luận án tiến sĩ phân lập một số hợp chất taxoid từ lá thông đỏ lá dài (taxus wallichiana zucc ) trồng ở lâm đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu

TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT TAXOID TỪ THÔNG ĐỎ...21 CHƯƠNG 2.. Các nhà khoa học ở Mỹ và một số nước châu Âu đã thành công trong việc chiế

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HỨA HOÀNG OANH

PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TAXOID TỪ LÁ

THÔNG ĐỎ LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.) TRỒNG Ở LÂM ĐỒNG, ĐỊNH HƯỚNG

THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2020

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HỨA HOÀNG OANH

PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TAXOID TỪ LÁ

THÔNG ĐỎ LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.) TRỒNG Ở LÂM ĐỒNG, ĐỊNH HƯỚNG

THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU

NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC

MÃ SỐ: 62720410

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN PHƯƠNG DUNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2020

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Người cam đoan

Hứa Hoàng Oanh

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC SƠ ĐỒ x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI 3

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG THÔNG ĐỎ 12

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA THÔNG ĐỎ 19

1.4 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT TAXOID TỪ THÔNG ĐỎ 21

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 33

2.2 DUNG MÔI, HÓA CHẤT 33

2.3 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ 33

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46

3.1 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP TAXOID TRONG LÁ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI 46 3.2 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 69

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC TAXOID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 87

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 103

4.1 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐỊNH TÍNH,

ĐỊNH LƯỢNG TAXOID TRONG LÁ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI 103

4.2 THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 117

4.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ HỢP CHẤT TAXOID 118

TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI 124

KẾT LUẬN 125

KIẾN NGHỊ 127

DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarization Transfer EtOAc Ethyl acetate

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Correlation HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Correlation

Ký hiệu,

tắt

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

UPLC Ultra Performance Liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu

10-DAB 10-deacetylbaccatin

10-DAT 10-deacetyltaxol

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các hợp chất diterpen phân lập từ Taxus wallichiana 15

Bảng 1.2 Các hợp chất trong tinh dầu ở lá Taxus wallichiana Zucc 18

Bảng 1.3 Các phương pháp chiết xuất taxoid và các dung môi được sử dụng 23

Bảng 1.4 Các phương pháp phân tích định lượng các hợp chất taxoid 32

Bảng 2.1 Ký hiệu, thời gian và địa điểm thu hái các mẫu khảo sát 33

Bảng 3.1 Kết quả định tính thành phần hóa học trên các dịch chiết 46

Bảng 3.2 Kết quả phân lập các phân đoạn giàu taxoid bằng sắc ký cột cổ điển 49

Bảng 3.3 Điều kiện sắc ký HPLC trong đánh giá độ tinh khiết và tinh sạch các hợp chất (1) và (2) 51

Bảng 3.4 Điều kiện sắc ký trong phân lập và đánh giá độ tinh khiết hợp chất (3) 52

Bảng 3.5 So sánh dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất (1) và taxinin B 55

Bảng 3.6 So sánh dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất (2) và taxuspin F 58

Bảng 3.7 So sánh dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất (3) và 10-deacetyl taxinin B 62

Bảng 3.8 So sánh dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất (4) với taxuspin D 65 Bảng 3.9 So sánh dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất (5) với taxchinin B 68

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ tinh khiết các hợp chất bằng kỹ thuật HPLC 71

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp HPLC 71

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát tính tuyến tính 74

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ đúng (n = 9) 77

Bảng 3.14 Dữ liệu phổ UV-Vis, MS và điểm chảy, năng suất quay cực của các chất phân tích 79

Bảng 3.15 Dữ liệu phổ IR của các chất phân tích 79

Bảng 3.16 Khảo sát độ lặp lại của taxinin B 80

Bảng 3.17 Khảo sát độ lặp lại của taxuspin F 81

Bảng 3.18 Khảo sát độ lặp lại của 10-deacetyl taxinin B 81

Bảng 3.19 Khảo sát độ lặp lại của taxuspin D 82

Bảng 3.20 Kết quả kiểm tra độ đồng nhất lô của các nguyên liệu chất đối chiếu 83

Bảng 3.21 Kết quả đánh giá bằng phân tích thống kê ANOVA một yếu tố 83

Bảng 3.22 Kết quả đánh giá liên PTN bằng phân tích thống kê ANOVA một yếu tố 84 Bảng 3.23 Xác định giá trị ấn định của taxinin B 85

Bảng 3.24 Xác định giá trị ấn định của taxuspin F 85

Bảng 3.25 Xác định giá trị ấn định của 10-deacetyl taxinin B 86

Bảng 3.26 Xác định giá trị ấn định của taxuspin D 86

Bảng 3.27 Chương trình rửa giải gradient định lượng đồng thời các taxoid 92

Bảng 3.28 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 99 Bảng 3.29 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống (%RSD) 99

Bảng 3.30 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian (n = 6) 100

Bảng 3.31 Kết quả khảo sát độ đúng (n = 9) 100

Bảng 3.32 Hàm lượng taxoid trong mẫu thử TW 101

Bảng 4.1 So sánh hệ số di chuyển R f của 2 pic trong phân đoạn Tw1-3 khảo sát với 3 hệ dung môi khai triển SKLM 108

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Thông đỏ lá dài mọc tự nhiên 4

Hình 1.2 Thông đỏ lá dài được trồng 4

Hình 1.3 Vi phẫu lá của Taxus caespitosa var latifolia 6

Hình 1.4 Các dạng hạt của Taxus sp. 7

Hình 1.5 Lá và hạt của Taxus contorta var contorta 10

Hình 1.6 Dạng lá Taxus contorta var mucronata có lá uốn cong, từ Bhutan 10

Hình 1.7 Taxus chinensis với các hạt có đầu nhọn, từ Quý Châu, Trung Quốc 10

Hình 1.8 Cành của Taxus chinensis trên núi Nga Mi, Tứ Xuyên, Trung Quốc 11

Hình 1.9 Cành của Taxus wallichiana từ Khasia, Ấn Độ 11

Hình 1.10 Lá của T wallichiana var yunnanensis, từ Vân Nam, Trung Quốc 11

Hình 1.11 Lá của T wallichiana var wallichiana Đông Himalaya 11

Hình 1.12 Khung taxoid căn bản 13

Hình 1.13 Khung 6/8/6 của hợp chất taxoid trong Thông đỏ 14

Hình 1.14 Cấu trúc các hợp chất taxoid có nitơ ở mạch nhánh C13 14

Hình 1.15 10,15-epoxy-11(15 1)-abeo-10-deacetylbaccatin III 16

Hình 1.16 Wallifoliol 16

Hình 3.1 Sắc ký đồ các phân đoạn phân lập hợp chất sau khi triển khai cao MeOH 100% đã xử lý qua cột cổ điển Silica-gel 51

Hình 3.2 Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (1) 56

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất (1) 56

Hình 3.4 Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (2) 59

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất (2) 59

Hình 3.6 Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (3) 61

Hình 3.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất (3) 61

Hình 3.8 Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (4) 64

Hình 3.9 Cấu trúc của hợp chất (4) 64

Hình 3.10 Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (5). 67

Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất (5). 69

Hình 3.12 Sắc ký đồ SKLM kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất (1) 70

Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng 72

Hình 3.14 Sắc kí đồ HPLC của taxinin B (λ = 280 nm) 72

Hình 3.15 Sắc kí đồ HPLC của taxuspin F (λ = 280 nm) 73

Hình 3.16 Sắc kí đồ HPLC của 10-deacetyl taxinin B (λ = 280 nm) 73

Hình 3.17 Sắc kí đồ HPLC của taxuspin D (λ = 280 nm) 74

Hình 3.18 Sắc kí đồ HPLC của taxinin B 75

Hình 3.19 Sắc kí đồ HPLC 3D kiểm tra độ tinh khiết của taxinin B 75

Hình 3.20 Độ tinh khiết sắc ký taxuspin F 75

Hình 3.21 Sắc kí đồ HPLC 3D kiểm tra độ tinh khiết của taxuspin F 76

Hình 3.22 Sắc kí đồ HPLC của 10-deacetyl taxinin B 76

Hình 3.23 Sắc kí đồ HPLC 3D kiểm tra độ tinh khiết 10-deacetyl taxinin B 76

Hình 3.24 Sắc kí đồ HPLC của taxuspin D 77

Hình 3.25 Sắc kí đồ HPLC 3D kiểm tra độ tinh khiết của taxuspin D 77

Hình 3.26 Phổ hấp thu UV của taxuspin F 87

Hình 3.27 Phổ hấp thu UV của paclitaxel 87

Hình 3.28 Phổ hấp thu UV của 10-deacetyl taxinin B 88

Hình 3.29 Phổ hấp thu UV của taxuspin D 88

Hình 3.30 Phổ hấp thu UV của taxinin B 88

Hình 3.31 Sắc ký đồ khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid bằng HPLC ở bước sóng 280 nm 89

Hình 3.32 Sắc ký đồ khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid bằng HPLC ở bước sóng 227 nm 89

Hình 3.33 Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất

taxoid với hệ pha động ACN – H 2 O (70 : 30) (λ = 227 nm) 90

Hình 3.34 Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid với hệ pha động ACN – H 2 O (60 : 40) (λ = 227 nm) 91

Hình 3.35 Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid với hệ pha động ACN – H 2 O triển khai gradient như bảng 3.27 92

Hình 3.36 Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid ở tốc độ dòng 0,8 ml/phút (λ = 227 nm) 93

Hình 3.37 Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid ở tốc độ dòng 1,2 ml/phút (λ = 227 nm) 93

Hình 3.38 Sắc ký đồ HPLC khảo sát điều kiện định lượng đồng thời 05 hợp chất taxoid ở tốc độ dòng 1 ml/phút (λ = 227 nm) 94

Hình 3.39 Sắc ký đồ taxuspin F (λ = 280 nm) 95

Hình 3.40 Sắc ký đồ paclitaxel (λ = 227 nm) 95

Hình 3.41 Sắc ký đồ 10-deacetyl taxinin B (λ = 280 nm) 95

Hình 3.42 Sắc ký đồ taxuspin D (λ = 280 nm) 96

Hình 3.43 Sắc ký đồ taxinin B (λ = 280 nm) 96

Hình 3.44 Sắc ký đồ mẫu trắng (λ = 280 nm) 97

Hình 3.45 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (λ = 227 nm) 97

Hình 3.46 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (λ = 280 nm) 98

Hình 3.47 Sắc ký đồ mẫu thử (λ = 227 nm) 98

Hình 3.48 Sắc ký đồ mẫu thử TW 101

Hình 4.1 SKĐ khảo sát tốc độ dòng ở 40 ml/phút và 50 ml/phút 109

Hình 4.2 Sắc ký đồ HPLC độ tinh khiết của hợp chất (1) trước khi tinh chế 110

Hình 4.3 Sắc ký đồ HPLC mẫu chuẩn ở bước sóng 227 nm 120

Hình 4.4 Sắc ký đồ HPLC mẫu chuẩn ở bước sóng 280 nm 121

Hình 5.1 Cấu trúc hóa học của các hợp chất taxoid được phân lập 126

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.1 Các nội dung và phương pháp nghiên cứu 35

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết xuất các taxoid thô từ lá Thông đỏ lá dài 48

Sơ đồ 3.2 Quy trình chiết tách và phân lập các hợp chất taxoid (1), (2) và (3) 50

Sơ đồ 3.3 Quy trình chiết tách và phân lập hợp chất taxoid (4) và (5) 53

MỞ ĐẦU

Theo các nhà khoa học, các loài Thông đỏ (Taxus sp.) có chứa taxoid là

nhóm hợp chất chính yếu gồm cả paclitaxel, 10-deacetyl baccatin III (10-DAB, tiềnchất tổng hợp paclitaxel) để sản xuất Taxol® và các dẫn xuất taxoid khác Hiện nay,taxol được sử dụng là nguyên liệu chính để điều chế thuốc chữa trị ung thư như:Ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, v.v [91] Các nhà khoa học ở Mỹ

và một số nước châu Âu đã thành công trong việc chiết xuất taxol và các taxoid từ

vỏ cây; công nghệ này làm cây nhanh lão hóa và gây cạn kiệt nguồn cung cấp.Người ta phải đốn 6 - 8 cây Thông đỏ 100 năm tuổi mới có đủ lượng taxol phân lập

từ vỏ cây để điều trị cho một bệnh nhân ung thư [97] Do có giá trị kinh tế cao nênThông đỏ bị lạm dụng khai thác, đặc biệt là ở vùng Himalaya và Trung Quốc,nguồn dược liệu thiên nhiên này trở nên khan hiếm và bị đe dọa tuyệt chủng [2]

Năm 2011, sách đỏ của IUCN đã công bố Taxus wallichiana là loài có nguy cơ

tuyệt chủng [50], [97] Do đó, để có đủ lượng taxol cho sản xuất thuốc, ngoài việctổng hợp trực tiếp taxol thì các nhà khoa học đã quan tâm chú ý nhiều hơn đến bántổng hợp taxol từ các taxoid khác được phân lập từ Thông đỏ Ngoài nguồn nguyênliệu từ vỏ, người ta còn thu được lượng 10-DAB ở cành và lá Thông đỏ nhiều hơn

so với ở vỏ cây [97]

Ở Việt Nam, Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) là loài chỉ mới gặp ở

Lâm Đồng với số cây còn lại ước tính chỉ trên 250 cây [7] Năm 2007, trong sách

đỏ Việt Nam, Thông đỏ được xếp vào cấp VU – loài sẽ nguy cấp; còn trong Nghịđịnh 32/2006/NĐ-CP của Chính phủ thì Thông đỏ được xếp vào nhóm IA – nghiêmcấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [2]

Do đó, để khai thác nguồn nguyên liệu quý mà không ảnh hưởng đến vùngphân bố tự nhiên của loài Thông đỏ này, Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc ĐàLạt trồng Thông đỏ bước đầu cung cấp nguyên liệu phục vụ cho chiết tách taxol vàcác hợp chất taxoid trong sản xuất thuốc điều trị ung thư [5] Bên cạnh đó, các nhàkhoa học Việt Nam đã tiến hành một vài nghiên cứu về chiết xuất, phân lập và xác

định cấu trúc các hoạt chất sinh học từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng [6],[8] Tuy nhiên, Thông đỏ lá dài vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ về thành phầncác hợp chất taxoid để có cơ sở xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguồn nguyênliệu taxol của Việt Nam Vì thế, đề tài: “Phân lập một số hợp chất taxoid từ lá

Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng, định hướng thiết lập

chất đối chiếu” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất taxoid từ lá Thông đỏ

lá dài trồng ở Lâm Đồng

2 Thiết lập một số chất đối chiếu được phân lập từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng phục vụ công tác kiểm nghiệm

3 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời taxol và một số taxoidphân lập được từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI

Tên gọi

Tên khoa học: Taxus wallichiana Zucc [1], [2], [3].

Tên nước ngoài: Himalayan yew (Anh), Xu mi hong dou shan (Trung Quốc)

Tên Việt Nam: Thông đỏ lá dài, Thông đỏ nam, Thông đỏ Hymalaya, sam hạt đỏ ládài, vân nam hồng đậu sam [1], [2], [3]

Trong hệ thống phân loại thực vật quốc tế, thông đỏ lá dài thuộc [1], [2], [3]:

Phân bố, sinh thái

Ở Việt Nam chi Taxus có 2 loài là Taxus chinensis thường gọi là “Thông đỏ

lá ngắn” và Taxus wallichiana Zucc gọi là “Thông đỏ lá dài” [1], [2].

Hình 1.1 Thông đỏ lá dài mọc tự nhiên Hình 1.2 Thông đỏ lá dài được trồng

Nguồn: Hình 1.1 và 1.2 theo tác giả Trần Công Luận [6]

Thông đỏ lá dài: Phân bố ở Nepan (vùng núi Hymalaya), phía bắc Myanmar,Đông Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Philippin và Việt Nam Ở Việt Nam,loài này cũng chỉ thấy ở một số vùng núi cao thuộc tỉnh Khánh Hòa, Lâm Đồng (ĐàLạt, Đơn Dương), Hà Giang (Thái An – Quản Bạ), độ cao phân bố từ 1400 – 1600

m hoặc hơn [1], [2]

Thông đỏ thường ra lá non vào mùa xuân – hè, nón đực xuất hiện sớm hơnnón cái từ cuối mùa đông, nhưng đến giữa mùa xuân năm sau cả nón đực và nón cáimới nở Thông đỏ sinh trưởng chậm, tái sinh tự nhiên từ hạt khó Tuy vậy, nếu trênđỉnh núi có vài cây to, vẫn có thể thấy những cây con mọc từ hạt Vài năm gần đây,một số cơ sở nghiên cứu ở Hà Nội và Đà Lạt đã thí nghiệm thành công việc nhângiống Thông đỏ bằng cành [6]

Các loài Thông đỏ trên thế giới

Trên thế giới, theo Spjut chi Taxus có 24 loài (species) và 55 thứ (varieties)

được phân loại thành ba nhóm, hai nhóm trong số đó có nguồn gốc từ Bắc Mỹ: (1)

Nhóm Baccata, đại diện là Thông đỏ Canada (Taxus canadensis) và nhiều giống được trồng có liên quan: T baccata, T biternata, T caespitosa, T cuspidata, T.

recurvata và T umbraculifera và (2) Nhóm Wallichiana, đại diện là Thông đỏ

Florida bản địa (Taxus continosa var floridana), Thông đỏ Mesoamerican (T.

continosa var continosa) và Thông đỏ Thái Bình Dương (T brevifolia), bao gồm

hai thứ (var polychaeta, var reptaneta) [94].

Nhóm Wallichiana được coi là tổ tiên của các nhóm khác bởi cấu tạo lá cócác tế bào biểu bì góc nhìn thấy ở mặt cắt ngang lá (phần T), và có các nhú(papillose) đồng nhất trên bề mặt được bao quanh bởi một biên hẹp của các tế bàotrơn nhẵn, thường là 4 tế bào Trong vi phẫu mặt cắt ngang lá (phần T) ở Hình 1.3.a

và Hình 1.3.b là một phần biểu bì mặt dưới của lá từ mép trái đến gân giữa của

Taxus caespitosa var latifolia, phóng to tương ứng ×100 và ×250, phía trên cho

thấy các tế bào biểu bì hình elip Quan sát được một vùng biên của tám (8) hình

thang nhẵn với các ô có chiều rộng gần như hình chữ nhật, không có (0) vùngchuyển tiếp của các tế bào nhú (papillose); tiếp theo là một dải 14 hàng lỗ khí, gângiữa có 15-18 tế bào theo chiều rộng, không có nhú và một phần của dải lỗ khí thứhai (1 hàng lỗ khí) Các tế bào màu cam là các tế bào phụ bao quanh lỗ mở (“nhẫnFlorin”) Lỗ khí cũng được bao quanh bởi các tế bào bảo vệ chìm không thể nhìn

thấy Các tế bào xung quanh nhú được gọi là các tế bào phụ Chi Taxus được xác

định bởi các dải nhú - lỗ khí chỉ có ở mặt dưới lá

Nhóm Wallichiana bao gồm 2 phân nhóm là Chinensis và Wallichiana; đượctìm thấy ở cả châu Á và Bắc Mỹ, phân nhóm Wallichiana được nhận biết nhờ các tếbào biểu bì lá có hình tứ giác và hình chữ nhật cao thấy trong mặt cắt ngang (phầnT), có xu hướng vuông góc với bề mặt của lỗ khí; và các nhánh cây màu đỏ tía Ởphân nhóm Chinensis, xuất hiện chủ yếu ở khu vực từ miền trung Trung Quốc đếnIndonesia, các tế bào biểu bì hình elip hoặc hình chữ nhật rộng, xu hướng song songvới bề mặt của lỗ khí (các lỗ khí vuông góc với bề mặt nhưng thường được địnhhướng kéo dài ra theo chiều dọc về phía mép lá và thường thẳng hàng theo hàngngang cũng như các hàng dọc) và các nhánh cây màu xanh lá đến màu vàng cam

(b)

Hình 1.3 Vi phẫu lá của Taxus caespitosa var latifolia

Nguồn: Hình 1.3.a được vẽ bởi Karen Parker; Hình 1.3.b do Spjut vẽ [94].

Nhóm Baccata có thể có nguồn gốc từ nhóm Wallichiana do mất dần lỗ khí

và các nhú, khác biệt bởi các tế bào biểu bì hình elip nhỏ hơn (trong phần T), và cácnhú kém phát triển trên gân chính ở giữa lá

Nhóm thứ ba (3) là nhóm Sumatrana, dường như tiến hóa hơn nhờ các tế bàobiểu bì biệt hóa vùng mép lá, thường xuất hiện màu đỏ bóng trong các mẫu vật khô.Vùng mép lá có chiều rộng thay đổi từ 8 – 36 dãy tế bào, trong đó gần một nửa số tếbào gần dải lỗ khí nhất có thể phát triển thành nhú, nhưng thường không quá 12 dãy

tế bào

Bằng chứng sinh học cổ xưa khác của Taxaceae ở Bắc Mỹ là hạt Manchester

(1994) [67] đã mô tả T masonii, Torreya clarnensis và một chi mới của Taxaceae,

Diploporus, từ hạt ở thế Thủy Tân (Eocene) ở Oregon Sự khác biệt của T masonii

với các loài còn tồn tại có liên quan dựa trên sự đối xứng hai bên của hạt, bề mặt cắt

ngang hình thấu kính, mặc dù hạt của T chinensis và T recurvata (Thông đỏ Anh

quốc) cho thấy xu hướng đối xứng hai bên cùng với sự phát triển của bề mặt dạng

lăng trụ (xem Hình 1.4) Thông đỏ châu Âu (T baccata) và Thông đỏ Canada (T.

canadensis) thường có hạt hình khối trụ với bề mặt nhẵn bóng, đuôi nhọn ở đỉnh,

trong khi các hạt trong các loài Thông đỏ khác ở châu Âu - Địa Trung Hải có hình

nón, hoặc xẻ thùy và không có đỉnh nhọn - có hình dạng giống như quả ớt chuông

(ví dụ, T baccata từ Iran) Khu vực từ Tây Tứ Xuyên (Trung Quốc) với đại diện T.

chinensis, đến Đông Nam nước Nga với đại diện bởi T umbraculifera var microcarpa, các hạt trở nên nhỏ hơn và hình nón càng ngày càng hẹp về phía đỉnh.

Khác với hạt có hình trứng có 3-4 cạnh của T kingstonii Spjut ở Đông Himalaya (Hình 1.4), hoặc hạt có 3-4 thùy của T biternata ở vùng ôn đới ở phía Đông Á hoặc các hạt hình cầu khác nhau ở Nhóm T sumatrana (xem Hình 1.4 với T celebica, T.

mairei var speciosa (Florin) Spjut ở Đông Nam Trung Quốc) Hạt hình nón tương

đối nhỏ hơn là một đặc điểm phân loại để nhận biết T umbraculifera var.

microcarpa và T caespitosa.

i

Hình 1.4 Các dạng hạt của Taxus sp.

Chú thích ảnh: Hàng trên cùng từ trái sang phải: (1) T canadensis var minor từ

Maine (Ovis, Island, Mỹ, True 164); (2) T contorta từ Tây Bắc Himalaya, Chumba (Pengelly); (3) T baccata var baccata từ Ma rốc (Haut 938); (4) var glauca, từ Armenia

(Szovich 610), (5) T recurvata var linearis Spjut từ Rumani (Barabas) Hàng giữa: (6) T.

baccata var subpyramidalis Jacques ex Carrière từ Iran (Koelz 16028); (7) T kingstonii

Spjut từ Khasia, Ấn Độ (Mann); (8) T celebica từ Quý Châu, Trung Quốc (Steward và cs

328); (9) T mairei var speciosa từ Tứ Xuyên, Trung Quốc (Fang 3442); (10); var mairei,

từ Quý Châu (Sino-Amer Exped 1046) Hàng cuối: (11) var mairei từ Hồ Nam, Trung

Quốc (Hu 644); (12) T chinensis từ Quý Châu (Sino-Amer Exped 1854);

(13) T umbraculifera var nana từ Nhật Bản (Muroi 5933); (14) var microcarpa từ Nhật Bản (Đại học Nông nghiệp Sapporo); (15): T caespitosa từ Nhật Bản (Mizushima 1985) [95].

Nguồn: Hình 1.4 theo tác giả Spjut [95].

Các loài Thông đỏ ở châu Á

Theo Spjut (2010), Taxus chinensis, T contorta, T wallichiana và các loài

liên quan được cho là đã tiến hóa ở các vùng địa lý - sinh thái khác biệt ở châu Á,vẫn duy trì tương đối ổn định trong một thời gian dài ở Kỷ Đệ tam (khoảng 200 đến

251 triệu năm trước) [96] Sự khô cằn và khí hậu lạnh hơn trong thời kỳ Neogene(khoảng 23,03 ± 0,05 triệu năm trước) (Axelrod 1975) có thể đã dẫn đến sự hình

thành các đặc điểm phân nhánh và lá của Taxus như ngày nay được thấy trong phức hợp các loài ôn đới và cận nhiệt đới ở châu Á [16] Taxus chinensis giữ vị trí trung

tâm đối với các phức hợp khác nhau, nhưng thông tin thu thập được còn ít

Taxus wallichiana Zuccarini, T contorta Griffith và T chinensis (Pilger)

Rehder là ba loài trên dãy Hy Mã Lạp Sơn và Tây Nam Trung Quốc trước đây đã bịnhầm lẫn do hiểu nhầm về phân loại và dùng sai tên Sự nhầm lẫn đã dẫn đến đặt

các tên khác không cần thiết là: T fuana Nan Li & R R Mill và T yunnanensis W.

C Cheng & L K Fu, sau này được phân loại là các thứ: T contorta var mucronata Spjut, và T wallichiana var yunnanensis (W C Cheng & L K Fu) C T Kuan.

Cách phân loại các loài Thông đỏ được phân biệt rõ hơn nhờ các đặc điểm hình tháichính và một số các mô tả chi tiết

Mô tả các loài Thông đỏ châu Á được xác định bởi các đặc điểm dựa trên dữliệu từ mẫu vật khô ở các vị trí địa lý tương quan với các kiểu thảm thực vật xung

quanh của Taxus; sự khác biệt về màu sắc so với mẫu vật tươi (Spjut) [96] Những

đặc điểm nổi bật được trình bày dưới đây chỉ liên quan đến ba loài Taxus ở khu vực

châu Á Lá mọc kiểu xoắn ốc nhưng lá thường xoắn dọc theo cuống lá và phiến lárồi tỏa ra hai bên Đặc điểm chính của ba loài và các thứ dưới loài (var.) của Thông

đỏ châu Á được tóm gọn theo thứ tự ưu tiên: (1) T contorta, (2) T chinensis và (3)

T wallichiana.

T contorta có lá khô với các tế bào nhu mô lỏng lẻo, màu đỏ sẫm, giống như

vỏ trứng vỡ, thường rơi ra khi cắt lá; (5-) 7-8 (-11) hàng/ dãy lỗ khí; tế bào biểu bì

lá thường hình elip trong các mặt cắt ngang, đặc biệt là trong các mẫu ở Tây BắcHimalaya; hạt hình khối trụ hay hình cầu (Hình 1.5)

T contorta var contorta có lá dài hơn chiều rộng 12 lần hay hơn, thẳng và

thon dài, tỏa rộng bằng cuống lá, cuống lá cong (Hình 1.5); 5- 8 (9-11) hàng/ dãy lỗ

khí; phân bố ở Afghanistan, Pakistan, Ấn Độ và Tây Nepal.

T contorta var mucronate có lá dài 5 - 10 lần so với chiều rộng, cuống lá

uốn cong rõ (Hình 1.6); 9 - 11 hàng/ dãy lỗ khí; phân bố ở Nepal, Tây Nam TâyTạng và Bhutan

T chinensis có lá khô với các tế bào nhu mô kết dính màu đỏ đến hơi xanh;

11-21 hàng/dãy lỗ khí; tế bào biểu bì lá góc cạnh hoặc hình elip trong mặt cắt nganglá; hạt hình nón, từ giữa hạt thon dần đến đỉnh nhọn (Hình 1.7) Cành xanh nhạt cósọc màu vàng, màu sẫm dần từ các nhánh non đến già; có vết tích của vảy chồinhưng có khi không tồn tại (Hình 1.8); lá hình elip hẹp đến thuôn dài; tế bào biểu bì

lá thường là hình elip trong mặt cắt ngang, hiếm khi góc cạnh; mọc ở Việt Nam vàTrung Quốc

T wallichiana có cành già không có sọc màu vàng, thường đột ngột sẫm màu

từ màu vàng lục đến màu nâu sẫm ở năm thứ 2, hoặc màu đỏ cam trong các mẫu vật

từ Đông bắc Ấn Độ; vảy nụ thường tồn tại ở gốc cành; giống như răng nhọn (Hình1.9); lá hầu hết là dải hẹp có gân lá hình cung gần gốc lá; tế bào biểu bì lá chủ yếugóc cạnh trong mặt cắt ngang

Lá T wallichiana var yunnanensis như hình giáo nhỏ (lá dài hơn đáng kể so

với chiều rộng và rộng nhất ở giữa, nhọn dần về phía đỉnh) ở mẫu cây từ Tứ Xuyên

và Vân Nam (Hình 1.10), hoặc dạng dải hẹp như mẫu cây từ Đông bắc Ấn Độ đếnTây Tạng; mặt cắt ngang dài và hẹp tới mép lá; tế bào biểu bì lá trong mặt cắt ngangthường được mở rộng dọc theo mặt dưới, rộng 35 – 50 µm, nhú hầu hết là đối diệnmép và gân lá; phân bố ở Đông bắc Ấn Độ, Myanmar, Đông Nam Tây Tạng và VânNam Trung Quốc.

Lá T wallichiana var wallichiana có dạng dải hẹp (Hình 1.11); mặt cắt

ngang không thon dài đến mép; các tế bào biểu bì mặt dưới trong mặt cắt ngangkhông mở rộng, nói chung là ngắn hơn so với các tế bào biểu bì mặt trên, rộng 15 –

25 µm; chiều dài tế bào giảm đi khi gần mép; các nhú thay thế hầu hết các tế bàotrên gân lá và mép lá hoặc dọc theo màng tế bào; phân bố ở Đông Bắc Ấn Độ,Nepal, Bhutan, Myanmar, Tứ Xuyên và Vân Nam

Hình 1.5 Lá và hạt của Taxus contorta var contorta Chú thích ảnh: Hình trái: cho thấy lá thẳng và thuôn dài, (Stainton 5616), mẫu vật

từ Nepal (BM) Hình phải: hạt hình khối trụ, Pingelly s.n., mẫu vật từ Ấn Độ (K).

Hình 1.6 Dạng lá Taxus contorta Hình 1.7 Taxus chinensis với các hạt có

var mucronata có lá uốn cong, từ Bhutan đầu nhọn, từ Quý Châu, Trung Quốc

Hình 1.8 Cành của Taxus chinensis trên núi Nga Mi, Tứ Xuyên, Trung Quốc

Hình 1.9 Cành của Taxus wallichiana từ Khasia, Ấn Độ

Hình 1.10 Lá của T wallichiana var.

yunnanensis, từ Vân Nam, Trung

Quốc

Hình 1.11 Lá của T wallichiana var wallichiana Đông Himalaya

Nguồn: Hình 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 1.10 và 1.11 theo tác giả Spjut [96].

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG THÔNG ĐỎ

Trên thế giới, các loài Thông đỏ (Taxus sp.) đã được nghiên cứu từ những

năm 1908 tới nay Nhiều thành phần hóa học đã được xác định như taxoid,flavonoid, steroid và nhiều hợp chất khác, …, nhưng trong đó được quan tâm nhiềunhất là các taxoid nhờ vào tác dụng kháng ung thư [13], [42], [62] [91]

Taxoid

Taxoid là tên gọi chung chỉ nhóm các hợp chất dẫn xuất diterpen Taxoidthường có chứa một vòng tám carbon ở giữa hai vòng sáu carbon nhưng có một sốlượng lớn hợp chất đã được sắp xếp lại khung taxan cơ bản như 3,11-cyclohexan;

11(15→1) abeo-cyclohexan; 11(15→1), (10→9) bi-abeo-taxan,… [14], [17].

Khung taxoid căn bản

Một taxan bình thường (I) chứa một vòng tám carbon giữa hai vòng sáu

carbon, nhưng có rất nhiều hợp chất đã sắp xếp lại khung cấu trúc Các taxoid có

cấu trúc 3,11-cyclotaxan (II) gồm 4 vòng do có liên kết bổ sung giữa C-3 và C-11.

Những taxan thuộc nhóm (III) được gọi là 11(15 → 1) abeo- taxan, có sự đổi liên

kết ở C-11 với C-15 thành liên kết C-11 với C-1; vì vậy từ cấu trúc khung 6/8/6 đã

tạo thành khung 5/7/6 Tương tự, hệ thống khung 6/10/6 (IV) được gọi là 2(3→ 20)

abeo-taxan Nhóm (V) là các taxan có khung 11(15 → 1), 11(10 → 9)

bisabeo-taxan cũng được tìm thấy Các hợp chất với khung (VI) được gọi là tiền chất của

taxan vì liên kết giữa C-3 và C-8 chưa được hình thành [14]

Các hợp chất diterpenoid khung taxan là thành phần tiêu biểu quan trọngnhất tạo nên hoạt tính của cây Thông đỏ Các diterpenoid này được sinh tổng hợp từpyruvat và glyceraldehyd-3-phosphat để tạo thành isopentenyl diphosphat và

dimethylallyl diphosphat, thông qua con đường 2-C-methyl-D-erythritol phosphat.

Isopentenyl diphosphat và dimethylallyl diphosphat đóng vai trò là chất nền chogeranyl diphosphat synthetase để tạo thành geranyl diphosphat Tiếp theo là chu kỳhình thành lõi taxan từ geranyl diphosphat xúc tác bởi taxadien synthetase, thôngqua oxy hóa mở rộng dẫn đến thay đổi cấu trúc và hình thành taxol [29] Sau khi

phân lập được taxol, mọi loài thuộc chi Taxus đều được nghiên cứu để sàng lọc các dipterpen gây độc tế bào Trên thực tế, mọi bộ phận dùng của các loài Taxus đã

được nghiên cứu về tiềm năng chống ung thư của các diterpen đã được phân lập

Hầu hết các loài T wallichiana cũng là nguồn nguyên liệu cung cấp diterpen đã

được phân lập từ lá, vỏ cây, rễ và gỗ Một số bài tóm tắt đã tổng hợp các diterpen

thu được từ chi Taxus và phân loại trên cơ sở vòng diterpen [13], [79].

Hình 1.12 Khung taxoid căn bản

Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được trên 50 chất diterpenoid khung

taxan trong loài Taxus wallichiana Zucc [91] Trong đó, nhiều chất quen thuộc có trong các loài khác thuộc chi Taxus như: Paclitaxel, baccatin III, 10-deacetyl baccatin III Các hợp chất taxoid phân lập được từ T wallichiana đa số thuộc nhóm

có khung 6/8/6 và khung 5/7/6

Trong các hoạt chất tìm thấy tác dụng thì nhóm các chất thuộc bộ khung

6/8/6 chiếm đa số, điển hình là paclitaxel [42], [75] Paclitaxel được tìm ra lần đầu

tiên vào năm 1971 bởi Wani và cs trong loài Thông đỏ Thái Bình Dương (T.

brevifolia), sau đó được phân lập ở tất cả các loài Thông đỏ khác, trong đó hàm

lượng paclitaxel trong loài T wallichiana khoảng 0,0045 - 0,015% [91].

R 5 R 4

8 11

O 15

Hình 1.14 Cấu trúc các hợp chất taxoid có nitơ ở mạch nhánh C13

Paclitaxel (taxol) OH H =O OAc Ph H Ph Bz

Bảng 1.1 Các hợp chất diterpen phân lập từ Taxus wallichiana

Bộ phận Các hợp chất diterpen

của cây

Thân, lá, Cephalomannin, taxol, baccatin III, 1β-hydroxybaccatin I,

10-rễ deacetylcephalomannin, 10-deacetyltaxol, 19- hydroxybaccatin III

Taxol, 7β-xylosyltaxol, xylosyltaxol,

10-deacetyl-7-xylosyltaxol C, cephalomannin, 2′-deacetoxytaxinin J, decinnamoyltaxinin J, 1-hydroxy-2-deacetoxytaxinin J (taxawallin A),2′-deacetoxyaustrospicatin, 7,2′-bisdeacetoxyaustrospicatin, taxacustin,

2′-deacetoxy-5-taxayuntin, 2α-acetoxybrevifoliol,

5α,7β,10β,13α-tetrahydroxy-2,9,15-triacetoxy-11(15-1)-abeotaxa-4(20),11-dien, tetraacetoxy-15-hydroxy-11(15-1)-abeotaxa-4(20),11-dien, taxawallin

5α,9α,10β,13α-I, 7,9-dideacetyltaxayuntin, taxawallin K, tasumatrol B,

4-deacetylbaccatin III

Vỏ thân 1,3-Diacetyl-10-deacetylbaccatin III, taxamairin F, taxusabietan C,

taxusabietan A, deacetylbaccatin III,

14β-hydroxy-10-deacetylbaccatin V

Lá 2-Debenzoyl-14β-benzoyloxy-10-deacetylbaccatin III, taxol,

cephalomannin, 10-deacetylbaccatin III, brevifoliol, acetoxybrevifoliol (taxchinin), wallifoliol, 19-debenzoyl-19-acetyltaxinin M, 10,13-deacetylabeobaccatin IV, 5-deacetyl-1-

2-hydroxybaccatin I, 2-deacetoxytaxinin B,

5αO-(3′-dimethylamino-3′-phenylpropionyl) taxinin M

Gỗ 7-O-Acetyltaxin A, 2α-acetoxy-2′β-deacetylaustrospicatin,

1-hydroxy-2-deacetoxy-5-decinnamoyl-taxinin J, taxusin, deacetyltaxol, taxoid oxy hóa C14, taxoid dibenzoyl hóa

7-xylosyl-10-13-Acetyl-13-decinnamoyltaxchinin B, paclitaxel, 1β-hydroxybaccatin

I, baccatin III, taxusin

Rễ 7-Xylosyl-10-deacetyltaxol, baccatin IV, taxoid oxy hóa C14

Các khung taxoid khác

Hình 1.15 10,15-epoxy-11(15 1)-abeo-Hình 1.16 Wallifoliol

10-deacetylbaccatin III

Các hợp chất diterpen phân lập từ các bộ phận thân, lá, rễ, vỏ thân và gỗ của

Taxus wallichiana đã được công bố từ năm 1981 đến năm 2018 đã được trình bày

trong Bảng 1.2 phía trên [91]

Flavonoid

Các biflavonoid là các chất chuyển hóa thứ cấp được hình thành qua cơ chếoxy hóa flavon, flavonol, dihydroflavonol, flavanon, isoflavon, auron, auronol hoặcchalcon [70] Đối với phần lớn các họ thực vật thuộc về ngành Hạt trần(Gymnospermae), bao gồm cả các họ Taxaceae và Ginkgoaceae, biflavonoid là các

điểm chỉ hóa học Đã có nhiều bioflavonoid được phân lập từ chi Taxus [62], [63], [91] Cụ thể, amentoflavon và sciadopitysin là biflavonoid đã được phân lập từ T.

wallichiana; bao gồm mono- và o-dimethyl-amentoflavon [80].

Lá cây Thông đỏ có chứa các hợp chất flavonoid kiểu amentoflavon nhưamentoflavon, sevoiaflavon, setersuflavon, ginkgetin, 4′,7″-dimethylamentoflavon,

7, 4′,7″-trimethylamentoflavon, sciadopitysin và kayaflavon [54], [73]

Năm 2001, Mai Văn Trì và cs đã phân lập và xác định được

7,7″,4-tri-O-trimethylamentoflavon, một biflavon hiếm thấy trong thiên nhiên, từ lá cây Thông

đỏ lá dài ở Lâm Đồng [10]

Các thành phần hóa học khác

Các nhà khoa học đã công bố nhiều thành phần hóa học khác trong Thông đỏ

lá dài [91] Năm 2008, Trần Công Luận và cs đã sơ bộ xác định được trong láThông đỏ còn có các thành phần khác như tinh dầu, chất béo, triterpenoid, alcaloid,tannin, saponin, chất khử, acid hữu cơ và các dẫn xuất của đường [5]

Tinh dầu

Lá T wallichiana rất giàu tinh dầu Các hợp chất terpen, alcohol, aldehyd,

acid hữu cơ, este của acid hữu cơ, ankan và anken là thành phần chính mang lại choThông đỏ mùi và vị đặc trưng Thành phần chính của các loại tinh dầu được liệt kêtrong Bảng 1.3 [91]

sau đó được phân lập từ gỗ của cây này được xác định là texiresinol, isotexiresinol

và (–)-secoisolariciresinol [24] Gần đây, những lignan này đã thu hút đáng kể sựchú ý ở các nghiên cứu do làm giảm tỷ lệ mắc một số bệnh mãn tính [ 93] Cáclignan như hydroxymatairesinol và secoisolariciresinol đã được tìm thấy có tácđộng chống ung thư [24], [66], [87] Texiresinol, một lignan khác, cũng đã cho thấytác động chống ung thư cũng như chống khối u [40] Một lignan khác làisotaxiresinol rất hữu ích trong điều trị loãng xương sau mãn kinh, đặc biệt là ngănngừa gãy xương do thiếu hụt estrogen [112]

Phytosterol và phytoecdysteroid

Sinh tổng hợp sterol trong thực vật không chỉ điều chỉnh tính lưu động vàtính thấm của màng để duy trì các chức năng khác nhau của màng tế bào mà còn tác

dụng điều chỉnh hoạt động của các protein liên quan đến màng bao gồm enzyme,

thụ thể và các chất dẫn truyền [81] Các sterol được phân lập từ T wallichiana thuộc loại 4-desmethylsterol, β-sitosterol và daucosterol (β-glucosylat của β- sitosterol), trong dịch chiết ethanol của vỏ cây [22] β-sitosterol có tác dụng chống

virus, kháng viêm, chống đông máu và co thắt tử cung, trong khi daucosterol đãđược nghiên cứu về tác dụng gây độc tế bào [47]

Bảng 1.2 Các hợp chất trong tinh dầu ở lá Taxus wallichiana Zucc.

Alkan n-Eicosan, docosan, n-pentacosan

Alcohol 1-Hepten-3-ol, (E)-2-hexenol, n-hexenol, n-heptan-2-ol,

n-heptanol, (E)-2-octen-ol, (Z)- 2-octen-ol,

1-octanol, (E)-verbenol, (E)-2-nonenol, myrtenol, geraniol,

eugenol, globulol

Aldehyd Heptanal, benzaldehyd, octanal, (E)-2-octenal,

n-nonanal, (E)-2-nonenal, dodecanal, n-nonanal,

anisaldehyd

Acid hữu cơ Acid hexanoic, acid benzoic

Các este của acid hữu cơ (Z)-3-Hexenyl format, (Z)-3-hexenyl acetat,

(E)-2-gexenyl acetat, metyl benzoat, (E)-3-heptenyl acetat, octyl format, benzyl acetat, metyl salicylat, n-octyl acetat, isopropyl-n-octanoat, sabinyl acetat, (E)-2- hexenyl-n-hexanoat,anisylacetat,(Z)-3-hexenyl

benzoat, geranyl tiglat, n-amyl anisoat,

geranyl-n-heptanoat, geranyl benzoat

Monoterpen/monoterpen α-Pinen, β-pinen, camphor, β-caryophyllen,

(Z)-β-hydrat ocimen, (Z)-sabinen hydrat, pinen hydrat.

Sesquiterpen β-Caryophyllen, (E)-α-bergamoten, α-humulen,

(E)-β-famesen, caryophyllen oxid, (E,E)-famesol.

Các steroid khác có trong Thông đỏ lá dài là các phytoecdysteroid Thực vậttổng hợp các phytoecdysteroid như một cơ chế bảo vệ [89] Hai phytoecdysteroid

được phân lập từ T wallichiana là ponasteron và ecdyson [23], [86].

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA THÔNG ĐỎ

Theo y học hiện đại

Cao nước lá Thông đỏ cho chuột cống trắng, giống cái uống liều 100 và 500mg/kg, trong những ngày 1 đến ngày 7 sau giao hợp, có tác dụng ức chế sự thụ thai60% và 80% tương ứng [91] Phân đoạn flavonoid từ lá Thông đỏ có 3 biflavonoid(scidopitysin, gingetin và sesquoiaflavon) có tác dụng ức chế thần kinh trung ương

và giảm đau mà không gây ngủ [104]

Năm 1962, một trong những dịch chiết từ cây Thông đỏ được phát hiện cókhả năng chống ung thư và có khả năng cô lập khối u rõ rệt Năm 1971, Wall vàWani đã phân lập và công bố cấu trúc paclitaxel (Taxol®) [105] Paclitaxel đượcdùng điều trị ung thư buồng trứng di căn, ung thư vú di căn và ung thư phổi sau khiđiều trị không đạt với liệu pháp chuẩn [42]

Chattopadhyay và cs đã tiến hành nghiên cứu có hệ thống các thành phần hóa

học có trong các bộ phận khác nhau của Taxus wallichiana, đã cô lập được ba

lignan từ tâm gỗ là taxiresinol; isotaxiresinol; (-)-secoisolariciresinol và đã chứngminh có tác dụng chống ung thư Đặc biệt taxirenol cho kết quả đáng chú ý với tác

dụng chống ung thư ruột già, gan, buồng trứng, tế bào ung thư vú in vitro [24] Các

lignan còn có các tác dụng sinh học đa dạng khác như chống co giật, giảm đau, hạsốt, chống viêm, chống nấm, chống vi khuẩn [57], [83]

Nisar và cs đã tiến hành thử nghiệm tác dụng chống nấm, chống vi khuẩn của

dịch chiết methanol của lá, vỏ cây và gỗ của Taxus wallichiana trên sáu chủng nấm

và sáu chủng vi khuẩn khác nhau Kết quả thử nghiệm cho thấy tất cả các dịch chiếtcủa các thành phần đều cho tác dụng kháng nấm và kháng vi khuẩn [77] Nisar còntiến hành thử nghiệm, nghiên cứu chứng minh tác dụng chống co giật, giảm đau, hạsốt, kháng viêm của dịch chiết methanol từ lá trên loài gặm nhấm Các nghiên cứuđược thực hiện bằng cách sử dụng acid acetic gây đau và penthylenetetrazol gây cogiật ở chuột nhắt, sử dụng formalin và nấm men gây sốt ở chuột cống Kết quả chothấy có sự giảm đau đáng kể trong cả hai mô hình sử dụng acid acetic và formalingây đau, đồng thời cũng cho tác dụng chống co giật và hạ sốt khi sử dụng dịch chiếtvới các liều tương ứng là 100 và 200 mg/kg [57], [78]

Nhìn chung, các tác dụng dược lý có được là do sự hiện diện của các hợpchất alkaloid, phenol, polyphenol, saponin, tannin, anthraquinon, steroid và đặc biệt

là các taxan diterpenoid (taxoid) được tìm thấy trong dịch chiết toàn phần củaThông đỏ lá dài [24], [83]

Độc tính của Thông đỏ

Vỏ cây, lá và hạt Thông đỏ có tác dụng gây độc Alkaloid taxin từ Thông đỏgây các triệu chứng ngộ độc như: Nôn, tiêu chảy, mê sảng, có tác dụng ức chế timlàm giảm lực co cơ tim, giảm nhịp tim và phong bế nhĩ thất do tác dụng ức chế kênhnatri và calci [1], [3]

Paclitaxel (Taxol®) được coi là chất chống ung thư và độc với gen Các thử

nghiệm in vivo và in vitro cho thấy paclitaxel có tác dụng gây đột biến gen trên tế

bào động vật có vú Sử dụng paclitaxel trong điều trị ung thư có thể gây nên một sốtác dụng phụ không mong muốn như suy tủy, giảm bạch cầu trung tính, giảm tiểucầu, thiếu máu; hạ huyết áp và giảm nhịp tim không biểu hiện triệu chứng; buồnnôn, nôn, tiêu chảy, táo bón, tắc ruột; rụng tóc, kích ứng tại nơi tiêm truyền; tăng

transaminase huyết thanh, tăng phosphat kiềm, tăng bilirubin huyết thanh; đau cơ, đau khớp; nhiễm khuẩn, … [1], [97].

1.4 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT TAXOID TỪ THÔNG ĐỎ

Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ

Taxoid đầu tiên được phân lập là taxol từ T brevifolia bằng phương pháp thay đổi dung môi do Wani thực hiện vào năm 1971 [105] T brevifolia chiết với

ethanol, dịch chiết EtOH được cô đặc và cao đặc EtOH được hòa vào nước rồi lắcphân bố lỏng - lỏng với cloroform Dịch chiết CHCl3 được cô đặc để loại dung môiCHCl3 Cao CHCl3 được triển khai sắc ký cột với 3 loại cột: Cột Florisil, SephadexLH-20 và silica-gel Kết tinh thu được từ dịch MeOH là taxol Năm 1993, Rao đãcông bố mô hình chiết taxoid đơn giản với các dung môi thông thường: Ethanol,methanol, nước,… [84] Phương pháp này hiện vẫn được nhiều nhóm nghiên cứu ápdụng [30]

Chiết xuất siêu tới hạn

Từ năm 1992, Jennings và cs đã sử dụng phương pháp chiết siêu tới hạn với

CO2 và EtOH 3% để chiết các taxoid từ lá T brevifolia [51].

Năm 2015, nhóm nghiên cứu Trần Công Luận và Vương Chí Hùng đã tiến

hành quy trình công nghệ chiết tách taxol từ lá cây Thông đỏ lá dài (Taxus

wallichiana Zucc.) ở quy mô pilot bằng kỹ thuật chiết CO2 siêu tới hạn [6] Bốn

taxoid khác cũng đã được phân lập gồm có: Deacetyl baccatin III; 10-DAB;taxuspin F; taxchin A

Chiết vi sóng (MAE- Microwave-assisted extraction)

Mattina và cs (1997) nhận thấy rằng phương pháp chiết vi sóng MEA có thể

giảm cả thời gian chiết và dung môi tiêu thụ [68] Nguyên liệu là lá của loài Taxus,

sử dụng hệ thống chiết vi sóng MES-1000 của CEM Corp thì dung môi EtOH 95%thường được sử dụng hơn MeOH; và sự tiêu tốn dung môi giảm rõ rệt Nhiệt độ tối

ưu là 85 °C và trong thời gian 9-10 phút Sử dụng các thông số trên và sau khi tinhsạch một phần các taxoid đã chiết bằng SPE, các taxoid chiết bằng MAE có kết quảđịnh tính và định lượng tương đương với các phương pháp chiết xuất thông thườngkhi lắc qua đêm 5 g lá kim trong 100 mL methanol ở nhiệt độ phòng Phương phápnày được nhiều nhóm nghiên cứu khác kế thừa và phát triển [8], [33].

Chiết xuất gia tốc dung môi (ASE - Accelerated solvent extraction)

Kikuchi (1997) và Kawamura (1999) đã tiến hành chiết taxol và các taxoid

liên quan từ vỏ của T cuspidata với hệ dung môi MeOH-H2O (90:10) trong hệthống chiết xuất gia tốc dung môi Dionex ASE-200 ở các điều kiện nhiệt độ và ápsuất khác nhau [55], [58]

Chiết siêu âm (Ultrasonic extraction)

Để tăng lượng paclitaxel chiết được, nhóm nghiên cứu Shujie và cs (2016)tiến hành chiết xuất bằng phương pháp siêu âm với EtOH và lắc phân bố lỏng –lỏng EtOH – CH2Cl2 (1:1) và kết hợp SKLM (TLC-UV) để phát hiện và phân lập

paclitaxel trong T cuspidata [92].

Các quy trình chiết xuất quy mô lớn

Năm 1986, các nhóm từ Đại học Bách khoa Virginia (Virginia PolytechnicInstitute) và Polysciences Inc (Huang và cs, 1986) đã thực hiện một quy trình quy

mô lớn, ban đầu chủ yếu dựa trên phương pháp của Wani và cs (1971) Phương

pháp này bao gồm các bước chiết vỏ cây T brevifolia (3.650 kg) bằng methanol,

cao đặc MeOH (1.085 kg) được hòa vào nước và lắc phân bố lỏng - lỏng vớimetylen clorid, cao metylen clorid (95 kg) triển khai sắc ký qua cột Florisil và silicagel thu được phân đoạn giàu taxol (13 kg), và cuối cùng thu được 911 g taxol thôkết tinh [46]

Nhiều phương pháp được công bố gần đây tập trung vào kỹ thuật điều chếhoặc bán điều chế các taxoid Sắc ký pha đảo là một phương pháp nhanh và hiệu

quả để tách và tinh sạch taxol Tuy nhiên, quan trọng là phải mở rộng được quy mô

để phân lập được một lượng lớn taxol

Bảng 1.3 Các phương pháp chiết xuất taxoid và các dung môi được sử dụng Dược liệu Taxoid Phương pháp – dung môi TLTK

Thay đổi dung môi

- EtOH – CHCl3

SKC rửa giải bằng MeOH

T brevifolia Taxol, baccatin III Chiết siêu tới hạn: [51]

CO2 và EtOH 3%

T cuspidata Taxol, baccatin III, Chiết xuất gia tốc dung môi: [55, 58]

10-DAB III MeOH-H2O (90:10)

Chiết siêu âm

- EtOH – CH2Cl2 (1:1)Chiết quy mô lớn bằng thay

- MeOH

- CH2Cl2 và H2OChiết quy mô lớn bằng sắc

ký lỏng điều chế trong công

Yang và cs (1998) đã phát triển một phương pháp điều chế hiệu quả để tinh

sạch taxol trong dịch chiết cloroform thô của T yunnanensis bằng hệ thống sắc ký

lỏng điều chế trong công nghiệp (IPLC- industrial preparative liquidchromatography) trên pha tĩnh polyme (nhựa D956: Chất đồng trùng hợpmetacrylat-divinylbenzen) rửa giải bằng hệ dung môi aceton - H2O Phương phápnày được sử dụng lần đầu tiên để sản xuất taxol ở quy mô công nghiệp từ dịch chiếtthô [110] Xue và cs (2000 và 2001) đã nghiên cứu phân lập taxol quy mô lớn trong

dịch chiết MeOH bán tinh khiết của vỏ cây T yunnanensis, sau đó tinh sạch taxol

qua cột sắc ký cột pha đảo C18 và rửa giải bằng hệ dung môi ACN - H2O [108],[109] Khó khăn trong việc tinh chế taxol là tách taxol khỏi các chất tương tự có liênquan chặt chẽ, 7-epi-10-deacetyltaxol và cephalomannin Mặc dù phương pháp ozonhóa có thể được sử dụng để tách cephalomannin khỏi taxol, việc tách taxol và 7-epi-

10-deacetyltaxol rất phức tạp bởi vỏ cây T yunnanensis có hàm lượng deacetyltaxol cao hơn nhiều so với các loài Taxus khác.

7-epi-10-Năm 2009, nhóm nghiên cứu Dorota và cs đã so sánh 4 phương pháp chiếtpaclitaxel, cephalomannin, và 10-deacetylbaccatin từ các nhánh lá Thông đỏ vớicùng dung môi MeOH: Siêu âm, chiết hỗ trợ vi sóng, chiết lỏng có áp suất (PLE),

và chiết Soxhlet Kết quả cho thấy chiết lỏng có áp suất (PLE) cho hiệu suất cao,các taxoid chiết được định lượng bằng HPLC [33]

Các nghiên cứu phân lập các taxoid từ Taxus wallichiana Zucc đã

công bố

Cùng với các nghiên cứu về các loài Taxus và chiết xuất phân lập taxoid từ

Thông đỏ trên thế giới, các nhà khoa học đã tiến hành nhiều nghiên cứu về thành

phần hóa học, phân lập taxoid trong Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) …

từ năm 1981 [69], [72] Dưới đây là các nghiên cứu được công bố gần đây về phân

lập taxoid từ T wallichiana Zucc.:

Năm 2002, Madhusudanan, Chattopadhyay và cs đã tiến hành phân tích bằng

kỹ thuật LC-ESIMS để lập dữ liệu các hợp chất taxoid trong phân đoạn chiết bằng

methanol từ vỏ thân của Taxus wallichiana ở các vùng khác nhau của dãy Himalaya

(Kashmir, Himachal Pradesh, đồi UP, Sikkim và Arunachal Pradesh) Nghiên cứu

đã thu thập được dữ liệu về số lượng và bản chất của các nhóm thế và khung taxan

đã có sẵn từ phổ LC-ESIMS Việc xác định các taxoid bằng cách so sánh khối phổESIMS so với dữ liệu phổ đã có sẵn hoặc bằng cách biện giải khối phổ ESIMS Kếtquả cũng được kiểm chứng bằng phân tích MS/MS phân đoạn đã được tinh chế vàtiêm trực tiếp vào nguồn ESI Paclitaxel, các dẫn chất tương tự và dẫn xuất xylosid

có hiện diện trong tất cả các mẫu ở các vùng Một quan sát thú vị là việc phát hiệnmột lượng lớn các loại taxoid cơ bản có chuỗi bên C-13 chứa nitơ [64]

Năm 2003, Atta-ur- Rahman và cs phân lập được 1 hợp chất taxan diterpen

mới: 7β,9α,10β,13α,15-pentahydroxy-2α, 4α-diacetoxy-abeo-baccatin-VI từ vỏ cây Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc) Cấu trúc các hợp chất được xác định

bằng phổ NMR với các phổ 2D-NMR Ngoài ra, nghiên cứu còn phân lập được 3hợp chất đã được công bố: 4-(4'-hydroxyplenyl)-2-butanon, 4-(4'-hydroxyphenyl)-2-

butanol và 9-hydroxy-4,7-megastigmadien-3-one-3-oxo-α-ionol Phương pháp phân lập đã được áp dụng là sắc ký cột với hệ dung môi pha động n-hexan: Cloroform, và

sắc ký lớp mỏng điều chế khai triển với hệ dung môi CHCl3 - MeOH (95:5) [14]

Năm 2007, để đánh giá sự biến động của hàm lượng 10-deacetyl baccatin III

và 19-hydroxyl baccatin III theo thời gian thu hái trong lá cây Thông đỏ (Taxus

wallichiana Zucc.), Nguyễn Hữu Toàn Phan và cs đã tiến hành chiết xuất các taxoid

này theo các bước sau: Lá khô được nghiền mịn, chiết 3 lần với MeOH trong bểsiêu âm 4 giờ/lần với tỷ lệ lá khô/MeOH = 1/5 Các dịch chiết được gộp chung, côthu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao MeOH Hòa tan cao trong dungdịch MeOH-nước 20%, lọc loại bỏ phần không tan và chiết loại chất màu với n-hexan, sau đó chiết lấy các hợp chất taxoid với chloroform Kết quả cho thấy hàmlượng 10-deacetyl baccatin III và 19-hydroxyl baccatin III tăng dần theo thời gianthu hái từ tháng 1 đến tháng 6 và sau đó, giảm dần đến tháng 12 Hàm lượng 10-

deacetyl baccatin III cao nhất là 0,037% và hàm lượng 19-hydroxyl baccatin III caonhất là 0,032% đạt được khi thu hái lá vào tháng 6 [7].

Năm 2009, Nguyễn Thị Thanh Tâm và cs đã chiết xuất và phân lập cáctaxoid theo qui trình như sau: Từ 1,0 kg bột lá khô được ngâm với MeOH ở nhiệt độphòng trong 4 giờ, dịch sau khi ngâm đem bốc hơi dung môi áp suất giảm thu đượccao thô Cao thô MeOH (250 g) được hòa tan vào nước, lần lượt ly trích với cácdung môi ether dầu hỏa, cloroform và ethyl acetat thu được các cao tương ứng Tiếnhành sắc ký cột silica gel, cao cloroform (25 g) với nhiều hệ dung môi khác nhau đãphân lập và xác định được các hợp chất là taxinin B, taxuspin F, 10-

deacetyltaxuspin F, 19-hydroxybaccatin III, 10-deacetylbaccatin III,

7-(β-xylosyl)-10-deacetyltaxol [9]

Năm 2016, nhóm nghiên cứu Lê Thị Kim Phụng và cs đã trích ly taxol và DAB III từ lá và cành cây Thông đỏ được trồng tại Lâm Đồng [8] Một vài phươngpháp trích ly truyền thống như phương pháp Soxhlet, phương pháp ngâm cũng nhưcác phương pháp hiện đại như chiết có hỗ trợ vi sóng (MAE), chiết có hỗ trợ siêu

10-âm (UAE) được thực hiện để đánh giá hiệu quả Nồng độ của 10-DAB III đạt hơn90% được so sánh với phương pháp ngâm và lượng taxol chiếm khoảng 80% khichiết bằng Soxhlet Vì vậy, MAE phù hợp hơn trong việc chiết xuất cả hai hợp chấttaxol và 10-DAB III so với các phương pháp khác bởi vì thời gian chiết ngắn và tiêutốn dung môi ít

Năm 2017, Dang và cs đã chiết xuất taxoid từ vỏ thân Taxus wallichiana.

Quy trình phân lập gồm các bước: Bột vỏ cây chiết hồi lưu với MeOH, cao đặcMeOH hòa vào nước và lắc phân bố lần lượt với CH2Cl2, EtOAc, các phân đoạn

CH2Cl2 và EtOAc được khai triển qua cột silica gel với các hệ dung môi EtOAc-PE,CHCl3-PE và thu được được 6 taxoid mới: Các wallitaxan A–F (1–6), cùng với 29

hợp chất đã biết Wallitaxan D được xác định là một loại taxoid oxetan mở có nhómacetal C(H)-20 tự nhiên đầu tiên, trong khi các wallitaxan E và F là đại diện của

nhóm abeo-taxoid hiếm [30].

Các phương pháp phân tích, định lượng các hợp chất taxoid trong Thông đỏ

Pha tĩnh, pha động và đầu dò của phương pháp phân tích taxoid bằng phương pháp HPLC

Các pha tĩnh khác nhau được sử dụng trong RP-HPLC định lượng các taxoid.Nguyên liệu từ dược liệu thường được phân tích trên các cột phenyl, diphenyl vàpentafluorophenyl (PFP) nhưng các cột C18, C8 và cyano cũng được sử dụng [100].Gần đây, các cột pha tĩnh chuyên biệt cho “taxan” như: Phenomenex Taxol (Curosiltrên silica, RP), Whatman TAC 1, Metachem Taxil, Supercosil LC-F® (cả ba đều làpentafluorophenyl trên silica, RP) và Zorbax SW-Taxan đã được phát triển để phântích định lượng taxoid Ngoài ra, một cột RP Fluofix® (dẫn xuất alkyl polyfluoratliên kết với silica) đã được Aboul-Enein và Serignese (1996) sử dụng để phân tíchtaxol và năm taxoid đã công bố [12] Nhựa D956 gồm các chất đồng trùng hợpdivinylmethacrylate-benzen, cũng được Yang và cs (1998) phát triển cho kỹ thuậtHPLC điều chế [110]

HPLC kết hợp với phép đo khối phổ, đó là HPLC-MS và HPLC-MS/ MS đãđược Hoke và cs (1992) sử dụng để xác định phân mảnh taxol và các taxoid [45].Chọn lọc ion làm tăng độ nhạy và độ chọn lọc, và đầu dò MS tăng giới hạn pháthiện lên mức 100 – 200 pg Theo nghiên cứu của Sadeghi-aliabadi và cs (2009) đã

sử dụng phương pháp HPLC với đầu dò UV và LC-MS để xác định và định lượng

chính xác hàm lượng taxol trong dịch chiết từ lá của Taxus baccata L [88].

Ghép HPLC với NMR (HPLC-NMR) là một trong những kỹ thuật mạnh nhất

để phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất chưa biết trong hỗn hợp TheoWolfender và cs (2001) [106], kỹ thuật LC-NMR đã được Hostettmann và cs ứngdụng trong phân tích hóa thực vật Ưu điểm của HPLC-NMR trong phân tích taxan

được Schneider và cs (1998) mô tả bằng phân tích các taxan từ ba loài Taxus [90].

Các nghiên cứu về phân tích taxoid được mô tả ngắn gọn dưới đây