Summary of Doctoral thesis in Medicine: Studying the mRNA expression of CIZ1b, VEGF genes and egfr mutations with merkel cell virus infection in patients with non- small cell lung cancer

Assessed the level of mRNA expression of CIZ1b, VEGF, EGFR mutations and the rate of Merkel cell infection in patients with non-small cell lung cancer. Assessed the level of mRNA expression of CIZ1b, VEGF, EGFR mutations and the rate of Merkel cell infection in patients with non-small cell lung cancer.

OF DEFENSE

VIETNAM MILITARY MEDICAL UNIVERSITY

HO VAN SON

STUDYING THE mRNA EXPRESSION OF CIZ1b, VEGF  GENES AND EGFR MUTATIONS WITH MERKEL CELL 

VIRUS INFECTION IN PATIENTS WITH NON­ SMALL 

CELL LUNG CANCER

Major: Biomedical ScienceCode: 9 72 01 01

SUMMARY OF DOCTORAL THESIS IN MEDICINE

HA NOI – 2020THE THESIS IS COMPLETED AT THE

­ Library of the Vietnam Military Medical University

INTRODUCTION        Primary   lung   cancer   (PLC)   is   one   of   the   most   common malignancies today and is the leading cause of death in cancer. In Vietnam, lung cancer (LC) has increased rapidly. According to the Global Cancer Research Organization (GLOBOCAN) in 2018, there are   23,667   new   people   in   the   country   with   LC   About   90%   of 

been   mentioned   and   researched   We   conducted   the   project: 

"Studying the mRNA expression of  CIZ1b,  VEGF  and  EGFR mutations with Merkel cell virus infection in patients with non­small cell lung cancer" with these objectives:

1. Assessed the level of mRNA expression of CIZ1b, VEGF, EGFR 

mutations and the rate of Merkel cell infection in patients with non­small cell lung cancer

2. Analysed the relationship between the level of mRNA expression 

of  CIZ1b,  VEGF,  EGFR  mutations with Merkel cell infection and 

some clinical and subclinical symptoms in patients with non­small cell lung cancer

Rationale of the Study

   Study on mRNA expression of CIZ1b, VEGF, EGFR mutation and 

Merkel   cell   virus   (MCV)   infection   contribute   to   early   diagnosis, identify the cause of disease and its application in monitoring and treatment  of  NSCLC,  contribute  to improving  the  quality  of  life, 

CHAPTER 1: LITERATURE REVIEW

1.1. Overview of lung cancer

    Lung cancer is currently the most common type of cancer in both incidence and mortality. In 2018, there were about 2.1 million new cases of lung cancer detected and an estimated 1.8 million deaths, accounting for more than 18% of all cancer deaths. In Vietnam, LC accounted for 15.48% of all new cancers. About 90% died in the first 

5 years. Prevalence of male is higher than female (The ratio of male 

to female is approximately 2.5:1)

    The main risk factors associated with lung cancer include tobacco use,   environmental   pollution,   Amian   infection,   Randon   gas, infectious agents, interactions between the sensitive genome and the environment and

     The oncogene in NSCLC often involves four main functional pathways:   cell   proliferation,   programmed   resistance   to   death, invasion or metastasis and angiogenesis.

1.2. Expression of CIZ1b in non­small cell lung cancer.

     CIZ1b is a variant of the CIZ1 gene, due to the deficiency of eight  amino acids at the beginning of the C end. CIZ1 gene encodes for an 

intracellular protein that plays a role in controlling cell proliferation: 

regulate cell cycle, regulate transcription  CIZ1  is an intermediate 

molecule that connects cyclin E and A to cyclin dependent kinase proteins   such   as   CDK2   and   p21,   to   accelerate   mammalian   DNA replication   This   protein   also   plays   an   indirect   role   in   DNA replication by regulating the expression of genes. It can bind directly 

to DNA molecules or act as a co­activator of transcription factors

        In   LC,  CIZ1b  manifested   much   in   NSCLC   samples   when 

compared   to   adjacent   tissue   samples   By   quantifying   the 

concentration of  CIZ1b  in plasma (using Western blot technique),  Higgins et al. were able to distinguish 98% of LC cases from normal 

people. In addition, compared patients with stage 1 NSCLC to the smoking control group of the same age or the group of benign lung 

tumours, this marker can also classify 95% of cases. Thus,  CIZ1b 

shows the potential of a molecular marker that can detect NSCLC early with high clinical accuracy

    CIZ1b affected the DNA replication function of lung cancer cells.  Using RNAi technique to reduce the expression of  CIZ1b  (without  affecting other forms of CIZ1) in the SBC5 lung cancer cell line can 

inhibit   the   proliferation   of   this   cell   line   The   same   result   was obtained with in vivo experiments, when implanting this cancer cell 

line in mice,  CIZ1b  depletion could reduce tumour growth. These  experiments   have   shown   that  CIZ1b  variant   plays   a   role   in 

controlling proliferation of cancer cells

      VEGF, which has been shown to play an important role in lung 

cancer, is strongly correlated with abnormal blood vessel formation and   promotes   tumour   growth   This   factor   has   been   applied   to differential diagnosis in patients with chronic obstructive pulmonary disease   and   lung   cancer,   benign   and   malignant   pleural   effusion. Notably, for patients whose tumours are detected by a chest X­ray or 

CT   scan,   the  level   of  VEGF  expression  in  bronchial   lavage  is  a 

(EGFR),   the   two  EGFR  molecules   combine   with   each   other 

(dimerization)   to   activate   phosphorylation   of   the   tyrosine   kinase 

region,   which   activates   specific   tyrosins   and  EGFR  receptor­

dependent intracellular signal proteins that induce transcription of target   genes   to   promote   proliferation,   programmed   resistance, invasion, metastasis and neovascularization

       EGFR is especially important in the pathogenesis of non­small 

cell lung cancer, especially adenocarcinoma. In people who do not 

smoke   or   rarely   smoke,   women   and   Asian   people,  EGFR 

manifestations   occur   in   more   than   50%   of   cases   of   lung adenocarcinoma   However,   they   also   make   malignant   cells susceptible to TKIs, and even predict response to broad­spectrum TKI   drugs   like   erlotinib   and   gefitinib   In   addition   to   the   TKI­

sensitive mutation, EGFR also has a mutation that helps cancer cells 

resist this drug, such as the T790M mutation that occurs in exon 20. About 50–60% of recurrent patients have a T790M mutation. This mutation  reduces the effectiveness  of  the first   generation  of   TKI 

1.5. Merkel cell Carcinoma Virus (MCV) in non­small cell lung cancer

1.5.1. Merkel cell virus and carcinogenic mechanism

       MCV belongs to the Polyomaviridae family and is listed on the 

list   of   class   2A   carcinogens   by   the   world   cancer   research   fund international. The MCV genome is a double­stranded circular DNA molecule, about 5 kb in size, divided into three main regions: a non­coding control region (NCRR) containing the replication centre of virus   Transcription   factors   are   located   between   two   regions:   the early coding region and the late coding region. Early coding region, coding for antigens: LT (Large T), ST (Small T). The late coding region encodes for the capsid proteins, VP1 and VP2

      The LT  and  ST  antigens  play  an  important  role  in  tumour formation caused by MCV. LT carries domain J (associated with thermal shock protein), retinoblastoma binding motif (RB) (inhibits 

RB family members), domain affixes replication centre at C end and domain helicase / ATPase (necessary for DNA replication of virus). Much of the carcinogenic function of LT antigen is due to its high affinity for  RB, causing isolation and inactivation of  this tumour suppressor gene. The RB binding function of MCV LT is essential for the sustainable growth of MCC­positive MCV tumours both in vitro and in experimental models

1.5.2. Relationship between Merkel virus and lung cancer

     Based on the histological similarities between MCC and small cell lung cancer (SCLC), the relationship between MCV and SCLC has been studied. Two studies in Germany showed the presence of MCV DNA by PCR with detection rates of 6.7% (2/30) and 38.9% (7/18). For NSCLC, epidemiological studies conducted in the US and 

(10/110)   patients   with   NSCLC   Recently,   Hashida  et   al.  first 

published the incidence of MCV in Asian lung cancer and detected MCV   DNA   in   17.9%   (20/112)   of   NSCLC   patients   in   Japan   In particular, the Japanese team found two cases of NSCLC infection with   MCV   bearing   the   characteristic   mark   of   the   tumour   These cases have the LT antigen expressed in cancer cells and integrate the viral   genome   into   the   cell   chromosome   and   cause   cancer modification

     Thus, integrated or mutated forms of MCV have been shown in a specific cancer other than MCC, suggesting that MCV is associated with the onset of an NSCLC group. However, no studies have been conducted in Vietnam to detect MCV in patients with NSCLC.CHAPTER 2: RSEARCH SUBJECTS AND METHODOLOGY2.1. Research subjects

2.1.1. Patient group:  100 patients with non­small cell lung cancer, 

identified by histopathology, aged 27­ 83

2.1.2. Healthy people (control group): 51 healthy people (without 

cancer), ages 48­60, are similar in age and gender to the patient group

2.1.3   Exclusion:   SCLC,   treated   NSCLC,   metastatic   LC,   COPD, 

asthma,   acute   and   chronic   bronchitis,   patients   receiving corticosteroids, pregnant women, patients with autoimmune disease and non­cooperative participants in the study

2.2. Research Methods

2.2.1. Research design

­ Cross­sectional descriptive and controlled study, combined with clinical examination and laboratory analysis

­   Research   location:   Department   of   Pathophysiology   ­   Military Medical   Academy,   Military   Hospital   175   and   Central   Military Hospital 108

2.2.5. The implementation techniques

2.2.5.1. Diagnosis of non­small cell lung cancer

     Based on the guidelines: the diagnosis and treatment of non­small cell lung cancer of the Ministry of Health of Vietnam applies to medical examination and treatment facilities nationwide

­ Identify EGFR mutations.

­ Determine the presence of Merkel cell virus in peripheral blood of healthy people, in blood and cancer tissue of patients

­ The relationship between the expression level of mRNA  VEGF,  mRNA  CIZ1b  and   some   subclinical   factors:   renal   function,   liver  function, blood sugar, CEA, CYFRA21­1,  EGFR  mutation, disease 

stage and tissue type pathology, differentiation and associated factors with MCV infection

Age 60,0 ± 10,5 61,0 53,9 ± 2,9 53,0 0,158Gender 

(Male/Fem

   There is no difference in age and gender in the two groups (disease and control)

3.1.3. Results of differentiation evaluation in the treatment group Table 3.3. Differentiation of tumour cells of NSCLC patients

No Differentiation 

Figure 3.1. Distribution of desease stage if NSCLC patients 3.1.4.  Results of the phase evaluation of NSCLC group

Stage IV had the highest rate (76%), followed by stage IIIB, early stages encountered less

3.2. mRNA expression of CIZ1b and VEGF, EGFR mutation and 

prevalence of MCV infection in patients with KTBN

3.2.1. mRNA expression of CIZ1b and VEGF in two study groups Table 3.4. mRNA expression of CIZ1b and VEGF in two study groups

Control group (%) (Blood) (95% OR

5,33(1,49­28,83) 0,004Negative 75 (75) 75 (75) 48 (94,1)

Total 100 (100) (100)100  51 (100)

       The rate of MCV infection in patients with NSCLC (25%) was higher than that of normal people (5.9%), people infected with MCV were 5.3 times more likely to be infected with UV than those without MCV infection.

Table 3.8. mRNA expression of CIZ1b and plasma VEGF and 

tumour histopathology

ma (n=9)

Grad 3(n = 22)

P

± SD Median ± SD Median ± SD Median

CIZ1b 11,8±5,8 10,9 11,5±6,7 9,9 9,3±6,9 7,7 > 0,05

VEGF 6,1±6,5 3,8 1,9±1,3 1,7 1,9±0,9 1,7 > 0,05

ns(n = 

3.3.5   Relationship   between   MCV   infection   and   the   stages   of   NSCLC 

Table 3.11. Relationship between stages of NSCLC and MCV 

infection

Positive n(%) Negative n(%)

3.3.6. Relationship between tumour cell differentiation and MCV   infection

3.3.7. Relationship between tumour cell differentiation and MCV  

CEA (ng/mL) 121,7±250,2 6,9 95,2±273,8 6,02 >0,05CYFRA 21.1 

3.3.9. Relationship between MCV infection with the level of gene expression in VEGF and CIZ1b

4.1.1. Age of illness

      According to the majority of domestic and foreign authors, the disease is usually occur with people aged between 50 and 70. In this study, the average age of disease was 60 ± 10.5, of which there were 

61 patients from 55 to 74 years old, accounted for 61% of the total number of patients studied. We found that the age of the disease in this study is lower than that of Patricia M.de Goot, which may be because our statistics are not big enough. It may also be because 

4.1.2. Gender

     Lung cancer is more common in men than women, in this study the ratio of male to female was 3.7:1. With this ratio, the amount of women having lung cancer is increasing. In Vietnam, the incidence 

of lung cancer is also tending to balance between men and women, according to Globocan 2018 the rate of men over women is 2.5:1. The difference in the incidence between men and women in this study and Globocan's overall rate was probably due to the fact that our sample was not large enough, moreover we only got data from one   cancer   treatment   center,   this   also   affected   the   proportional distribution between men and women

4.2   The   level   of   mRNA   expression   of  CIZ1b,  VEGF,  EGFR 

mutations and the rate of Merkel Cell virus infection in patients with non­small cell lung cancer

4.2.1. Levels of mRNA expression of CIZ1b gene in patients with   non­small cell lung cancer.

     In previous research conducted by Higgins et al. in 2012, CIZ1b 

was   proved   to   be  a   valuable   biomarker   in  the  diagnosis  of   lung 

cancer  CIZ1b  was only found in lung cancer patients but not in  normal people. Therefore, CIZ1b was proposed as a suitable marker 

for early stage lung cancer

      Studies showed that the CIZ1b variant was sensitive enough to 

allow accurate identification of patients with stage 1 cancer, in high­risk   groups,   including   patients   with   benign   lymphadenopathy, pneumonia,   asthma,   chronic   obstructive   pulmonary   disease)   and smokers. It is also found that cancer patients have much higher levels 

of  CIZ1b  than normal  people without  cancer.  When analyzed by  stage   of   cancer,  CIZ1b  concentration   also   increased   by   stage   in 

be   used   as   a   Biomarker   to   diagnose,   to   monitor   lung   cancer development   as   well   as   to  monitor   the  prognosis   of   lung  cancer treatment.

4.2.2. Levels of mRNA expression of VEGF gene in patients with   non­small cell lung cancer.

       One study assessed the mRNA expression of  VEGF  in three 

groups   of   patients   including   squamous   cell   carcinoma, adenocarcinoma,   and   undifferentiated   cell   carcinoma   The   results 

showed that in 65% of cases, VEGF mRNA expression was higher in  cancer tissue than normal tissue. mRNA expression of  VEGF  was 

higher in non­squamous cell carcinoma and higher in tumors with lymph   node   metastases   Similarly,   this   study   also   showed   that 

mRNA   expression   of  VEGF  in   peripheral   blood   was   also 

significantly higher in lung cancer patients compared to the control group

     In this study, we did not observe the association of VEGF mRNA 

expression with clinical features such as liver dysfunction, Glucose disorder, tumor histopathology, stage of disease. We also did not see 

the difference in mRNA expression of VEGF between differentiation