Nghiên cứu tạo sinh khối spirulina platensis 11

Nghiên cứu tạo sinh khối spirulina platensis sạch bằng quy trình nuôi trong hệ kín

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Kết quả thuần chủng S platensis

Trong dịch nuôi S platensis xuất hiện chủ yếu một loại tạp khuẩn Đã xác

định sơ bộ được là loại trực khuẩn, gram dương, hình que, hai đầu dạng thon

3.1.1 Kết quả thuần chủng bằng tác nhân UV

Khi sử dụng tia UV kết quả đạt được không những kém xa mong đợi mà còn

có ảnh hưởng xấu, lượng vi khuẩn tạp nhiễm có chiều hướng tăng tỷ lệ với thời gian chiếu Số lượng khuẩn lạc trước khi chiếu UV là 500 CFU/ml và sau khi chiếu UV

là 104 CFU/ml

Như vậy, có thể yếu tố thời gian chiếu UV có tác động xấu đến S platensis,

từ đó hỗ trợ cho vi khuẩn lạ phát triển.Tia cực tím có khả năng diệt khuẩn, điều đó

có nghĩa rằng S platensis cũng là đối tượng chịu ảnh hưởng, khả năng này càng dễ xảy ra khi S platensis được phơi trực tiếp dưới tia cực tím

Mặt khác, S platensis với kích thước lớn hơn nhiều lần vi khuẩn thì lượng tia

UV nhận được cũng sẽ nhiều hơn, và sinh khối S platensis cũng là nơi mà vi khuẩn

có thể ẩn nấp để tránh tác động của tia UV

Thực nghiệm cho thấy, khi chiếu liên tục tia UV trong 30 phút, hầu hết dạng

sợi S platensis bị phá hủy thành dạng đoạn ngắn hoặc đơn bào Khi tăng thời gian

chiếu lên 60 phút, toàn bộ tế bào bị phá vỡ, giải phóng các chất chứa bên trong tế bào

Đối với vi khuẩn tia UV có tác động tiêu diệt tương tự, nhưng nhờ kích thước

lớn của S platensis che chắn nên tác dụng đó sẽ giảm đi Thêm vào đó, S platensis

với thành phần dinh dưỡng hoàn hảo càng thúc đẩy nhanh sự phát triển trở lại của vi sinh vật tạp nhiễm

S platensis với cấu trúc xoắn lò xo, nên luôn tồn tại những vị trí bị che khuất

theo chiều dài sợi, đây chính là chỗ mà UV hầu như không thể tiếp cận để phát huy tính sát khuẩn

Như vậy có thể kết luận rằng, bố trí thí nghiệm tia UV như mục 2.1.1 không

có tác dụng làm thuần S platensis nếu như chiếu trực tiếp vào dịch nuôi

Hình 3.1 Mật độ vi khuẩn nhiễm trước khi chiếu UV

Hình 3.2 Mật độ vi khuẩn nhiễm sau khi chiếu UV 5 phút

3.1.2 Kết quả thuần chủng bằng môi trường Zarrouk vô trùng

S platensis với khả năng phát triển nhanh hơn vi khuẩn tạp nhiễm trong

những giờ đầu tiên cấy trên môi trường thạch Zarrouk, nên có thể tận dụng đặc

điểm này để làm thuần chủng

Kết quả cho thấy, sau 4 lần cấy chuyền theo phương pháp này có thể thu được

sợi sinh khối S platensis sạch tạp khuẩn nhiễm, không có khuẩn lạc tạp khuẩn mọc

lên sau 48 giờ cấy

Số lượng khuẩn lạc giảm rõ rệt sau mỗi lần cấy chuyền (bảng 3.1)

Bảng 3.1 Diễn biến số khuẩn lạc sau mỗi lần cấy chuyền

Lần cấy chuyền Khuẩn lạc (CFU/ml)

1 500

2 47

3 9

4 (÷)

Chú giải: (÷) là có thể còn song rất ít, không phát hiện được

Vi khuẩn nhiễm bị rửa trôi phần lớn ở các ống nghiệm Khi chưa kịp tăng số

lượng trở lại thì thao tác cấy lên môi trường thạch Zarrouk vô trùng với thành phần

hoàn toàn là khoáng, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật dị dưỡng Trong khi đó, S

platensis với khả năng tự dưỡng vẫn phát triển sinh khối tạo ra những sợi mới trong

thời gian ngắn từ 6-8 giờ đồng hồ, những sợi mới này lại được chuyển sang môi

trường Zarrouk mới, vô trùng

Hình 3.3 S platensis quan sát dưới kính hiển vi sau bốn lần cấy chuyền (x1000)

Hình 3.4 S platensis phát triển trên môi trường Zarrouk thạch sau bốn lần cấy

chuyền

Khuẩn nhiễm là vi sinh vật dị dưỡng, do đó cần nguồn carbon hữu cơ để phát

triển, chúng sống trong môi trường nuôi S platensis là do các chất dinh dưỡng của

tế bào khuẩn lam bị phân hủy Môi trường Zarrouk không chứa bất kỳ nguồn carbon

hữu cơ nào Sợi sinh khối S platensis mới phát triển là những sợi còn khỏe mạnh,

do đó sẽ tiếp tục tăng sinh khối trong khoảng thời gian 12-14 giờ đồng hồ sau khi cấy trên môi trường Zarrouk mới Do nguồn dinh dưỡng bị hạn chế tới mức cạn kiệt nên vi khuẩn nhiễm cũng bị hạn chế tới mức tối thiểu trong thời gian đó Tế bào khuẩn nhiễm còn lại sẽ bị loại bỏ dần qua các bước rửa và cấy lên môi trường Zarrouk thạch vô trùng tiếp theo

Như vậy, bằng một phương pháp khá đơn giản bao gồm các bước “Môi

trường thạch – Môi trường dịch thể - Rửa –Môi trường thạch” thì thu được giống S

platensis thuần sau 4 lần lặp

3.2 Kết quả xác định mật độ tế bào khởi đầu để nuôi S platensis

Để thời gian toàn bộ quá trình nuôi không quá dài thì một mật độ tế bào S

platensis khởi đầu là cần thiết

S platensis được nuôi trong môi trường Zarrouk với 4 nồng độ sinh khối

khác nhau, kết quả thu được như bảng 3.2

Bảng 3.2 Tốc độ tăng sinh của S platensis ở nồng độ sinh khối ban đầu 0,1; 0,2;

0,3; và 0,4 g/l

Nồng độ sinh khối (g/l) Ngày

Sự phát triển của S platensis có đặc điểm, khi các sợi khuẩn lam đạt một mật

độ cần thiết thì sự phát triển mạnh mới bắt đầu diễn ra, điều đó giải thích cho thí

nghiệm nuôi ở nồng độ sinh khối 0,1; 0,2 (g/l) S platensis có biểu hiện phát triển

yếu trong khoảng 5-6 ngày đầu và đạt giá trị cao nhất lần lượt vào ngày nuôi thứ 16,

15

Theo bảng 3.21 (phụ lục 1), bốn nồng độ sinh khối khởi đầu đều có sự khác biệt và theo bảng 3.2, nồng độ sinh khối khởi đầu 0,4 g/l cho thời gian tăng trưởng ngắn nhất là 12 ngày, nhưng để có mật độ tế bào đạt 0,4 sẽ tốn nhiều thời gian nuôi ban đầu

Đồ thị 3.1 Tốc độ tăng sinh của S platensis ở nồng độ

tế bào ban đầu 0,1; 0,2; 0,3; và 0,4 g/l Theo đồ thị 3.1, trong ba giá trị 0,1; 0,2 và 0,3 thì từ khi sinh khối đạt khoảng

0,3 g/l S platensis có thể tăng sinh nhanh chóng đến nồng độ sinh khối cao nhất

khoảng 10-12 ngày sau

Do đó, giá trị sinh khối 0,3 g/l được chọn làm nồng độ sinh khối ban đầu để tiến hành các thí nghiệm sau

Hệ các ống thuộc một mặt phẳng song song với mặt đất (hệ 1)

Hệ các ống thuộc mặt phẳng vuông góc với mặt đất, các ống nối tiếp và song song với nhau (hệ 2)

Hệ các ống thuộc một mặt phẳng vuông góc với mặt đất, các ống song song với nhau, nhưng không nối với nhau trực tiếp mà nối bằng hai ống chung ở hai đầu trên và dưới (hệ 3)

nuôi S platensis là hoàn toàn không có khả năng đảo trộn môi trường nuôi

Hệ 2 có cùng kiểu nối tiếp như hệ 1 nhưng được dựng đứng lên theo chiều các ống vuông góc với mặt đất Hệ này có một số ưu, nhược điểm như sau:

Ưu điểm

¾ Tốn ít diện tích nhờ tận dụng khoảng không theo chiều cao

Nhược điểm

¾ Môi trường chỉ vào các ống 1, 3, 5, 7, 9

¾ Khí không sục vào hệ thống được

¾ Khó lấy mẫu làm thí nghiệm

¾ Dễ xảy ra hiện tượng rò rỉ môi trường nuôi

¾ Thu hoạch sinh khối khó

¾ Áp lực nước cao

Những nhược điểm trên dẫn đến hệ không thể hoạt động để nuôi S platensis

Có thể làm các lỗ thông khí phía trên mỗi ống, khi đó môi trường vào đầy tất cả các ống nhưng không khắc phục được nhược điểm còn lại Vì vậy hệ 2 không được tiếp tục nghiên cứu thêm trong luận văn này

Những kết quả kém của hệ 1 và 2 đã dẫn đến những thay đổi trong thiết kế hệ

và đã có hai hệ kín được tạo ra

Hệ 3 và hệ 4

Hệ 3 và 4 mang lại khả năng hoạt động cao khi nuôi S platensis cả về năng

suất lẫn chất lượng sinh khối Để có thể đánh giá đầy đủ về hệ 3 và 4 trong vai trò

nuôi S platensis, thì các thí nghiệm về thiết kế và năng suất đã được thực hiện và

cho một số kết quả như sau

Ưu và nhược điểm trong thiết kế

™ Cả hai hệ 3 và 4 đều mang những ưu điểm như dưới đây:

¾ Tiết kiệm diện tích

¾ Sục khí vào hệ thống dễ dàng

¾ Dễ lấy mẫu để làm kiểm tra

¾ Dễ thu hoạch sinh khối

Bảng 3.3 Một số đặc điểm khác biệt của hai hệ 3 và 4

Áp lực lên các mối lắp ghép cao Áp lực lên các mối lắp ghép thấp

Dễ rò rỉ dịch nuôi Dịch nuôi hầu như không bị rò rỉ

Khó lắp ráp do các ống phải có độ dài

bằng nhau

Dễ lắp ráp, các ống không cần dài bằng nhau

Vệ sinh hệ khó khăn Vệ sinh dễ dàng

Khó đưa môi trường nuôi vào hơn do phải

đưa từ dưới vào

Dễ đưa môi trường nuôi vào, có thể đưa

từ trên vào Không thể hoạt động riêng từng phần hệ

thống

Có thể hoạt động riêng từng phần hệ thống

Khó tìm vật liệu do phải có độ cứng Dễ tìm vật liệu

b) Về ưu nhược, điểm trong khi tiến hành nuôi S platensis của hai hệ 3 và 4

Cả hai hệ 3 và 4 đều cho thời gian nuôi ngắn và nồng độ cao hơn hệ hở cũng như không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện xung quang như gió, bụi, các vi khuẩn lạ xâm nhiễm, ít thất thoát nước và khí CO2 Mẫu được lấy từ van của hệ thống (xem hình 3.11)

Bảng 3.4 Một số ưu, nhược điểm khi nuôi S platensis của hai hệ 3 và 4

Nồng độ tế bào thấp hơn Nồng độ tế bào cao hơn

Cần khí sục hơn nhiều lần Cần ít khí sục hơn

S platensis phát triển không đồng đều ở

các ống khác nhau

S platensis phát triển ở các ống dưới

cùng trước nên thu hoạch dễ dàng

Theo bảng 3.5, hệ 4 với nồng độ sinh khối cao hơn nên cho năng suất cao

hơn, nồng độ sinh khối cao nhất của hệ 3 và 4 lần lượt là 2,49 g/l và 3,44 g/l tương

ứng với năng suất trung bình 0,27 g/l/ngày và 0,52 g/l/ngày ở thời điểm thu hoạch

sinh khối Kết quả về sự tăng trưởng sinh khối của hai hệ 3 và 4 như bảng 3.5

Bảng 3.5 Sự tăng trưởng của S platensis khi nuôi trong hai hệ 3 và 4, sục khí

1 l/phút, ở điều kiện phòng thí nghiệm

Nồng độ sinh khối (g/l) Ngày nuôi

Theo bảng 3.5, khi nuôi trong hệ 4 S platensis tăng sinh nhanh hơn so với hệ

3 Thời điểm thu hoạch của hệ 4 là ngày 7, hệ 3 là ngày 9

Theo bảng 3.22 (phụ lục 2), nồng độ sinh khối ở 9 ngày nuôi đều có tăng trưởng mang ý nghĩa khác biệt, do đó nên thu hoạch sinh khối ở hệ 4 vào ngày nuôi thứ 7

Đồ thị 3.2 Sự tăng trưởng của S platensis khi nuôi trong hai hệ 3 và 4

Cùng một xuất phát điểm nhưng mang lại hai kết quả khác nhau, điều này là

do khác biệt về kiểu thiết kế gây nên Theo như nghiên cứu ban đầu thì nguyên nhân

là cách sục khí vào hệ tạo nên chế độ dòng chảy môi trường nuôi

Hệ 3 với dòng khí sục từ dưới lên trên, trong khi di chuyển các bọt khí va

chạm một cách trực diện với sợi S platensis, nhiều va chạm liên tục khiến các sợi tế

bào bị yếu và gẫy làm nhiều đoạn bào Khi thời gian sục khí kéo dài thì lượng sinh khối bị ảnh hưởng cũng sẽ tăng theo và làm cho toàn bộ thời gian nuôi dài thêm Bên cạnh đó, do thiết kế đứng nên các sợi tế bào có xu hướng chìm xuống đáy hệ, nơi mà ít chịu tác động của việc sục khí, làm cho nồng độ sinh khối của hệ bị giảm

Hệ 4, dòng khí sục vào di chuyển bên trên bề mặt môi trường nên lực va chạm nhỏ Thiết kế tạo một độ dốc để khí sục vào tự chuyển động về phía sau hệ thống, đồng thời tạo ra lực đảo trộn môi trường nên sinh khối không lắng xuống,

song có xu hướng chuyển dồn xuống các ống phía dưới, nên các ống càng thấp thì

hàm lượng sinh khối càng cao và càng dễ thu hoạch Kết quả quan sát hình thái S

platensis trong hai hệ 3 và 4 như hình 3.12 và 3.13

Hình 3.12 Kích thước S platensis khi sục khí ở hệ 3

Hình 3.13 Kích thước S platensis khi sục khí ở hệ 4

Sinh khối thu được từ hệ 4 có hàm lượng protein, các sắc tố chlorophyll,

phycocyanin và carotenoid cao hơn so với hệ 3

Bảng 3.6 Hàm lượng các chất trong S platensis nuôi ở hai hệ 3 và 4, sục không khí

Trong hệ 4, do trong mỗi ống dòng khí chuyển động ở phần trên bề mặt môi

trường dịch, chỗ tiếp xúc nhiều với ánh sáng và khi đi từ ống dưới lên ống trên dòng

khí làm đảo trộn môi trường và tạo dòng môi trường chuyển động ngược lại với

hướng đi của dòng khí, vì vậy môi trường được đảo trộn đều hơn và sinh khối được

tiếp xúc với ánh sáng tốt hơn nên quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học xảy

ra mạnh hơn, lượng protein cao hơn (58,42 so với 56,0 khác biệt 4,3%) đặc biệt các

sắc tố chlorophyll, phycocyanin, carotenoid cao hơn đáng kể (18,5; 24,2 và 1%

tương ứng) Chỉ riêng hàm lượng carbohydrate và lipid thấp hơn (5,6 và 14,2%

tương ứng) Điều này có thể giải thích do việc chuyển động nên chi phí năng lượng

của nguyên liệu dễ chuyển hóa (carbohydrate) nhiều hơn và tích lũy năng lượng

(dưới dạng lipid) thấp hơn Chính xu hướng này làm cho sinh khối Spirulina có giá

trị hơn về mặt thực phẩm chức năng: giàu protein năng lượng thấp, các chất chống

oxy hóa cao…

Với kết quả thu được, hệ 4 được sử dụng tiếp trong các thí nghiệm sau

3.3.2 Kết quả hoạt động hệ thống

3.3.2.1 Hệ hở

Do những hạn chế về ánh sáng và sự đảo trộn mà nồng độ tế bào cao nhất đạt 1,31 g/l

Bảng 3.7 Nồng độ sinh khối S platensis nuôi trong hệ hở

Ngày nuôi Nồng độ sinh khối (g/l)

Theo bảng 3.7, hệ hở mang lại năng suất trung bình 0,077 g/l/ngày ở ngày nuôi thứ 14

0 0,15

Đồ thị 3.3 Sự tăng trưởng của S platensis trong hệ hở

Đồ thị 3.3 cho thấy, sự tăng sinh khối diễn ra mạnh từ ngày nuôi thứ 3 đến

ngày nuôi thứ 10 Sự đảo trộn làm tăng thời gian tiếp xúc giữa S platensis và ánh

sáng giúp sinh khối tạo ra nhiều hơn

Từ ngày nuôi thứ 10 trở đi, S platensis phát triển chậm bởi lúc này lượng tế

bào đã nhiều gấp nhiều lần so với ngày nuôi thứ 1, vì vậy dinh dưỡng khoáng của môi trường đã cạn kiệt hoặc do ánh sáng cần cho tế bào trẻ phía dưới quang hợp bị cản lại bởi sinh khối nổi trên bề mặt dịch nuôi vì khoảng trống thoáng bề mặt dịch nuôi bị giới hạn bởi dụng cụ nuôi Đây cũng là nguyên nhân chính khiến năng suất của hệ mở bị giới hạn ở một mức thấp

Theo bảng 3.23 (phụ lục 3), mặc dù ở các ngày nuôi thứ 14 và thứ 15 nồng độ

sinh khối S platensis cao nhất, nhưng không có sự khác biệt đáng kể về so với ngày

nuôi thứ 12 ở mức ý nghĩa 5%, vì vậy nên thu hoạch sinh khối ở ngày nuôi thứ 12

Sau khi phát triển đến mật độ sinh khối cao nhất, S platensis vẫn duy trì khả

năng sống và cho nồng độ tế bào khá ổn định đến ngày nuôi thứ 25, hiện tượng này

có thể do thành phần chất khoáng trong dịch nuôi vẫn còn, điều kiện chiếu sáng vẫn

được duy trì, môi trường ít bị nhiễm tạp vi sinh vật, trao đổi chất của S platensis

vẫn cân đối

Nếu trữ lâu, bề mặt môi trường xuất hiện xác của côn trùng như gián,

muỗi… Dưới đáy có lớp bụi và chất nhầy thì thu hoạch sinh khối khó hơn Sinh

khối lẫn tạp như trên ít có khả năng ứng dụng làm thực phẩm cho người cũng như

các chất có dược tính quý như GLA, carotenoid, ngoài ra còn gây khó khăn ở những

giai đoạn chế biến sau

Bảng 3.8 Hàm lượng các chất trong S platensis nuôi ở hệ hở

Protein Carbohydrate Lipid Chlorophyll Phycocyanin Carotenoid

55,40 16,30 5,80 11,02 78,16 1,23

Theo bảng 3.8, hàm lượng protein, carbohydrate, lipid ở mức trung bình

Hàm lượng các sắc tố chlorophyll, phycocyanin, carotenoid tương đối thấp so với

sinh khối nuôi trong hai hệ kín

Nói chung, hệ hở là hệ nuôi mà các thông số chính như nhiệt độ, ánh sáng,

chế độ đảo trộn, sự mất CO2, hơi nước, khả năng bị ô nhiễm môi trường và nhiễm

tạp vi sinh vật không thể điều khiển được mà phải phụ thuộc vào điều kiện môi

trường xung quanh Theo đó, S platensis nuôi trong hệ hở đồng nghĩa với dịch nuôi

có mật độ sinh khối thấp, dẫn đến năng suất thấp, thời gian nuôi kéo dài đến 14

ngày và sinh khối không đảm bảo vệ sinh Việc thu hoạch sinh khối gặp khó khăn

do nồng độ sinh khối thấp và thể tích dịch nuôi lớn khiến giá thành sản phẩm tăng

theo

3.3.2.2 Hệ kín

Kêt quả thí nghiệm 1 Về cường độ ánh sáng và tốc độ dòng khí

Bảng 3.9 ghi nhận nhiệt độ và cường độ ánh sáng ngoài trời trong ngày nắng

tháng 6/2009 và nhiệt độ trong lòng môi trường nuôi S platensis Nhiệt độ thấp vào

buổi sáng sau đó tăng nhanh đến đỉnh cao nhất lúc 12 giờ trưa Buổi chiều, nhiệt độ không thay đổi nhiều cho tới sau 16 giờ chiều

Bảng 3.9 Cường độ ánh sáng và nhiệt độ của dịch nuôi S platensis trong hệ 4

Nhiệt độ trong lòng dịch nuôi

(0C)

Cường độ ánh sáng

(µmol s-1m-2) Thời gian

Ngoài trời Có mái che Có mái che Ngoài trời

nuôi S platensis trong hệ kín, vì đặc điểm của hệ là kín nên lượng nhiệt tạo ra bởi

hoạt động sống của tế bào và ánh sáng mặt trời đốt nóng làm tăng nhiệt độ của dịch nuôi

Sự tăng trưởng của S platensis phụ thuộc vào sự biến động của nhiệt độ Gia

tăng nhiệt độ đến 350C làm tăng tốc độ tăng trưởng riêng Sự tăng trưởng giảm