“Đa dạng hóa các môi trƣờng sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

Đa dạng hóa các môi trƣờng sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum

Phần 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Thạch dừa (Nata de Coco) là một loại thức ăn tráng miệng phổ biến, có nguồn

gốc từ Philippin, được tạo ra từ sự lên men nước dừa bởi vi khuẩn Acetobacter

xylinum, và là một trong số các loại thực phẩm thương mại đầu tiên ứng dụng từ

bacterial cellulose (BC)

Thuận lợi của việc sản xuất BC theo phương pháp lên men truyền thống chính

là ưu điểm của công nghệ sản xuất vi sinh: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị đơn giản, ít tốn mặt bằng và nhân công, tương ứng giá thành rẻ… Tuy nhiên, điểm hạn chế của nó lại là phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu (nước dừa già), dẫn đến khó ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp

Xuất phát từ yêu cầu trên, tôi thực hiện đề tài “Đa dạng hóa các môi trường

sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum” nhằm nghiên cứu khả

năng tạo BC trên nhiều loại môi trường khác nhau, tận dụng phế phụ liệu từ các quá trình sản xuất thực phẩm khác

 Mục đích của đề tài

- Tìm môi trường thay thế môi trường nước dừa già truyền thống để nuôi cấy vi

khuẩn Acetobacter xylinum

- Tìm công thức tối ưu nhất để sản xuất bacterial cellulose trên các môi trường thay thế

 Yêu cầu

- Thuần khiết giống và giữ giống Acetobacter xylinum

- Khảo sát và đánh giá sinh khối cellulose thô trên các môi trường:

Nước dừa già (đối chứng)

Nước dứa

Nước cốt dừa

- Khảo sát và đánh giá khả năng phát triển của Acetobacter xylinum khi thay đổi

các thành phần bổ sung

Phần 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

THÍ NGHIỆM

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: đề tài được tiến hành từ 03/2005 đến 08/2005

Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Công nghệ thực phẩm, trường ĐH Nông Lâm TP HCM

2.2 Vật liệu – hoá chất – trang thiết bị

2.2.1 Nguồn giống: giống vi khuẩn Acetobacter xylinum do phòng thí nghiệm vi sinh

khoa Công nghệ thực phẩm cung cấp

2.2.2 Nguyên liệu: nước dừa già, nước cốt dừa, nước dứa

2.2.3 Hoá chất

- Nhóm hoá chất bổ sung vào môi trường: DAP, SA, saccharose, agar, acid acetic, cao nấm men

- Hoá chất nhuộm Gram: Crystal violet, Fuschin, Lugol

2.2.4 Trang thiết bị: nồi hấp autoclave, tủ cấy vô trùng, kính hiển vi, tủ sấy, cân điện

tử, các dụng cụ thủy tinh, hộp nhựa…

2.2.5 Môi trường dinh dưỡng

Môi trường I: môi trường hoạt hóa

Môi trường II: môi trường nhân giống và giữ giống

Chế độ khử trùng của môi trường hoạt hóa và môi trường nhân giống là 1210

C, 1atm, 15 phút Acid acetic được bổ sung sau khi nấu sôi môi trường

Môi trường thí nghiệm

- Môi trường III: môi trường nước cốt dừa, công thức môi trường được bố trí theo 81 nghiệm thức khác nhau

- Môi trường IV: môi trường nước dứa, công thức môi trường được bố trí theo 81 nghiệm thức khác nhau

Thanh trùng bằng phương pháp nấu sôi ở 1000C

2.3 Nội dung và phương pháp thí nghiệm 2.3.1 Thuần khiết giống và nhân giống đã thuần khiết

Mục đích thí nghiệm: tạo ra đủ giống thuần khiết cung cấp cho quá trình lên men

Sơ đồ thí nghiệm:

Giống của phòng thí nghiệm

Chọn khuẩn lạc thuần khiết

Cấy chuyền nhiều lần

(môi trường II trong ống nghiệm)

Cấy phân lập trên môi trường thạch đĩa

Nhân giống cấp 2 (môi trường II trong chai nước biển)

Nhuộm Gram

Quy trình chung để tạo BC:

2.3.2 So sánh hiệu quả hoạt hóa giống bằng môi trường I và môi trường I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright

Mục đích thí nghiệm: đánh giá xem môi trường nào giúp hoạt hóa giống tốt hơn

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại

Trọng lượng BC thô (g)

NT1: theo thành phần môi trường I

NT2: môi trường I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright

Dung dịch Skeggs & Wright: MgSO4.7H2O 40g

MnSO4.4H2O 2g

Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) sau 8 ngày lên men ở nhiệt độ phòng

2.3.3 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trường nước cốt dừa

Mục đích thí nghiệm: tìm công thức tối ưu nhất cho việc sản xuất BC trên môi trường nước cốt dừa

Chuẩn bị môi trường Thanh trùng / khử trùng

Để nguội Lên men 8 ngày ở nhiệt độ phòng Thu lớp váng BC nổi trên bề mặt

Cân

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 4 yếu tố với 2 lần lặp lại

dừa/nước (g/ml)

DAP (%)

SA (%)

Sacccharose (%)

Nồng độ

1/10 1/20 1/30

0,2 0,4 0,6

0,6 0,8 1,0

2

4

6

MT

TLPL

(lần)

DAP

(%)

SA (%)

Sac (%) MT

TLPL (lần)

DAP (%)

SA (%)

Sac (%) MT

TLPL (lần)

DAP (%)

SA (%)

Sac (%)

Ghi chú: MT: môi trường

TLPL: tỷ lệ pha loãng Sac : saccharose

Đối chứng là môi trường II Tỷ lệ giống cấp 2 cấy vào môi trường là 10 % Hàm lượng acid acetic là 1,2 % Thời gian lên men là 8 ngày ở nhiệt độ phòng

Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g)

2.3.4 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trường nước dứa

Mục đích thí nghiệm: tìm công thức tối ưu nhất cho việc sản xuất BC trên môi trường nước dứa

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 4 yếu tố với 2 lần lặp lại

Yếu tố Tỉ lệ nước dứa/nước

(g/ml)

DAP (%)

SA (%)

Saccharose (%)

Nồng độ

1/10 1/20 1/30

0,2 0,4 0,6

0,6 0,8 1,0

2

4

6

MT

TLPL

(lần)

DAP

(%)

SA (%)

Sac (%) MT

TLPL (lần)

DAP (%)

SA (%)

Sac (%) MT

TLPL (lần)

DAP (%)

SA (%)

Sac (%)

Ghi chú: MT: môi trường

TLPL: tỷ lệ pha loãng Sac : saccharose

Đối chứng là môi trường II Tỷ lệ giống cấp 2 cấy vào môi trường là 10 % Hàm lượng acid acetic là 1,2 % Thời gian lên men là 8 ngày ở nhiệt độ phòng

Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g)

2.3.5 So sánh sinh khối BC thô thu hoạch từ môi trường nước dừa, nước cốt dừa

và nước dứa

Mục đích thí nghiệm: so sánh khả năng tạo sinh khối BC thô từ các môi trường thay thế với môi trường nước dừa già truyền thống

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại

Trọng lượng

BC thô (g)

NT1: môi trường nước cốt dừa theo kết quả mục 2.3.3

NT2: môi trường nước dứa theo kết quả mục 2.3.4

ĐC : môi trường nước dừa theo thành phần môi trường II

Tỷ lệ giống cấy vào môi trường: 10 %

Thời gian lên men: 8 ngày ở nhiệt độ phòng

Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g)

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của các loại acid đến quá trình lên men tạo BC

Mục đích thí nghiệm: đa dạng hóa các loại acid bổ sung để lên men tạo BC

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp l

NT1: bổ sung HCl đến pH = 4,5 NT2: bổ sung H2SO4 đến pH = 4,5

ĐC : bổ sung acid acetic đến pH = 4,5

Các thành phần khác cố định theo công thức môi trường II

Tỷ lệ giống cấy vào môi trường là 10 %, lên men 8 ngày ở nhiệt độ phòng

Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g)

Nghiệm thức NT 1 NT 2 NT 3

Trọng lượng

BC thô (g)

Phần 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thuần khiết giống và nhân giống đã thuần khiết

Từ giống chai A xylinum ở phòng thí nghiệm, tiến hành phân lập lại trên môi

trường thạch đĩa Kết quả quan sát đại thể và vi thể như sau:

3.1.1 Quan sát đại thể

Sau khi phân lập, mỗi tế bào tách riêng

rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc Các khuẩn

lạc có dạng tròn lồi, nhầy và trơn bóng, rìa mép

khuẩn lạc nhẵn, màu trắng trong hơi đục Sau 5

ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2-5

mm

3.1.2 Quan sát vi thể

Sau khi chọn khuẩn lạc điển hình, tiến hành nhuộm Gram, quan sát tế bào vi khuẩn ở vật kính X100 dưới giọt dầu cerde thu được kết quả như sau:

Giống A xylinum cấp I và cấp II

Như vậy từ giống chai sẵn có chúng tôi đã thuần khuyết được giống A xylinum và tiến

hành giữ giống trong môi trường lỏng (môi trường II)

Hình dạng

Kích thước

Nhuộm Gram

Hình que, xếp riêng lẻ hoặc thành chuỗi dài 2– 4 m

Gram âm (G-)

3.2 So sánh hiệu quả hoạt hoá giống bằng môi trường I và môi trường I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright

Bảng 3.2: Kết quả so sánh sinh khối BC thô giữa môi trường I và môi trường I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright

dung dịch Skeggs & Wright Trung bình trọng lượng

Biểu đồ so sánh trọng lượng BC thô giữa 2 môi trường

Qua bảng kết quả trên chúng tôi thấy sinh khối BC thô tạo ra bởi vi khuẩn A

xylinum sau quá trình hoạt hóa bởi 2 loại môi trường là tương đương nhau, không có

sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê (trắc nghiệm F, độ tin cậy 95 %).Việc bổ sung thêm dung dịch Skeggs & Wright là nhằm cung cấp thêm các loại muối khoáng, các

thành phần vô cơ để kích thích sự phát triển của A xylinum Nhưng kết quả cho thấy

rằng không có sự gia tăng đáng kể về trọng lượng BC Có nghĩa là lượng khoáng chất

trong nước dừa (môi trường I) đã đủ cho sự sinh trưởng và phát triển của A xylinum,

không cần phải bổ sung thêm, giúp tiết kiệm chi phí sản xuất

0

50

100

150

Nghiệm thức

3.3 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trường nước cốt dừa

Bảng 3.3: Kết quả sinh khối BC thô thu được từ các môi trường nước cốt dừa (g)

Qua bảng kết quả 3.3 và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, xác suất p << 0,05, chúng tôi thấy rằng cả 4 yếu tố tỷ lệ pha loãng, DAP, SA và saccharose đều có tương tác với nhau Công thức môi trường số 21, 24, 27 cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với các công thức môi trường khác, khác biệt này là rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học Tuy nhiên, khác biệt về trọng lượng BC thô giữa 3 môi trường 21,

24 và 27 không có ý nghĩa về mặt thống kê (độ tin cậy 95 %)

Tỷ lệ cơm dừa/nước = 1/10 cho trọng lượng BC cao nhất, khác biệt này có ý nghĩa thống kê so với các tỷ lệ pha loãng 1/20 và 1/30

MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB

Hàm lượng DAP = 0,6 % cho trọng lượng BC cao nhất, khác biệt này có ý nghĩa thống kê so với các tỷ lệ 0,2 và 0,4 % Hàm lượng phosphate này là cần thiết để

A xylinum phát triển tạo cellulose

Nếu xét riêng từng yếu tố thì hàm lượng SA = 1% cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với hàm lượng SA = 0,6 % và 0,8 % Nhưng do cả 4 yếu tố có tương tác với nhau nên hàm lượng SA = 0,6 % cũng tạo ra một lượng BC tương đương với khi dùng 0,8 % hay 1% SA Như vậy, để có hiệu quả kinh tế trong sản xuất, chúng tôi đề nghị chọn SA = 0,6 % làm công thức lên men

Từ sự tương tác 4 yếu tố, chúng tôi nhận thấy rằng hàm lượng đường saccharose = 6 % cho trọng lượng BC cao nhất

Như vậy, công thức tối ưu để sản xuất BC trên môi trường nước cốt dừa:

Yếu tố

Tỷ lệ cơm dừa/nước (g/ml)

DAP (%)

SA (%)

Saccharose (%)

Với công thức trên, ta có thể sản xuất BC từ môi trường nước cốt dừa thay cho môi trường nước dừa già truyền thống Điều này sẽ hạn chế được những khó khăn, tốn kém của việc vận chuyển nước dừa khi sản xuất BC ở những vùng miền không có nguyên liệu là nước dừa già

3.4 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trường nước dứa

Bảng 3.4: Kết quả trọng lượng BC thô thu được từ các môi trường nước dứa (g)

MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB

13 86.2 116 101.1 40 90.7 79.4 85 67 78.5 73.2 76

Qua bảng kết quả 3.4 và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, xác suất

p < 0,05, chúng tôi nhận thấy rằng cả 4 yếu tố tỷ lệ pha loãng, DAP, SA và saccharose

có tương tác với nhau Công thức môi trường số 22 và 78 cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với các công thức môi trường khác Khác biệt này rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học

Bảng 3.5: Công thức tối ưu để sản xuất BC trên môi trường nước dứa

Công thức

môi trường

Tỷ lệ dứa/nước (g/ml)

DAP (%)

SA (%)

Saccharose (%)

22

78

1/10 1/30

0,6 0,6

0,8 0,8

2

6

Ở công thức môi trường 22, khi ta pha loãng theo tỷ lệ dứa / nước = 1/10 thì lượng đường có trong nước dứa còn khá đủ để lên men tạo BC Vì vậy ta chỉ cần bổ sung thêm 2 % saccharose để tạo công thức tối ưu cho lên men sản xuất BC

Đối với công thức môi trường 78, tỷ lệ dứa / nước = 1/30, nghĩa là pha loãng 30 lần, lượng saccharose có trong nước dứa sẽ giảm đi, vì thế cần phải bổ sung thêm đường Lúc này hàm lượng saccharose phải là 6 % mới đảm bảo đủ cho quá trình lên men

Như vậy, ứng dụng vào thực tế, tùy thuộc tình hình, điều kiện và quy mô sản xuất mà ta chọn pha môi trường theo công thức 22 hay 78

3.5 So sánh sinh khối BC thô thu hoạch từ môi trường nước dừa, nước cốt dừa và nước dứa

Bảng 3.6: Sinh khối BC thô thu hoạch từ các môi trường sản xuất khác nhau

Biểu đồ so sánh sinh khối BC thô giữa 3 loại môi trường

Qua bảng kết quả 3.6 chúng tôi nhận thấy sinh khối BC tạo ra từ các loại môi trường là tương đương nhau Và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, độ tin cậy 95% càng thấy rõ rằng không có sự khác biệt ý nghĩa về phương diện thống kê học giữa trọng lượng BC được tạo ra từ 3 loại môi trường

Như vậy, khả năng tạo sinh khối BC của 2 môi trường thay thế (môi trường nước cốt dừa và môi trường nước dứa) là tương đương với môi trường truyền thống (môi trường nước dừa già)

Về mặt chất lượng, qua đánh giá cảm quan sơ bộ thấy kết quả như sau:

Bảng 3.7: Kết quả cảm quan BC thô thu hoạch từ 3 loại môi trường

Màu sắc

Cấu trúc

Trắng đục Chặt, mịn, không tách lớp

Trắng ngà Hơi chặt, mịn, không tách lớp

Trắng ngà Rất chặt, mịn, không tách lớp

135 141

140

0 50 100

150

Môi trường

Qua bảng kết quả 3.7, chúng tôi thấy rằng màu sắc BC sản xuất từ nước dừa có màu trắng đẹp hơn, nhưng màu trắng ngà của BC thô có thể mất hoặc giảm đi rất nhiều sau quá trình ngâm và rửa kĩ Còn về cấu trúc, BC sản xuất từ nước dứa có cấu trúc chặt chẽ hơn, BC sản xuất từ môi trường nước cốt dừa thì kém chặt hơn, nhưng ở cả 2 môi trường thay thế không có sự khác biệt lắm so với BC sản xuất từ nước dừa

Nhìn chung, màu sắc và cấu trúc của BC thô không ảnh hưởng mạnh đến chất lượng cảm quan của sản phẩm sau này Điều này được trình bày cụ thể trong phần ứng dụng của BC Vì vậy, môi trường nước cốt dừa và nước dứa hoàn toàn có khả năng thay thế nước dừa già để sản xuất BC ở quy mô công nghiệp

Hình 3.5: Sản phẩm BC thô thu hoạch từ 3 môi trường

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của các loại acid đến quá trình lên men tạo BC

Bảng 3.8: Kết quả so sánh sinh khối BC thô tạo ra khi thay đổi acid bổ sung để điều chỉnh pH đến 4,5

Biểu đồ so sánh trọng lượng BC thô khi thay đổi acid bổ sung đến pH = 4,5

Qua bảng số liệu 3.8 và kết quả xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F và LSD, chúng tôi thấy không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê giữa trọng lượng BC thô được tạo ra từ các môi trường bổ sung các loại acid khác nhau Từ đây có thể kết luận rằng vai trò của acid acetic chỉ là chất điều chỉnh pH, tạo ra môi trường acid để lên

men, chứ không đóng vai trò là chất cung cấp năng lượng cho A xylinum phát triển

Như vậy, trong sản xuất công nghiệp, ta có thể thay thế acid acetic bằng các loại acid

vô cơ khác như HCl, H2SO4 để tiện dụng hơn, kinh tế hơn

3.7 So sánh giá trị kinh tế của các loại môi trường lên men sản xuất BC

Bảng 3.9: So sánh giá thành các loại nguyên liệu tính trên 100 lít môi trường

sản xuất BC

Môi trường nước dừa

Thành phần Nước dừa DAP (0,2%) SA (0,8%) Saccharose (2%)

Tổng tiền (đ) 124.000

136.3 135.7

139.3

0

50

100

150