LUAN VAN THAC SI CONG NGHE SINH HOC: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINOPAL CBSX TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Tinopal CBSX là chất làm trắng dạng bột là chất cấm dùng trong thực phẩm thường được dùng làm trắng các sản phẩm từ tinh bột. Mục tiêu của nghiên cứu là xác định phương pháp tối ưu của quá trình định lượng Tinopal CBSX trong thực phẩm. Điều kiện định lượng bao gồm 2 yếu tố được khảo sát bằng thực nghiệm là dung môi chiết tách và thông số hệ thống. Phương pháp HPLC đầu dò UVVIS được sử dụng để khảo sát xuyên suốt đề tài. Kết quả nghiên cứu ở những mẫu thực phẩm bị làm trắng bởi Tinopal CBSX gồm mẫu chứa tinh bột và mẫu giàu chất xơ như củ kiệu, măng thì với phương pháp định tính bằng máy soi UV bước sóng 365 nm được xây dựng với LOD: 25,0 µgkg. Đối với phương pháp định lượng độ thu hồi đạt 81 % – 108 %, dung môi thích hợp được sử dụng là acetonitril có mặt 4 % H3PO4. Các thông số điều kiện tối ưu trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò UVVIS để phân tích Tinopal CBSX gồm: Cột sắc ký lỏng pha đảo Eclipse C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và cột bảo vệ hay tương đương; bước sóng: 347 nm; pha động gồm ACN và đệm ammonium formate pH 5 (gradient); tốc độ dòng: 1,0 mlmin. Thể tích tiêm: 10 µl; giới hạn phát hiện và định lượng tính trên nền mầu thử lần lượt là 0,4 mgkg và 2,0 mgkg. Từ đó nghiên cứu thêm ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình chế biến cho thấy Tinopal CBSX dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao với độ thu hồi giảm đi 50 % so với mẫu chuẩn. Đề tài sẽ tiếp tục nghiên cứu để mở rộng phạm vi áp dụng cho các nền thực phẩm cần độ trắng cảm quan khác trong những đề tài tiếp theo, tiếp tục đánh giá các phương pháp, quy trình và kết quả thu được; ứng dụng nhiều trong thực tiễn để phát triển phương pháp có độ thu hồi cao và giới hạn phát hiện thấp hơn trong việc xác định nồng độ Tinopal CBSX trong thực phẩm

-TRẦN THÁI THÀNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINOPAL CBS-X TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM

CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ

MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 60420201

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2020

-TRẦN THÁI THÀNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINOPAL CBS-X TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM

CÓ NGUỒN GỐC TỪ TINH BỘT VÀ RAU CỦ

MUỐI CHUA BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Cán bộ hướng dẫn khoa học: Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP HCM ngày 12 tháng 06 năm 2020

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận sau khi Luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trần Thái Thành Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 02/06/1994 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 1841880003

I- Tên đề tài:

Nghiên cứu xác định hàm lượng Tinopal CBS-X trong mốt số thực phẩm có

nguồn gốc từ tinh bột và rau củ muối chua bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao

II- Nhiệm vụ và nội dung:

+ Nghiên cứu phương pháp sàng lọc mẫu

+ Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lượng Tinopal CBS-X

trong nền mẫu

+ Nghiên cứu điều kiện định lượng hàm lượng Tinopal CBS-X bằng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV-VIS

III- Ngày giao nhiệm vụ: 05/10/2019

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 04/05/2020

V- Cán bộ hướng dẫn: Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hồng

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quảnêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trìnhnào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Học viên thực hiện Luận văn

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn này, em đã nhận được sự hỗ trợ, giúp

đỡ cũng như là quan tâm, động viên từ nhiều cơ quan và cá nhân Luận văn cũng đượchoàn thành dựa trên sự tham khảo, học tập kinh nghiệm từ các kết quả nghiên cứu liênquan, các sách, báo chuyên ngành của nhiều tác giả ở các trường Đại học Đặc biệt hơnnữa là sự hợp tác của giáo viên trường Đại học Công nghệ Tp.HCM và sự giúp đỡ, tạođiều kiện về vật chất và tinh thần từ phía gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô Nguyễn Ngọc Hồng – ngườitrực tiếp hướng dẫn khoa học đã luôn dành nhiều thời gian, công sức hướng dẫn emtrong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn

Tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám đốc Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc – Mỹphẩm – Thực phẩm cùng toàn thể các anh chị công tác trong phòng Thực phẩm đã tậntình truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiêncứu

Một lần nữa tôi xin chân thành cám ơn!

Hồ Chí Minh, 4 tháng 5 năm 2020

Tác giả

Trần Thái Thành

TÓM TẮT

Tinopal CBS-X là chất làm trắng dạng bột là chất cấm dùng trong thực phẩmthường được dùng làm trắng các sản phẩm từ tinh bột Mục tiêu của nghiên cứu là xácđịnh phương pháp tối ưu của quá trình định lượng Tinopal CBS-X trong thực phẩm Điềukiện định lượng bao gồm 2 yếu tố được khảo sát bằng thực nghiệm là dung môi chiết tách

và thông số hệ thống Phương pháp HPLC đầu dò UV-VIS được sử dụng để khảo sátxuyên suốt đề tài

Kết quả nghiên cứu ở những mẫu thực phẩm bị làm trắng bởi Tinopal CBS-Xgồm mẫu chứa tinh bột và mẫu giàu chất xơ như củ kiệu, măng thì với phương phápđịnh tính bằng máy soi UV bước sóng 365 nm được xây dựng với LOD: 25,0 µg/kg.Đối với phương pháp định lượng độ thu hồi đạt 81 % – 108 %, dung môi thích hợpđược sử dụng là acetonitril có mặt 4 % H3PO4 Các thông số điều kiện tối ưu trên hệthống sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò UV-VIS để phân tích Tinopal CBS-X gồm:Cột sắc ký lỏng pha đảo Eclipse C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm) và cột bảo vệ haytương đương; bước sóng: 347 nm; pha động gồm ACN và đệm ammonium formate pH

5 (gradient); tốc độ dòng: 1,0 ml/min Thể tích tiêm: 10 µl; giới hạn phát hiện và địnhlượng tính trên nền mầu thử lần lượt là 0,4 mg/kg và 2,0 mg/kg Từ đó nghiên cứuthêm ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình chế biến cho thấy Tinopal CBS-X dễ bịphân hủy ở nhiệt độ cao với độ thu hồi giảm đi 50 % so với mẫu chuẩn

Đề tài sẽ tiếp tục nghiên cứu để mở rộng phạm vi áp dụng cho các nền thựcphẩm cần độ trắng cảm quan khác trong những đề tài tiếp theo, tiếp tục đánh giá cácphương pháp, quy trình và kết quả thu được; ứng dụng nhiều trong thực tiễn để pháttriển phương pháp có độ thu hồi cao và giới hạn phát hiện thấp hơn trong việc xác địnhnồng độ Tinopal CBS-X trong thực phẩm

Tinopal CBS-X is fluorescent whitening agent, which is banned from food use,and often used to bleach starch products The objective of the study is to determine theoptimal method of quantifying Tinopal CBS-X in food product The quantitativeconditions include two factors, which are experimentally examined, such as extractionsolvent and system parameters The HPLC UV-VIS probe method is used for examinationthroughout the topic

Research results on samples of food whitened by Tinopal CBS-X include samplescontaining starch and samples rich in fiber such as beets, bamboo shoots, with qualitativemethods using 365 nm UV scanner built with LOD: 25.0 µg/kg For the method ofquantitative recovery of 81 % - 108 %, the required solvent is Acetonitrile in H3PO4 4 %.Optimal parameters on high-performance liquid chromatography UV-VIS detector forTinopal CBS-X analysis include: Eclipse C18 reverse-phase liquid chromatographycolumn (250 mm x 4.6 mm x 5 µm) and recolumn; wavelength: 347 nm; mobile phase:ACN and buffer ammonium formate pH 5 (gradient); flow rate: 1.0 ml/min Injectionvolume: 10 µl; The limit of detection and quantification is 0.4 mg/kg and 2.0 mg/kg,respectively Rased on the study, the effect of temperature during the process shows thatTinopal CBS-X easily decomposes at high temperatures with a recovery of 50 % less thanthe standard sample does

The research will continue to expand the scope of the application for other sensoryevalution such as whiteness in food in next topics, evaluate the methods, processes andresults obtained; develop practical applications for high-recovery methods and lowerdetection limits for the determination of Tinopal CBS-X concentrations in food

MỤC LỤC

Chương 1: TỔNG QUAN 16

1.1 Sơ lược về các thực phẩm nhiễm Tinopal CBS-X 16

1.1.1 Các sản phẩm về tinh bột gạo 16

1.1.2 Các sản phẩm có nguồn gốc từ củ kiệu, măng 18

1.2 Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang 18

1.2.1 Giới thiệu 18

1.2.2 Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học 19

1.3 Tinopal CBS-X 21

1.3.1 Khái niệm 21

1.3.2 Cơ chế làm trắng 22

1.3.3 Ứng dụng của Tinopal CBS-X 22

1.4 Một số kết nghiên cứu và phương pháp xác định 23

1.4.1 Phương pháp soi bằng đèn cực tím 25

1.4.2 Phương pháp định lượng HPLC bằng đầu dò huỳnh quang 25

1.4.3 Phương pháp định lượng HPLC bằng đầu dò tử ngoại khả kiến 27

1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 28

1.5.1 Cơ sở phương pháp và phạm vi ứng dụng 28

1.5.2 Khái niệm 28

1.5.3 Phân loại 29

1.5.4 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 30

1.5.5 Ứng dụng của HPLC 33

1.6 Các tiêu chí đánh giá thẩm định phương pháp 33

1.6.1 Tính đặc hiệu 34

1.6.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 35

1.6.3 Giới hạn phát hiện 38

1.6.4 Giới hạn định lượng 39

1.6.5 Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) 40

1.6.5.1 Độ chụm 41

1.6.5.2 Độ đúng (trueness) 45

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48

2.1 Vật liệu 48

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 48

2.1.2 Hóa chất và chất chuẩn[3]: 48

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 49

2.1.4 Dụng cụ 50

2.2 Nội dung nghiên cứu 50

2.2.1 Phương pháp chiết tách chất phân tích 50

2.2.2 Khảo sát chương trình gradient 52

2.2.3 Nghiên cứu phương pháp định tính Tinopal CBS-X bằng đèn UV 365 nm 54

2.2.3.1 Chuẩn bị 54

2.2.3.2 Tiến hành 55

2.2.3.3 Giới hạn phát hiện 55

2.2.3.4 Độ chính xác 55

2.2.4 Kiểm tra phương pháp phân tích 55

2.2.4.1 Tính đặc hiệu 56

2.2.4.2 Tính tuyến tính 56

2.2.4.3 Độ chụm và độ thu hồi của phương pháp 57

2.2.4.4 Giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp 58

2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp làm giảm nồng độ Tinopal 59

CBS-X 59

2.2.6 Khảo sát độ nhạy, độ chính xác của phương pháp định lượng Tinopal CBS-X đo quang phổ và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 60

Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 61

3.1 Phương pháp chiết tách chất phân tích 61

3.2 Khảo sát chương trình gradient 62

3.3 Nghiên cứu phương pháp định tính Tinopal CBS-X bằng đèn UV 365 nm 66

3.3.1 Giới hạn phát hiện phương pháp 66

3.3.2 Độ lặp lại 68

3.4 Kiểm tra phương pháp phân tích 70

3.4.1 Tính đặc hiệu 70

3.4.2 Tính tuyến tính 76

3.4.4 Độ chụm và độ thu hồi của phương pháp 78

3.4.5 Giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp 82

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp làm giảm nồng độ Tinopal CBS-X 82

3.6 Khảo sát độ nhạy, độ chính xác của phương pháp định lượng Tinopal CBS-X bằng phương pháp đo quang phổ và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 84

3.7 Quy trình định lượng Tinopal CBS-X sau quá trình nghiên cứu 84

Chương 4: KIẾN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 87

Tài liệu kham khảo 90

Phụ lục 94

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

- FWAs (Fluorescent Whitening Agent): Chất làm trắng huỳnh quang

- HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng hiệu năng cao

- HPLC UV-VIS (High Performance Liquid Chromatography/ Ultraviolet visible): Sắc

ký lỏng hiệu năng cao - đầu dò tử ngoại – khả kiến

- HPLC-RF (High Performance Liquid Chromatography / Fluorescence): Sắc ký lỏnghiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang

- ICP-AES (Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy): Đầu dò phổphát xạ nguyên tử

- LC/MS (Liquid Chromatography / Mass Spectrometry): Sắc ký lỏng ghép khối phổmột lần

- LC/MS/MS (Liquid Chromatography with tandem mass spectrometry): Sắc ký lỏng

ghép khối phổ hai lần

- LOD (Limit of Detection): Giới hạn phát hiện

- LOQ (Limit of Quantification): Giới hạn định lượng

- Obs (Optical Brighteners): Chất làm trắng quang học

- RSD (Relative Standard Deviation): Độ lệch chuẩn tương đối (%)

- ACN (Acetonitrile): Acetonitril

- MeOH (Methanol): Methanol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Chương trình theo tỷ lệ Gradient dung môi 27

Bảng 1.2 : Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn 34

Bảng 1.3: Sự khác nhau giữa độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ tái lập 41

Bảng 1.4: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau 44

Bảng 1.5 : Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau 47

Bảng 2.1: Bảng tỷ lệ H3PO4 cần khảo sát trong MeOH và ACN 52

Bảng 2.2: Chương trình gradient pha động 1 53

Bảng 2.3: Chương trình gradient pha động 2 53

Bảng 3.1: Chương tình theo tỷ lệ gradient dung môi 65

Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của bánh canh tại nồng độ 2,5 mg/kg 71

Bảng 3.3: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của bánh phở tại nồng độ 2,5 mg/kg 72

Bảng 3.4: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của bún tại nồng độ 2,5 mg/kg 73

Bảng 3.5: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của măng chua tại nồng độ 2,5 mg/kg 74

Bảng 3.6: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của củ kiệu tại nồng độ 2,5 mg/kg 75

Bảng 3.7: Diện tích dung dịch chuẩn 0,5 – 5 mg/ lngày 1 76

Bảng 3.8: Diện tích dung dịch chuẩn 0,5 – 5 mg/l ngày 2 77

Bảng 3.9: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 0,5 mg/kg ngày1 78

Bảng 3.10: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 2,5 mg/kg ngày 1 79

Bảng 3.11: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 5,0 mg/kgngày 1 79Bảng 3.12: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 0,5 mg/kgngày 2 80Bảng 3.13: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 2,5 mg/kgngày 2 81Bảng 3.14: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 5,0 mg/kgngày 2 81

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium 4,4'-bis[(4-anilino-6-

morpholino-1,3,5-triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate 20

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của 2, 2’ ([1, 1’ biphenyl] 4, 4’ diyldi 2, 1 -ethenediyl) bis, dạng muối đinatri 20

Hình 1.3: Sự phân hủy quang học của Tinopal CBS-X 24

Hình 1.4: Phát hiện FWA theo dãy chuẩn pha loãng liên-tiếp từ bên trái sang bên phải bằng đèn phát cực tím cầm tay 25

Hình 1.5: Sơ đồ huỳnh quang kế, nguồn kích thích và nguồn phát xạ 26

Hình 1.6: Sơ đồ nguyên tắc và hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 30

Hình 1.7: Cách xác định khoảng tuyến tính 36

Hình 1.8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính 40

Hình 2.1: Máy sắc ký lỏng Shimadzu, đầu dò UV-VIS đặt tại phòng kiểm nghiệm Thực phẩm 49

Hình 2.2: Sơ đồ phương pháp tách chiết chất phân tích 51

Hình 2.3: Sơ đồ phương pháp sàng lọc mẫu 54

Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng làm giản nồng độ Tinopal CBS-X 59

Hình 3.1 Đồ thị biểu thị độ thu hồi chiết Tinopal CBS-X bằng MeOH 61

Hình 3.2: Đồ thị biểu thị độ thu hồi chiết Tinopal CBS-X bằng ACN 62

Hình 3.3 Dãy chuẩn Tinopal CBS-X trên hệ dung môi Đệm-Acetonnitril 63

Hình 3.4 Dãy chuẩn Tinopal CBS-X trên hệ dung môi Đệm- MeOH 64

Hình 3.5: Đồ thị thể hiện tỷ lệ ACN: đệm theo chương trình gradient 65

Hình 3.6: Dãy chuẩn Tinopal CBS-X dưới đèn soi UV ở bước sóng 365 nm có nồng độ từ 0,5 mg/l đến 5,0 mg/l 66

Hình 3.7: Dãy chuẩn Tinopal CBS-X dưới đèn soi UV ở bước sóng 365 nm có nồng độ từ 0,25 mg/l đến 2,5 µg/l 67

Hình 3.8: Độ lặp lại của mẫu sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 5,0 µg/l 68

Hình 3.9: Độ lặp lại của mẫu sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 10,0 µg/l 69

Hình 3.10: Độ lặp lại của mẫu sau khi thêm chuẩn ở nồng độ 25,0 µg/l 70

Hình 3.11: Đường chuẩn khảo sát khoảng nồng độ 0,5 – 5,0 mg/l 76

Hình 3.12: Đường chuẩn khảo sát khoảng nồng độ 0,5 – 5,0 mg/l ngày 2 77

Hình 3.13: Sắc ký đồ của mẫu thử sau khi xử lý so với mẫu chuẩn 83

Hình 3.14: Đồ thị so sánh kết qua đo mẫu giữa hai máy UV-VIS và quang phổ UV 84

Hình 3.15: Sơ đồ quy trình định lượng Tinopal CBS-X 85

MỞ ĐẦU

Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm trong cả nước đang gây ra nhiều lo lắngcho người tiêu dùng Tình trạng một số cơ sở sản xuất sử dụng các hóa chất cấm dùngtrong nuôi trồng, chế biến nông sản, thủy sản, thực phẩm; Việc sản xuất các sản phẩmkém chất lượng đang gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và người tiêu dùng Trong đócác sản phẩm làm từ tinh bột như bún, hủ tiếu, bánh phở,… thường bị sử dụng chấtTinopal CBS-X trong sản xuất để làm tăng độ trắng sáng, cải thiện độ bóng bề mặt vàlàm cho sản phẩm hấp dẫn hơn

Thay vì dùng bột gạo hoàn toàn, họ pha trộn thêm bột khoai mì tươi, bột lọc vì giábột này rẻ hơn gạo (khoảng 1.800 đ/kg) Giá bán sỉ của loại bún này cũng rẻ hơn bún gạohoàn toàn, chỉ 2.500-2.800 đ/kg[30] Tuy nhiên, bún làm bằng bột khoai mì tươi, bột lọcthường có màu xám đen, trụng nước sôi thì bị bở, vụn Vì vậy, những cơ sở sản xuất loạibún này phải dùng hóa chất Tinopal CBS-X để làm trắng và làm dai sợi bún Với loại bún

có pha trộn chất Tinopal CBS-X nhìn rất trắng, bóng, đẹp mắt, hoàn toàn không để lạimùi vị, khi đưa ra ánh sáng mặt trời sợi bún thường trắng óng ánh

Những năm gần đây, bên cạnh việc sử dụng trái phép Tinopal CBS-X trong thựcphẩm không chỉ có trong các sản phẩm có nguồn gốc từ tinh bột, các cơ sở và hộ kinhdoanh đã sử dụng Tinopal CBS-X trong các sản phẩm như măng, củ kiệu,… để làmtrắng và tăng thị hiếu người dùng Vì các sản phẩm này rất dễ bị oxy hóa nếu không xử

lý đúng cách từ đó gây ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan Do đó sử dụng TinopalCBS-X trong việc làm trắng thực phẩm đã gây ra nỗi lo ngại về sức khỏe đối với ngườitiêu dùng

Tinopal CBS-X là một chất làm trắng quang học có tên khoa học là 4,4- sulfostyryl) biphenyl, công thức phân tử C28H2ONa2O6S2[16] Tinopal CBS-X là chất làmtrắng huỳnh quang có khả năng phát huỳnh quang (fluorescence) và gây ra hiệu ứngtán xạ trên bề mặt sản phẩm mà chúng bám vào làm cho sản phẩm có cảm giác trắnghơn

bis(2-Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch được dùng trongcông nghiệp sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ phẩm và được dùng làmchất làm trắng trong gia dụng để làm trắng sản phẩm và làm sạch bề mặt vật dụng,…nhưng không được phép sử dụng trong thực phẩm[3].

Để kiểm soát Tinopal CBS-X trong thực phẩm, ngày 16 tháng 8 năm 2013, Cục

An toàn thực phẩm – Bộ Y Tế đã có công văn số 1731/ATTP-KN về việc áp dụng quytrình kiểm nghiệm Tinopal CBS-X trong thực phẩm[1]

Hiện nay, đã có nhiều phương pháp phân tích hàm lượng Tinopal CBS-X trongcác đối tượng phân tích với nhiều kỹ thuật khác nhau Phương pháp kiểm tra sàng lọcTinopal CBS-X bằng cách soi duới ánh sáng đèn tử ngoại UV 365 nm trong buồngtối[18] Với thiết bị phân tích Tinopal CBS-X là máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

để định lượng, tùy thuộc vào đầu dò của mỗi thiết bị mà phương pháp có độ nhạy và độchọn lọc khác nhau nhưng đầu dò tử ngoại- khả kiến được xem là đầu dò có độ chọnlọc, độ nhạy tốt, thời gian trả kết quả nhanh và chính xác Nghiên cứu này mở rộngthêm phạm vi nền mẫu ở các mẫu thường cần độ trắng cảm quan như măng, củ kiệu với

độ thu hồi đạt được 81 – 108 % tin cậy Tuy nhiên, khi áp dụng quy trình kiểm traTinopal CBS-X trên đối tuợng là các loại thực phẩm có nguồn gốc từ tinh bột thì thấyrất ít công trình nghiên cứu, do đó cần phải xây dựng, đánh giá và kiểm định phươngpháp thích hợp trên mỗi thiết bị khác nhau

Để kiểm soát triệt để việc sử dụng Tinopal CBS-X trong sản xuất, kinh doanhthực phẩm, Cục An toàn thực phẩm đã có Công văn gửi các Sở Y Tế các tỉnh thànhphố trực thuộc Trung ương về việc phối hợp truy nguyên nguồn gốc nguyên liệu, kiểmsoát Tinopal CBS-X trong sản xuất thực phẩm Nhận thấy được điều đó, Trung tâmkiểm nghiệm Thuốc – Mỹ Phẩm – Thực phẩm đang rất quan tâm đến vấn đề phân tíchđịnh lượng hàm lượng Tinopal CBS-X trong các loại thực phẩm Trên cơ sở đó, đề tài

“Nghiên cứu xác định hàm lượng Tinopal CBS-X trong một số thực phẩm có nguồn

gốc từ tinh bột và rau củ muối chua bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”

được thực hiện

Trong luận văn này, đề tài có các mục tiêu nghiên cứu:

+ Xây dựng phương pháp định tính Tinopal CBS-X bằng đèn UV 365 nm.+ Xây dựng phương pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lượng Tinopal CBS-Xtrong nền mẫu

+ Các điều kiện định lượng hàm lượng Tinopal CBS-X bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV-VIS

Chương 1 TỔNG QUAN1.1 Sơ lược về các thực phẩm nhiễm Tinopal CBS-X

% đến 1,3 % amyloza, tập trung chủ yếu ở tâm hạt tinh bột Tinh bột lúa nếp bị nhuộmmàu đỏ hay nâu với iot còn gạo tẻ thì nhuộm màu xanh hay xanh tím Hàm lượngamylose phụ thuộc vào trị số và hình dạng hạt tinh bột

Hạt tinh bột lúa nếp và lúa thường có nhiệt độ hồ hóa giống nhau Nhiệt độ hồhóa có thể dao động từ 550C đến 790C phụ thuộc vào giống và điều kiện canh tác Nhiệt

độ hồ hóa phản ánh độ bền của hạt tinh bột tới sự tác động của các loại thuốc thử khácnhau Những sự khác biệt về nhiệt độ hồ hóa phản ánh rõ tới thời gian nấu gạo

Nấu gạo có nhiệt độ hồ hóa cao sẽ kéo dài thời gian vài phút so với gạo có nhiệt

độ hồ hóa thấp Gạo có nhiệt độ hồ hóa thấp khi nấu sẽ bắt đầu hút nước và trương nở

ở nhiệt độ thấp hơn so với gạo có nhiệt độ hồ hóa cao Nhiệt độ hồ hóa cũng có thểphản ánh độ rỗng tương đối của nội nhũ

Tỷ lệ amylose: Amilopectin xác định các tính chất của cơm Hàm lượngamylose càng cao, các hạt tinh bột hút nước càng mạnh, thể tích các hạt tinh bột tăngnhưng cấu trúc không bị phá hủy nhờ khả năng của amylose tạo thành các liên kếtnước ở mức cao Độ chắc của cơm và độ bóng bề mặt của nó được quyết định bởi tỷ sốamylose: amilopecin trong tinh bột[6]

Cách tách tinh bột gạo: Hạt tinh bột gạo có kích thước nhỏ (3 – 8 µm) được baobởi một lớp vỏ protein cứng, chặt và không hoà tan trong nước, nên để tách được tinhbột cần phải xử lý hoá học để tách protein ra khỏi tinh bột

Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch kiềm loãng (0,25 % - 0,35 %) trong mộtthời gian dài để làm mềm hạt Tách hết kiềm, rửa bằng nước, sau đó gạo được nghiền

để phá vỡ tế bào và giải phóng các hạt tinh bột Tiếp đó khối nghiền được khuấy đềuvới một lượng dư dung dịch kiềm loãng Phần lớn protein sẽ bị hoà tan và chuyển vàolớp trên của dung dịch kiềm nên có thể tách ra bằng cách gạn

Khuếch tán khối tinh bột vào nước để tạo ra dịch sữa tinh bột rồi cho qua rây cókích thước nhất định để loại bỏ các tạp chất Tinh bột được rửa và lắng gạn, lặp đi lặplại nhiều lần sẽ thu được tinh bột tinh sạch

Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch SO2 ở nhiệt độ và thời gian nhất định(50oC, 72h) để làm cho khung protein bị trương lên và bị khuếch tán vào dung dịch dễdàng Tiếp đó, gạo được nghiền trong cối nghiền Khối nghiền cho qua sàng quay vàsàng rung để tách vỏ và xơ Sau đó khuấy đều với dung dịch NaOH để tạo ra huyềnphù rồi cho vào ly tâm để tách ra làm 2 lớp: lớp chất lỏng ở phía trong (quanh tâm củamáy ly tâm) chứa nhiều protein và lớp đặc có khối lượng riêng lớn thì ở vòng ngoàichứa chủ yếu là tinh bột có lẫn ít protein Ly tâm nhiều lần dịch sữa tinh bột trongkiềm, rồi trong nước sẽ thu được tinh bột tinh sạch[6]

Có rất nhiều loại sản phẩm có thành phần chính là tinh bột gạo như bánh tráng,bánh phở, hủ tiếu, bún tươi, bún khô, các loại bột gạo, Các sản phẩm này được làm

từ tinh bột gạo được chế biến qua nhiều công đoạn, quá trình chế biến rất quan trọng làđảm bảo về vệ sinh an toàn thực phẩm

Một số cơ sở sản xuất các sản phẩm từ bột gạo cho các chất phụ gia bị cấm như:hàn the, Tinopal CBS-X, formol, chất bảo quản và các chất màu vào trong sản phẩmlàm gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng

1.1.2 Các sản phẩm có nguồn gốc từ củ kiệu, măng.

Củ kiệu là củ của cây kiệu, là cây thảo nhỏ thuộc họ hành, có thân hành màutrắng, hình trái xoan thuôn Lá mọc ở gốc, hình dải hẹp, nửa hình trụ, dài 15 – 60 cm,rộng 1,5 – 4 mm

Cụm hoa hình tán kép trên một cuống hoa dài 15 – 60 cm, mang 6 – 30 tán hoamàu hồng hay màu tím, củ có màu trắng, hình tròn hoặc tròn dài giống củ hành nhưngthường nhỏ hơn, củ có nhiều vảy mỏng bọc bên ngoài

Ngoài tên gọi là củ kiệu còn có tên gọi khác tiểu toán (tỏi nhỏ), tiểu căn toán, dãtoán, đại đầu thái tử, hỏa thông… Cây kiệu được trồng khắp nơi, nhân dân thườngtrồng để lấy củ muối dưa, dùng lá làm gia vị như một loại rau thơm[29]

Măng là các cây non mọc lên khỏi mặt đất của các loài tre, nứa, trúc Măngđược sử dụng làm thực phẩm ở nhiều nước châu Á và được bán dưới nhiều hình thứcnhư măng khô, măng tươi và măng đóng hộp

Người ta thu hoạch măng tre vào mùa xuân khi chồi nhú khỏi mặt đất cao 15-20

cm Lột mo nang, rửa sạch, thường dùng tươi Măng có vị ngọt, hơi đắng, tính mátbình, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, mát gan, chỉ khát tiêu đờm, làm se, nhuận táo,chống co thắt

Bởi bản chất màu trắng của mình nhưng lại rất khó giữ được độ trắng trong quátrình bảo quản nhất là đối với các cơ sở buôn bán trong thời gian dài, nên việc sử dụngTinopal CBS-X để làm trắng cho các sản phẩm củ kiệu, măng gây nên ảnh hưởng sứckhỏe của người sử dụng

1.2 Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang

1.2.1 Giới thiệu.

Chất làm trắng quang học (OBs) được dùng trong ngành công nghiệp hóa chất,hoặc các chất làm trắng huỳnh quang (FWAs) được dùng trong ngành công nghiệp chấtlàm trắng, là những hợp chất có thể hấp thụ ở bước sóng 350 - 365 nm của ánh sáng

UV và sau đó phát ra ánh sáng màu xanh trắng ở bước sóng 400 - 440 nm[8] Electron

trong phân tử huỳnh quang được kích thích lên một trạng thái năng lượng cao hơn bằngcách hấp thụ photon ánh sáng thích hợp sau đó phân tử chuyển một lượng nhỏ nănglượng thành nhiệt huỳnh quang, phần còn lại phát xạ thành photon của bức xạ huỳnhquang khi các electron quay trở lại trạng thái cơ bản của nó Nhiệt huỳnh quang đượctạo ra từ trạng thái kích thích thứ nhất có thể được đo được bằng thiết bị nhưng rấtphức tạp và tốn kém Bức xạ huỳnh quang trong trạng thái kích thích thứ hai được đobằng thiết bị gọi là fluorometers [13],[14],[22]

1.2.2 Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học

Các chất làm trắng quang học có thể được phân loại dựa trên cấu trúc và thuộctính, vào khoảng 11 nhóm chất lớn, mỗi thành phần có chứa gốc khác nhau, hàng trămhợp chất, và hàng ngàn công thức khác nhau Tất cả OBs đa vòng hydrocarbon thơm,cấu trúc có chứa nhiều liên kết đôi có thể được kích hoạt bằng ánh sáng tia cực tím.Hàng ngàn công thức OBs đã được dùng nhiều trong các ngành công nghiệp chất làmtrắng, nhưng tương đối ít đáp ứng được yêu cầu của ngành công nghiệp, và chất làmtrắng làm trắng huỳnh quang (FWAs) đã được nghiên cứu sử dụng

FWAs được sử dụng nhiều trong các chất làm trắng bao gồm các hợp chất stilben như:

+ FWA-1 có tên hóa học: Disodium triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate[8]

4,4'-bis[(4-anilino-6-morpholino1,3,5-Công thức cấu tạo hóa học:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium 4,4'-bis[(4-anilino-6- triazin-2-yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate[14].

morpholino-1,3,5-+ FWA-5 có tên hóa học: Benzenesulfonicacid, 2,2’-([1,1’- biphenyl]- diyldi-2,1-ethenediyl)bis-disodiumsalt FWA-5 thường được gọi là DSBP(Distyrylbiphenylsulfonate) hoặc Tinopal CBS-X

4,4’-Công thức cấu tạo hóa học:

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của 2,2’- ([1,1’-biphenyl] - 4,4’ - diyldi - 2,1 - ethenediyl)bis, dạng muối đinatri[8]

1.3 Tinopal CBS-X

1.3.1 Khái niệm.

Tên thường được gọi là DSBP (Distyrylbiphenylsulfonate)

Tên hóa học: 2,2’-([1,1’-biphenyl]-4,4’–diyldi-2,1-ethenediyl)bis, dạng muối đinatri Công thức phân tử: C28H20Na2O6S2

Công thức cấu tạo hóa học: xem hình 1.2

Tính chất

+ Khối lượng phân tử: 562,58 g/mol

+ Màu sắc: màu vàng

+ Điểm nóng chảy: > 300°C

+ Điểm sôi: N/A

+ Áp suất hơi ở 25 °C: < 7E-16 ở 25°C

+ Hệ số phân số octanol - nước [log10]: - 2,32 ở pH 6,8; 25°C

+ Độ tan trong nước [mg/l]: 17’600 ở 2°C

+ Hằng số Henry: < 1E-15 ở 25°C

+ Hằng số KOC: 125 L/kg

+ Tỷ trọng: 1490 kg/m3

+ pH: 10,4 ở 50 g/L + pKa (acid tự do): - 2,5 > pKa > - 3,0

+ Sự ổn định trong nước: T1/2 ≥ 1 năm ở pH từ 4 đến 9

Theo Enzyclopediaof Industrial Chemistry, sản xuất distyrylbiphenylsulfonatebắt đầu với biphenyl, được sản xuất cùng với các hợp chất thơm khác trong tinh chếdầu thô Nó phản ứng nhanh với hydrogen chloride và formaldehyde và tạo thành 4,4’–bis(chloromethyl)biphenyl, sau đó phản ứng với trimethylphosphite cho ra 4,4’-bis(dimethoxyphosphonomethyl)biphenyl Biphenylphosphonate đối xứng này đượcphản ứng với hai phân tử benzaldehyde-2-sulphonic acid, được sản xuất từ một hợpchất là 2- chlorbenzaldehyde và natri sunfit Thành phần sản phẩm hoạt chất sinh ra làxấp xỉ 90 %, các tạp chất khác < 1,2 % bao gồm các sản phẩm và số dư là natri clorua

Các chất này sau khi giặt vẫn còn trên sợi vải và không bị phân hủy bởi nhiệt vàcác chất khác trong bột giặt Chúng có thể được phát hiện các chất làm trắng quang họcnày bằng cách chiếu dưới đèn cực tím trong buồng tối và thấy quần áo sẽ sáng lên[30]

1.3.3 Ứng dụng của Tinopal CBS-X.

Chất làm trắng quang học và chất làm trắng huỳnh quang được sử dụng rộng rãitrong dệt may, sản xuất giấy, nhựa và sợi tổng hợp bên cạnh đó còn được ứng dụngtrong y học, hóa chất, dầu khí Các chất của nhóm này bao gồm các công thức hóa học

OBs được sử dụng rộng rãi nhất trong ngành công nghiệp chất làm trắng là carbocycles(chủ yếu là distyrylbiphenyls), và triazinylaminostilbenes.

FWA-1 được sử dụng trong các chất làm trắng nồng độ khoảng từ 0,05 % đến0,15 % và phân hủy > 50 % trong 12 tháng FWA-5 được dùng trong chất làm trắng giadụng ở khoảng nồng độ 0,02 % đến 0,10 % và phân hủy > 70 % trong 28 ngày OBsđược dùng nhiều trong các ngành công nghiệp làm trắng, nhưng tương đối ít đáp ứngđược yêu cầu của các nhà sản xuất vì thế chất làm trắng làm trắng huỳnh quang được

bổ sung thêm vào[8]

Tinopal CBS-X được sử dụng làm hóa chất để sản xuất các sản phẩm tiêu dùng,

nó có trong trong các môi trường nước bị ô nhiễm, trầm tích và đất

Tinopal CBS-X có nhiều dẫn chất ở dạng bột, dạng dung dịch được dùng trongcông nghiệp sản xuất giấy, vải sợi, nhựa, sơn, mực in hay mỹ phẩm và được dùng làmchất làm trắng trong gia dụng để làm trắng sản phẩm và làm sạch bề mặt vật dụng[13], [14], [22]

1.4 Một số kết nghiên cứu và phương pháp xác định.

Các muối acid distyrylbiphenyldisulfonicdisodium (DSBP) có khả năng hòa tantốt trong nước và hằng số KOC rất thấp, có khả năng tích lũy sinh học Theo hằng sốHenry, áp suất hơi của nó rất thấp và do đó DSBP không hòa tan vào trong khí quyển

và chất này không bị thủy phân Các hợp chất này được phát hiện trong các môi trườngnước, bùn, bùn cát và đất,

Khi Tinopal CBS-X được tiếp xúc với ánh sáng mặt trời, bước đầu tiên là sựđồng phân hóa bởi ánh sáng Các dữ liệu xác nhận rằng khi tiếp xúc với ánh sáng mặttrời, DSBP hòa tan trong nước được chuyển đổi sang các photoisomers trong vòng vàiphút Thành phần chính 85 % là đồng phân E, E có khả năng phát huỳnh quang, trongkhi đó 15 % ở dạng đồng phân Z, Z mà không phát huỳnh quang

Được biết, Tinopal CBS-X sẽ bị mất tính chất huỳnh quang theo các điều kiệnkhác nhau khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời Nghiên cứu tại Thụy Sĩ trên hồ

Greifensee và sông Glatt chứng minh quy mô và tốc độ quang phân trong điều kiệnmột khu vực đông dân cư DSBP có trong hồ Greifensee vào mùa hè chứng tỏ phânhủy quang đáng kể và ở sông Glatt sự phân hủy quang học 70 % trong vòng 28 ngàyxảy ra vào mùa đông Vào mùa hè phân hủy quang học là 70 % chỉ sau 1,5 ngày

Sự cân bằng khối lượng chỉ ra rằng 80 % bị chuyển hóa bởi quang phân Còn lại

20 % DSBP được phân bố đồng đều hấp phụ vào trong đất đá, trầm tích [Stoll, 1999]

Sự phân hủy quang học ban đầu mang lại một sản phẩm là chính (muối acidbenzaldehyde-2 - sulphonic) và 1b sản phẩm trung gian không ổn định, với tốc độchậm, phá vỡ để tạo thành một 1 sản phẩm thứ hai chính (diphenyl - 4, 4' - dialdehyde)

Cả hai sản phẩm phân hủy quang học được chứng minh là có thể dễ dàng phân hủysinh học trong thử nghiệm OECD 301F Diphenyl-4,4'-dialdehyde không ổn định và bịoxy hóa thành diphenyl4,4'-dicarboxylic acid (1c, oxit) trong vòng 24 giờ[8]

Hình1.3: Sự phân hủy quang học của Tinopal CBS-X][8]

Một trong những tầm quan trọng nhất là cần phải phát hiện chính xác và xácđịnh OBs (hoặc FWAs) trong các nguồn bị ô nhiễm như nguồn nước và một số sảnphẩm khác Việc phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang thực sự là một phép đo rất ít cácnhà khoa học nghiên cứu Phép đo huỳnh quang là một mục tiêu chuyển đổi của cáctiêu chuẩn phòng thí nghiệm; do đó các phép đo phải được thực hiện hoặc so sánh vớimột vài khoảng nồng độ[13].

1.4.1 Phương pháp soi bằng đèn cực tím.

Trên thế giới, một trong những phương pháp phổ biến nhất để phát hiện FWAs

đã được sử dụng là dùng đèn cực tím huỳnh quang kiểm tra cầm tay ở bước sóng 365

Hình 1.4: Phát hiện FWA theo dãy chuẩn pha loãng liên tiếp từ trái sang phảibằng đèn soi UV[10]

1.4.2 Phương pháp định lượng HPLC bằng đầu dò huỳnh quang.

Năm 1935, Judd là người xác định các tác nhân làm trắng huỳnh quang đầu tiên

Kể từ đó, một số phương pháp xác định làm trắng huỳnh quang đã được phát triển,trong số đó phương pháp sắc ký lớp mỏng hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC),phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo được sử dụng rộng rãi nhất để táchhỗn hợp hóa học của nó

Phương pháp huỳnh quang càng chính xác hơn vì sử dụng thiết bị phân tích có

cả hai nguồn kích thích và nguồn phát xạ để định lượng chất cần phân tích Phươngpháp này phát hiện nhanh, dễ dàng kiểm tra số lượng lớn các mẫu trong một thời gianngắn, chính xác hơn (khả năng phân biệt giữa FWAs và các hợp chất huỳnh quangkhác), định lượng khoảng nồng độ, và độ nhạy tốt hơn (phát hiện nồng độ thấp hơn).Đơn vị là phát hiện µg/l[14], [22] ], [24] ], [25]

Hình 1.5: Sơ đồ huỳnh quang kế, nguồn kích thích và nguồn phát xạ[10]

Bước sóng đơn sắc

Detector phát xạ

Nguồn sáng

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với các đầu dò UV, huỳnh quang, khối phổcho độ chính xác và độ nhạy cao thích hợp cho việc phát hiện chất cần phân tích củabất kỳ mẫu thử nào, nhưng tương đối tốn thời gian.

Tại Việt Nam, tác giả Phạm Duy[3] đã ứng dụng phương pháp HPLC đầu dòhuỳnh quanh để phân tích hàm lượng Tinopal CBS-X trong các sản phẩm nền tinh bột.Tác giả đả sử dụng cột Ecosil HPLC column C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm)

Pha động gồm kênh MeOH: H2O được thiết lập theo tỷ lệ chương trình gradienttheo bảng 1.1,nhiệt độ buồng cột 400C, đầu dò huỳnh quang ở λex = 350 nm và λem =ex = 350 nm và λex = 350 nm và λem =em =

430 nm, thể tích bơm mẫu là 10 µl, tốc độ dòng pha động là 1,0 ml/phút

Bảng 1.1: Chương trình theo tỷ lệ Gradient dung môi[3]

+ Độ nhạy trung bình khoảng 1 ppm mẫu trong dung môi

+ Không phân tích được hợp chất ở dạng vết

+ Nhạy cảm với sự thay đổi nhỏ về nhiệt độ

+ Rất khó làm việc khi giải ly cột sắc ký với pha động

Những hạn chế này có thể được khắc phục khi sử dụng đầu dò tử ngoại khảkiến

1.4.3 Phương pháp định lượng HPLC bằng đầu dò tử ngoại khả kiến

Trên thế giới cũng như tại Việt Nam, phương pháp định lượng Tinopal CBS-Xbằng đầu dò tử ngoại khả kiến có rất ít công trình nghiên cứu Vì thế đề tài này tập

trung xây dựng phương pháp nghiên cứu định lượng hàm lượng Tinopal CBS-X bằngđầu dò tử ngoại khả kiến với các ưu điểm: Không nhạy với nhiệt độ, có sự đáp ứngtuyến tính giữa sự hấp thu UV với lượng mẫu chất.

1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.5.1 Cơ sở phương pháp và phạm vi ứng dụng.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid chromatography) hoặcsắc ký lỏng cao áp (High - pressure liquid chromatography) là một kỹ thuật sắc kýđược sử dụng ngày càng phổ biến để phân tách một hỗn hợp trong lĩnh vực hóa phântích (analytical chemistry) và sinh hóa (biochemistry) với mục đích xác định, địnhlượng và tinh sạch từng thành phần riêng lẻ của hợp chất Sắc ký lỏng hiệu năng caocũng được xem là một kỹ thuật đo đạc trong hóa phân tích, thay vì kỹ thuật trọng lượng(gravimetric technique)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một dung môilỏng để tải hỗn hợp vào cột, trong đó quá trình phân tách xảy ra Một cột phân tách sắc

ký lỏng hiệu năng cao được nạp vật liệu pha rắn (như silica, polymers hay chất hấpphụ) và hỗn hợp mẫu được phân tích thành những hợp chất tương tác với các phần tửtrong cột Sự phân tách sắc ký lỏng hiệu năng cao bị ảnh hưởng bởi các điều kiện dungmôi lỏng (như áp suất và nhiệt độ), tương tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu và dung môilỏng (như tính không ưa nước, quá trình proton hóa, v.v) và tương tác hóa học giữa cáchợp chất mẫu và nguyên tử đặc rắn bên trong cột phân tích (như ái lực ligand, trao đổiion,…) [4]

Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do:

có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc

dễ phân hủy nhiệt, như phân tích các chất thuộc lĩnh vực dầu mỏ, hóa chất côngnghiệp, các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm tronglĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

1.5.2 Khái niệm.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động làchất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phânhoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được thay đổibằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ[4]

Sắc ký là một phương pháp tách, trong đó các cấu tử được tách và phân bố giữahai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo mộthuớng xác định (theo IUPAC (1993))

1.5.3 Phân loại.

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng, HPLC được phân thành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

 Sắc ký phân bố (partition chromatography)

 Sắc ký ion (ion chromatography)

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được nhữnghợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khốilượng phân tử không quá lớn (< 3000)

Sắc ký phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa phatĩnh và pha động: sắc ký pha thường (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo(reversed phase chromatography)

Trong sắc ký pha thường, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Phatĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực Sắc ký pha thường dùng để tách vàphân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

Sắc ký pha đảo là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơnpha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phâncực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp chophân tích bằng sắc ký pha đảo Dung môi sử dụng trong sắc ký pha đảo là các dung

môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó,sắc ký pha đảo được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn sắc ký pha thường[32].

1.5.4 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Hình 1.6: Sơ đồ nguyên tắc và hoạt động của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC)[30]

+ Hệ thống dung môi (Solvent): bình chứa dung môi, ống dây dẫn, đầu lọc 0,45

µm, các đầu nối

+ Bơm cao áp (Pump)

+ Bộ phận tiêm mẫu (Injector)

Đầu dò

PC

Bộphậnkhử khí

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường có 4 kênh dung môi vào đầubơm cao áp cho phép chúng sử dụng 4 bình chứa được sử dụng dung môi cùng một lần

để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ của 4 kênh là 100 % Hệ pha động đượcpha trộn đồng nhất giúp ổn định quá trình rửa giải, và có thể thay đổi thành phần bởichương trình gradient

Bình chứa dung môi bằng thủy tinh có dung tích khoảng 1 lít Dung môi cần lọcqua giấy lọc 0,45 µm trước khi sử dụng và để an toàn hơn ở đầu của ống nhựa trongbình chứa dung môi cần phải có đầu lọc Loại bỏ các không khí hòa tan hoặc các bọtkhông khí trong dung môi bằng cách chạy siêu âm, hoặc sục khí trơ như khí heli…

Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sửdụng cho HPLC Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải làhóa chất tích khiết dùng cho phân tích

Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đườngnền, tạo nên các pic tạp trong quá trình phân tích

Bơm cao áp (Pump)

Bơm cao áp là vận chuyển pha động qua cột tách với một tốc độ xác định Bơmpha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải chịu được áp suất caokhoảng 250 – 600 bar và tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 10 ml/phút

Áp suất trong cột phụ thuộc vào chiều dài cột, kích thước hạt của pha tĩnh, độnhớt và tốc độ dòng của pha động Cột tách thông thường chịu áp suất khoảng 20 – 300bar

Bộ phận tiêm mẫu (Autosamper).

Để đưa mẫu vào cột phân tích qua bộ phận tiêm mẫu với thể tích bơm có thểthay đổi từ 1 – 100 µL

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động(autosamper)

Cột sắc ký (HPLC Column).

Cột chứa pha tĩnh được coi là bộ phận không thể thiếu của của hệ thống sắc kýlỏng hiệu năng cao, được làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 50 – 250

mm, đường kính trong 1 – 10 mm, hạt nhồi cỡ 0,3 – 5 µm

Chất nhồi trong cột tách là silicagel hoặc gắn một màng mỏng chất hữu cơ Bêncạnh silicagen nguời ta còn dùng Al2O3, hạt polymer xốp, hạt chất trao đổi ion

Ví dụ: Cột phân tích C18 Ecosil HPLC column, kích thước hạt nhồi cỡ 5 µm,đường kính 4,5 mm, chiều dài cột 250 mm

Bộ lọc tiền cột / cột bảo vệ: Sau bộ phận tiêm mẫu và truớc cột tách cần phải lắpcột bảo vệ (hay bộ lọc tiền cột) giúp bảo vệ cột khỏi sự xâm nhập của của các hạt bẩnnhỏ có trong dung môi và trong mẫu tiêm vào Nó được thiết kế kích thước nhỏ và thểtích nhỏ, các hạt nhồi như cột phân tích, không làm thay đổi hiệu quả tách của cột tách

Đầu dò (Detector).

Là bộ phận phát hiện các chất phân tích khi chúng kéo ra khỏi cột bằng dungmôi pha động và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng.Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại đầu dò phù hợp

Các yêu cầu sử dụng đầu dò trong kỹ thuật HPLC: Có tính chọn lọc, có độ nhạycao đối với chất phân tích, hoạt động ổn định và bền vững trong các điều kiện phântích, có vùng tuyến tính rộng Không bị ảnh hưởng hoặc ít bị ảnh hưởng bởi các tácđộng của môi trường như nhiệt độ, áp suất, nhiệt độ, có độ nhiễu nền nhỏ

Trên cơ sở đó, các lọai đầu dò sử dụng trong kỹ thuật HPLC sau:

+ Đầu dò quang phổ tử ngoại 190-360 nm để phát hiện UV

+ Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900 nm) để phát hiện các chấthấp thụ quang, đây là loại đầu dò thông dụng nhất

+ Đầu dò hùynh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên

và các dẫn suất có huỳnh quang

+ Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính cácchất theo độ hấp thụ cực đại của các chất

+ Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng phân tích các loại đường.

+ Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn

+ Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…

Bộ phận ghi nhận tín hiệu (PC).

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện Đối với các hệ thống sắc ký lỏnghiệu năng cao hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu cácthông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan, đồng thời tính toán, xử lý các thông số liênquan đến kết quả phân tích Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy inkết nối với máy tính[4], [32]

1.5.5 Ứng dụng của HPLC.

*Phân tích định tính

Định tính các hợp chất là một phần cốt lõi của bất cứ một phương pháp HPLC nào.Phân tích định tính bằng HPLC chủ yếu thực hiện bằng 3 cách sau đây[4]:

 Dựa vào các dữ liệu về sự lưu

 Phân tích định tính các chất thu được từ HPLC quy mô phân tích

 Phân tích phổ nghiệm online các đỉnh HPLC

*Phân tích định lượng:

Nguyên tắc: việc định lượng các chất bằng HPLC có thể dựa vào sự so sánhchiều cao của đỉnh hay so sánh diện tích đỉnh của chất cần xác định với một hay nhiềumẫu chuẩn đã biết trước nồng độ

Các phương pháp định lượng[4]:

 Phương pháp quy về 100% diện tích

 Phương pháp dùng chuẩn ngoại

 Phương pháp dùng chuẩn nội

 Phương pháp thêm chất chuẩn

1.6 Các tiêu chí đánh giá thẩm định phương pháp

Thẩm định phương pháp là một công việc rất khó khăn, nhàm chán, và tốn kémtuy nhiên lại là một nội dung quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phântích

Theo các quy định của USFDA, AOAC, USP và ICH, đối với các phương phápphân tích hóa học các thông số cần thẩm định bao gồm:

- Tính đặc hiệu, tính chọn lọc; (Specifility/Selectivity)

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn; (Linearity and Calibration curve)

- Giới hạn phát hiện; (Limit of Detection – LOD)

- Giới hạn định lượng; (Limit of Quantitation – LOQ)

- Độ đúng; (Trueness) - Độ chụm; (Precision)

- Độ vững (ổn định) của phương pháp; (Robustness/Ruggedness)

Bảng 1.2 : Lựa chọn thông số thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn[2]

Các thông số thẩm

định

Phân tích định tính

1.6.1 Tính đặc hiệu

* Định nghĩa: