Nghiên cứu tạo sinh khối spirulina platensis 10

Nghiên cứu tạo sinh khối spirulina platensis sạch bằng quy trình nuôi trong hệ kín

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Phương pháp thuần chủng Spirulina

Nguồn giống

Giống Spirulina được cung cấp từ Phòng Công nghệ biến đổi sinh học - Viện

Sinh học nhiệt đới – Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam Giống được phân lập

và giữ trên môi trường Zarrouk chứa 1,5% agar Dịch sinh khối được chuẩn bị trong môi trường Zarrouk dạng dịch và nuôi ở điều kiện ánh sáng, nhiệt độ phòng thí

nghiệm cho tới khi đạt được nồng độ sinh khối khoảng 0,6 g/l Việc nuôi Spirulina

trong môi trường dịch thể được thực hiện trong hệ ống thủy tinh

Spirulina được thuần chủng (tinh sạch giống) bằng tia cực tím (UV) và nuôi

rửa bằng môi trường Zarrouk vô trùng

2.1.1 Tia UV [30]

Sử dụng bóng UV công suất 15 W, công suất đầu ra của tia UV là 4,9 W

Cách làm: sau 15 ngày nuôi, dịch nuôi Spirulina được chiếu UV với thời gian 0, 5,

10, 15, 30, 60 phút Khoảng cách đến bóng đèn UV là 50 cm, có khuấy dịch nuôi bằng máy khuấy từ trong khi chiếu UV với tốc độ 155-175 vòng/phút Độ sâu của

dịch nuôi là 1-2 cm Sau khi chiếu UV, Spirulina được giữ 22-24 giờ ở điều kiện

phòng thí nghiệm Tiếp theo, mẫu được nhuộm fucshine và quan sát dưới kính hiển

vi Dịch nuôi được cấy lên môi trường thạch-cá-peptone để phát hiện khuẩn lạc của

vi khuẩn nhiễm tạp Dịch nuôi được đánh giá sạch và Spirulina được cho là thuần

chủng khi không có sự xuất hiện của vi khuẩn tạp sau hai ngày nuôi

2.1.2 Môi trường Zarrouk vô trùng

Cách làm: sau 15 ngày nuôi, Spirulina được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút

trong 7-10 phút, thu phần sinh khối lắng xuống và đưa lại vào môi trường Zarrouk

đã vô trùng (1210C, 15 phút) Khuấy nhẹ và tiếp tục ly tâm, thu sinh khối lắng xuống, ly tâm lặp lại ba lần Ở lần sau cùng, thu lấy sinh khối cấy lên môi trường

Zarrouk thạch vô trùng Khi xuất hiện những sợi Spirulina đầu tiên phát triển ra thì

thu lấy phần đầu của những sợi đó và cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn môi trường Zarrouk vô trùng, để yên ở nhiệt độ phòng Sau khoảng 12-14 giờ nuôi, sinh khối trong ống nghiệm được rửa qua 5-7 ống nghiệm khác cũng chứa môi trường

Zarrouk vô trùng Spirulina đã rửa được cấy lên môi trường Zarrouk thạch vô trùng,

lại tiếp tục thu lấy sợi Spirulina đầu tiên phát triển ra, đưa vào ống nghiệm chứa

môi trường Zarrrouk vô trùng, để nuôi trong 12-14 giờ ở điều kiện phòng thí

nghiệm, lặp lại quá trình trên cho đến khi thu được sinh khối thuần Kiểm tra mức

độ thuần khiết của Spirulina bằng nhuộm fucshine và quan sát dưới kính hiển vi,

dịch nuôi được cấy lên môi trường thạch - cá - peptone để phát hiện khuẩn lạc của

vi khuẩn nhiễm tạp Dịch nuôi được đánh giá là sạch và Spirulina được cho là thuần

chủng nếu sau hai lần kiểm tra mà không xuất hiện vi khuẩn tạp nhiễm

™ Môi trường Zarrouk [5]

Bảng 2.1 Thành phần của môi trường Zarrouk

(g/l) NaHCO3

EDTA = Ethylene Diamine Tetra Acetat

2.2 Xác định nồng độ tế bào ban đầu để nuôi Spirulina

Thí nghiệm như sau: nuôi Spirulina với 4 nồng độ tế bào 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4

g/l trong môi trường Zarrouk Bố trí như sau: 200 ml dịch nuôi chứa trong chai PET

thể tích 330 ml, có lắp, chất liệu polyethylen (PE), nuôi tĩnh, điều kiện phòng thí

nghiệm Sự thay đổi nồng độ tế bào được theo dõi bằng trọng lượng khô theo ngày

nuôi vào khoảng 4-5 giờ chiều Từ 4 giá trị trên, so sánh kết quả và kết luận giá trị

tối ưu

2.3 Hệ thống nuôi Spirulina

2.3.1 Thiết kế hệ thống

Spirulina được nuôi trong hai hệ thống: hở (trong điều kiện tự nhiên) và kín

(trong điều kiện có điều khiển)

Khí sục vào hệ hở và hệ kín được lọc bằng bông thủy tinh (BTT) và than hoạt

tính (THT) xếp xen kẽ nhau thành 5 lớp (BTT-THT-BTT-THT-BTT)

Hệ kín được rửa sạch bằng dung dịch có độ pH 9-10 trước khi đưa vào nuôi

S platensis

2.3.1.1 Hệ hở

Hệ hở được làm từ các chậu 30 lít, thể tích dịch nuôi 10-20 lít, chất liệu

polyvinylclorua (PVC)

2.3.1.2 Hệ kín

Hệ kín là các ống hình trụ làm từ thủy tinh hoặc PE trong suốt Đường kính

trong 3,1 cm, đường kính ngoài 3,3 cm, chiều dài ống 120 cm, độ truyền suốt 95%,

các ống được nối với nhau nhờ bộ nối PVC có khả năng lắp vào và tháo ra dễ dàng

2.3.2 Hoạt động hệ thống

2.3.2.1 Hoạt động của hệ hở

Đối với hệ này được thực hiện ở cùng một vị trí với hệ kín (để có cùng cường

độ ánh sáng), sử dụng môi trường Zarrouk để nuôi, thời gian theo dõi từ 10-30

ngày

Chế độ đảo trộn: liên tục trong suốt quá trình nuôi bằng máy sục khí

Các chỉ tiêu tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein trong sinh khối thu được

khi kết thúc quá trình nuôi được ghi nhận để từ đó so sánh với hệ kín

2.3.2.2 Hoạt động của hệ kín

™ Thí nghiệm 1 Về cường độ ánh sáng và vận tốc dòng khí: Spirulina được

nuôi ở hai vị trí tương ứng với hai chế độ ánh sáng như bảng 2.2

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm về cường độ ánh sáng và vận tốc dòng khí

a) Dưới ánh nắng trực tiếp b) Có mái che

Vận tốc dòng khí (m/giây)

Vận tốc dòng khí (m/giây)

Sục khí liên tục trong quá trình nuôi

Chỉ tiêu theo dõi: thời gian tăng trưởng, năng suất sinh khối, hàm lượng protein và

sắc tố

™ Thí nghiệm 2 Về thời gian sục khí được thực hiện theo bảng 2.3

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm về thời gian sục khí

Thời gian sục khí

Nguồn carbon, cường

độ ánh sáng, vận tốc dòng khí

Chỉ tiêu theo dõi

- Thời gian tăng trưởng

- Năng suất sinh khối

- Hàm lượng protein và sắc tố

™ Thí nghiệm 3 Về nguồn carbon cung cấp cho S platensis như bảng 2.4

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm về nguồn carbon cung cấp cho S platensis

Nguồn carbon Môi trường Cường độ ánh sáng, vận

Ngoài ra, hiệu suất sử dụng khí CO2 cũng được phân tích nhằm xem xét khả

năng dùng nguồn khí lên men cồn cho nuôi Spirulina ở quy mô lớn hơn hoặc đề

xuất một giải pháp mới để tận dụng nguồn CO2 khá tinh sạch này

2.4 Phương pháp lên men cồn ethylic [6], [8]

™ Nguyên liệu

Giống nấm men

Mật rỉ

Bình lên men thể tích 25 lít

Môi trường Hansen (xem bảng 2.5)

Bảng 2.5 Thành phần của môi trường Hansen

(g/l) Peptone

™ Quy trình lên men cồn ethylic tiến hành theo sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Quy trình lên men cồn ethylic

2.5 Xác định nồng độ CO 2

Nồng độ CO2 được xác định bằng máy TELAIRE 7001 (CO2/Temperature Monitor, USA), đo từ 0-10000 ppm hoặc lớn hơn, độ chính xác ± 50 ppm

Nguyên tắc hoạt động: máy TELAIRE 7001 dựa trên sự khác biệt nồng độ

CO2 bên trong và bên ngoài để tính lượng CO2 có trong mẫu phân tích

2.6 Xác định cường độ ánh sáng và độ truyền suốt của vật liệu làm hệ thống

Giống nấm men thuần

chủng tăng sinh trong

môi trường Hansen

Tăng sinh trong môi

trường mật rỉ pha loãng

Lên men trong bình 25 lít, 3-7 ngày

Thu khí CO2

- Xác định hàm lượng

- Sục vào hệ thống nuôi

AS ×Trong đó: AS1 là cường độ ánh sáng trên bề mặt ống, µmol s-1m-2,

AS2 là cường độ ánh sáng dưới bề mặt ống, µmol s-1m-2,

và 100 là số chuyển sang phần trăm

2.7 Xác định độ oxy hòa tan

Độ oxy hòa tan được xác định bằng máy SIGMA 950 với đầu dò oxy

Nguyên tắc: dựa theo một cực phổ oxy của máy Để đo lượng oxy hòa tan thì

máy bao gồm: điện cực làm việc là một kim loại quý (bằng Pt) điện cực đối là Ag Dung dịch điện phân là KCl, màng làm bằng teflon

Một hiệu điện thế được tạo ra giữa hai điện cực làm oxy được tạo ra bị khử và

đi qua màng Lượng bị khử bằng với lượng oxy hòa tan tạo ra, do đó xác định được lượng oxy hòa tan ban đầu

2.8 Phương pháp thu hoạch sinh khối [19], [20]

Sinh khối Spirulina được thu hoạch theo hai cách: lọc chân không bằng máy

AUTOSCIENCE và lọc trọng lực bằng vải polyeste

Hiệu suất lọc được tính bằng độ chênh lệch sinh khối trước và sau lọc theo cách sau: cùng một thể tích V ml của dịch nuôi chưa lọc, dịch thu được sau khi lọc chân không và lọc vải được đem sấy ở 100-1050C đến trọng lượng không đổi

Hiệu suất tính theo công thức sau:

2 1

100

lck

m HS

m

3 1

100

lv

m HS

m

Trong đó: HSlck là hiệu suất lọc chân không, %,

HSlv là hiệu suất lọc vải, %,

m1 là khối lượng sau sấy của dịch chưa lọc, g,

m2 là khối lượng sau sấy của dịch lọc chân không, g

và m3 là khối lượng sau sấy của dịch lọc vải

2.9 Phương pháp xác định trọng lượng khô của sinh khối [38]

™ Hóa chất

Dung dịch HCl (pha loãng 1:1 với nước cất) Khi dùng, lấy 0,5 ml dung dịch

này pha thành 100 ml bằng nước cất để sử dụng

™ Cách tiến hành

Sấy giấy lọc ở nhiệt độ 70oC qua đêm, để nguội và đem cân, ghi lại trọng

lượng G1

Lấy 10 ml dịch nuôi, lọc qua giấy lọc

Rửa phần trên giấy lọc bằng HCl để loại khoáng lẫn trong sinh khối

Giấy lọc cùng với sinh khối trên giấy lọc được sấy ở 700C qua đêm

Làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân, ghi lại trọng lượng G2

10 là thể tích dịch nuôi, ml,

1000 là số chuyển đổi từ ml sang l,

G2 là trọng luợng giấy lọc và sinh khối đã sấy, g,

G1 là trọng luợng giấy lọc đã sấy, g

2.10 Tính số Renolds [28]

Số Renolds (Re) trong đường ống tính theo công thức sau:

DRe

v

x

V K

=Trong đó:

và Xt là nồng độ sinh khối tại thời gian t (ngày có nồng độ sinh khối cao nhất) sau t0 (ngày), g/l

2.12 Định lượng chlorophyll [14], [28]

™ Nguyên tắc: dựa vào bước sóng hấp phụ cao nhất của chlorophyll để thu

lấy giá trị A khi đo mầu

Trong đó: A665 là độ hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm,

13,9 là hệ số hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm,

và a là khối lượng mẫu có trong 10 ml dịch phân tích, g

2.13 Định lượng phycocyanin [14]

™ Nguyên tắc

Phycocyanin có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 618 nm, dựa vào giá trị A

đo được để tính hàm lượng phycocyanin có trong mẫu phân tích

Máy đo cường độ mầu

Máy đồng hóa ULTRA-TURRAX T8 (IKA-WERKE, 5000–25000 vòng/phút, 100w, Germany)

Máy ly tâm lạnh

™ Hóa chất

Dung dịch đệm phosphate 100mM (10,64g K2HPO4 và 5,29g

KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất, pH 7)

™ Cách tiến hành

Lấy 10 ml mẫu, lọc, thu phần trên giấy lọc, cân a g từ sinh khối lọc được cho vào ống ly tâm, sau đó cho 10 – 15 ml dung dịch đệm phosphate vào ống ly tâm, lắc kỹ

Đồng hóa mẫu trong khoảng thời gian 5-10 phút, ở tốc độ 10000-15000 vòng/phút bằng máy ULTRA-TURRAX T8

Để ở 370C trong 24 giờ đồng hồ

Khi đủ thời gian, đem ly tâm ở tốc độ 3500 vòng/phút trong thời gian 10 phút

A a

Trong đó:

a là trọng lượng sinh khối thí nghiệm, g,

A618 là giá trị hấp thu đo được của mẫu,

và 3,39 là hệ số hấp thu của phycocyanin tại bước sóng 618 nm

2.14 Định lượng carotenoid [16]

carotenoid ra khỏi nguyên liệu Dựa vào giá trị A thu được khi đo mầu để tính hàm lượng carotenoid có trong nguyên liệu

3 Ly tâm mẫu với tốc độ 8000-10000 vòng/phút, trong 5 phút

4 Chuyển phần dịch nổi vào phễu tách và thêm 15-25 ml diethyl ether và 20-30 ml NaCl 9%

5 Trộn kỹ và để cho đến khi dịch nổi phân làm hai lớp: mầu xanh lá cây ở dưới, mầu vàng ở trên

6 Cẩn thận, thu lấy phần mầu xanh lá cây

7 Thêm NaCl 9% và lặp lại bước 6 cho tới khi dịch tách thành hai lớp mầu vàng và mầu trắng trong suốt

8 Tách và thu lấy phần dịch mầu vàng, cho thêm một lượng nhỏ

Na2SO4 vào để hấp thu nước

9 Thêm diethyl ether vào dịch mầu vàng tới 25 ml và trộn đều

10 Đo mầu ở bước sóng 450 nm với dung dịch diethyl ether làm mẫu chứng

™ Tính kết quả:

Carotenoid (mg/g) = 450 25

260

x x

A a

Trong đó:

A450 là độ hấp phụ đo được ở bước sóng 450 nm,

a là trọng lượng mẫu thí nghiệm, g,

và 260 là hệ số hấp thu của carotenoid ở bước sóng 450 nm

2.15 Định lượng carbohydrate [3]

™ Nguyên tắc: sự định lượng này căn bản dựa trên phản ứng mầu đặc trưng cho

bởi đường với sự hiện diện của H2SO4

™ Sự chính xác của kết quả tùy thuộc vào:

Phenol 5% trong cồn

H2SO4 đậm đặc

Dung dịch đường saccharose 0,1%: 500 mg saccharose, sấy khô

ở 60oC hoà tan trong 500 ml nước cất

Sau đó thêm 10 ml cồn 80o vào cốc chứa cặn, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi cách thủy Để nguội, lọc Tiếp tục làm như vậy khoảng 2 lần Sau đó đưa cặn lên giấy lọc và tráng cốc 2 – 3 lần bằng cồn 80o nóng (nước tráng cũng cho cả lên giấy lọc) Dịch lọc cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy để cồn bay hơi hết

Pha loãng cặn thu được với nước cất thành 50 ml Để lắng, dung dịch này đem đi hiện mầu để xác định hàm lượng đường, có thể pha loãng dung dịch đường tùy theo nồng độ đường có trong dung dịch nhiều hay ít

Bước 2 Thực hiện phản ứng mầu

Hút 1 ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm rồi thêm vào

1 ml dung dịch phenol 5% Sau đó cho chính xác 5 ml H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm (không để giây acid vào thành ống) Để 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để hiện mầu

Bước 3 Xây dựng đường chuẩn

Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi bổ sung như bảng 2.6

Chuẩn bị 8 ống nghiệm, lần lượt cho vào các ống như bảng 2.7

Bảng 2.7 Thí nghiệm phản ứng mầu của đường saccharose

Mầu bền vững trong vài giờ Xác định cường độ mầu bằng máy quang phổ so mầu ở bước sóng 490 nm

™ Tính kết quả

Vẽ đường cong chuẩn: trị số mật độ quang của những ống mẫu phải trừ đi trị

số mật độ quang của ống thử không Từ đó, ta xây dựng một đường cong chuẩn Mặt khác, trị số mật độ quang của dung dịch đường cần định lượng cũng phải trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi dựa vào đường chuẩn để suy ra nồng độ

x μg, từ đó tính ra lượng đường trong mẫu

2.16 Định lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl [3]

BO2- Là một bazơ mạnh, bởi vậy dung dịch của bình hứng chuyển từ mầu tím

đỏ sang mầu xanh lá mạ Lượng BO2- được tạo thành tương đương với NH3 đẩy ra trong quá trình cất đạm Xác định BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với HCl 0,25N Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ mầu xanh lá mạ sang mầu tím

đỏ

BO2- + H+ → HBO2

H2SO4đđ Chất đạm → (NH4)2SO4

Xúc tác

NH4OH + HBO2 → NH4 + BO-2 + H2O

Hoà tan 0,624g methyl đỏ trong 250 ml cồn tuyệt đối

Hoà tan 1,28g Bromocresol blue trong 50 ml cồn tuyệt đối Trộn đều 2 dung dịch trên, bổ sung 96 ml HCl 0,25N Bổ sung đến 1 lít bằng cồn tuyệt đối

Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị mầu: làm tan 80g acid boric trong 1800 ml nước cất, đun nóng một chút Để nguội và bổ sung 25 ml hỗn hợp chất chỉ thị mầu Bổ sung đến 2 lít bằng nước cất

™ Cách tiến hành

Bước 1 Vô cơ hoá mẫu

Tùy theo hàm lượng đạm có trong mẫu mà khối lượng mẫu vô cơ hóa nhiều hay ít, Cân a g mẫu đã nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 g chất xúc tác và

5 ml H2SO4 đậm đặc đặt lên bếp tiến hành phá mẫu trong tủ hút, đun đến khi dung dịch có mầu xanh rồi trong suốt, tiếp tục đun thêm 30 phút nữa Để nguội ở nhiệt độ phòng Khi phá mẫu xong, để nguội và bổ sung 50 ml nước cất, trộn đều và để

nguội, lắp vào máy chưng cất

Bước 2 Chưng cất mẫu

Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 30ml NaOH 32% Khởi động quy trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20 ml dung dịch chỉ thị mầu

Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ)

Chuẩn độ bằng HCl 0,25N Ngừng chuẩn độ khi xuất hiện mầu phớt đỏ

Trong đó:

VHCl làthể tích HCl 0,25N dùng để chuẩn độ, ml,

và a là trọng lượng mẫu đem xác định, g

Sau khi có kết quả Ntổng, có thể tính được hàm lượng protein trực tiếp trong nguyên liệu dựa theo công thức sau:

X là hàm lượng lipid có trong nguyên liệu ở độ khô tuyệt đối, %,

P là khối lượng gói nguyên liệu trước khi chiết lipid, g,

P1 là khối lượng gói nguyên liệu sau khi chiết lipid và sấy, g,

và m là khối lượng mẫu đem phân tích, g

2.18 Phương pháp xác định tổng nấm men, nấm mốc [7]

nguồn carbon hữu cơ từ môi trường bên ngoài Dựa vào đặc điểm này để sử dụng

kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường Plate Count Agar (PCA)

™ Môi trường và hóa chất

Môi trường tổng hợp PCA (casein, dịch chiết nấm men, dextrose, agar)

Quy trình phân tích như sơ đồ 2.2