngoại vi bằng

kỹ thuật PCR, nhưng những báo cáo này thực hiện trên số lượng bệnh nhân khôngnhiều Do đó, mối quan hệ giữa HBV pgRNA trong máu ngoại vi và đặc điểm lâmsàng chưa được khảo sát ở những báo cáo trên

Những năm sau đó, Shi và CS đã sử dụng phương pháp ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) để phát hiện HBV pgRNA lưuhành trong máu ngoại vi của bệnh nhân [72] Kết quả là đã phát hiện được HBVpgRNA ở 19/57 (37,1%) bệnh nhân có HBsAg dương tính và 1/10 (10%) bệnh nhân

có HBsAg âm tính, trong khi đó 6 bệnh nhân khỏe mạnh đều không xuất hiện sự cómặt của HBV pgRNA Tần số của HBV pgRNA dương tính được phát hiện ởnhững bệnh nhân có mức ALT cao, HBeAg huyết thanh dương tính và mức độHBV DNA ≥ 0,7 Meq/ml

Năm 2015, Louis và CS đã sử dụng kỹ thuật Realtime PCR có độ nhạy cao

để phát hiện và định lượng nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương của nhữngbệnh nhân viêm gan B mạn tính [43] Kết quả là đã phát hiện được HBV pgRNAtrong huyết tương của tất cả bệnh nhân viêm gan B mạn tính có HBeAg dương tính

và HBeAg âm tính Thêm vào đó, đã có nhiều báo cáo cho thấy phát hiện đượcHBV pgRNA có mặt trong huyết tương trong khi điều trị với NA [39, 41, 90, 126]

1.3.2 Trong nước

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng ở nước tađứng hàng cao nhất thế giới Tần suất có HBsAg (+) ở người lớn từ 15 đến 21%thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu người mang

HBV mạn tính [3] Với diễn biến phức tạp trong điều trị bệnh viêm gan B mạn tính

và tiên lượng nặng nề của các biến chứng liên quan HBV về bệnh gan như xơ gan

và ung thư biểu mô tế bào gan, vấn đề quản lý, giám sát người nhiễm HBV mạntính ở nước ta những năm gần đây rất được quan tâm nghiên cứu Đã có nhiều côngtrình nghiên cứu đề cập về vai trò của các dấu ấn huyết thanh virus học trong dựbáo đáp ứng điều trị và tiên lượng sau điều trị

Năm 2012, Trần Ngọc Ánh công bố kết quả nghiên cứu về nồng độ HBsAg,HBV DNA huyết tương trên 279 bệnh nhân viêm gan B mạn tính Kết quả cho thấynồng độ HBsAg trung bình 3,66 ± 0,44 log10IU/ml, HBV DNA trung bình 7,3 ±1,67 log10 copies/ml Nồng độ HBsAg, HBV DNA cao hơn đáng kể ở các bệnhnhân viêm gan B mạn tính HBeAg dương tính so với nhóm HBeAg âm tính, không

có sự liên quan giữa nồng độ HBsAg và HBV DNA (p = 0,231, r = 0,136) ở cả hainhóm bệnh nhân [1]

Tuy nhiên, tác giả Phạm Hoàng Phiệt và Nguyễn Phương Thảo trong mộtcông bố năm 2010 trên 97 bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính đã đưa ra nhận địnhkhác Nhóm bệnh nhân nghiên cứu có HBV DNA ở mức cao và ALT > 60 IU/ml đãcho thấy nồng độ HBsAg có mối tương quan khá chặt chẽ với nồng độ HBV DNA

ở nhóm bệnh nhân có HBeAg dương tính, mối tương quan này chặt chẽ hơn ở thểviêm gan có HBeAg âm tính (r=0,6336;p=0,000 so với r=0,303;p<0,0287 tươngứng) [5] Kết luận này cũng được tác giả Hoàng Tiến Tuyên và CS xác nhận trongmột nghiên cứu công bố năm 2017, đồng thời nhóm tác giả cũng nhận thấy không

có sự tương quan giữa nồng độ HBsAg, HBV DNA với hoạt độ ALT trên các nhómbệnh nhân viêm gan mạn tính [4]

Tác giả Võ Triều Lý và CS năm 2015 đã công bố một nghiên cứu bước đầu vềđịnh lượng HBsAg giúp phân biệt người mang HBV không hoạt động (I) và viêm gan

B mạn tái hoạt (II) cho thấy HBsAg định lượng của nhóm I (inactive carrier) thấp hơnnhóm II (active carrier) có ý nghĩa thống kê HBsAg định lượng tại một thời điểm với

giá trị < 1000 IU/mL có thể giúp phân biệt người mang HBV không hoạt động và viêmgan B mạn tính tái hoạt [6].

Kết quả của các tác giả trong nước tương đối phù hợp với nhận định thuđược từ các nghiên cứu trên thế giới về vai trò của HBsAg trong đáp ứng điều trị vàtiên lượng bệnh viêm gan B mạn tính Tuy nhiên, nhiều báo cáo cũng đã đề cập vềviệc tạo ra một cách dư thừa lượng HBsAg trong huyết tương bệnh nhân viêm gan

B mạn tính làm giảm vai trò của yếu tố nồng độ HBsAg trong việc phản ánh nồng

độ cccDNA trong tế bào gan cũng như sự nhân lên của HBV [82], [96] Việc trị liệucác bệnh nhân viêm gan B mạn tính bằng các NAs mới có hoạt tính kháng virus caonhư entecavir hay tenofovir làm giảm nhanh nồng độ HBV DNA huyết tương, điềunày làm giảm vai trò về động học của HBV DNA đối với việc dự báo chuyển đảoHBeAg trong quá trình điều trị

Mặc dù các nghiên cứu trên thế giới gần đây đã đề cập đến vai trò của nồng

độ HBV pgRNA huyết tương trong dự báo chuyển đảo huyết thanh và đáp ứngvirus bền vững sau điều trị bằng NA [115], [18] Việc giám sát quản lý nhiễm HBVmạn tính ở các cơ sở y tế trong nước hiện nay chủ yếu theo các hướng dẫn của một

số hiệp hội về bệnh gan lớn trên thế giới (AASLD - Hội nghiên cứu bệnh gan Mỹ,EASL - Hiệp hội nghiên cứu gan châu Âu, APASL - Hiệp hội nghiên cứu bệnh ganChâu Á Thái Bình Dương), chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá về các dấu ấn mớitrong giám sát theo dõi và quản lý với các bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở ViệtNam Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố về quy trình địnhlượng tải lượng HBV pgRNA huyết tương cũng như vai trò của biến động tải lượngHBV pgRNA trong đáp ứng điều trị cũng như tiên lượng sau điều trị trên bệnh nhânviêm gan B mạn tính ở Việt Nam

1.4 Tính mới và tính sáng tạo của đề tài

Mục tiêu điều trị của viêm gan B mạn tính là cải thiện chất lượng cuộc sống

và duy trì sự sống bằng cách ngăn chặn sự tiến triển của bệnh xơ gan, xơ gan mất

bù, bệnh gan giai đoạn cuối, ung thư biểu mô tế bào gan và tử vong Đây là mục

tiêu có thể đạt được nếu sự sao chép của HBV bị ức chế và duy trì liên tục Việcgiảm nồng độ HBV DNA kèm theo hoạt động mô học của viêm gan B mạn tính làmgiảm nguy cơ xơ gan và giảm nguy cơ HCC, đặc biệt trong những bệnh nhân xơgan [59] Tuy nhiên, nhiễm HBV mạn tính không thể hoàn toàn bị loại trừ do sự tồntại bền vững của covalently closed circular DNA (cccDNA) trong nhân của tế bàogan bị nhiễm HBV [21, 87] Hơn nữa, bộ gen HBV được tích hợp vào hệ gen củavật chủ và có thể phát sinh ung thư [20, 23, 83].

Các nghiên cứu trên thế giới và trong nước đánh giá vai trò của các dấu ấnvirus viêm gan B như HBV DNA, HBeAg, HBsAg đã có đóng góp tích cực nhấtđịnh trong việc kiểm soát bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Tuy nhiên cho đến nay,chưa có một mô hình nào có thể dự báo đáp ứng virus sớm trong điều trị, dự báođáp ứng virus bền vững sau kết thúc điều trị mang lại hiệu quả cao trong thực hànhlâm sàng [60], [18], [105]

Các thuốc điều trị viêm gan B mạn tính hiện nay được cấp phép là Peg-IFN 2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đường uống đồng đẳng của nucleoside(nucleos(t)ide analogues, NAs) như Lamivudine, Telbivudine, Adefovir, Entecavir,Tenofovir [32], [63] Sự ức chế dài hạn việc tái bản HBV bằng NAs làm giảm đánh

α-kể những biến chứng liên quan đến nhiễm HBV, tuy nhiên thời gian điều trị với cácNAs không được xác định và với hầu hết bệnh nhân phải điều trị suốt đời [63] Ở một

số bệnh nhân được điều trị bằng NAs, sự chuyển đảo HBeAg huyết thanh có thể xảy

ra với sự biến mất của HBeAg và xuất hiện anti-HBe Đến nay, chuyển đảo HBeAghuyết thanh được công nhận là một dấu mốc quan trọng trong quá trình điều trị nhiễmHBV mạn tính, là điều kiện tiên quyết cho sự chuyển đảo HBsAg huyết thanh, cả haiđều đại diện cho sự thuyên giảm nhiễm HBV một cách ổn định và cho phép ngừngđiều trị [32], [18] Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu trên thế giới và trong nướcvẫn chưa thiết lập được các công cụ hiệu quả nhằm dự báo sự chuyển đảo HBeAgnhư một kết quả của quá trình điều trị với các NAs

Sự suy giảm mạnh về nồng độ HBV DNA huyết tương ở các bệnh nhân viêmgan B mạn tính khi được đơn trị liệu bằng NAs đã được nhiều nghiên cứu đề cập[32], [111] Tuy nhiên việc ức chế tổng hợp DNA không ảnh hưởng trực tiếp tớinguồn cccDNA trong nhân tế bào gan bị nhiễm, do đó hầu như không loại bỏ hoàntoàn được cccDNA trong thực hành lâm sàng [71] và khi ngừng điều trị, người ta lạithấy sự phục hồi trở lại của HBV DNA trong huyết tương người bệnh Một sốnghiên cứu cho thấy nồng độ HBsAg cũng là một yếu tố tiềm năng trong tiên lượngđáp ứng điều trị và tiên lượng các biến chứng gặp phải trên bệnh nhân viêm gan Bmạn tính [44], [96], [24] Tuy nhiên, việc HBsAg được tạo ra một cách dư thừatrong máu ngoại vi nên HBsAg cũng chưa phản ánh chính xác cccDNA trong nhân

tế bào gan và điều này làm giảm vai trò của yếu tố nồng độ HBsAg trong các tiênlượng về sự nhân lên của HBV

Việt Nam nằm trong khu vực có tỉ lệ lưu hành HBV trong cộng đồng vàoloại cao nhất trên thế giới [56] và nhiễm HBV mạn tính là một vấn đề y tế nặng nềtại nước ta Sự cấp thiết trong việc tìm ra hay thiết lập các công cụ theo dõi, kiểmsoát điều trị cũng như quản lý hạn chế sự lây nhiễm trong cộng đồng là rất rõ ràngtrong bối cảnh phổ biến của nhiễm HBV mạn tính và sự phức tạp, khó khăn trongđiều trị một cách triệt để các bệnh gan liên quan đến HBV Hiện nay, chưa có mộtnghiên cứu nào trong nước được thực hiện nhằm làm rõ hơn những vấn đề hết sứctiềm năng về ý nghĩa lâm sàng của tải lượng HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhânviêm gan B mạn tính Các nghiên cứu trên thế giới về định lượng HBV pgRNA vẫncòn tiến hành với số lượng bệnh nhân chưa nhiều Chính vì vậy, cần thiết phải xâydựng một quy trình định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao trên đốitượng là các bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng các đồng đẳngnucleoside ở nước ta

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng, vật liệu, hóa chất nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân viêm gan B mạn tính (CHB) Cỡ mẫu (n = 77) được xác định theophương pháp nghiên cứu lâm sàng, nhóm bệnh nhân này được sử dụng để đánh giáquy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA sau quá trình tối ưu và đánh giá nhằmđánh giá quy trình trên mẫu bệnh nhân CHB Đồng thời, so sánh với các quy trìnhđịnh lượng HBV pgRNA trên thế giới hiện nay Nhóm chứng: 50 người khoẻ mạnh

để xây dựng panel độ đặc hiệu Ngoài ra, sử dụng 5 mẫu bệnh nhân viêm gan C.Quá trình tối ưu quy trình RT-qPCR sử dụng các mẫu chuẩn dương sẽ thiết kế ởphần sau đây

Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu: Chẩn đoán nhiễm HBV mạntính: Bệnh nhân viêm gan vi rút B mạn tính được xác định theo tiêu chuẩn của Hiệphội gan mật Mỹ - 2018 [104]:

 HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và Anti-HBc IgG (+)

 HBV DNA ≥ 105 copy/mL ở nhóm HBeAg (+) và ≥104 copy/mL ở nhómHBeAg (-)

 ALT tăng liên tục hay từng đợt

Tiêu chuẩn chọn nhóm chứng:

Nhóm chứng là những người khỏe mạnh bình thường, không có bệnh lý vềgan Các đối tượng nghiên cứu thuộc nhóm chứng đều được khám và xét nghiệmchức năng gan và các dấu ấn của virus viêm gan trước khi thu thập mẫu máu

Tiêu chuẩn loại trừ:

Loại trừ những bệnh nhân ra khỏi nhóm bệnh nhân nghiên cứu khi có cáctình trạng sau:

+ Đồng nhiễm virus viêm gan khác hoặc HIV.

+ Bệnh nhân có tổn thương gan do nguyên nhân khác: rượu, do thuốc,

do hóa chất, do bệnh gan tự miễn

+ Bệnh nhân đang trong giai đoạn thai kỳ và đang cho con bú

+ Bệnh nhân mắc các bệnh kết hợp như đái tháo đường, viêm đườngmật

+ Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Vật liệu, hóa chất

Bảng 1: Máy móc, trang thiết bị

4 Tủ an toàn sinh học cấp độ Hàn Quốc

Bảng 2: Hóa chất nghiên cứu

1 Hóa chất dùng trong tách chiết RNA tổng

số

QIAamp MinElute Virus vacuum Kit QIAGEN

2 Hóa chất dùng trong phản ứng RT-qPCR

1 Quantitect probe master mix QIAGEN

4 Nước khử deion DNA/RNAse Free Thermo Scientific

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

2.2.2 Thu thập, bảo quản mẫu

- Quy trình thu thập mẫu, lưu trữ bảo quản:

Đánh giá tính đa hình,đột biến vùng gen đích Thiết kế mồi, probe

Thiết lập tiêu chuẩn

Đánh giá quy trình

+ Quy trình thu thập bảo quản mẫu được áp dụng cả ở khu vực điều trị bệnhnhân và phòng xét nghiệm

+ Các mẫu máu ngoại vi được bảo quản lạnh 4°C - 8°C và chuyển đến phòngxét nghiệm trong vòng 2 giờ kể từ khi lấy máu, được gán mã riêng biệt

Quy trình kỹ thuật lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi: Mẫu máu tĩnh mạch

ngoại vi với thể tích 5 ml/người được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA.Trong vòng 2 giờ sau khi lấy, mẫu máu được vận chuyển đến labo, tách huyết tươngbằng ly tâm 1500 g trong thời gian 10 phút và chuyển sang tube nhựa polypropylen.Phần tế bào máu sẽ được bảo quản trong ngân hàng cho mục đích phân tích gen bổsung khi cần thiết Mẫu huyết tương và tế bào được bảo quản ở tủ âm -80°C đến khiphân tích

2.2.3 Tách chiết acid nucleic

RNA huyết tương được tách chiết bằng bộ kit QIAamp MinElute VirusVacuum Kit (QIAGEN) sử dụng quy trình tách máu và dịch cơ thể theo khuyến cáocủa nhà sản xuất, sau đó được xử lý bằng DNase I, RNase-free (Thermo FisherScientific) để loại bỏ DNA trước khi tiến hành tách chiết RNA Thể tích huyếttương được sử dụng để tách chiết RNA là 500 µL và thể tích RNA tách chiết thuđược cuối cùng là 50 µL

2.2.4 Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương

a) Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV-RNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.

Xác định được vùng bảo tồn là vùng gen S (kích thước khoảng 1200 nu, vùngN-terminal là vùng bảo tồn hơn cả (đã chứng minh ở phần tổng quan), vùng nàyđược đánh dấu để thiết kế mồi, probe Bước tiếp theo là đánh giá tính đa hình, độtbiến của vùng này để tìm ra vùng trình tự cụ thể cho thiết kế mồi/probe sử dụngphần mềm Clustalx