ĐỊNH LƯỢNG VÀ PHÂN LẬP HAI ALKALOID CHÍNH TỪ VỊ THUỐC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM EVODIAE FRUCTUS (NGÔ THÙ DU)

ĐỊNH LƯỢNG VÀ PHÂN LẬP HAI ALKALOID CHÍNH TỪ VỊ THUỐC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM EVODIAE FRUCTUS (NGÔ THÙ DU)Evodiae fructus (Wuzhuyu, ngô thù du) là quả khô, chưa chín của cây Ngô thù du, họ Cà phê (Evodia rutaecarpa, Rutaceae).YHCT: trị các rối loạn dạ dày ruột và chứng xuất huyết, mất kinh sau sinh.3 thành phần chính: limonin, evodiamin, và rutaecarpin được chứng minh có nhiều tác dụng như kháng viêm, kháng tiểu đường, cao huyết áp, trợ tim, kích thích trung ương, giãn mạch, chống đông máu và co thắt phế quản.Dược điển Trung Quốc kiểm định 2 alkaloid chính là evodiamin và rutaecarpin bằng nhiều kỹ thuật phân tích, trong đó có sắc ký lỏng ghép khối phổ kép (LCMSMS).Việc áp dụng kỹ thuật này bị hạn chế do yêu cầu thiết bị tốn kém.Hóa chấtAcetonitril và methanol HPLC (Merck)Limonin (98.47%), evodiamin (99%), và rutaecarpin (99%), (SigmaAldrich, USA).Nguyên liệu40 mẫu quả Ngô thù du được thu mua từ nhiều vùng ở Việt Nam.Được định danh tại BM. Thực vật dược, Khoa Dược, trường ĐH YD Cần ThơĐược bảo quản tại PTN Quản lý Dược và Độc chất trong gói kín và tránh tiếp xúc với hơi ẩm, ánh sángTinh chếPhân đoạn tinh khiết 1 được tinh chế bằng cách rửa với nhexan lạnhPhân đoạn tinh khiết 2 được tinh chế bằng kết tinh trong chloroformKiểm định tinh khiếtKiểm định sơ bộ sự tinh khiết của hợp chất qua SKLM mới nhiều hệ pha động khác nhau.Kiểm định tinh khiết với HPLC

ĐỊNH LƯỢNG VÀ PHÂN LẬP HAI ALKALOID CHÍNH TỪ VỊ THUỐC

CỔ TRUYỀN VIỆT NAM EVODIAE

FRUCTUS (NGÔ THÙ DU)

Bài viết: Quantitative determination and preparative isolation of two

major alkaloids from the vietnamese medicinal herb evodiae fructus

Tác giả: N Van T Nguyen, X Dao T Nguyen, K Ngan H Nguyen, T Kien Nguyen, M Phuong Nguyen

Ấn bản: International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical

1 Đặt vấn đề

2

1 Đặt vấn đề Tầm quan trọng của Ngô thù du

• Evodiae fructus (Wuzhuyu, ngô thù du) là quả khô, chưa

chín của cây Ngô thù du, họ Cà phê (Evodia rutaecarpa,

Rutaceae)

• YHCT: trị các rối loạn dạ dày ruột và chứng xuất huyết, mất kinh sau sinh

• 3 thành phần chính: limonin, evodiamin, và rutaecarpin

được chứng minh có nhiều tác dụng như kháng viêm, kháng tiểu đường, cao huyết áp, trợ tim, kích thích trung ương, giãn mạch, chống đông máu và co thắt phế quản

1 Đặt vấn đề

Vấn đề nghiên cứu

• Dược điển Trung Quốc kiểm định 2 alkaloid chính là

evodiamin và rutaecarpin bằng nhiều kỹ thuật phân tích, trong

đó có sắc ký lỏng ghép khối phổ kép (LC/MS/MS).

• Việc áp dụng kỹ thuật này bị hạn chế do yêu cầu thiết bị tốn kém.

4

1 Đặt vấn đề

Mục tiêu nghiên cứu

Nhằm phát triển một phương pháp phân tích đơn giản, nhanh và nhạy để định lượng các thành phần sinh học quan trọng trong

Ngô thù du (Evodiae fructus), gồm limonin, evodiamin, và

rutaecarpin , để đánh giá chất lượng Ngô thù du được bán trên thị trường

2 Phương pháp nghiên cứu

6

2 Phương pháp nghiên cứu 2.1 Hóa chất và nguyên liệu

1 Hóa chất

1 Acetonitril và methanol HPLC (Merck)

2 Limonin (98.47%), evodiamin (99%), và rutaecarpin (99%),

(Sigma-Aldrich, USA).

2 Nguyên liệu

1 40 mẫu quả Ngô thù du được thu mua từ nhiều vùng ở

Việt Nam.

2 Được định danh tại BM Thực vật dược, Khoa Dược,

trường ĐH YD Cần Thơ

3 Được bảo quản tại PTN Quản lý Dược và Độc chất trong

gói kín và tránh tiếp xúc với hơi ẩm, ánh sáng

2 Phương pháp nghiên cứu

2.2 Chuẩn bị mẫu thử

8

0,1 g bột dược liệu mịn (0,3 mm)

Dịch chiết ethanol 80%

+ 40 ml ethanol 80% (v/v) * 3 lần Chiết siêu âm 20 phút

Cắn ethanol 80%

Cô thu hồi dm ở áp suất giảm

Dịch chiết dicloromethan

1 Phân tán trong 20 ml dichloromethan

2 Rửa 2 lần với 10 ml nước (chiết phân bố)

Cắn dichromethan

Cô thu hồi dm ở áp suất giảm

Dung dịch mẫu thử Hòa tan vào 10 ml pha động

2 Phương pháp nghiên cứu 2.3 Thiết bị và điều kiện sắc ký

1 Hệ Hitachi HPLC L-2000 (Hitachi, NB)

1 Bơm L-2130,

2 Bơm tiêm mẫu L-2200,

3 Hệ thống kiểm soát nhiệt độ L-2300

4 Đầu dò dãy diod L-2455

2 Phương pháp nghiên cứu 2.3 Thiết bị và điều kiện sắc ký

2 Điều kiện sắc ký:

1 Cột sắc ký Germini C18 (150 mm × 4.6 mm I.D., 5 µm),

2 Bước sóng phát hiện: 210 nm.

3 Pha động gồm acetonitril (A), methanol (B), và nước

(C)

4 Chương trình rửa giải gradient: (1) 0-18 min, gradient

tuyến tính 40% A và 5% B lưu lượng 1 ml/min; (2) 18-30 min, gradient tuyến tính 100% A

lưu lượng 1.2 ml/min

5 Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

10

2 Phương pháp nghiên cứu 2.4 Thẩm định quy trình kiểm nghiệm

Đối tượng thẩm định: Quy trình định lượng đồng thời limonin,

evodiamin, và rutaecarpin trên HPLC\DAD

Quy trình: theo hướng dẫn của Hội nghị Quốc tế về cân đối các yêu cầu kỹ thuật trong việc đăng kí dược phẩm dùng cho người

International Conference on Harmonization of Technical

Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human

Use (ICH, 2005)

Các tiêu chí cần thẩm định: khả năng tương thích hệ thống,

tính chọn lọc, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác và độ đúng

2 Phương pháp nghiên cứu 2.5 Phân lập alkaloid chính

1 Chuẩn bị mẫu thô

1 Chọn mẫu Ngô thù du cho hàm lượng alkaloid toàn

phần lớn nhất để chiết xuất và phân lập

2 Phân đoạn DCM (CH2Cl2) từ cao tổng ethanol 80%

được tách phân đoạn bằng sắc ký cột hở với hệ dung

môi rửa giải gồm n-hexan và ethyl acetat.

3 Các phân đoạn được phân biệt dựa vào hình ảnh

sắc ký lớp mỏng

12

2 Phương pháp nghiên cứu 2.5 Phân lập alkaloid chính

2 Tinh chế

1 Phân đoạn tinh khiết 1 được tinh chế bằng cách rửa

với n-hexan lạnh

2 Phân đoạn tinh khiết 2 được tinh chế bằng kết tinh

trong chloroform

3 Kiểm định tinh khiết

1 Kiểm định sơ bộ sự tinh khiết của hợp chất qua SKLM

mới nhiều hệ pha động khác nhau

2 Kiểm định tinh khiết với HPLC

2 Phương pháp nghiên cứu 2.5 Phân lập alkaloid chính

3 Định danh, xác định cấu trúc

1 Các hợp chất, tinh khiết ≥ 98,5%, được xác định cấu

trúc qua dữ liệu 1 H NMR, 13 C NMR (phổ cộng hưởng từ

hạt nhân 1H và 13C) và ESI-MS (khối phổ ion hóa bằng

phun điện tử)

2 Dữ liệu được đối sánh với phổ đối chiếu từ tài liệu

tham khảo để định danh các chất

14

3 Kết quả và bàn luận

Xem bài viết