Phân lập một số hợp chất taxoid từ lá thông đỏ lá dài (taxus wallichiana zucc ) trồng ở lâm đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu tt

Kh o sát ch n quy trình phân tích: Th nghi m ch ng trình gradient và đ ng dòng.

Có th tìm hi u Lu n án t i th vi n:

- Th vi n Qu c gia Vi t Nam

- Th vi n Khoa h c T ng h p TP HCM

- Th vi n i h c Y D c TP HCM

GI I THI U LU N ÁN

1 t v n đ

Theo các nhà khoa h c, các loài Thông đ (Taxus sp.) có

ch a taxoid là nhóm h p ch t chính y u g m c paclitaxel, deacetyl baccatin III (10-DAB, ti n ch t t ng h p paclitaxel) đ s n

10-xu t Taxol® và các d n xu t taxoid khác (docetaxel) làm thu c ch a

tr ung th nh : Ung th bu ng tr ng, ung th vú, ung th ph i, v.v

Do có giá tr kinh t cao nên Thông đ b l m d ng khai thác, đ c

bi t là vùng Himalaya và Trung Qu c, ngu n d c li u thiên nhiên này tr nên khan hi m và b đe d a tuy t ch ng

Vi t Nam, Trung tâm tr ng và ch bi n cây thu c à L t

tr ng Thông đ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) nh m cung c p nguyên li u ph c v cho chi t tách taxol và các h p ch t taxoid trong

s n xu t thu c đi u tr ung th Vì th , đ tài: “Phân l p m t s h p

ch t taxoid t lá Thông đ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) tr ng Lâm ng, đ nh h ng thi t l p ch t đ i chi u” đ c th c hi n v i các m c tiêu sau:

1 Chi t xu t, phân l p và xác đ nh c u trúc m t s h p ch t taxoid t

lá Thông đ lá dài tr ng Lâm ng

2 Thi t l p m t s ch t đ i chi u đ c phân l p t lá Thông đ

3 Xây d ng và th m đ nh quy trình đ nh l ng đ ng th i taxol và

m t s taxoid phân l p đ c t lá Thông đ

2 Tính c p thi t c a đ tƠi

Theo yêu c u GMP c a WHO trong s n xu t, vi c đánh giá ch t

l ng các cây thu c và các ch ph m ph i d a vào hàm l ng ho t

ch t (ho c ch t đánh d u sinh h c) Ngoài ra, các l nh v c khác nh

tr ng tr t, nghiên c u cây thông đ c ng c n theo dõi, đánh giá ch t

l ng các m u nghiên c u đánh giá đ c ch t l ng thông đ

tr ng Lâm ng và các ch ph m c n ph i có ch t chu n bao g m các taxoid ch y u: Taxol, 10-deacetyl baccatin III (10-DAB), v.v và

m t s t p ch t chu n đ c tr ng cho thông đ Vi t Nam Hi n nay, các nhà khoa h c Vi t Nam đã thành công trong vi c chi t xu t, phân

l p đ c m t s h p ch t taxoid Vì v y, vi c chi t xu t, phân l p,

đi u ch các h p ch t taxoid chu n đ ki m đ nh và nghiên c u thông đ Vi t Nam là h t s c c p thi t, có ý ngh a khoa h c, th c

t và kinh t Các h p ch t taxoid chu n đ c tr ng cho thông đ

Vi t Nam còn có th ng d ng đ ki m đ nh ch t l ng c a các lo i thông đ khác trên th tr ng trong và ngoài n c Trong khi các

ch t chu n dùng cho ki m nghi m taxol d c d ng theo D c đi n

4 B c c c a lu n án

Lu n án g m: 131 trang, đ t v n đ 2 trang, t ng quan 29 trang, đ i

t ng và ph ng pháp nghiên c u 13 trang, k t qu 60 trang, bàn

lu n 20 trang, k t lu n 2 trang và ki n ngh 1 trang Lu n án có 37

• Lá cây Thông đ thu hái Lâm ng do Trung tâm tr ng và

ch bi n cây thu c à L t-Vimedimex cung c p

2.3 Ph ng pháp nghiên c u

2.3.1 Nguyên li u - Dung môi, hóa ch t - Trang thi t b

- Dung môi, hóa ch t s d ng lo i k thu t dùng cho chi t xu t, lo i phân tích và s c ký (Merck và JT Baker) dùng cho các k thu t SKLM, UV-Vis, IR, NMR, HPLC, …

- Thi t b chi t xu t và phân tích t i Khoa D c- i h c Y D c TP.HCM, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam, Vi n

Ki m nghi m thu c TP.HCM

2.3.2 Ph ng pháp nghiên c u

2.3.2.1 Chi t tách h p ch t taxoid t lá Thông đ lá dài

Kh o sát s b các thành ph n hóa h c trong lá Thông đ lá dài

Phân tích s b theo quy trình phân tích c a I Ciuley đ c c i ti n

b i B môn D c li u, Khoa D c, i h c Y D c TP HCM

Chi t xu t taxoid (diterpen)

Ph ng pháp dùng dung môi h u c thay đ i đ phân c c

Chi t cao toàn ph n b ng ph ng pháp ngâm l nh v i methanol

Lo i t p và d u béo d a vào đ phân c c:

- Chi t l ng - l ng d ch chi t MeOH/n c v i dicloromethan

- S c ký c t diaion HP-20, r a gi i l n l t v i các dung môi: N c,

MeOH 20%, MeOH 40%, MeOH 60%, MeOH 80%, MeOH 100%

Phân l p taxoid

S d ng các ph ng pháp:

- S c ký c t c đi n (v i silica gel 0,040-0,063 mm) đ tách các phân

đo n nh t p trung h p ch t taxoid, các h p ch t taxoid k t tinh thô

- S c ký c t áp su t trung bình (MPLC) tách các h p ch t taxoid trong phân đo n nh thu đ c sau khi tri n khai s c ký c t c đi n

Chi t xu t, phân l p, tinh ch

Ch t đ i chi u taxoid phân l p t lá Thông đ lá dài b ng các k thu t s c ký c t c đi n, s c ký c t trung áp, k t tinh l i, s c ký l ng

đi u ch đ đ t đ tinh khi t cao nh t

ánh giá đ ng nh t lô trong quá trình đóng gói ch t đ i chi u

L y m u: S d ng cách l y m u ng u nhiên theo ph n m m Excel,

ánh giá ch t đ i chi u thông qua liên phòng thí nghi m

Ti n hành xác đ nh đ tinh khi t t i ba phòng thí nghi m đ c l p đ t tiêu chu n GLP ho c ISO/IEC17025 ánh giá k t qu b ng k thu t th ng kê ANOVA m t y u t , so sánh 2 giá tr Ftn và Ftc

Xác đ nh giá tr n đ nh và đ không đ m b o đo

Xác đ nh giá tr n đ nh và đ không đ m b o đo theo ISO 13528

nh l ng

Do không có ch t chu n nên hàm l ng % tính trên nguyên tr ng (theo h ng d n c a WHO)

2.3.2.3 Xây d ng và th m đ nh quy trình đ nh l ng đ ng th i các taxoid b ng ph ng pháp HPLC

Kh o sát ch n ch ng trình dung môi: Thay đ i t l pha đ ng, ch n

đi u ki n đ pic đ t đ phân gi i t i thi u 1,5

Kh o sát ch n quy trình phân tích: Th nghi m ch ng trình gradient và đ ng dòng

Kh o sát b c sóng phát hi n: G n v i c c đ i h p thu c a các ch t

Kh o sát t c đ dòng: Tri n khai trên m u th v i t c đ dòng t ng

d n t 0,8 ml/phút; 1 ml/phút; 1,2 ml/phút đ l a ch n đ c t c đ dòng phù h p

Th m đ nh quy trình

- Tính phù h p c a h th ng

Yêu c u: H s đ i x ng c a pic 0,8  As  1,5; %RSD di n tích pic

 2,0; s đ a lý thuy t ≥ 2000

- Tính đ c hi u: S c ký đ pha đ ng và dung môi pha m u không

xu t hi n tín hi u trùng v i th i gian l u c a ch t c n phân tích trong

m u th và m u đ i chi u tinh khi t c a pic ch t c n phân tích trong s c ký đ m u th : > 0,99 phân gi i gi a pic ch t c n phân

B ng 3.1 K t qu đ nh tính thành ph n hóa h c trên các d ch chi t

3.1.1.2 Chi t taxoid thô b ng ph ng pháp thay đ i đ phân c c

dung môi

3.1.2 Phân l p các h p ch t taxoid t lá Thông đ lá dài

3.1.2.1 Phân l p b ng ph ng pháp s c ký c t c đi n (SKC) và s c

ký c t áp su t trung bình (MPLC)

S đ phân l p các h p ch t taxoid b ng SKC c đi n 1 và MPLC

S đ phân l p các h p ch t taxoid b ng SKC c đi n 2

3.1.2.2 Tinh ch các h p ch t taxoid sau khi phân l p

Các h p ch t sau phân l p đ c tinh ch b ng ph ng pháp k t tinh

l i trong dung môi và b ng s c ký l ng hi u n ng cao đi u ch đ đ t

đ tinh khi t cao trên HPLC

5,39 (t, 3); 5,45 (dd; 6; 11); 5,94 (d;

10,5); 6,25 (d; 10,5); 1,77 (m); 2,39 (d; 20); 2,85 (dd; 7; 20); 2,25 (d; 1,5;

7); 3,33 (d; 6,5); 4,92 (s); 5,45 (s)

(CDCl3, 500 MHz): 1,74 (s); 1,11 (s); 2,33 (s); 0,98 (s); 2,02 (s); 2,05 (s) x 2; 2,08 (s); 5,60 (dd; 1,5: 6,0); 4,22 (d; 2,5); 5,50 (dd; 5,5; 11,5); 5,90 (d; 11,0); 6,26 (d; 11,0); 1,61 (m); 1,94 (m); 2,33 (d; 19,5); 2,77 (dd; 7,0; 20,0); 2,20 (dd; 2,0; 6,0); 3,53 (d; 6,0); 4,81 (s); 5,23 (s)

Các h ng s v t lý và d li u ph c a (3) và (4) tóm t t trong b ng sau:

(3) - 10-deacetyl taxinin B (4) - taxuspin D

Mô t Tinh th hình kim, màu tr ng B t m n, màu tr ng

i m ch y 239 - 241 oC 230 – 232 oC

UV (EtOH) 274 nm 217, 278 nm

IR (KBr, cm-1) 3450, 1665, 1639, 1128, 1041 3450, 1653, 1636, 1131, 1038

EI-MS m/z 622, 526, 359, 288, 137 724, 512, 374, 274, 159

1H-NMR

(H, ppm; J, Hz)

(CDCl3, 500 MHz): 1,23 (s); 1,80 (s); 2,24 (s); 1,02 (s); 2,08 (s) x 3;

5,60 (d; 6,0; 3,2); 5,35 (s); 5,38 (m);

5,83 (d; 10,0); 5,30 (t; 3,0); 1,76 (m); 2,08 (m); 2,38 (d; 20,0); 2,86 (dd; 20,0; 7,0); 2,23 (d; 1,5; 7,0);

3,32 (d; 6,0); 4,90 (s); 5,42 (s); 6,44 (d; 15,5); 7,69 (d; 15,5); 7,44 (m);

7,78 (d; 7,0); 7,42 (m); 2,08 (m)

(CDCl3, 500 MHz): 1,49 (s); 1,17 (s); 1,60 (s); 1,53 (s); 1,96 (s); 2,10 (s) x 2; 2,00 (s); 2,02 (s); 2,20 (s); 5,80 (d; 7,0); 5,34 (dd; 9,4; 6,2); 4,85 (m); 4,85 (d; 5,0); 5,60 (d; 5,0); 2,07 (m); 2,36 (d; 18,5); 2,57 (dd; 18,5; 7,5); 1,89 (dd; 1,5; 7,5); 3,70 (d; 7,0); 5,20 (s); 5,08 (s); 6,46 (d; 16,0); 7,70 (d; 16,0); 7,54 (m) x 2; 7,40 (m)

(CDCl3, 125 MHz): 67,9; 84,8; 70,6; 76,4; 68,7; 79,1; 134,1; 129,0 (x 2); 130,7; 128,8 (x 2); 129,1; 129,5; 128,2; 133,4; 135,9; 148,2; 170,3; 169,2; 169,8

3.2 Thi t l p ch t đ i chi u

Chi t xu t, phân l p và tinh ch đ thu đ c ch t đ i chi u (C C)

tinh khi t Xây d ng tiêu chu n ch t l ng v i m c ch t l ng, ch

tiêu, ph ng pháp th theo h ng d n c a WHO và ASEAN

B ng 3.1 Tóm t t tiêu chu n ch t l ng c a taxinin B (C C)

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 199,3; 169,3; 169,7; 169,2; 150,5; 138,6; 68,6; 76,2; 69,6; 75,0 và 72,8

Ph NMR 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,74 (s); 1,11 (s); 2,33 (s); 0,98 (s); 2,02

(s); 2,05 (s) x 2; 2,08 (s); 5,60 (dd); 4,22 (d); 5,50 (dd); 5,90 (d); 6,26 (d); 1,61 (m); 1,94 (m); 2,33 (d); 2,77 (dd); 2,20 (d); 3,53 (d); 4,81 (s)

và 5,23 (s)

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 199,4; 169,2; 169,3; 169,7; 169,8; 115,5; 139,2; 144,7 và 149,8

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 199,3; 169,3; 169,7 (x 2); 150,5 138,6 (x 2); 134,5; 129,0 (x 2); 128,6 (x 2); 130,5 và 118,8

i m ch y 239-241 oC

nh l ng Không ít h n 95,0%

B ng 3.4 Tóm t t tiêu chu n ch t l ng c a taxuspin D (C C)

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 170,6; 170,2; 169,3; 170,4; 168,5; 124,3; 144,2; 110,9; 50,4; 40,8; 142,6; 134,2; 128,1 (x 2); 128,9 (x 2); 68,4; 67,4; 70,4; 76,7; 78,5; và 77,3

i m ch y 230-232 oC

nh l ng Không ít h n 95,0%

(1) ậ Taxinin B (2) ậ Taxuspin F

3.3 Xây d ng quy trình đ nh l ng đ ng th i các taxoid b ng

D a vào k t qu kh o sát các đi u ki n nh trên, quy trình

đ nh l ng đ ng th i đ c đ ngh nh sau:

B ng 3.5 Các đi u ki n tri n khai quy trình đ nh l ng đ ng th i

i u ki n s c ký HPLC

Pha tnh C t Phenomenex C18, 5 µm, 250 x 4,6 mm, 110 Å Pha đ ng ACN – H2O (60 : 40)

- Tính tuy n tính: K t qu kh o sát tính tuy n tính cho th y có s

t ng quan tuy n tính gi a n ng đ các ch t đ i chi u và paclitaxel

chu n c ng nh các ch t th trong m u và di n tích pic t ng ng

v i h s t ng quan r > 0,995

- chính xác và đ đúng

K t qu th ng kê cho th y các quy trình có t l h i ph c n m trong

gi i h n cho phép c a t l h i ph c lý thuy t 90% - 107%; RSD <

2% và RSD < 2% đ i v i đ l p l i; RSD < 3% đ i v i đ chính xác trung gian

CH NG 4 BÀN LU N

4.1 Ch i t xu t, phơn l p, xác đ nh c u trúc vƠ đ nh tính,

đ nh l ng taxoid trong lá Thông đ lá dƠi

Lu n án đã dùng ph ng pháp chi t xu t t lá Thông đ lá dài b ng các dung môi h u c có đ phân c c thay đ i nh MeOH,

CH2Cl2 đ phân l p đ c các h p ch t taxoid Do trong lá Thông đ

có nhi u t p nh di p l c t , d u béo nên c n x lý t p b ng thay đ i dung môi, tri n khai qua c t daion HP-20, l c v i ether d u h a tài đã phân l p và xác đ nh đ c c u trúc c a 5 h p ch t taxoid trong

lá Thông đ lá dài: Taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F, taxchinin B ây đ u là các taxoid có tác d ng d c lý và

có tri n v ng làm thu c c bi t, hai h p ch t taxuspin D và taxchinin B ch a đ c công b tìm th y trong lá Thông đ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.)

đ nh tính các taxoid trong lá Thông đ lá dài tr ng Lâm

ng, lu n án đã áp d ng h u h t các ph ng pháp ph bi n và đ tin

c y cao Nh ng ph ng pháp phân tích đ nh tính đã đ c s d ng

nh : SKLM, HPLC-PDA, ph nghi m (UV, IR, MS, NMR), đi m

ch y c a t ng h p ch t so sánh v i d li u trong tài li u tham kh o

nh l ng các taxoid trong nguyên li u d c li u th ng

g p nh ng khó kh n: (1) là hàm l ng taxol r t th p trong các cây Taxus; (2) là chi t xu t t d c li u ch a nhi u h p ch t n i sinh khác nhau, và (3), c u trúc c a m i taxoid khác nhau r t ít Vì v y,

đ nh l ng các taxoid b ng HPLC th ng các đ nh phân tách kém và đòi h i th i gian phân tích dài Do đó, các k thu t khác bao g m SKLM c i ti n, s c ký đi n di MEKC, đi n di mao qu n, … c ng

đ c nghiên c u

Nghiên c u này đã xây d ng ph ng pháp đ nh l ng các taxoid b ng ph ng pháp HPLC v i c t C18, đ u dò PDA Do c u trúc và tính ch t lý hóa c a các taxoid c n phân tích là nh ng h p

ch t mang tính base h u c do có s hi n di n c a nhóm alkanoyl trong c u trúc và đ phân c c t trung bình đ n phân c c do có các nhóm -OH Do đó, nghiên c u đ nh tính, đ nh l ng các taxoid c a

lu n án đã s d ng k thu t HPLC/PDA pha đ o v i c t Phenomenex Gemini RP-C18 (250 x 4,6 mm, 5 m) và h pha

10-l p ch t đ i chi u Hi n nay, các h p ch t này c ng ch a th y có nhà

s n xu t hay phân ph i ch t chu n đ i chi u nh ChromaDex, Sigma Aldrich, USP, Cerilliant ho c hai Vi n ki m nghi m thu c trung

ng và TP.HCM cung c p

Lu n án đã xây d ng đ c quy trình chi t xu t, phân l p

ch t đ i chi u các taxoid trong lá Thông đ có tính n đ nh, hi u

qu Các ch t đ c phân l p có đ tinh khi t cao, đ c xác đ nh

b ng ph ng pháp ph nghi m và phân tích HPLC có các giá tr tin

c y cao Quy trình đ nh l ng các taxoid đ c xây d ng b ng

ph ng pháp HPLC đ c th m đ nh đô đ c hi u, tính phù h p h

th ng, đ l p l i, kho ng tuy n tính

4.3 Xây d ng quy trình đ nh l ng đ ng th i

Ph ng pháp HPLC-PDA

D c đi n M (t USP 30 tr đi) là có chuyên lu n paclitaxel,

đ c p đ n đ nh l ng taxol và các t p ch t liên quan Theo USP (hi n đang l u hành là USP 42), đ i v i nguyên li u đ c dán nhãn là đ c phân l p t ngu n t nhiên, vi c ki m tra đ tinh khi t và xác đ nh t p

ch t liên quan c a paclitaxel đ c ti n hành b ng ph ng pháp HPLC

v i đi u ki n s c ký: C t s c ký L43 (4,6 mm x 25 cm, 5 µm), nhi t đ

c t: 30 oC, b c sóng phát hi n: 227 nm, t c đ dòng: 2,6 ml/phút, th tích tiêm m u: 15 µl, h pha đ ng MeOH-ACN tri n khai theo ch ng trình gradienttrong 80 phút/ m u

Lu n án xây d ng quy trình đ nh l ng đ ng th i b ng HPLC d a trên chuyên lu n paclitaxel c a USP 41 và các tài li u tham kh o USP s d ng c t L43 (c t Pentafluorophenyl) là c t chuyên bi t cho taxoid, tuy nhiên giá thành còn cao so v i đi u ki n trang b thi t b các phòng thí nghi m c a n c ta Vì vây, nghiên

c u này ti n hành xây d ng quy trình đ nh l ng trên c t C18, quy trình đ nh l ng đ t các ch tiêu th m đ nh v đ đ c hi u, tính tuy n tính, đ chính xác, đ l p l i, đ đúng

K thu t HPLC/PDA trong nghiên c u này gi ng v i các nghiên c u đã công b Tuy nhiên, nghiên c u này đã s d ng pha

t nh c t C18, pha đ ng ACN-H2O v i ch ng trình đ ng dòng, th i gian phân tích d i 30 phút/ m u phù h p h n đ tách đ ng th i 05 taxoid (taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F và paclitaxel) trong lá Thông đ ây là quy trình đ nh tính, đ nh l ng

đ ng th i trên các taxoid có trong lá Thông đ lá dài b ng ph ng pháp HPLC/PDA mà ch a đ c công b b i tài li u nào

Qua kh o sát các y u t nh h ng lên kh n ng phân tách

gi a các pic thì h dung môi tri n khai đóng vai trò quan tr ng Quy