TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔKHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNGBÁO CÁO THỰC HÀNHBỘ MÔN DƯỢC LIỆU 2NĂM 2020Bài 2KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOIDA. CƠ SỞ LÝ THUYẾT1. Khái niệm Các alkaloid (alcaloid) là những base hữu cơ thường dễ tan trong các dung môi hữu cơ (như ether, benzen, cloroform, aceton, methanol và ethanol) Đa số các alkaloid base thự tế không tan trong nước Một vài alkaloid có cấu trúc amonium bậc IV tan được trong nước và kém tan trong dung môi hữu cơ. Một số alkaloid không có oxy tồn tại duới trạng thái lỏng có thể tan ít trong nước. Một số alkaloid dạng lỏng có thể bay hơi và lôi cuốn dược theo hơi nước. Một số alkaloid không có oxy ở dạng rắn có thể thăng hoa được ở áp suất thường. Một số alkaloid có OH phenol có thể tan một phần trong dung dịch kiềm mạnh. Dưới dạng muối, các alkoaloid thường tan dược trong nước, cồn (ethanol, methanol). hay hỗn hợp cồn nước: chúng không tan hoặc rất kém tan trong các dung môi hữu cơ kém phân cực (ether, benzen. cloroform).2. Tính chất Alkaloid thường là những base yếu, tan trong các dung môi hữu cơ. Không tan trong nước. Khi cho alkaloid tác dụng với acid sẽ thu dược alkaloid dạng muối. Các muối của alkaloid thường dễ tan trong nước. Các muối này dễ bị các chất kiềm vô cơ (NH4OH. NaOH) thậm chí cả các muối khác (Na2CO3, đôi khi cả NaHCO3) đẩy ra khỏi muối cho lại các alkaloid base ban đầu. Alkaloid phản ứng với các thuốc thử chung (thuốc thử tạo tủa) tạo thành các muối khó tan (dạng kết tinh hay dạng vô định hình) được ứng dụng trong định tính alkaloid. Một số alkaloid hay nhóm alkaloid có thể cho màu sắc đặc trưng với một số thuốc thử gọi là thuốc thứ đặc hiệu của alkaloid (thuốc thử tạo màu) ứng dụng trong định tính hoặc làm thuốc thử phát hiện trong sắc ký.3. Các phương pháp chiết xuất Trong cây, các alkaloid thường tồn tại dưới dạng muối hòa tan với acid hữu cơ hoặc vô cơ hay dạng kết hợp với tanin. Người ta có thể chiết alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật bằng nhiều cách nhưng nhìn chung có thể quy về 2 cách chính là: + Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng alkaloid base bằng dung môi hữu cơ. + Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng muối bằng dung môi phân cực (nước, cồn, hỗn hợp cồn nước đã bị acid hóa). Với một vài alkaloid đặc biệt, người ta có thể chiết bằng: + Phương pháp cất kéo lôi cuốn theo hơi nước (chiêt xuất nicotin từ Thuốc lá). + Phương pháp thăng hoa (chiết xuất cfein từ Trà). Dựa vào tính tan khác nhau của dạng base và dạng muối alkaloid trong các dung môi, người ta có thể loại phần nào tạp chất ra khỏi dịch chiết trước khi định tính, định lượng hay phân lập các alkaloid tinh khiết.Các quy trình dưới đây thường được sử dụng trong chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu thực vật dùng cho định tính alkaloid.Chú ý:Thế tích dung môi chiết, thời gian chiết trong các phương pháp trên có thể thay đổi tùy thuộc vào dược liệu và phương tiện sử dụng.B. THỰC HÀNH 1. Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm (Phương pháp 1): Cân 3g Dược liệu Bình vôi. Kiềm hoá bằng NH4OH đậm đặc (vừa đủ ẩm). Mỗi lần thêm 5 giọt khoảng 35 giọt vừa đủ ẩm. Để yên 10 phút. Chiết bằng 20ml CHCl3 ở nhiệt độ phòng sau đó lọc bông. Thu được dịch chiết CHCl3Tiếp tục cho dịch chiết vào bình lắng gạn thêm vào 10 ml H2SO4 lọc lắng gạng 2 lần. Thu dịch chiết lớp trên. Thu được dịch chiết nước acid 2. Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung. Lấy 4 ống nghiệm đánh số 0,1,2,3 thêm vào mỗi ống 2ml dịch chiết nước acid bình vôi. Tiếp tục thêm riêng lẻ 3ml vào ống 1,2,3 lần lượt là Bouchardat, ValseMayer, Dragendorff. Ống 0 dùng để so sánh. Nhận định kết quả: Ống 1: cho kết quả (+) với thuốc thử Bouchardat Ống 2 : cho kết quả (++++) với thuốc thử ValseMayer Ống 3: Cho kết quả (++) với thuốc thử Dragendorff.Một số câu hỏi (?)Khi cho NH4OH pH>10 thì xử lý như thế nào?Thêm H2SO4 2% để trung hoà lại để PH=10Nồng độ CHCl3 là ?Nồng độ từ 2528%Tại sao lọc dịch chiết bột Dược liệu bằng bông?Vì bột Dược liệu hạt to nên có thể chiết bằng bông và tiết kiệm nhiều thời gian hơn thay vì chiết bằng giấy lọc.Khi nào chiết bằng giấy lọc?Khi Dược liêu có hạt nhỏ cần lọc kỹ để loại bỏ các tạp chất để thu dịch tinh khiết.Dược liều bình vôi:Tại sao Phải Kiềm hóa bằng NH4OH đặm đặc (vừa đủ ấm)?Để chuyển alkaloid dưới dạng muối trong cơ thể sinh vật thành dạng base tự do tan trong dung môi hữu cơ người ta thường ngâm tẩm mẫu trong dung dịch kiềm loãng hoặc dung dịch amoniac.Ngoài ra, dược liệu khi được làm ẩm sẽ trương nở , giúp cho dung môi thấm vào tế bào, kéo hoạt chất ra dễ dàng hơn Dược liệu lá sen:Tại sao (khi sử dụng dịch chiết nước acid với NH4OH đđ phải chỉnh đến pH= 10? Vì khi PH=10 NH4OH Kiềm hoá vừa đủ sẽ tách chiết được Dịch chiết aicd thành Dịch chiết CHCl3 và acid . Đã loại bỏ hết tạp chất. Khi PH10 Thì dịch chiết sẽ trung hoà với NH4OH bị kiềm hoá đi.Dược liệu tâm sen:Cách pha chế cồn aicd 5% ?Với cồn 96 độ cần thêm khoảng 4.3ml acid đậm đặc để được cồn aicd 5%Khi nào phải trung hòa dịch chiết cồn acid đến pH=56 ?Khi chiết dịch chiết bằng clorofom Câu hói thảo luận:1. Những điểm chú ý khi tiến hành định tính alkaloid bằng thuốc thử chung ? Khi thực hiện phản ứng với thuốc thử chung phải cho từ từ từng giọt thuốc thử vào ống nghiệm Không nên cho quá nhiều thuốc thử vào ống nghiệm vì một số thuốc thử có tủa và tủa tan trong một lượng thuốc thử thừa.Bài 3ĐỊNH TÍNH ALKALOID TRONG DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÍ LỚP MỎNGCƠ SỞ LÍ THUYẾTTHỰC HÀNHBước 1. Chuẩn bị Bản mỏng silica gelMẫu thử (10ml dịch chiết Tâm sen, 10ml Lá sen) Dung môi khai triển S2=CHCl3MeOHNH4OH(20 : 3,6 : 0,4) Tiến hành sắc kíKẻ đường thẳng cách mép dưới bản mỏng từ 11,5cm, ghi tên mẫuPhát hiện vếtBước 2. Thực hiệnKiềm hóa dung dịch về pH=10 bằng NH4OHLấy một mảnh giấy quỳ rồi chia đều ra thành từng mảnh nhỏ đặt lên mặt kính đồng hồ để định pH dung dịch.Nhỏ vài giọt NH4OH vào mẫu thử. Dùng đũa thủy tinh chấm vào dung dịch rồi chấm lên những mảnh quỳ tím trên mặt kính đồng hồ, nếu giấy quỳ tím vẫn còn màu đỏ thì tiếp tục nhỏ NH4OH và chấm thử lên quỳ tím cho đến khi giấy quỳ cho màu giống pH=10 (màu xanh đen) trên thang đo pH thì ngừng. Cho mẫu thử vào từng bình lắng gạn cùng với 10ml dd CHCl3, đậy nắp bình lại và đem lắc 3 lần (lưu ý lắc nhẹ nhàng tránh lắc mạnh dễ gây tạo nhũ) sau đó gạn lấy phần dịch trong bên dưới, đem đun cách thủy đến cô lại còn khoảng 12ml. Chấm sắc kí. Phát hiện vết trên bản mỏng bằng máy soi UV: Ánh sáng ở bước sóng 254 nmKết quả: Vết do chuyển cao, thẳng, vết có màu xanh dương đậmCách làm hiện vết bằng thuốc thử DragendorffDùng kẹp gắp bản mỏng nhúng nhanh vào thuốc thử Dragendorff rồi để khô sẽ thấy xuất hiện vết trên bản mỏng. Kết quả RfLá sen: R_f=78,8 Tâm sen: R_f=68,8TRẢ LỜI CÂU HỎINhững điểm cần chú ý khi tiến hành định tính alkaloid bằng thuốc thử chung?Khi thực hiện phản ứng với thuốc thử chung phải cho từ từ từng giọt thuốc thử ống nghiệm.Không nên cho quá nhiều thuốc thử vào ống nghiệm vì một số thuốc thử có tủa và tủa tan lại trong một lượng thuốc thử thừa.Ý nghĩa của việc dùng và NH4OH trong hệ dung môi hay bão hòa bình sắc kí?Khi cho NH4OH vào thì pH của dung dịch lớn hơn pHa+2, các alkaloid chuyển về một dạng nhất định (alkaloid base), các vết sắc kí gọn, đều và đẹp.Khi cho NH4OH thì mẫu ở dạng alkaloid base (kém phân cực) cho Rf cao và làm độ chính xác cao hơn.Nếu các vết có Rf quá thấp trên sắc kí đồ, hướng giải quyết để có sắc kí đồ tốt hơn?Thay thế hệ dung môiChấm dung dịch thử với một lượng vừa đủTrong quá trình khai triển, để dung môi khai triển chạy quãng đường càng dài càng tốt mà gần mép bản mỏng không quá 0,5 cm.Chuyển dạng của alkaloid.Có thể kết luận hai chất nào đó là khác nhau hoặc là đồng nhất bằng sắc ký lớp mỏng?Bằng sắc ký lớp mỏng có thể kết luận sơ bộ hai chất nào đó là khác nhau (hoặc đồng nhất).Làm thế nào để kết luận có một chất X nào đó có trong thành phần của hỗn hợp?Để kết luận một chất X nào đó có trong thành phần của hỗn hợp Y cần làm sắc ký như sắc ký lớp mỏng.Nếu Rf của X bằng độ dài Rf bất kì có trong thành phần của hỗn hợp Y thì có thể kết luận.Để có độ chính xác cao hơn có thể làm với nhiều hệ dung môi khác nhau hoặc xử lý hai chất có cùng Rf sau đó cho chạy với một hệ dung môi khác nếu vẫn cùng Rf thì kết luận là chất X có trong thành phần của hỗn hợp Y.Alkaloid tâm sen và lá sen giống hay khác? Tại sao?Alkaloid toàn phần thu được từ lá sen kiểm tra trên sắc ký bản mỏng với hệ dung môi S2 và thuốc thử Dragendoff thấy có ít nhất 2 vết, trong đó có một vết rất đậm có Rf trùng với nuciferin, allaloid toàn phần thu được từ lá sen bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, trong tâm sen có 3 vết. Thành phần alkaloid của tâm Sen đã được khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng. Alkaloid chính trong đó đã được phân lập và xác định cấu trúc là neferin và nuciferin. BÀI 4ĐỊNH TÍNH ALKALOID BẰNG THUỐC THỬ ĐẶC HIỆUCƠ SỞ LÝ THUYẾTTHỰC HÀNHKiểm nghiệm Hạt Mã tiền (Semen Strychnii)Bộ phận dùng là hạt cây Mã tiền (Strychnos nuxmonica L., Loganiaceae)Định tính bằng các phản ứng đặc hiệuChiết xuất: Chiết 3g bột dược liệu theo phương pháp 2 (Chiết bằng nước acid) Cân 3g bột dược liệu cho vào becher, thêm 20ml dung dịch H2SO4 2% Đun BM 15p, lọc nóng qua gòn (2 lần x 20ml) Thu được dịch chiết nước acid, thêm NH4OH đậm đặc, chỉnh pH =10 Thêm CHCl3 10ml x 2 lần. Thêm H2SO4 2% (5ml x 2 lần). Lắc và lọc lấy lớp dung dịch bên dưới. Cho dịch cloroform vào 2 chén sứ, cô cách thủy tới cắn khô.Định tính strychnin: Nhỏ vào chén 1 chừng 4 giọt H2SO4 đậm đặc, khuấy nhẹ cho tan, thả vào chén một vài hạt tinh thể K2Cr2O7 Dùng đũa kéo hạt tinh thể K2Cr2O7 ngang qua dung dịch acid, có vệt tím chuyển sang hồng vàng và biến thành nâu đen.Kết luận: Dương tính. Dược liệu Mã tiền chứ Brucin và Strychnin.Giải thích: Vì strychnin là alkaloid nhân indol, vị trí N số 9 có khả năng tạo muối với H2SO4 và cho phản ứng oxi hóa với kalidicromate. Brucin không cho phản ứng này vì có nhóm –OCH3 khóa phản ứng. Định tính Brucin: Nhỏ một giọt HNO3 đậm đặc vào cắn trên chén 2 sẽ có màu đỏ cam.Kết luận: Dương tính.Giải thích: vì Bruxin có 2 nhóm methoxy ở vòng thơm của nhân indol, acid HNO3 đậm đặc sẽ demethyl hóa –OCH3 > OH. Nhóm –OH bị oxi hoá tạo cetone cho ra vòng quinone có màu đỏ cam.Là phản ứng đặc hiệu để nhận biết strychnin và brucin.Kiểm nghiệm lá Trà Folium Camelliae:Dược liệu là lá của cây Trà (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze = Thea chinensis L., Theaceae)Định tính bằng thuốc thử đặc hiệu:Chiết xuất: Cho 5g bột lá Trà vào bình nón 100ml, làm ẩm với dung dịch Na2CO3, để trong 5p. Thêm 50ml nước sôi, lắc trong 10p. Lọc lấy dịch lọc . Để nguội lắc với 20ml DCM (CHCl3), gạn lấy lớp CHCl3 bên dưới, làm khan với một ít Na2SO4 khan. Cho vào một chén sứ nhỏ, bốc hơi trên bếp cách thủy đến cắn khô.Phản ứng murexid: Nhỏ lên cắn 3 giọt HCl đậm đặc và 2 giọt H2O2 đậm đặc. Bốc hơi trên bếp cách thủy đến cắn khô.Thêm vào cắn vài giọt NH4OH đậm đặc, sẽ xuất hiện màu đỏ tím.Kết luận: Dương tính.Giải thích: Do caffein có tính kiềm rất yếu nên phản ứng cần thực hiện trong môi trường khan > dùng Na2SO4 để loại bỏ nước trong dung dịch cloroform, để khi đun nóng bốc hơi cloroform sẽ nhanh hơn do tsôi CHCl3 =61,2°C < tsôi H2O =100°C.H2O2 ddHCldd là tác nhân oxi hóa mạnh, sẽ oxi hóa caffein thành purpuric acid.Sau khi cô cắn để loại bỏ H2O2 ddHCldd cho cắn tác dụng với NH4OH sẽ cho màu đỏ tím do tạo thành muối murexide (muối ammonium purpurate).CÂU HỎI THẢO LUẬNTrong chiết xuất Trà tại sao lại dùng Na2CO3 để làm ẩm dược liệu?Tạo môi trường bazo, giúp dược liệu trương nở, dung môi dễ thấm vào tế bào và chiết được nhiều hoạt chất hơn.Thuốc thử đặc hiệu, thuốc thử chung?Thuốc thử chung là thuốc thử dành cho tất cả các phản ứng.Thuốc thử đặc hiệu chỉ dành cho 1 phản ứng riêng biệt.
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG
BÁO CÁO THỰC HÀNH
BỘ MÔN DƯỢC LIỆU 2
NĂM 2020
Trang 2Bài 2 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID
A CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1 Khái niệm
- Các alkaloid (alcaloid) là những base hữu cơ thường dễ tan trongcác dung môi hữu cơ (như ether, benzen, cloroform, aceton,methanol và ethanol)
- Đa số các alkaloid base thự tế không tan trong nước
- Một vài alkaloid có cấu trúc amonium bậc IV tan được trong nước
và kém tan trong dung môi hữu cơ
- Một số alkaloid không có oxy tồn tại duới trạng thái lỏng có thểtan ít trong nước
- Một số alkaloid dạng lỏng có thể bay hơi và lôi cuốn dược theohơi nước
- Một số alkaloid không có oxy ở dạng rắn có thể thăng hoa được ở
2 Tính chất
- Alkaloid thường là những base yếu, tan trong các dung môi hữu
cơ Không tan trong nước Khi cho alkaloid tác dụng với acid sẽ thudược alkaloid dạng muối
- Các muối của alkaloid thường dễ tan trong nước Các muối này
dễ bị các chất kiềm vô cơ (NH4OH NaOH) thậm chí cả các muốikhác (Na2CO3, đôi khi cả NaHCO3) đẩy ra khỏi muối cho lại cácalkaloid base ban đầu
Trang 3- Alkaloid phản ứng với các thuốc thử chung (thuốc thử tạo tủa) tạo
thành các muối khó tan (dạng kết tinh hay dạng vô định hình) đượcứng dụng trong định tính alkaloid
- Một số alkaloid hay nhóm alkaloid có thể cho màu sắc đặc trưng
với một số thuốc thử gọi là thuốc thứ đặc hiệu của alkaloid (thuốc
thử tạo màu) ứng dụng trong định tính hoặc làm thuốc thử pháthiện trong sắc ký
3 Các phương pháp chiết xuất
- Trong cây, các alkaloid thường tồn tại dưới dạng muối hòa tan vớiacid hữu cơ hoặc vô cơ hay dạng kết hợp với tanin Người ta có thểchiết alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật bằng nhiều cách nhưngnhìn chung có thể quy về 2 cách chính là:
+ Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng alkaloid base bằngdung môi hữu cơ
+ Chiết alkaloid ra khỏi dược liệu dưới dạng muối bằng dung môiphân cực (nước, cồn, hỗn hợp cồn nước đã bị acid hóa)
- Với một vài alkaloid đặc biệt, người ta có thể chiết bằng:
+ Phương pháp cất kéo lôi cuốn theo hơi nước (chiêt xuất nicotin
từ Thuốc lá)
+ Phương pháp thăng hoa (chiết xuất cfein từ Trà)
- Dựa vào tính tan khác nhau của dạng base và dạng muối alkaloidtrong các dung môi, người ta có thể loại phần nào tạp chất ra khỏidịch chiết trước khi định tính, định lượng hay phân lập các alkaloidtinh khiết
Các quy trình dưới đây thường được sử dụng trong chiết xuấtalkaloid từ nguyên liệu thực vật dùng cho định tính alkaloid
Chú ý:
Thế tích dung môi chiết, thời gian chiết trong các phương pháp trên
có thể thay đổi tùy thuộc vào dược liệu và phương tiện sử dụng.
Trang 4B THỰC HÀNH
1 Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm (Phương pháp 1):
- Cân 3g Dược liệu Bình vôi
- Kiềm hoá bằng NH4OH đậm đặc (vừa đủ ẩm) Mỗi lần thêm 5 giọtkhoảng 35 giọt vừa đủ ẩm Để yên 10 phút
Trang 5- Chiết bằng 20ml CHCl3 ở nhiệt độ phòng sau đó lọc bông.
Trang 6
Thu được dịch chiết CHCl3
- Tiếp tục cho dịch chiết vào bình lắng gạn thêm vào 10 mlH2SO4 lọc lắng gạng 2 lần Thu dịch chiết lớp trên
Trang 7 Thu được dịch chiết nước acid
2 Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung.
Trang 8- Lấy 4 ống nghiệm đánh số 0,1,2,3 thêm vào mỗi ống 2ml dịchchiết nước acid bình vôi.
- Tiếp tục thêm riêng lẻ 3ml vào ống 1,2,3 lần lượt là Bouchardat,Valse-Mayer, Dragendorff Ống 0 dùng để so sánh
Nhận định kết quả:
- Ống 1: cho kết quả (+) với thuốc thử Bouchardat
Trang 9- Ống 2 : cho kết quả (++++) với thuốc thử Valse-Mayer
- Ống 3: Cho kết quả (++) với thuốc thử Dragendorff
Một số câu hỏi (?)
Khi cho NH4OH pH>10 thì xử lý như thế nào?
- Thêm H2SO4 2% để trung hoà lại để PH=10
Nồng độ CHCl3 là ?
- Nồng độ từ 25-28%
Tại sao lọc dịch chiết bột Dược liệu bằng bông?
- Vì bột Dược liệu hạt to nên có thể chiết bằng bông và tiết kiệmnhiều thời gian hơn thay vì chiết bằng giấy lọc
Khi nào chiết bằng giấy lọc?
- Khi Dược liêu có hạt nhỏ cần lọc kỹ để loại bỏ các tạp chất đểthu dịch tinh khiết
Dược liều bình vôi:
Tại sao Phải Kiềm hóa bằng NH4OH đặm đặc (vừa đủ ấm)?
- Để chuyển alkaloid dưới dạng muối trong cơ thể sinh vật thànhdạng base tự do tan trong dung môi hữu cơ người ta thườngngâm tẩm mẫu trong dung dịch kiềm loãng hoặc dung dịchamoniac
- Ngoài ra, dược liệu khi được làm ẩm sẽ trương nở , giúp chodung môi thấm vào tế bào, kéo hoạt chất ra dễ dàng hơn
Dược liệu lá sen:
Tại sao (khi sử dụng dịch chiết nước acid với NH4OH đđ phảichỉnh đến pH= 10?
- Vì khi PH=10 NH4OH Kiềm hoá vừa đủ sẽ tách chiết được Dịchchiết aicd thành Dịch chiết CHCl3 và acid Đã loại bỏ hết tạp chất.Khi PH<10 thì không thể loại bỏ hết tạp chất vẫn còn tính aicd KhiPH>10 Thì dịch chiết sẽ trung hoà với NH4OH bị kiềm hoá đi
Dược liệu tâm sen:
Trang 10 Cách pha chế cồn aicd 5% ?
- Với cồn 96 độ cần thêm khoảng 4.3ml acid đậm đặc để đượccồn aicd 5%
Khi nào phải trung hòa dịch chiết cồn acid đến pH=5-6 ?
- Khi chiết dịch chiết bằng clorofom
Câu hói thảo luận:
1 Những điểm chú ý khi tiến hành định tính alkaloid bằng thuốc thửchung ?
- Khi thực hiện phản ứng với thuốc thử chung phải cho từ từ từnggiọt thuốc thử vào ống nghiệm
- Không nên cho quá nhiều thuốc thử vào ống nghiệm vì một sốthuốc thử có tủa và tủa tan trong một lượng thuốc thử thừa
Bài 3 ĐỊNH TÍNH ALKALOID TRONG DƯỢC LIỆU
Trang 11 Kiềm hóa dung dịch về pH=10 bằng NH 4 OH
Lấy một mảnh giấy quỳ rồi chia đều ra thành từng mảnh nhỏ đặt lên mặtkính đồng hồ để định pH dung dịch
Nhỏ vài giọt NH4OH vào mẫu thử Dùng đũa thủy tinh chấm vào dung dịchrồi chấm lên những mảnh quỳ tím trên mặt kính đồng hồ, nếu giấy quỳ tímvẫn còn màu đỏ thì tiếp tục nhỏ NH4OH và chấm thử lên quỳ tím cho đếnkhi giấy quỳ cho màu giống pH=10 (màu xanh đen) trên thang đo pH thìngừng
Trang 12 Cho mẫu thử vào từng bình lắng gạn cùng với 10ml dd CHCl3, đậy nắp bìnhlại và đem lắc 3 lần (lưu ý lắc nhẹ nhàng tránh lắc mạnh dễ gây tạo nhũ) sau
đó gạn lấy phần dịch trong bên dưới, đem đun cách thủy đến cô lại cònkhoảng 1-2ml Chấm sắc kí
Trang 13
Phát hiện vết trên bản mỏng bằng máy soi UV:
Ánh sáng ở bước sóng 254 nm
Kết quả: Vết do chuyển cao, thẳng, vết có màu xanh dương đậm
Cách làm hiện vết bằng thuốc thử Dragendorff
Dùng kẹp gắp bản mỏng nhúng nhanh vào thuốc thử Dragendorff rồi để khô
sẽ thấy xuất hiện vết trên bản mỏng
Trang 14III TRẢ LỜI CÂU HỎI
1 Những điểm cần chú ý khi tiến hành định tính alkaloid bằng thuốc thử chung?
- Khi thực hiện phản ứng với thuốc thử chung phải cho từ từ từng giọtthuốc thử ống nghiệm
- Không nên cho quá nhiều thuốc thử vào ống nghiệm vì một số thuốc thử
có tủa và tủa tan lại trong một lượng thuốc thử thừa
2 Ý nghĩa của việc dùng và NH 4 OH trong hệ dung môi hay bão hòa bình sắc kí?
- Khi cho NH4OH vào thì pH của dung dịch lớn hơn pHa+2, các alkaloidchuyển về một dạng nhất định (alkaloid base), các vết sắc kí gọn, đều vàđẹp
- Khi cho NH4OH thì mẫu ở dạng alkaloid base (kém phân cực) cho Rfcao và làm độ chính xác cao hơn
3 Nếu các vết có Rf quá thấp trên sắc kí đồ, hướng giải quyết để có sắc kí đồ tốt hơn?
- Thay thế hệ dung môi
- Chấm dung dịch thử với một lượng vừa đủ
- Trong quá trình khai triển, để dung môi khai triển chạy quãng đườngcàng dài càng tốt mà gần mép bản mỏng không quá 0,5 cm
- Chuyển dạng của alkaloid
Trang 154 Có thể kết luận hai chất nào đó là khác nhau hoặc là đồng nhất bằng sắc
Để có độ chính xác cao hơn có thể làm với nhiều hệ dung môi khác nhau hoặc
xử lý hai chất có cùng Rf sau đócho chạy với một hệ dung môi khác nếu vẫncùng Rf thì kết luận là chất X có trong thành phần của hỗn hợp Y
6 Alkaloid tâm sen và lá sen giống hay khác? Tại sao?
Alkaloid toàn phần thu được từ lá sen kiểm tra trên sắc ký bản mỏng với hệ dungmôi S2 và thuốc thử Dragendoff thấy có ít nhất 2 vết, trong đó có một vết rất đậm
có Rf trùng với nuciferin, allaloid toàn phần thu được từ lá sen bằng phương phápsắc ký lớp mỏng, trong tâm sen có 3 vết Thành phần alkaloid của tâm Sen đãđược khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng Alkaloid chính trong đó đã được phân lập
và xác định cấu trúc là neferin và nuciferin
BÀI 4 ĐỊNH TÍNH ALKALOID BẰNG THUỐC THỬ ĐẶC
HIỆU
I CƠ SỞ LÝ THUYẾT
II THỰC HÀNH
Kiểm nghiệm Hạt Mã tiền (Semen Strychnii)
Bộ phận dùng là hạt cây Mã tiền (Strychnos nux-monica L., Loganiaceae)
Trang 16- Cân 3g bột dược liệu cho vào becher, thêm 20ml dung dịch H2SO4 2%
- Đun BM 15p, lọc nóng qua gòn (2 lần x 20ml)
- Thu được dịch chiết nước acid, thêm NH4OH đậm đặc, chỉnh pH =10
Trang 17- Thêm CHCl3 10ml x 2 lần
- Thêm H2SO4 2% (5ml x 2 lần)
Trang 18- Lắc và lọc lấy lớp dung dịch bên dưới.
- Cho dịch cloroform vào 2 chén sứ, cô cách thủy tới cắn khô
Trang 19 Kết luận: Dương tính Dược liệu Mã tiền chứ Brucin và Strychnin.
Giải thích: Vì strychnin là alkaloid nhân indol, vị trí N số 9 có khả năng tạo
muối với H2SO4 và cho phản ứng oxi hóa với kalidicromate Brucin không chophản ứng này vì có nhóm –OCH3 khóa phản ứng
Trang 20
Định tính Brucin:
- Nhỏ một giọt HNO3 đậm đặc vào cắn trên chén 2 sẽ có màu đỏ cam
Kết luận: Dương tính.
Giải thích: vì Bruxin có 2 nhóm methoxy ở vòng thơm của nhân indol, acid
HNO3 đậm đặc sẽ demethyl hóa –OCH3 -> OH Nhóm –OH bị oxi hoá tạocetone cho ra vòng quinone có màu đỏ cam
Là phản ứng đặc hiệu để nhận biết strychnin và brucin
Trang 21 Kiểm nghiệm lá Trà Folium Camelliae:
Dược liệu là lá của cây Trà (Camellia sinensis (L.) O Kuntze = Thea chinensis
Trang 22- Lọc lấy dịch lọc
- Để nguội lắc với 20ml DCM (CHCl3), gạn lấy lớp CHCl3 bên dưới, làmkhan với một ít Na2SO4 khan
Trang 23- Cho vào một chén sứ nhỏ, bốc hơi trên bếp cách thủy đến cắn khô
Phản ứng murexid:
- Nhỏ lên cắn 3 giọt HCl đậm đặc và 2 giọt H2O2 đậm đặc
- Bốc hơi trên bếp cách thủy đến cắn khô
- Thêm vào cắn vài giọt NH4OH đậm đặc, sẽ xuất hiện màu đỏ tím
Kết luận: Dương tính.
Trang 24 Giải thích: Do caffein có tính kiềm rất yếu nên phản ứng cần thực hiện trong
môi trường khan -> dùng Na2SO4 để loại bỏ nước trong dung dịch cloroform,
để khi đun nóng bốc hơi cloroform sẽ nhanh hơn do tsôi CHCl3 =61,2°C < tsôi H2O
=100°C
H2O2 dd/HCldd là tác nhân oxi hóa mạnh, sẽ oxi hóa caffein thành purpuric acid.Sau khi cô cắn để loại bỏ H2O2 dd/HCldd cho cắn tác dụng với NH4OH sẽ chomàu đỏ tím do tạo thành muối murexide (muối ammonium purpurate)
III CÂU HỎI THẢO LUẬN
Trong chiết xuất Trà tại sao lại dùng Na 2 CO 3 để làm ẩm dược liệu?
Tạo môi trường bazo, giúp dược liệu trương nở, dung môi dễ thấm vào tế bào vàchiết được nhiều hoạt chất hơn
Thuốc thử đặc hiệu, thuốc thử chung?
Thuốc thử chung là thuốc thử dành cho tất cả các phản ứng
Thuốc thử đặc hiệu chỉ dành cho 1 phản ứng riêng biệt
H2O2 nồng độ bao nhiêu?
Trang 25 Tại sao bazo tan được trong nước nóng?
Alkaloid trong lá Chè (caffein) có tính kiềm rất yếu nên không thể chiết đượcbằng các phương pháp chiết alkaloid thông thường Caffein tan tốt trong nướcnóng, rất ít tan trong nước lạnh -> Dùng nước sôi để chiết alkaloid từ chè Điểmnóng chảy của nó là 235 ºC và ở nhiệt độ cao hơn, nó bị phân hủy
Chi? Tên khoa học? Bộ phận dùng? Alkaloid chính của 4 dược liệu?
Mã Tiền Strychnos Strychnos nux- vomica Hạt strychnin
Cà độc dược Datura Datura metelL. Lá/Hạt scopolamin
Canh ki na Cinchona Cinchona spp. Vỏ thân quinin
Vàng đắng Coscinium fenestratum Coscinium Thân cây berberin
Trà Camellia Camellia sinensis Lá caffeine
1 Ý nghĩa của việc làm ẩm dược liệu với một lượng vừa đủ kiềm khi chiết alkaloid base bằng các dung môi hữu cơ kém phân cực?
Alkaloid có tính kiềm Làm ẩm dược liệu bằng dung môi hữu cơ kém phân cực đểchuyển alkaloid dạng muối trong tế bào thực vật sang dạng bazo tự do Ngoài ra,giúp dược liệu trương nở, dung môi dễ thấm vào tế bào và chiết được nhiều hoạtchất hơn
2 Các giai đoạn nào cần chú ý khi thực hiện phản ứng thaleoquinin, erythroquinin?
- Phản ứng thalleoquinin: làm mất huỳnh quang như phản ứng trên, thêm NH4OH(ammoni hydroxyd) thừa sẽ cho màu xanh lục
- Phản ứng erythroquinin: dung dịch muối quinin sau khi tác dụng với halogen,cho thêm NH4OH (ammoni hydroxyd) và một ít kali fericyanur sẽ cho tủa màu đỏ
Trang 26BÀI 5 ĐỊNH LƯỢNG DƯỢC LIỆU BẰNG
PHƯƠNG PHÁP CÂN
I CƠ SỞ LÝ THUYẾT
- Để định lượng alkaloid trong dược liệu bằng phương pháp cân, trước tiên người ta phải chiết kiệt alkloid ra khỏi nguyên liệu thực vật bằng các dung môi thích hợp và loại tối đa các tạp chất trong dịch chiết bằng các phương pháp phù hợp Sau đó xác định hàm lượng alkaloid bằng cách cân cắn alkaloid sau khi đã loại bỏ dung môi Từ lượng cắn này, suy ra hàm lượng % của alkaloid trong dược liệu.
- Tùy theo từng nguyên liệu mà người ta áp dụng phương pháp chiết, dung môi chiết và phương pháp loại tạp thích hợp nhưng nhìn chung người ta thường chiết alkaloid base trong môi trường kiềm và loại các tạp chất bằng cách chuyển qua lại alkaloid trong môi trường nước acid và dung môi hữu cơ.
II THỰC HÀNH
1 Nguyên vật liệu thí nghiệm
1.1 Dung môi, hóa chất, thuốc thử
Trang 27- Thuốc thử Valse – Mayer
Trang 281.2 Dược liệu
- Bình vôi (Tuber Stephaniae) là gốc thân phình thành củ của một số loại Bình vôi (Stephania spp., Menispermaceae).
2 Phương pháp tiến hành
- Cân chính xác khoảng 3g dược liệu Bình vôi cho vào erlen
Trang 29- Chiết tiếp bằng cách đun cách thủy 15 phút với 30ml CHCl3 cho tới khi dịch chiết không còn phản ứng với thuốc thử Valse-Mayer nữa.
(Cách thử phản ứng với Valse-Mayer: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên lam kính, hơ trên bếp cách thủy khô hết Nhỏ lần 2 thêm 2 giọt dịch chiết, làm khô Nhỏ lên cắn dịch chiết 2 giọt acid sulfuric 2%, dùng đủa thủy tinh khuấy nhẹ Thêm 1 giọt Valse-Mayer).
Trang 30Dịch chiết lần 1 tủa nhiều hơn dịch chiết lần 2
HCl 2% vào bình và tương tự các lần sau đó 10ml HCl 2% cho đến khi dịch HCl không cho phản ứng với thuốc thử Valse Mayer.
Trang 31 Dịch chiết lần 1 tủa hơn dịch chiết tủa lần
2
- Gộp chung dung dịch cho vào becher
không còn phản ứng với thuốc thử Valse-Mayer
Trang 32- Gộp chung dịch chiết CHCl3 vào bình lắng gạn, rửa dịch CHCl3 1 lần
bằng Natri sulfat khan.
Trang 33- Cho dịch chiết vào chén sứ rửa bằng 10ml CHCl3 Bốc hơi trên bếp cách thủy rồi đem bỏ vô tủ sấy 100°C cho tới khi khối lượng cắn không đỗi (Đem chén sứ bỏ vào tủ sấy và khử trùng rồi đem cân trước khi cho dịch chiết vào).
Trang 34Khối lượng chén sứ trước khi cho dịch chiết vào
Khối lượng chén sứ sau khi sấy
Tính hàm lượng alkaloid base toàn phần:
a×(1−h)%
Trong đó:
- a: khối lượng dược liệu đem định lượng (gam)
- h: độ ẩm của mẫu định lượng (%): cho độ ẩm là 10%
- P: Khối lượng dược liệu sau cắn.
Trang 35P=75,4939-75,4705=0,0234 (g)
3,0037 ×(1−10 %)=0,87 %
CÂU HỎI THẢO LUẬN
1 Ưu, khuyết điểm và phạm vi ứng dụng của định lượng alkaloid bằng phương pháp cân?
Ưu điểm: Cách tiến hành đơn giản
Khuyết điểm: Do độ ẩm thủy phân dễ thay đổi và cần có cân chính xác dẫn đến dễ sai số.
Phạm vi ứng dụng của định lượng alkalid bằng phương pháp cân có thể định lượng khá chính xác về hàm lượng dược chất
có trong dược liệu, giúp phân biệt dược liệu mới hay đã chiết xuất.
2 Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả định lượng alkaloid bằng phương pháp cân, hướng khắc phục?
Độ ẩm không khí, chất liệu dung môi hóa chất, độ ẩm dược liệu, cân
Cách khắc phục: làm trong phòng kín, chất liệu hóa chất nên mua ở nơi có uy tín cao, độ ẩm dược liệu phải giống với dược điển Việt Nam, cân cần chính xác.
3 Ý nghĩa của việc sử dụng nước cất để rửa CHCl3?
nên nó sẽ tách lớp, ngoài ra nước có thể loại một số tạp phân
Bài 6 ĐỊNH LƯỢNG, KIỂM NGHIỆM TINH DẦU SẢ BẰNG
SẮC KÍ LỚP MỎNG