Xây dựng qui trình nhân nuôi và tinh chế virút dengue sử dụng trong sản xuất vắc xin sống giảm độc lực : Luận văn ThS. Sinh học: 84201

1.1.1.3 Miễn dịch tế bào Khi cơ thể con người nhiễm virút dengue, sẽ sản sinh ra một lượng kháng thể đáp ứng tế bào T CD4+ và CD8+ đặc hiệu với các epitope trên nhiều kháng nguyên DEN k

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Đỗ Tuấn Đạt PGS TS Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Tuấn Đạt, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong công việc cũng như trong suốt quá trình học tập, và thực hiện các nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Bùi Thị Việt Hà – Bộ môn Vi sinh – Khoa Sinh học – Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội, người đã chỉ bảo

và góp ý nhiệt tình giúp tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật học thuộc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các anh chị và bạn các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi, cùng chia sẻ các kinh nghiệm và kiến thức trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại phòng Công nghệ Cao, Công ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1

Cuối cùng, tôi muốn được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên khích lệ, động viên tôi trong suốt thời gian vừa qua

Học Viên

Hoàng Đức Lộc

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm virút Dengue 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái và phân loại 3

1.1.2 Cấu trúc phân tử và các protein chức năng 4

1.1.3 Quá trình lây nhiễm và sao chép của virút 5

1.1.4 Đáp ứng miễn dịch với virút dengue 8

1.2 Dịch tễ học bệnh sốt xuất huyết 12

Tình hình dịch tễ bệnh trên thế giới 12

Tình hình dịch tễ bệnh tại Việt Nam 16

Nguồn bệnh trong tự nhiên 18

Đường lây và vector truyền bệnh 19

Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng bệnh sốt xuất huyết dengue 20

Các yếu tố ảnh hưởng 21

Các phương pháp phòng ngừa dịch bệnh 21

1.3 Tình hình nghiên cứu phát triển vắc xin phòng SXHD trên thế giới 24

Vắc xin sống, giảm độc lực 24

Vắc xin bất hoạt 27

Vắc xin tiểu đơn vị tái tổ hợp 28

Vắc xin DNA 29

1.4 Đặc điểm chủng vắc xin dengue tái tổ hợp được sử dụng tại VABIOTECH 30 2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Vật liệu 34

2.1.1 Tế bào Vero 34

2

2.1.2 Các chủng virút dengue tái tổ hợp 34

2.1.3 Môi trường nuôi cấy và các dung dịch trong nghiên cứu 34

2.1.4 Các hóa chất và sinh phẩm 35

2.1.5 Dụng cụ và trang thiết bị 35

2.2 Phương pháp 37

2.2.1 Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản và nhân số lượng tế bào Vero trên chai nuôi một lớp hoặc chai Cell factory 37

2.2.2 Phương pháp gây nhiễm và nuôi cấy virút dengue trên tế bào 39

2.2.3 Phương pháp thu hoạch virút dengue sau gây nhiễm 40

2.2.4 Phương pháp ly tâm 40

2.2.5 Phương pháp lọc loại xác tế bào 41

2.2.6 Phương pháp xử lý DNA tế bào chủ bằng enzyme benzonase 41

2.2.7 Phương pháp thẩm tích 42

2.2.8 Phương pháp chuẩn độ virút dengue bằng tạo đám hoại tử 43

2.2.9 Phương pháp thử vô khuẩn 44

2.2.10 Phương pháp định lượng protein theo phương pháp Lowry 46

2.2.11 Phương pháp định lượng DNA tổng số bằng phương pháp lai phân tử47 3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51

3.1 Xây dựng quy trình nhân nuôi virút dengue ở quy mô phòng thí nghiệm.51 3.1.1 Liều gây nhiễm và thời gian hấp phụ virút 51

3.1.2 Thời gian nuôi cấy và số lượng mẻ gặt 54

3.1.3 Quy trình nhân nuôi virút dengue ở quy mô phòng thí nghiệm 61

3.2 Xây dựng qui trình tinh chế virút ở quy mô phòng thí nghiệm 63

3.2.1 Qui trình tinh sạch hỗn dịch virút 63

3.2.2 Qui trình xử lý loại DNA tế bào bằng enzyme 66

3.2.3 Qui trình thẩm tích hỗn dịch 69

3

3.2.4 Quy trình lọc vô trùng hỗn dịch virút 71

3.2.5 Qui trình tinh chế virút dengue ở quy mô phòng thí nghiệm 74

KẾT LUẬN 78

KIẾN NGHỊ 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

4

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Ảnh mô phỏng hạt virút dengue và hỉnh ảnh virút dengue chụp trên kính

hiển vi điện tử [66] 3

Hình 1.2 Cấu trúc hệ gen và các protein virút dengue [22] 4

Hình 1.4 Chu trình xâm nhiễm và nhân lên của virút dengue [25] 6

Hình 1.5 Mô hình hiện tượng tăng cường phụ thuộc kháng thể dengue [13] 11

Hình 1.6 Bản đồ mức độ phân bố dịch sốt xuất huyết dengue toàn cầu [12] 13

Hình 1.7 Số lượng trung bình các trường hợp nhiễm dengue tại 30 Quốc gia/ vùng lãnh thổ lưu hành dịch cao nhất báo cáo WHO từ năm 2004 – 2010 [62] 14

Hình 1.8 Những vụ dịch dengue lớn xảy ra trên toàn cầu từ năm 1990 – 2015 [16] 15

Hình 1.9 Thống kê số ca mắc sốt xuất huyết dengue tại Việt Nam từ năm 2006 – 2015 [6] 16

Hình 1.10 Số lượng trường hợp mắc dengue tại Việt Nam được báo cáo lên WHO năm 2017 [63] 17

Hình 1.11 Sự lây nhiễm virút dengue trong tự nhiên [13] 18

Hình 1.12 Sơ đồ cấu trúc các chủng vắc xin dự tuyển tái tổ hợp TV003/005 so sánh với vắc xin Denvaxia 32

Hình 2.1 Tế bào Vero sau khi nuôi cấy 38

Hình 3.1 Hiệu giá virút Dengue thu được tại các liều gây nhiễm MOI: 0.005, 0.01 và 0.05 với thời gian hấp phụ 1 hoặc 2 giờ 52

Hình 3.2 Hình ảnh các đám hoại tử virus dengue tái tổ hợp khi nhuộm với kháng thể đặc hiệu 53

Hình 3.3 Hiệu giá virút rDEN 1 theo thời gian nuôi cấy 55

Hình 3.4 Hiệu giá virút rDEN 2 theo thời gian nuôi cấy 55

Hình 3.5 Hiệu giá virút rDEN 3 theo thời gian nuôi cấy 56

Hình 3.6 Hiệu giá virút rDEN 4 theo thời gian nuôi cấy 57

Hình 3.7 Hình ảnh tế bào thay đổi sau các mẻ gặt virút rDEN 4 liên tiếp 60

5

Hình 3.8 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân nuôi virút dengue 61

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra DNA tồn dư trước và sau xử lý enzyme mẫu rDEN 1 69

Hình 3.10 Hệ thống lọc tiếp tuyến sử dụng trong thẩm tích liên tục 71

Hình 3.11 Phiến chuẩn độ hiệu giá rDEN 1 các bước sản xuất 73

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.2 Các vắc xin dengue dự tuyển đang được phát triển ở các pha TNLS 25

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra chất lượng các mẻ gặt đơn virút dengue 62

Bảng 3.2 Hiệu giá virút sau tinh sạch 65

Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra DNA tổng số trước và sau xử lý enzyme 68

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra protein tổng số và hiệu giá virút trước và sau thẩm tích 70

Bảng 3.5 Bảng tổng hợp kết quả kiểm tra chất lượng mẫu lọc vô trùng virút 72

Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu trước và sau tinh chế 76

6

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic

2 ARN Acid ribonucleic Axit ribonucleic

3 cDNA Coplementary Acid

deoxyribonucleic

axit deoxyribonucleic bổ sung

4 DEN Dengue virus Virút dengue

5 HCSD Hội chứng sốc dengue

6 HVĐT Hiển vi điện tử

9 MOI Multiple of infection Liều gây nhiễm

10 NIAID National Institute of Allergy

and Infectious Diseases

Viện Quốc Gia về dị ứng và các bệnh nhiễm trùng

11 NIH National Institute of Health Viện sức khỏe Hoa Kỳ

12 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

13 PFU Plague forming unit Đơn vị tạo đám hủy hoại tế bào

15 SXH Sốt xuất huyết

16 SXHD Sốt xuất huyết dengue

17 TCYTTG Tổ chức Y Tế Thế Giới

18 UTR Unstranslated region vùng không dịch mã

19 VABIOTECH Công ty TNHH MTV Vắc xin và

Sinh phẩm số 1

1

MỞ ĐẦU

Sốt xuất huyết dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây ra bởi virút dengue, bao gồm bốn týp huyết thanh (DEN 1, DEN 2, DEN 3 và DEN 4) Theo Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), SXHD là căn bệnh gia tăng nhanh chóng nhất trên thế giới bắt nguồn bởi vector lây truyển bệnh là muỗi, khiến gần 400 triệu người nhiễm bệnh mỗi năm trong đó có 500.000 ca sốt xuất huyết với hơn 25.000 ca tử vong [69] Trong vòng 50 năm qua, SXHD đã lan rộng từ một nhóm nước và trở thành dịch tại 128 quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi có khoảng 4 tỷ người đang sinh sống,

và số ca nhiễm sốt xuất huyết cũng đã tăng gấp 30 lần trong giai đoạn này Sốt xuất huyết dengue mang tới gánh nặng tài chính khổng lồ (lên tới 9 tỉ USD/ năm) trên các

hệ thống chăm sóc y tế ở những quốc gia có dịch lưu hành, đặc biệt ở những nước đang phát triển [69, 12]

Nằm trong khu vực lưu hành dịch, Việt Nam là một trong những nước chịu ảnh hưởng nặng nề nhất của dịch SXHD Kể từ năm 1994 trở lại đây số lượng ca mắc

và tử vong do SXHD có xu hướng tăng mạnh Bệnh có diễn biến phức tạp, đã và đang trở thành một vấn đề y tế nghiêm trọng, đặc biệt là khu vực miền nam Việt Nam [2,6] Theo thống kê của TCYTTG, trong năm 2017 Việt Nam có 183.287 trường hợp mắc (154.552 trường hợp nhập viện), 30 trường hợp tử vong Dịch bùng phát trên 61/63 tỉnh thành và đặc biệt tăng cao tại miền Bắc và Hà Nội Hàng năm, Chính Phủ Việt Nam đã chi rất nhiều kinh phí cho các hoạt động nghiên cứu, tuyên truyền kiểm soát

và phòng chống dịch bệnh do virút dengue gây ra, tuy nhiên kết quả thu được còn nhiều hạn chế Các biện pháp phòng ngừa dịch bệnh thông qua kiểm soát vector như phun hóa chất diệt muỗi trưởng thành, diệt bọ gậy, vệ sinh môi trường tốn nhiều kinh phí và cần tiến hành đồng bộ và trong một thời gian lâu dài Sử dụng vắc xin phòng bệnh SXHD được cho là biện pháp phòng chống dịch bệnh trên người chủ động và triệt để nhất, giúp khống chế sự lây lan của dịch bệnh trên toàn cộng đồng

Với mong muốn làm chủ được công nghệ sản xuất vắc xin dengue hiện đại, Công ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã hợp tác với Viện Quốc Gia về dị ứng và các bệnh nhiễm trùng, Viện Sức Khỏe Hoa Kỳ (NIAID, NIH) tiếp nhận giải pháp công nghệ và hệ thống chủng giống tái tổ hợp để tiến hành các

2

nghiên cứu phát triển vắc xin dengue tại Việt Nam Vắc xin dengue sản xuất tại Việt Nam sẽ cần có đầy đủ các tiêu chí như: an toàn, bảo vệ được cả 4 týp huyết thanh dengue, giá thành rẻ, dễ bảo quản và vận chuyển

Qui trình công nghệ nhân nuôi virút và tinh chế vi rút là những bước quan trọng trong quá trình sản xuất vắc xin Các quy trình này đóng vai trò quyết định đến hiệu suất và chất lượng của thành phẩm vắc Do vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Xây dựng qui trình nhân nuôi và tinh chế virút dengue sử dụng trong sản xuất vắc xin sống giảm độc lực” với mục tiêu:

• Xây dựng được quy trình nhân nuôi virút dengue để sản xuất vắc xin ở qui mô phòng thí nghiệm

• Xây dựng được qui trình tinh chế virút dengue để sản xuất vắc xin ở quy mô phòng thí nghiệm

3

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm virút Dengue

1.1.1 Đặc điểm hình thái và phân loại

Virút Dengue (DEN) là thành viên thuộc họ Flaviviridae, được xếp vào nhóm

flavivirus bao gồm một số virút gây bệnh khác nhau ở người và động vật, điển hình

như virút viêm não West Nile (WNV), virút gây viêm não Nhật bản (JEV), virút viêm não do ve truyền (TBEV), và virút gây bệnh sốt vàng da (YFV), virút Zika… [52] Hầu hết các loại virút thuộc nhóm này được lây truyền qua vết cắn của động vật chân đốt (muỗi hoặc ve) do đó chúng được phân loại là arbovirus Trong tự nhiên con người không phải là nguồn truyền bệnh của hầu hết các arbovirus, do virút gây bệnh

ở người không nhân lên với hiệu giá đủ lớn để lây truyền qua muỗi ngược sang cho động vật hoặc người khác ngoại trừ virút sốt vàng, sốt xuất huyết dengue, và virút Zika Ba loại virút này cần có vector lây truyền là muỗi, tuy nhiên chúng thích ứng tốt trên cơ thể con người nên không nhất thiết phải phụ thuộc vào vật chủ là động vật [24]

Hình 1.1 Ảnh mô phỏng hạt virút dengue và hỉnh ảnh virút dengue chụp trên

kính hiển vi điện tử [73]

4

Virút dengue được phân loại dựa trên đặc điểm kháng nguyên gồm bốn týp huyết thanh là DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4 Các týp huyết thanh này đều có khả năng gây bệnh và có các triệu chứng lâm sàng tương tự nhau Ngoài ra, trong mỗi týp huyết thanh virút lại có nhiều genotype khác nhau về mặt di truyền, trong đó các genotype gây bệnh cho người thường gây ra các vụ dịch lớn, nghiêm trọng được hiểu biết nhiều hơn so với những genotype gây bệnh ở động vật linh trưởng sống trong rừng hiện chưa rõ ràng về đặc điểm dịch tễ học cũng như tác nhân gây bệnh [1]

Tương tự như các virút thuộc nhóm flavivirus khác, hạt DEN hoàn thiện bao gồm một

RNA sợi dương được bao bọc bởi một nucleocapsid có kích thước khoảng 30 nm Hạt nucleocapsid này được bao phủ bởi lớp vỏ lipid có độ dày khoảng 10 nm Hạt virút hoàn thiện có kích thước khoảng 40 – 50 nm (Hình 1) Trọng lượng riêng của hạt virút khoảng 1,23 g/ cm3 [52]

1.1.2 Cấu trúc phân tử và các protein chức năng

Hình 1.2 Cấu trúc hệ gen và các protein virút dengue [24]

Bộ gen RNA virút có kích thước khoảng 10,700 nucleotide mã hoá cho khoảng

3411 amino acid có chứa 3 protein cấu trúc (vỏ capsid C, protein tiền màng PrM, và protein vỏ E) và bảy protein không cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B

và 3’UTR đều đóng vai trò quan trọng trong quá trình sao chép và dịch mã của virút [23] Các vùng không dịch mã có cấu trúc bậc hai đặc trưng, thực hiện các chức năng riêng biệt và có tính bảo tồn cao giữa các týp huyết thanh DEN khác nhau Đầu 5’UTR

có chứa một vòng lặp lớn hoạt động như một promoter điều khiển quá trình hoạt động RNA polymerase NS5

1.1.3 Quá trình lây nhiễm và sao chép của virút

1.1.3.1 Sự tương tác của các receptor và virút xâm nhập

Trong quá trình lây nhiễm tự nhiên trên người, mục tiêu tấn công của virút dengue là các tế bào bạch cầu đơn nhân (tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào đuôi gai) và tế bào Langerhan da [31] Trên muỗi, virút dengue lây nhiễm khởi đầu ở ruột non rồi lây lan và nhân lên ở các cơ quan, bộ phận khác Trong điều kiện nuôi cấy thí nghiệm, virút dengue đã được chứng minh có khả năng lây nhiễm và nhân lên ở nhiều dòng tế bào thường trực như: tế bào người (K562, U937, THP-1…)

tế bào muỗi (C6/36), tế bào khỉ (Vero, BS-C-1, CV-1); tế bào chuột lang (BHK) Khả năng lây nhiễm ở phổ rộng các tế bào đã cho thấy virút phải liên kết với số lượng lớn các phân tử trên bề mặt tế bào, hoặc sử dụng nhiều thụ thể làm trung gian cho quá trình lây nhiễm [73] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra virút dengue sử dụng kết hợp nhiều thụ thể để xâm nhập vào tế bào như: sự tương tác của DEN với các protein sốc nhiệt

70 (Hsp70), R80, R67 và một protein có kích thước 45 kDa trên tế bào muỗi [31] Ở động vật linh trưởng, các thụ thể Heparan sulfat, Hsp90, CD14, GRP78/ BiP được xác định là các thụ thể chính được sử dụng trong quá trình lây nhiễm virút Ở người,

6

các thụ thể tương tác với DEN bao gồm lectin týp C như ICAM-3; DC- SIGN; thụ thể mannose, CLEC5 [27] (Hình 1.4)

Hình 1.3 Chu trình xâm nhiễm và nhân lên của virút dengue [27]

Virút dengue cũng như các virút khác thuộc họ Flavivirus khác đều xâm nhập

tế bào sử dụng trung gian clathrin Sử dụng phương pháp theo dõi phân tử đơn, các nhà khoa học đã cho thấy kết quả hạt virút DEN 2 bám trên bề mặt tế bào di chuyển thông qua khuếch tán trên một lớp clathrin Điều này cho thấy phân tử DEN di chuyển dọc theo bề mặt tế bào bằng cách lăn trên các thụ thể khác nhau hoặc di chuyển như phức hợp thụ thể - virút [61]

Một báo cáo gần đây đã chỉ ra các con đường xâm nhập nội bào khác (độc lập với clathrin, caveolae, và lipid rafts) tùy thuộc vào týp huyết thanh dengue, và loại tế bào mục tiêu bị xâm nhiễm [10] Quá trình dung hợp màng tế bào để xâm nhiễm phụ thuộc vào đặc tính phụ thuộc pH trên màng tế bào của virút, do đó có thể khác nhau giữa các týp huyết thanh DEN Nhiều nghiên cứu về cấu trúc và chức năng được thực

7

hiện để cho thấy điều kiện pH axit trong endosome đã gây ra sự phân ly của các homodimer E, dẫn tới việc đẩy domain II về phía trước và tiếp xúc màng tế bào mục tiêu Sau đó, các vòng dung hợp sẽ chèn vào màng mục tiêu, kích hoạt sự lắp ráp các trimer E Tiếp theo, domain III sẽ thay đổi và gấp lại về phía peptide dung hợp tạo hình kẹp tóc Cơ chế gập lại này sẽ buộc màng đích và màng virút uốn cong vào nhau, cuối cùng là dính lại và giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất [61]

1.1.3.2 Quá trình tổng hợp các thành phần virút trong tế bào

Sau khi virút xâm nhập vào tế bào và cởi lớp vỏ nucleocapsid, phân tử RNA được dịch mã tại tế bào chất tạo ra một chuỗi polyprotein đơn Trong quá trình này, trình tự chuyển tiếp trên chuỗi polyprotein điều khiển quá trình chuyển vị qua lại qua mạng lưới nội chất của tế bào Chuỗi polyprotein được xử lý quá trình trước và sau dịch mã bởi tế bào và virút được hình thành phân tách thành 3 protein cấu trúc (C, prM và E) và bảy protein không cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, and NS5) Protein E được glycosyl hóa ở amino acid Asn67 và Asn153 để thực hiện quá trình gấp nếp của protein [50] Các vị trí glycosyl hóa khác có thể xảy ra ở vị trí amino acid 7, 31; 52 trên protein prM và vị trí 130; 207 trên NS1 Trong quá trình dịch mã protein và gấp nếp các protein riêng lẻ, các protein NS bắt đầu quá trình sao chép hệ gen virút RNA mới được tổng hợp sau đó được đóng gói bởi protein C để hình thành một nucleocapsid (Hình 1.3) Protein prM và E hình thành các chuỗi dị dimer được định hướng vào các khoang của lưới nội chất Sau đó, các chuỗi dị dimer prM/E này biết đổi thành trimer và sự tương tác giữa các oligomeric này được cho rằng tạo ra mạng lưới bề mặt cong, định hướng cho sự hình thành virút [27,36]

1.1.3.3 Sự hoàn thiện hạt virút trưởng thành

Phân tích cấu trúc virion chưa hoàn thiện cho thấy rằng một virion đơn có chứa

180 prM/E heterodimer được trải rộng trên bề mặt virút tạo thành 60 gai trimer Các hạt virion chưa trưởng thành được hoàn thiện trong mạng lưới nội chất và di chuyển theo con đường tiết Mức độ pH hơi acid (5.8 – 6.0) của mạng lưới trans-Golgi tạo ra

sự phân ly của các heterodimer prM/E, dẫn tới sự hình thành 90 dimer phẳng trên bề mặt của hạt virion, với mũ prM kết hợp với peptide protein E Quá trình cắt furin xảy

ra ở trình tự nhận biết Arg-X-(Lys/Arg)-Arg (X là amino acid bất kì) và dẫn tới việc

8

tạo ra protein liên kết màng M và một “pr” peptide Peptide pr vẫn được kết hợp với hạt virion cho tới khi virút được tiết ra môi trường ngoại bào [72] Protein prM cũng như peptide pr được cho rằng đóng vai trò là các chaperon ổn định protein E trong suốt quá trình vận chuyển thông qua con đường tiết, ngăn ngừa sự thay đổi cấu trúc protein E dẫn tới hòa tan màng tế bào Khi phân hủy peptide pr, hạt virion hoàn thiện

sẽ có khả năng lây nhiễm sang các tế bào mới (Hình 1.3)

1.1.4 Đáp ứng miễn dịch với virút dengue

1.1.1.1 Miễn dịch tự nhiên

Các đáp ứng đầu tiên với quá trình chống xâm nhập với DEN là quá trình sản xuất interferon (IFNs) Khi muỗi đốt, DEN xâm nhập vào trung gian các tế bào đuôi gai, các IFN loại I sẽ được sản xuất đầu tiên trong vài giờ sau lây nhiễm Không chỉ riêng các tế bào đuôi gai mà phần lớn các tế bào bị DEN lây nhiễm đều sản sinh ra IFN Cả IFN loại I (α, β) và loại II (ɤ) đều có vai trò quan trọng trong việc chống lại

sự lây nhiễm DEN trong tự nhiên cũng như trong điều kiện nuôi cấy thí nghiệm Nhiều nghiên cứu cho thấy sự kích hoạt sớm các thế bào miễn dịch sản xuất IFN đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại DEN xâm nhiễm [54] Quá trình sản xuất IFN được bắt đầu sau khi virút tương tác với các thụ thể nhận dạng bệnh (PRRs), ví dụ như các lectin týp C và các thụ thể nhận diện tool-like receptor (TLR) được biểu hiện trên các tế bào tủy Các lectin týp C tham gia vào việc tạo các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh khi nhiễm DEN Trong khi đó các PRR hoạt hóa truyền tín hiệu thông qua một loạt yếu tố phiên mã, dẫn tới sự biểu hiện IFN Các IFN được tiết ra sẽ gắn với các thụ thể IFN trên cùng tế bào đó hoặc những tế bào lân cận dẫn đến kích hoạt con đường JAK/STAT với sự biểu hiện của hơn 100 protein tương tác Cả hai con đường STAT-1 độc lập và STAT-1 phụ thuộc đều liên quan tới phản ứng IFN trung gian chống lại sự lây nhiễm DEN Các đáp ứng IFN trung gian kích thích chuyển hóa sang dạng chống virút và khởi đầu cho hàng hoạt quy trình bao gồm quá trình chuyển hóa trao đổi chất kiểm soát, giới hạn sự lây nhiễm của virút Ngoài ra các đáp ứng này thúc đẩy quá trình miễn dịch thích ứng thông qua kích thích tế bào đuôi gai trưởng thành và kích hoạt trực tiếp tế bào miễn dịch B và tế bào T [27]

9

1.1.1.2 Miễn dịch dịch thể

Miễn dịch dịch thể trên cơ thể người phát triển khoảng 6 ngày sau khi bị đốt bởi muỗi nhiễm DEN Những đáp ứng miễn dịch IgM xuất hiện sớm hơn, sau đó là các đáp ứng IgG (chủ yếu thuộc các nhóm IgG1 và IgG3) Các đáp ứng kháng thể chủ yếu hướng tới các glycoprotein E và prM trên bề mặt virút Các kháng thể chống NS1 cũng được tạo ra, bởi vì protein này được biểu hiện, nằm trên bề mặt của tế bào

bị nhiễm và được tiết từ những tế bào này hòa tan trong các khoang gian bào [37] Các kháng thể đáp ứng với NS1 đã được chứng minh đóng vai trò kích hoạt các bổ thể trung gian ly giải các tế bào bị nhiễm DEN và bảo vệ chuột khỏi thử nghiệm thử thách DEN Kháng thể chống lại protein E và prM ảnh hưởng tới tính chất lây nhiễm của các hạt DEN Các kháng thể có thể làm trung hòa hoặc tăng cường khả năng lây nhiễm DEN trong cơ thể hoặc trong điều kiện thí nghiệm, do đó đóng vai trò kép trong việc kiểm soát lây nhiễm virút DEN [27]

Virút dengue bị trung hòa hoàn toàn khi số lượng các phân tử đủ lớn để bám vào các epitope trên protein E và ngăn chặn quá trình gắn virút vào các tế bào đích hoặc ngăn chặn khả năng giải phóng RNA virút vào tế bào chất của tế bào bị nhiễm Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng trung hòa virút bao gồm lượng kháng thể gắn với các epitope E của virút, ái lực của kháng thể với các epitope, khả năng tiếp cận các epitope trên bề mặt virút, nhóm kháng thể và sự tương tác của kháng thể với các bổ

thể trong cơ thể [15] Đối với virút DEN cũng như các flavivirus khác, hầu hết các

kháng thể trung hòa mạnh nhất thường đặc hiệu với týp huyết thanh và hướng tới domain III trên protein E [27] Các kháng thể trung hòa phản ứng chéo hoặc yếu hơn được quan sát chủ yếu nằm ở gần domain II hoặc trong các peptide lai [54] Đáng chú

ý, các đáp ứng miễn dịch ở người thường chị phối bởi kháng thể chống lại domain I

và II

1.1.1.3 Miễn dịch tế bào

Khi cơ thể con người nhiễm virút dengue, sẽ sản sinh ra một lượng kháng thể đáp ứng tế bào T CD4+ và CD8+ đặc hiệu với các epitope trên nhiều kháng nguyên DEN khác nhau, mà chủ yếu là các thành phần protein phi cấu trúc [15] Có rất ít các nghiên cứu về vai trò của tế bào CD8+ T trong việc bảo vệ hoặc tăng cường bệnh Cả

10

kháng thể CD8+T đặc hiệu cho từng chủng và kháng thể bảo vệ chéo đều sản sinh IFNɤ và TNF-α đều được xác định ở những bệnh nhân có miễn dịch với DEN Các nghiên cứu về vai trò miễn dịch của các tế bào T CD8+ bị hạn chế do thiếu mô hình động vật tốt Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây cho thấy tế bào T CD8+ rất quan trọng trong với chủ thể chống lại DEN Mặt khác, việc hoạt hóa tế bào T CD8+ trong lần nhiễm thứ cấp được cho là dẫn tới việc tạo các cytokine và miễn dịch đặc trưng của hiện tượng sốt xuất huyết dengue/ hội chứng sốc dengue (SXHD/HCSD) [40]

1.1.1.4 Hiện tượng tăng cường phụ thuộc kháng thể

Các nghiên cứu dịch tễ học đã chứng minh rằng ở lần nhiễm thứ cấp với một týp huyết thanh khác hoặc lần nhiễm đầu ở trẻ được sinh ra từ bà mẹ đã có miễn dịch với dengue làm tăng đáng kể nguy cơ tăng nặng bệnh Hiện tượng này được giải thích dựa trên bốn căn cứ lâm sàng đã được ghi nhận: thứ nhất, mức độ virút huyết (virút lưu hành trong máu) ở những bệnh nhân SXHD/ HCSD cao hơn gấp 10 đến 100 lần

so với những bệnh nhân SD [62] Thứ 2, các trường hợp bệnh tăng nặng có liên quan mật thiết với lần nhiễm thứ phát virút dengue có týp huyết thanh khác với lần nhiễm đầu Mặc dù cũng ghi nhận một số trường hợp xảy ra ở lần nhiễm sơ cấp, nhưng tỉ lệ này xảy ra rất thấp Thứ ba, các trường hợp SXHD/ HCSD xảy ra ở trẻ sơ sinh thường xảy ra ở giai đoạn sau 06 tháng tuổi, ở thời điểm này kháng thể được chuyển sang từ

mẹ đã giảm đi rất nhiều Thứ tư, trong một số nghiên cứu đã chứng minh, khi truyền kháng thể kháng virút dengue vào khỉ và chuột chưa từng nhiễm dengue cũng làm tăng rõ rệt khả năng nhân lên của virút dengue trên những động vật này [15] Những kết quả này đã dẫn tới giả thuyết được chấp thuận về hiện tượng tăng cường phụ thuộc kháng thể (ADE) Các nghiên cứu kháng thể đặc hiệu với protein E cho thấy, khi quá trình gắn kháng thể trung hòa các thụ thể không vượt quá ngưỡng cần thiết để trung hòa virút, các kháng thể này không những không trung hòa được virút mà còn hướng các hạt virút tới các tế bào mang FcR, như các tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào

và các tế bào đuôi gai (các tế bào mục tiêu tự nhiên của virút) Quá trình này làm tăng cường khả năng virút gắn vào bề mặt tế bào và tạo điều kiện thuận lợi cho việc xâm nhập của virút thông qua kênh nhập bào FcR trung gian [26] (Hình 1.4)

11

Việc hấp thu các phức hợp miễn dịch thông qua nhập bào FcR trung gian không chỉ dẫn tới số lượng tế bào nhiễm cao hơn, mà còn ảnh hưởng tới số lượng hạt virút sản sinh trên mỗi tế bào nhiễm Trong một nghiên cứu gần đây cho thấy sự lây nhiễm ở tế bào THP-1 với các phức hợp DEN-miễn dịch đã là giảm sự sản sinh IL-

12, IFN-ɤ, TNF-α và NO, và tăng cường sự biểu hiện của IL-6, IL-10 cho thấy việc nhập bào FcR-trung gian ngăn chặn miễn dịch với virút, thúc đẩy quá trình nhân lên của virút [17]

Hình 1.4 Mô hình hiện tượng tăng cường phụ thuộc kháng thể dengue [15]

Không chỉ các kháng thể E mà các kháng thể prM cũng liên quan tới hiện tượng tăng cường phụ thuộc kháng thể Đáng lưu ý, gần đây các nhà khoa học đã quan sát thấy rằng kháng thể prM có khả năng biến đổi các hạt virút chưa trưởng thành không lây nhiễm gần giống các hạt virút hoang dại Các kháng thể prM làm tăng khả năng lây nhiễm của hạt virút trưởng thành nhưng không có tác dụng thúc đẩy quá trình sản xuất các virion trên tế bào nhiễm [27]

Dấu hiệu bệnh học SXHD/ HCSD là hiện tượng mất toàn vẹn nội mô, được giả định là kết quả của phản ứng miễn dịch dị thường với virút Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng mức độ cytokine và các chất trung gian như TNF-α, IL-1b, IL-2,

12

IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-18, MCP-1, và IFN-ɤ, IFN-α tăng đáng kể ở những bệnh nhân SXHD/ HCSD Vai trò của cytokine trong việc gia tăng tính thẩm thấu của mao mạch đã được khoa học chứng minh trong mô hình chuột Nhiều nhà khoa học tin rằng việc gia tăng lượng cytokine quá mức gây ra bởi sự hoạt hóa số lượng lớn các tế bào T ái lực thấp phản ứng chéo Các tế bào T có ái lực thấp này cho thấy khả năng bảo vệ kém, sản sinh cytokine và hoạt hóa cytolytic, quá trình này không những không trung hòa được virút mà con gây hoạt hóa miễn dịch quá mức Tuy nhiên, các phản ứng tế bào T ở lần nhiễm thứ cấp không giải thích được hiện tượng SXHD/ HCSD ở trẻ em sinh ra từ các bà mẹ đã có miễn dịch với DEN Các giả thuyết không loại trừ lẫn nhau và có lẽ cả miễn dịch kháng thể và miễn dịch tế bào T đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của bệnh từ SD sang SXHD trong lần nhiễm trùng thứ cấp [27]

1.2 Dịch tễ học bệnh sốt xuất huyết

Tình hình dịch tễ bệnh trên thế giới

Từ những năm 990, tại Trung Quốc đã ghi nhận căn bệnh có triệu chứng lâm sàng tương tự SD/ SXHD Tuy nhiên những hiểu biết về tác nhân gây bệnh ở thời điểm này còn nhiều hạn chế Dịch SXHD lần đầu tiên được báo cáo xảy ra tại Jakarta, Indonesia vào năm 1779 đã trở thành mối đe doạ tới sức khoẻ cộng đồng với số lượng

ca mắc và tỉ lệ tử vong đáng chú ý Thời gian đầu, bệnh diễn ra rải rác rồi dần dần tạo

ra các vụ dịch nhỏ đến lớn và lan rộng ra nhiều vùng địa lý khác trên thế giới Mặc

dù các triệu chứng lâm sàng tương tự bệnh đã được ghi nhận trong nhiều thế kỉ trước, tuy nhiên phải đến năm 1943, những hiểu biết về virút SXH mới được làm rõ Alber Sabin lần đầu tiên phân lập và định danh virút DEN 1 trên mẫu bệnh phẩm của những người lính nhiễm virút Tại thời điểm này, dịch SXHD đã được báo cáo ở nhiều khu vực trải rộng từ Ấn Độ tới Nam Thái Bình Dương Những năm sau đó, nhiều chủng virút dengue tiếp tục được phân lập từ các vùng khác nhau trên thế giới và dược định danh vào một trong 4 týp huyết thanh DEN 1, DEN 2, DEN 3 và DEN 4 [20] Virút dengue đã lan rộng nhanh chóng ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trong vài thập kỉ qua, dẫn tới việc gia tăng nhanh chóng về tần xuất cũng như các trường hợp sốt xuất huyết nặng, số lượng các chủng ở nhiều quốc gia nhiệt đới, và cận nhiệt đới Sự gia

13

tăng dân số, di cư và quá trình đô thị hóa nhanh chóng, giao thông phát triển đã góp phần không nhỏ vào sự lây lan và gia tăng của dịch bệnh [2, 5, 52, 67, 69] (Hình 1.5)

Hình 1.5 Bản đồ mức độ phân bố dịch sốt xuất huyết dengue toàn cầu [12]

Trước năm 1970, chỉ có 9 Quốc gia từng trải qua những đợt dịch sốt xuất huyết dengue lớn, tuy nhiên hiện nay dịch số xuất huyết dengue lưu hành ở trên 128 quốc gia và vùng lãnh thổ ở Nam Á, Châu Mỹ, Tây Thái Bình Dương, Châu Phi và Đông Địa Trung Hải, và tỉ lệ mắc bệnh đã tăng 30 lần trong vòng 50 năm qua [69, 51, 28] Những ước tính gần đây được đưa ra vào năm 2013 cho thấy có tới 390 triệu người lây nhiễm sốt xuất huyết và 96 triệu trường hợp mắc bệnh hàng năm trên toàn thế giới, cao hơn gấp 3 lần ước tính của Tổ Chức Y Tế Thế giới năm 2012 Tuy nhiên, những gánh nặng thực tế của dịch bệnh chưa được tìm hiểu rõ, đặc biệt ở Ấn Độ, Indonesia, Brazil, Trung Quốc, và Châu Phi Các nghiên cứu đoàn hệ tiền cứu ở Nicaragua và Thái Lan cho thấy tỉ lệ mắc số xuất huyết vào khoảng 6-29% mỗi năm Các nghiên cứu khác đã tính toán các trường hợp sốt xuất huyết thực tế cao hơn từ 2 – 28 lần số lượng mà các hệ thống giám sát sức khỏe quốc gia báo cáo [59]

14

Hình 1.6 Số lượng trung bình các trường hợp nhiễm dengue tại 30 Quốc gia/ vùng lãnh thổ lưu hành dịch cao nhất báo cáo WHO từ năm 2004 – 2010 [69]

Theo nghiên cứu của Suaya JA và cộng sự được tiến hành tại 8 quốc gia Châu

Mỹ và Châu Á cho thấy chi phí trung bình cho những ca bệnh trong trường hợp điều trị ngoại trú là khoảng 519 đô la mỹ, và trường hợp nhập viện là 1394,6 đô la Mỹ [60] Thiệt hại kinh tế cho dịch bệnh hàng năm ước tính lên tới 9 tỉ đô la trên toàn thế giới Trong đó thiệt hại về mất năng xuất của người lao động chiếm 52% Chi phí trên chưa bao gồm ngân sách cho các biện pháp phòng ngừa dịch bệnh vào kiểm soát vector [12] Ngoài ra, mức độ phát triển của hệ thống chăm sóc, y tế đóng vai trò quan trọng trong việc cứu sống bệnh nhân Tỉ lệ tử vong đối với các bệnh nhân không được điều trị lên tới 20%, nhưng tỉ lệ này có thể giảm xuống dưới 1% nếu bệnh nhân được trẩn đoán sớm và điều trị đúng phác đồ [57]

Theo nghiên cứu thống kê các báo cáo dịch sốt xuất huyết dengue của Congcong Gou và cộng sự, từ năm 1990 đến năm 2015 trên toàn thế giới đã xảy ra

262 đợt dịch bùng phát Trong số các Quốc gia lưu hành dịch trên thế giới, số vụ dịch bùng phát cao nhất tại Ấn Độ (58/262), tiếp theo là Trung Quốc (38/262) và Brazil (24/262) Tất cả các đợt dịch đều xảy ra ở các khu vực nhiệt đới, và cận nhiệt đới ngoại trừ một đợt dịch xảy ra tại Nimes, Pháp vào năm 2015 Các vụ dịch lớn xảy ra

15

nhiều nhất ở khu vực Đông Nam Á (72/262) tiếp theo là khu vực Tây Thái Bình Dương (72/262) và Châu Mỹ (65/262) chiếm 83,6% Châu Âu là khu vực ít bị ảnh hưởng bởi dịch sốt xuất huyết nhất, các báo cáo chỉ ghi nhận có 6 vụ dịch xảy ra từ năm 1990 đến 2015 Trong đó chỉ có 4 đợt dịch lớn xảy ra tại Pháp và 2 vụ dịch được báo cáo tại Bồ Đào Nha (Hình 1.7) Độ tuổi trung bình của các bệnh nhân là 30,1 tuổi, tỉ lệ nam giới chiếm 54.5% [18] Tỉ lệ các ca bệnh chuyển sang tình trạng sốt xuất huyết nghiêm trọng chiếm 23,2%, tỉ lệ tử vong 1,3% Trong đó những bệnh nhân nhiễm dengue thứ phát, hoặc có tiền sử bệnh đái tháo đường, huyết áp thấp và suy thận có nguy cơ bệnh tăng nặng cao hơn

Hình 1.7 Những vụ dịch dengue lớn xảy ra trên toàn cầu từ năm 1990 – 2015 [18]

Trong 174 vụ dịch xảy ra được báo cáo chi tiết về các týp huyết thanh từ năm

1990 đến 2015, số lượng các đợt dịch do một týp huyết thanh đơn xảy ra nhiều nhất

là týp DEN-2 (20.7%) tiếp theo là DEN-1 (16.7%), DEN-3 (10.9%) và DEN-4 (4%) Các đợt dịch do nhiều týp huyết thanh gây ra chiếm 47.7%, phổ biến nhất là các đợt dịch do cả 4 týp huyết thanh gây ra (chiếm 14.4%), tiếp theo là nhiễm 2 týp huyết thanh DEN-1 và DEN-2 (chiếm 9.2%) và đồng nhiễm DEN-1, DEN-2 và DEN-3 (6.9%) Mức độ phổ biến của các týp huyết thanh dengue phân bố theo các khu vực địa lý khác nhau: DEN-1 và DEN-2 phổ biến nhất ở khu vực Châu Phi và Châu Mỹ DEN-1 là týp huyết thanh phổ biến ở Châu Âu Khu vực Đông Nam Á phổ biến cả 4 týp huyết thanh DEN-2 và DEN-3 được báo cáo nhiều ở khu vực Đông Địa Trung

16

Hải, và DEN-1 chiếm ưu thế ở khu vực Tây Nam Thái Bình Dương Tỉ lệ tử vong được xác định cao nhất là do DEN-2 chiếm 2% tiếp theo là DEN-3 1,6%; DEN-4 0,7% và DEN-1 0,3% [18]

Tình hình dịch tễ bệnh tại Việt Nam

Từ năm 1913, Gaide đã báo cáo về một số ca SD cổ điển được ghi nhận ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam Sau đó, vụ dịch SXH lớn đầu tiên được ghi nhận tại miền Bắc vào hè năm 1958 Cho tới năm 1969 dịch SXH đã xảy ra trên 19 tỉnh thành phía Bắc Tại miền Nam Việt Nam, dịch SXHD lớn được ghi nhận vào năm 1960 và ngày càng có xu hướng gia tăng, đặc biệt tại các tỉnh đồng bằng song Cửu Long [1] Tại thời điểm này, các vụ dịch xảy ra rải rác trên toàn quốc với chu kì khoảng 4 – 5 năm một lần

Hình 1.8 Thống kê số ca mắc sốt xuất huyết dengue tại Việt Nam từ năm 2006 –

2015 [6]

Mức độ lây lan nhanh chóng của dịch SXHD phụ thuộc vào quá trình đô thị hóa, và phát triển giao thông giao lưu giữa các vùng miền Trước đây, dịch phân bố chủ yếu ở các vùng: Châu thổ sông Hồng, sông Cửu Long, Duyên hải miền Trung Tuy nhiên, đến thời điểm hiện tại dịch xảy ra hàng năm ở hầu hết các tỉnh trong cả

79080 96980

74780

32049 94335

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000

17

nước và không còn tuân theo quy luật 4 – 5 năm xảy ra một chu kỳ dịch Thời điểm dịch xảy ra lớn được ghi nhận vào tháng 8 – 11, với đỉnh dịch vào tháng 10, sau đó

giảm dần Mùa mưa là điều kiện thuận lợi cho muỗi Aedes aegypti sinh sản và tăng

số lượng Thời điểm dịch lưu hành cũng khác nhau giữa các vùng miền do sự khác biệt về đặc điểm khí hậu, địa lý Ở miền Bắc và Tây Nguyên bệnh thường xảy ra từ tháng 4 – 11, trong khi đó miền Nam và miền Trung bệnh xuất hiện quanh năm

Theo thống kê của chương trình phòng chống SXHD quốc gia, từ năm 1956 –

1985, Việt Nam đã có tổng cộng 502.702 trường hợp nhiễm dengue và số ca tử vong lên tới 7114 trường hợp [7] Trong khoảng 10 năm trở lại đây từ năm 2006 – 2015, dịch SXHD diễn biến phức tạp và có xu hướng tăng lên (Hình 1.8) Đặc biệt trong năm 2017, theo thống kê của TCYTTG, Việt Nam có 183.287 trường hợp mắc (154.552 trường hợp nhập viện), 30 trường hợp tử vong Dịch bùng phát trên 61/63 tỉnh thành và đặc biệt tăng cao tại miền Bắc và Hà Nội Chỉ tính tới đầu tháng 7/2017, dịch bùng phát tại miền Bắc đã tăng 763% so với cùng kỳ năm 2016, trong đó riêng tại Hà Nội một số Quận huyện số ca mắc SXH tăng hơn 10 lần so với năm 2016 (Hình 1.9)

Hình 1.9 Số lượng trường hợp mắc dengue tại Việt Nam được báo cáo lên WHO

năm 2017 [70]

Là một trong các quốc gia nóng nhất về dịch sốt xuất huyết, Việt Nam chịu ảnh hưởng nặng nề thiệt hại do dịch bệnh gây ra Hàng năm, Chính phủ đã chi rất nhiều kinh phí cho các hoạt động phòng chống dịch thông qua kiểm soát vector truyền bệnh bằng hóa chất để diệt muỗi trưởng thành, diệt bọ gậy, vệ sinh môi trường và công tác truyền thông toàn dân, tuy nhiên hiệu quả còn nhiều hạn chế Việc nghiên cứu phát triển vắc xin phòng bệnh chủ động là vô cùng cần thiết và nên được thực hiện sớm tại Việt Nam

Nguồn bệnh trong tự nhiên

Hình 1.10 Sự lây nhiễm virút dengue trong tự nhiên [15]

Trong tự nhiên, có ba loại ổ chứa virút dengue là người, muỗi Aedes, và khỉ

(Hình 1.10) Trong một số nghiên cứu đã phát hiện một số động vật linh trưởng khác như: vượn, hắc tinh tinh… cũng nhiễm virút dengue Tuy nhiên ở khỉ và các động vật linh trưởng này khi mắc dengue các triệu chứng lâm sàng thường rất nhẹ, lượng virút

19

nhân lên trong máu thấp, khả năng lây truyền ngược trở lại con người thông qua muỗi chưa được xác định rõ Virút dengue không gây bệnh ở những động vật xương sống khác, ngay cả với chuột ổ là động vật mô hình thường xuyên được sử dụng để phân lập các loại Arbovirus khác Chuột ổ không có các biểu hiện nhiễm bệnh nếu các chủng virút dengue tiêm chưa được thích ứng trên chuột ổ trước Do vậy, trong tự

nhiên chỉ có người bệnh và muỗi Aedes được coi là nguồn bệnh chính của virút

dengue gây bệnh dịch trên người [26]

Đường lây và vector truyền bệnh

Virút sốt xuất huyết dengue lây truyền ở người thông qua vết đốt của muỗi

Aedes aegypti và Aedes albopictus trong đó muỗi Aedes aegypti đóng vai trò chủ yếu

[67] Muỗi Aedes aegypti là loài muỗi vằn, có kích thước nhỏ, rất phổ biến ở đô thị

Muỗi vằn có nguồn gốc từ Châu Phi nhưng theo thời gian chúng đã lan rộng ra các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Quá trình di cư và nhập cư trên toàn thế giới, sự gia tăng đi lại, buôn bán, giao lưu giữa các khu vực đã góp phần đáng kể vào sự lan truyền và phổ biến của muỗi vằn sang các châu lục khác trên toàn thế giới [11] Sự tăng lên nhanh chóng của dân số toàn cầu, quá trình đô thị hoá gia tăng cũng là nguyên nhân dẫn đến các tình trạng như: nhà ở không đạt tiêu chuẩn, thiếu hệ thống cung cấp nước sạch, quản lý rác thải và vệ sinh kém Người dân sử dụng nhiều các dụng cụ chứa nước uống, nước sinh hoạt, bao gồm bể, bi, lu, xô chậu, dụng cụ phế thải có nước đọng Tất cả đã tạo thêm nhiều môi trường sinh sản phù hợp cho muỗi Muỗi vằn không mang virút dengue một cách tự nhiên, nó phải đốt người bị bệnh và nhiễm virút từ người bị bệnh rồi mới có thể truyền sang cho cộng đồng

Muỗi Aedes aegypti trưởng thành thường trú ngụ trong nhà, và có tập tính đốt người vào ban ngày Hình thức đốt của muỗi cái Aedes aegypti rất nguy hiểm, thường

chia quá trình đốt ra thành nhiều lần, và quay lại đốt cùng một người hoặc người khác

ở thời điểm sau Vì tập tính này, Aedes aegypti thường sẽ đốt nhiều người trong một

bữa ăn và nếu mang virút dengue, muỗi có thể truyền virút cho nhiều người trong khoảng thời gian ngắn ngay cả khi muỗi chỉ đốt thăm dò chưa hút máu [2]

20

Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng bệnh sốt xuất huyết dengue

Bệnh SXHD có các biểu hiện đặc trưng bao gồm sốt, xuất huyết, và thoát huyết tương Những trường hợp bệnh nặng có thể dẫn tới hậu quả sốc, giảm thể tích tuần hoàn, rối loạn đông máu, suy tạng và tử vong Biển hiện lâm sàng của bệnh đa dạng Ngoài ra, bệnh lại có diễn biến nhanh chóng từ nhẹ tới nặng Do đó việc chẩn đoán phát hiện sớm, và điều trị kịp thời đóng vai trò rất quan trọng trong việc cứu sống bệnh nhân Sau giai đoạn ủ bệnh từ 3 – 7 ngày, các triệu chứng lâm sàng của bệnh bắt đầu xuất hiện nhanh và chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn sốt ban đầu, giai đoạn nguy hiểm và giai đoạn phục hồi [67]

1.2.5.1 Giai đoạn sốt ban đầu

Giai đoạn ban đầu thường đặc trưng bởi hiện tượng sốt cao (trên 38.5oC) kèm theo nhức đầu, nôn mửa, đau cơ và đau khớp, đôi khi có phát ban nhẹ Trẻ em thường sốt cao nhưng nhìn chung thường có ít triệu chứng hơn so với người lớn ở giai đoạn này Các biểu hiện xuất huyết nhẹ như đau nhức, các vết thâm tím ở da đặc biệt ở vị trí tĩnh mạch Các xét nghiệm sinh hóa thường thấy việc giảm tiểu cầu và bạch cầu nhẹ đến trung bình, đi kèm với men gan tăng Thông thường giai đoạn này tiểu cầu vẫn giữ được ở mức trên 100.000/cm3 Giai đoạn này thường kéo dài khoảng 3 – 7 ngày, sau đó bệnh nhân hồi phục mà không có biến chứng nào [51]

1.2.5.2 Giai đoạn nguy hiểm

Một tỉ lệ nhỏ bệnh nhân thường là trẻ em và người trưởng thành trẻ tuổi tiến triển bệnh trở nên nghiêm trọng, các triệu chứng cụ thể như hiện tượng xuất huyết dưới da, niêm mạc và nội tạng kèm theo các biểu hiện thoát huyết tương như tràn dịch màng phổi, mô kẽ, nề mi mắt; gan to và đau Biểu hiện cận lâm sàng bao gồm hematocrit tăng, số lượng tiểu cầu giảm dưới 100.000/mm3, men gan tăng, các trường hợp nặng có thể xảy ra rối loạn đông máu [67] Ban đầu, các cơ chế bù trừ sinh lý đều được điều chỉnh tăng lên nhằm duy trì sự lưu thông phù hợp các cơ quan trong cơ thể, dẫn tới giảm huyết áp kẹt khi lượng huyết tương trong máu mất nhiều Nếu huyết áp kẹt giảm xuống 20 Hg hoặc thấp hơn, cùng với các dấu hiệu của xuất huyết ngoại vi Đây là những dấu hiệu cảnh báo hiện tượng sốc dengue, bệnh nhân cần phải được hồi sức cấp bách và thận trọng Mặc dù thời điểm này huyết áp tâm trương có thể vẫn

21

bình thường, hoặc thậm chí tăng lên và bệnh nhân cảm giác như tình trạng bệnh đã được cải thiện, tuy nhiên khi huyết áp hạ, huyết áp tâm thu giảm mạnh, bệnh nhân chuyển sang tình trạng sốc nhanh và tử vong có thể sảy ra mặc dù có nỗ lực hồi sức Trong thời gian chuyển giai đoạn sốt đến giai đoạn nghiêm trọng, giữa ngày 4 – 7 của bệnh, bác sĩ phải xác định được các dấu hiệu chuyển biến của bệnh đặc biệt là hiện tượng thoát huyết tương Những dấu hiệu bao gồm nôn mửa kéo dài, đau bụng đau gan ngày càng trầm trọng, gan tụy dị ứng, nồng độ hematocrit tăng cao, giảm tiểu cầu, tràn dịch màng phổi, chảy máu niêm mạc, lơ mơ, rối loạn ý thức [51]

1.2.5.3 Giai đoạn hồi phục

Giai đoạn suất huyết thường xảy ra trong khoảng thời gian ngắn, và quá trình phục hồi tự nhiên trong khoảng 48 – 72 giờ, đồng thời với sự cải thiện nhanh chóng các triệu chứng ở bệnh nhân Lần phát ban thứ 2 có thể xuất hiện trong giai đoạn này Ở người lớn có thể cảm thấy mệt mỏi trong một vài tuần sau khi hồi phục

Các yếu tố ảnh hưởng

Trong các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới sự phân bố, mức độ nhiễm và mức độ nghiêm trọng của bệnh SXHD Ngoài các yếu tố

có thể gây ra hiện tượng tăng cường phụ thuộc huyết thanh của dengue (như trình bày

ở mục 1.1.1.4), các yếu tố khác như týp huyết thanh dengue gây bệnh (1; 2; DEN-3 và DEN-4), giới tính, chủng tộc, thể trạng và tình trạng dinh dưỡng của trẻ, các bệnh mãn tính của bệnh nhân… là các yếu tố ảnh hưởng tới mức độ cảm nhiễm với virút dengue và mức độ nặng của bệnh

DEN-Các yếu tố về điều kiện môi trường, đặc điểm thời tiết, sự tương tác giữa vật chủ và nguồn bệnh, đặc điểm miễn dịch của vùng dân cư, thói quen sinh hoạt của người dân, trình độ dân trí… ảnh hưởng trực tiếp tới sự phân bố, đa dạng, và mật độ của vector truyền bệnh là yếu tố quyết định tới sự phân bố dịch [18, 69]

22

việc lạm dụng hoá chất còn dẫn tới các vấn đề về môi trường và nguy cơ kháng thuốc

ở các động vật chân đốt này Việc phòng ngừa dịch sốt xuất huyết dengue phần lớn dựa vào việc kiểm soát muỗi ở giai đoạn ấu trùng và muỗi trưởng thành Ở khu vực

thành thị, muỗi Aedes aegypti đẻ trứng trong các vật dụng chứa nước đọng như vũng

nước, chai vỡ, chậu cây, ly nhựa… Việc thu dọn vệ sinh, đổ các vật dụng đọng nước kết hợp sử dụng thuốc đuổi côn trùng, diệt muỗi, sử dụng màn chống muỗi trong nhà mang lại hiệu quả tốt, giảm đáng kể số lần muỗi đốt [59] Ở thời điểm hiện tại, mặc

dù chưa có một loại thuốc kháng virút dengue được cấp phép sử dụng trong điều trị bệnh SXHD, tuy nhiên các nhà khoa học đã và đang tiến hành rất nhiều các nghiên cứu phát triển các loại hợp chất chống virút dengue với hai hướng tác động chính bao gồm tương tác với các thành phần virút hoặc tác động tới vật chủ Ngoài ra, với những tiến bộ trong các phương pháp chẩn đoán bệnh đã giúp cho việc chẩn đoán sớm và điều trị bệnh trở nên khả thi hơn

Đối với các bệnh truyền nhiễm do virút nói chung và bệnh SXHD nói riêng, sử dụng vắc xin phòng bệnh luôn được coi là biện pháp phòng bệnh chủ động, giúp kiểm soát bệnh hiệu quả nhất Tuy nhiên, một trong những thách thức trong việc nghiên cứu phát triển vắc xin phòng SXHD là việc tạo miễn dịch cân bằng giữa các týp huyết thanh loại trừ nguy cơ tăng nặng của bệnh do hiện tượng tăng cường phụ thuộc kháng thể (xem phần 1.1.1.4) Do đó ý tưởng về việc sản xuất vắc xin bao gồm cả 4 thành phần để tạo đáp ứng miễn dịch tứ giá với cả bốn chủng là cần thiết Đây cũng là một hướng tiếp cận khoa học dựa trên sự thành công của vắc xin bại liệt bao gồm 3 chủng đơn phối hợp Các đáp ứng miễn dịch với cả 4 týp phải cân bằng và kéo dài ở mức cao đủ bảo vệ không gây các phản ứng phụ nguy hiểm Trên thực tế đã ghi nhận trường hợp sốt xuất huyết tăng nặng ở lần nhiễm trùng thứ cấp sau hơn 20 năm nhiễm trùng lần đầu [38] Ngoài ra, việc chưa có động vật mô hình chuẩn cho các thử nghiệm tiền lâm sàng vắc xin dengue cũng mang lại những khó khăn không nhỏ cho các nghiên cứu đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin

Vào đầu năm 2016, vắc xin phòng bệnh SXHD đầu tiên (vắc xin Denvaxia) do công ty Sanofi Pasteur sản xuất chính thức được TCYTTG cấp phép thương mại hoá Đây là một bước tiến lớn và đánh dấu kết quả nghiên cứu phát triển vắc xin SXHD

23

trong hơn 40 năm của các nhà khoa học Denvaxia là vắc xin tái tổ hợp tứ giá sống giảm độc lực được phát triển dựa trên giá thể virút vắc xin sốt vàng da 17D được thay thế gen qui định protein E và Pre-M của một trong bốn týp huyết thanh Dengue Đến thời điểm hiện tại có 11 quốc gia cấp phép sử dụng, bao gồm: Mexico, Philippines, Brazil, El Salvador, Costa Rica, Paraguay, Guatemala, Peru, Indonesia, Thailand và Singapore Tuy nhiên vắc xin Denvaxia cũng có một số hạn chế như: vắc xin sử dụng cho đối tượng từ 9 – 45 tuổi và chỉ sử dụng ở những khu vực đã có dịch bùng phát Ngoài ra với phác đồ tiêm 03 liều (0; 6; 12 tháng), với mức giá khoảng 50 USD/ liều, đây là mức giá tương đối cao, chưa phù hợp với điều kiện của đại đa số người dân ở các nước đang phát triển (phần lớn các nước nằm trong khu vực lưu hành dịch) [25, 71] Tại các phòng thí nghiệm trên thế giới, các nỗ lực phát triển vắc xin dengue dự tuyển khác vẫn đang được tiếp tục tiến hành, trong đó vắc xin dạng sống giảm độc lực được cho là có tiềm năng, và đang tiến xa nhất trong các pha nghiên cứu lâm sàng trên người Hai vắc xin dự tuyển TV003/ TV005 do Viện Sức khỏe Hoa Kỳ (NAID)

và vắc xin Denvax do Takeda Nhật Bản phát triển đang được đánh giá lâm sàng ở pha III và hứa hẹn sẽ có thể thương mại hóa trong vài năm tới [59] Các phương pháp tiếp cận vắc xin dengue khác như vắc xin bất hoạt, vắc xin tiểu đơn vị, vắc xin vector

và ADN cũng đang được tiến hành, và đã mang lại một số kết quả khả quan (Phần 1.3)

Mặc dù, hiện tại vẫn đang còn nhiều thách thức trong việc phát triển và đưa ra một vắc xin phòng bệnh sốt xuất huyết dengue an toàn và hiệu quả cao, phù hợp với nhiều lứa tuổi và các khu vực trên thế giới bao gồm các khu vực lưu hành dịch và khu vực không lưu hành dịch Các nghiên cứu chuyên sâu về miễn dịch, các nguy cơ trao đổi chéo giữa các thành phần trong vắc xin, các đánh giá tính an toàn và hiệu quả bảo

vệ lâu dài sau tiêm của các vắc xin dự tuyển cần tiếp tục được tiến hành Tuy nhiên việc vắc xin sốt xuất huyết dengue đầu tiên được với thiệu, cùng hàng loạt các vắc xin dengue dự tuyển đang được các hãng vắc xin thúc đẩy nghiên cứu phát triển ở các pha lâm sàng khác nhau hứa hẹn trong tương lai gần, bệnh sốt xuất huyết dengue trở thành bệnh kế tiếp có thể phòng ngừa bằng vắc xin và mục tiêu của TTYTTG là

Trong các dạng vắc xin dự tuyển, vắc xin sống giảm độc lực đang tiến xa nhất

ở các pha thực nghiệm lâm sàng (Bảng 1) Có rất nhiều ưu điểm của vắc xin sống giảm độc lực đang phát triển để phòng bệnh sốt xuất huyết Thứ nhất, vắc xin virút sống về lý thuyết sẽ gây đáp ứng miễn dịch bền vững cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào, qui trình lây nhiễm tương tự như ở tự nhiên Những miễn dịch này đều phản ứng với cả thành phần protein cấu trúc và không cấu trúc của virút Đối với vắc xin ở dạng khảm thành phần protein E và protein PrM vào giá thể khác sẽ hạn chế hơn thành phần kháng thể với protein cấu trúc NS của virút Thứ hai, khả năng sao chép của virút trên cơ thể phải được hạn chế đủ để ngăn ngừa nguy cơ gây bệnh Các triệu chứng như sốt, nhức đầu và đau khớp thường thấy ở các bệnh nhân sốt xuất huyết tự nhiên thường được cho là không thể chấp nhận được đối với các chủng virút vắc xin Các triệu chứng nhẹ như phát ban nhẹ, tăng men gan nhẹ và giảm bạch cầu

là một phần của các phản ứng bình thường đối với sự sao chép của DEN và sẽ được chấp nhận Việc nhân lên của virút vắc xin dự tuyển cùng với các phản ứng nhẹ của

cơ thể được cho là cần thiết để sản sinh miễn dịch bảo vệ, và đó là bản chất của sự cân bằng giữa phản ứng của vắc xin và tính sinh miễn dịch Lượng virút huyết lưu hành trong máu sau tiêm nên nằm trong khoảng 101 – 102 là vừa đủ (dựa trên kinh nghiệm của vắc xin sốt vàng da) Thứ ba, virút vắc xin nên giảm khả năng lây truyền bởi muỗi, có thể bị kiểm soát bởi lượng virút huyết lưu hành thấp, sao cho 1 – 2 μl máu do muỗi truyển không đủ để khởi đầu việc lây nhiễm hoặc những đột biến này hạn chế khả năng nhân lên của virút trên muỗi Thứ tư, virút có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tốt ở liều tiêm thấp, có thể được nuôi cấy hiệu quả thông qua nuôi cấy tế bào, sản xuất với chi phí thấp Thứ năm, cả bốn thành phần vắc xin để có khả năng nhân lên hiệu quả ở người, tạo miễn dịch cân bằng trung hoà cả 4 týp huyết thanh Thứ sáu, giảm độc lực thông qua gây đột biến hệ gen được cho là tốt nhất để

CƠ CHẾ GIẢM ĐỘC LỰC HOẶC BẤT HOẠT

PHA THỬ NGHIỆM

Pasteur

Sống giảm độc lực

Kháng nguyên ghép trên nền giá thể virút sốt vàng da

Thương mại hóa

TV003/TV005 NIAID Sống

giảm độc lực

Chủng virút hoang dại được gây đột biết giảm độc lực

Pha III

giảm độc lực

Chủng DEN 2 được giảm độc lực trên tế bào thận chó, sau đó được giảm độc lực bằng gây đột biết gen NS3

Biểu hiện protein PreM và

E trên hệ thống biểu hiện

Drosophilia S2

Pha I

1.3.1.1 Vắc xin tứ giá sống, giảm độc lực Dengvaxia (CYD-TDV) – Sanofi Pasteur

CYD-TDV là vắc xin tái tổ hợp tứ giá sống giảm độc lực được phát triển dựa trên giá thể virút vắc xin sốt vàng da 17D được thay thế gen qui định protein E và Pre-M của một trong bốn týp huyết thanh Dengue Vắc xin được tiêm 3 liều theo lịch 0/6/12 [25] Theo kết quả nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III của vắc xin CYD-TDV được triển khai tại hai khu vực (CYD14 triển khai tại 5 quốc gia ở Châu Á và CYD15 triển khai tại 5 quốc gia ở Châu Mỹ Latinh), vắc xin Dengvaxia không có

26

hiệu quả bảo vệ ở nhĩm trẻ dưới 9 tuổi Kết quả thử nghiệm lâm sàng cũng cho thấy tính hiệu quả của vắc xin chỉ đạt 56,5% tại Châu Á và 60,8% tại Châu Mỹ Latinh Hiệu quả vắc xin khác nhau theo từng týp huyết thanh: vắc xin cĩ hiệu quả cao với týp huyết thanh DEN 3 và DEN 4 tương ứng 71,6% và 76,9%, huyết thanh týp DEN

1 và týp DEN 2 chỉ đạt 54,7% và 43,0% [63] Hiệu quả vắc xin đối với những đối tượng phơi nhiễm với virút sốt xuất huyết dengue là 74,3%; đối với nhĩm khơng phơi nhiễm là 35,5% Ngồi ra, nghiên cứu CYD14 nghi nhận nguy cơ tăng cường phụ thuộc kháng thể ở nhĩm trẻ 2 -5 tuổi trong năm thứ 3 sau khi tiêm vắc xin, làm gia tăng đáng kể số trường hợp nhập viện (tỉ lệ lên tới 7,45%) Do đĩ, vắc xin Dengvaxia khơng được khuyến cáo sử dụng cho trẻ dưới 9 tuổi và chỉ ưu tiên sử dụng ở những nơi cĩ dịch bùng phát

1.3.1.2 Vắc xin dengue tứ giá sống, giảm độc lực TV003/TV005 – NIH

Viện sức khoẻ Hoa Kỳ (NIH) đã phát triển vắc xin tứ giá sống giảm độc lực (TV003/TV005) bao gồm cấu trúc tồn bộ hệ gen các chủng virút hoang dại DEN-1, DEN-3 và DEN-4 được giảm độc lực thơng qua gây đột biến loại bỏ 30 nucleotide ở vùng 3’ khơng dịch mã Thành phần vắc xin DEN-2 được phát triển trên giá thể DEN-430 thay thế phần gen mã hố protein prM và E của chủng DEN-2 Hai cơng thức pha vắc xin tứ giá được sử dụng bao gồm TV003 (hiệu giá virút cho cả 4 týp huyết thanh sử dụng trong thành phần vắc xin là 103 PFU) và TV005 (tương tự cơng thức TV003 nhưng hiệu giá virút DEN-2 là 104 PFU) Kết quả nghiên cứu trên các đối tượng chưa nhiễm dengue (DEN-nạve) cho thấy hiệu quả giảm độc lực của các chủng virút vắc xin (hiệu giá virút lưu hành trong máu nhỏ hơn 101 đối với cơng thức TV003,

và cao hơn 101 đối với thành phần DEN-1 và DEN-4 trong cơng thức TV005) Thời gian lưu hành virút trong máu ít hơn 2 ngày

Kết quả thực địa lâm sàng giai đoạn I, cả hai cơng thức pha vắc xin đều an tồn và cĩ khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch cao ở chỉ với một liều tiêm Đối với cơng thức TV003 cho đáp ứng miễn dịch với cả 4 chủng là 74% (tỉ lệ chuyển đổi huyết thanh với các chủng DEN 1 – 4 lần lượt là: 92%; 76%; 97% và 100%) Liều đơn TV005 cho đáp ứng lên tới 90% (tỉ lệ chuyển đổi huyết thanh lần lượt: 92%; 97%; 97% và 97%) [33] Ở thời điểm hiện tại, vắc xin đang được đánh giá lâm sàng

27

giai đoạn 2 trên 294 đối tượng ở Thái Lan, bắt đầu với nhóm người lớn (độ tuổi từ 18 – 50) vào tháng 12/ 2014, và nhóm trẻ em (1 – 4 tuổi) vào tháng 9/ 2015

1.3.1.3 Vắc xin tứ giá sống giảm độc lực Denvax – Inviragen/Takeda

Vắc xin dự tuyển DENVax là vắc xin tứ giá sống giảm độc lực được công ty dược phẩm Takeda phát triển Thành phần vắc xin bao gồm toàn bộ hệ gen DEN-2 sống giảm độc lực làm giá thể cho các DEN tương ứng Nguồn gốc của chủng vắc xin DEN-2 này được phát triển dựa trên những nghiên cứu trước đó của vắc xin DEN-

2 PDK-53 được thực hiện bởi Đại học Mahitol (Bangkok, Thái Lan) Chủng vắc xin này đã được làm giảm độc lực thông qua cấy chuyển liên tiếp 53 đời trên tế bào thận chó (PDK) và đã được đánh giá tiền lâm sàng và lâm sàng từ những năm 1980 Chủng vắc xin DENVax hiện tại được làm giảm độc lực hơn nữa thông qua việc gây đột biến

ở gen NS3 (DEN-2 PDK-53-V) Các týp huyết thanh trong thành phần được tạo ra thông qua việc thay thế các gen qui định protein pre-M và protein E của các chủng hoang dại DEN-1, DEN-3 và DEN-4 vào giá thể DEN-2 PDK-53-V [46]

Các nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy, vắc xin dự tuyển có tính ổn định cao,

an toàn và có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tốt ở chuột và động vật linh trưởng Theo kết quả nghiên cứu lâm sàng pha II được tiến hành ở Puerto Rico, Colombia, Singapore and Thailand (Den-203) trên 344 đối tượng, thuộc các nhóm tuổi từ 1,5 – 45 [58] Vắc xin dự tuyển an toàn, và có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tốt, tỉ lệ chuyển đổi huyết thanh ở tất cả các nhóm tuổi cao, đặc biệt ở nhóm tuổi thấp nhất (1,5 – 5 tuổi) lên tới 100% sau 2 liều tiêm Các nghiên cứu đánh giá tính an toàn, và khả năng đáp ứng miễn dịch dài hạn đang tiếp tục được tiến hành

Vắc xin bất hoạt

Vắc xin bất hoạt có hai ưu điểm chính so với vắc xin sống giảm độc lực đó là tính an toàn do đã được loại bỏ hoàn toàn nguy cơ biến đổi ngược lại thành dạng độc lực và khả năng tạo miễn dịch cân giữa bốn týp huyết thanh DEN [65] Tuy nhiên, phát triển vắc xin bất hoạt toàn virút cũng có nhiều thách thức như vắc xin chỉ chứa thành phần protein cấu trúc, do đó không tạo được miễn dịch đối với thành phần protein không cấu trúc Để tạo được miễn dịch tối ưu trên những đối tượng chưa từng nhiễm dengue, cần bổ sung tá dược trong thành phần vắc xin Thành phần tá dược

28

này sẽ gây thêm những phản ứng phụ không mong muốn và tăng chi phí sản xuất Đối với vắc xin bất hoạt nói chung, cần tiến hành tiêm nhắc lại nhiều lần để duy trì miễn dịch lâu dài Ngoài ra, do virút DEN nhân lên trong nuôi cấy tế bào với hiệu giá không cao, do đó chi phí sản xuất vắc xin bất hoạt sẽ bị đẩy lên cao do cần lượng kháng nguyên virút lớn [65] Những thách thức này làm cho vắc xin bất hoạt kém hấp dẫn nếu sử dụng ở các vùng dịch DEN lưu hành, tuy nhiên cũng có thể hiệu quả khi

sử dụng đối với các trường hợp cần miễn dịch tạm thời như quân đội hoặc khách du lịch, hoặc sử dụng là một phần trong phác đồ tiêm nhẳm tăng cường miễn dịch cho vắc xin sống

1.3.2.1 Vắc xin dengue tứ giá toàn virút bất hoạt DPIV – GlaxoSmithKline/

Fiocruz/ Walter Reed

Vắc xin DPIV được phát triển bởi Viện nghiên cứu Walter Reed Army (WRAIR), trên nền tảng nuôi cấy virút trên tế bào Vero, và bất hoạt sử dụng formalin Các nghiên cứu tiền lâm sàng vắc xin đơn giá trên động vật cho thấy vắc xin an toàn

và có khả năng kích thích sinh miễn dịch tốt ở chuột và khỉ Rhesus macaques Hiện

tại có 2 vắc xin dự tuyển DPIV gần tương tự nhau đang được tiến hành đánh giá lâm sàng giai đoạn I Thử nghiệm thứ nhất được WRAIR kết hợp với hãng GSK và Fiocrus tiến hành trên 100 đối tượng (hầu hết chưa từng nhiễm dengue) ở Mỹ, và 100 đối tượng (đã nhiễm dengue) ở Puerto Rico nhằm đánh giá các công thức pha sử dụng các tá dược khác nhau được phát triển bởi hãng GSK bao gồm nhôm, tá dược ASO1

và ASO2 [53] Các đối tượng sẽ được tiêm 02 liều vắc xin cách nhau 4 tuần Bên cạnh đó, một thử nghiệm khác đang được WRAIR tiến hành nhằm đánh giá khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch khi tiêm booster vắc xin sống giảm độc lực TDENV-LAV sau khi tiêm DPIV Vắc xin TDENV-LAV là vắc xin đã được phát triển trước đây bởi Walter Reed và GSK, giảm độc lực thông qua cấy chuyển nhiều đời trên tế bào thận chó (PDK)

Vắc xin tiểu đơn vị tái tổ hợp

Các nghiên cứu phát triển vắc xin tiểu đơn vị tái tổ hợp thường được tiến hành dựa trên việc biểu hiển thành phần kháng nguyên virút dengue, chủ yếu là thành phần protein E trên các hệ thống biểu hiện Tương tư như vắc xin bất hoạt, vắc xin tiểu đơn

29

vị tái tổ hợp có tính an toàn cao, tuy nhiên việc sản xuất gặp nhiều khó khăn với hiệu suất không cao Ngoài ra, hầu hết các chế phẩm tiểu đơn vị kích thích sinh đáp ứng miễn dịch ở mức thấp trên chuột

1.3.3.1 Vắc xin dengue tứ giá tái tổ hợp V180 – Merck

Vắc xin dengue dự tuyển V180 có thành phần là các glycoprotein vỏ 80E) tái tổ hợp của mỗi týp huyết thanh dengue, được biểu hiện trên hệ thống biểu

(DEN-hiện tế bào côn trùng Drosophila S2 Trong các nghiên cứu tiền lâm sàng trên động

vật linh trưởng do Merck tiến hành, vắc xin V180 dự tuyển sử dụng tá dược ISCOMATRIX vắc xin có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch ở mức độ cao

và cân bằng giữa các týp huyết thanh ở những động vật chưa từng nhiễm dengue Vắc xin dự tuyển sử dụng tá dược Alhydrogen cho khả năng đáp ứng miễn dịch thấp hơn

Ở thời điểm hiện tại, vắc xin đang được đánh giá lâm sàng giai đoạn I trên 98 đối tượng người lớn (từ 18 – 49 tuổi) khoẻ mạnh, chưa từng nhiễm dengue tại Australia Các đối tượng sẽ được tiêm 3 liều vắc xin V180 trong 1 tháng, và tiền đánh giá tính an toàn và khả năng sinh miễn dịch trong 28 ngày sau tiêm Tính an toàn và khả năng sinh đáp ứng miễn dịch dài hạn sẽ tiếp tục được đánh giá sau 1 năm Kết quả sơ bộ sau 1 tháng tiêm vắc xin V180 sử dụng tá dược ISCOMATRIX an toàn và

có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tốt (tỉ lệ chuyển đổi huyết thanh đạt 85.7 – 100%) Vắc xin sử dụng tá dược Alhydrogel cho hiệu quả thấp hơn (tỉ lệ chuyển đổi huyết thanh chỉ đạt từ 0 – 62.5%) [22]

Vắc xin DNA

Mặc dù rất nhiều hệ vector tái tổ hợp đã được sử dụng để biểu hiện kháng nguyên của DEN, nhưng các kết quả thu được khi sử dụng hệ vector biến đổi của virút đậu mùa và adenovirút vẫn còn nhiều hạn chế Việc phát triển và tìm thêm các

hệ vector biểu hiện phù hợp cần được tiếp tục nghiên cứu Thay vì sử dụng các vector sống để biểu hiện các kháng nguyên virút dengue, các kháng nguyên này có thể được biểu hiện từ các cấu trúc ADN đưa vào trong tế bào sau đó dịch mã thành các kháng nguyên virút dengue hoặc các tiểu đơn vị Vắc xin ADN này có rất nhiều lợi thế so với vắc xin truyền thống như sản xuất dễ dàng hơn, có khả năng ngăn chặn quá trình

30

nhân lên của virút và khả năng gây miễn dịch chống lại nhiều mầm bệnh với một mũi tiêm

1.3.4.1 Vắc xin tứ giá DNA plasmid TVDV – NMRC

Vắc xin tứ giá DNA plasmid (TVDV) được phát triển bởi Trung tâm Nghiên cứu Y học Hải Quân Hoa Kỳ (NMRC) thông qua việc kết hợp gen quy định protein pre-M và protein E vào vector plasmid VR1012 Nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I vắc xin được tiến hành trên các đối tượng chưa từng nhiễm dengue, tiêm theo đường tiêm bắp, sử dụng kim tiêm Biojector 2000, theo lịch tiêm 0, 1 và 5 tháng ở hai liều tiêm hàm lượng thấp và cao Kết quả lâm sàng cho thấy, mặc dù vắc xin được dung nạp tốt, an toàn nhưng không tạo được các đáp ứng miễn dịch với liều tiêm hàm lượng thấp, và chỉ 42% đối tượng có đáp ứng miễn dịch ở liều tiêm hàm lượng cao, tuy nhiên các đáp ứng này không phải đáp ứng dài hạn [29] Các nghiên cứu tiếp theo đang được tiến hành bao gồm việc sử dụng các phương pháp tiêm thay thế, kết hợp với tá dược Vaxfectin, hoặc phát triển vắc xin DNA trên nền tảng mới

1.4 Đặc điểm chủng vắc xin dengue tái tổ hợp được sử dụng tại VABIOTECH

Viện Quốc Gia các bệnh di ứng và nhiễm trùng (NIAID) thuộc viện NIH, Hoa

Kỳ đã nỗ lực tiến hành các nghiên cứu phát triển vắc xin dengue trong hơn 15 năm qua Các chủng virút giảm độc lực được phát triển dựa trên công nghệ DNA tái tổ hợp bằng phương pháp thiết kế trực tiếp thông qua hai chiến lược giảm độc lực chính bao gồm: tạo ra các đột biến mất nucleotide trong vùng không dịch mã và tạo virút ở dạng khảm Cả hai chiến lược này đều tạo ra các đột biến không có khả năng phục hồi, đảm bảo tính ổn định di truyền chủng, khả năng tái độc rất thấp do đó tính an toàn của vắc xin sẽ cao hơn so với công nghệ giảm độc lực thông qua cấy truyền nhiều đời Cấu trúc vùng 3’ không dịch mã (3’-UTR) virút dengue có tính bảo thủ cao giữa các tuýp huyết thanh khác nhau Mặc dù các nucleotide riêng lẻ trong vùng

31

này ít bảo thủ, tuy nhiên cấu trục cuộn vòng tạo bởi các nucleotide lại có tính bảo thủ cao, và đây là cơ sở cho các nghiên cứu gây đột biến giảm độc lực tại NIH

Hình 1.11 Sơ đồ hệ gen các chủng dengue tái tổ hợp được sử dụng trong nghiên

cứu sản xuất vắc xin sống giảm độc lực tại VABIOTECH

Chủng virút tái tổ hợp rDEN 1 được phát triển dựa trên cấu trúc toàn bộ hệ gen DEN 1 chủng Tây Thái Bình Dương, được làm giảm độc lực thông qua đột biết mất đoạn 30 nucleotide vùng 3’-UTR từ vị trí 172-143 Tương tự như vậy chủng virút tái tổ hợp rDEN 4 được phát triển trên cấu trúc hệ gen chủng DEN4 Dominica/81 strain 814669 [21] Chủng virút tái tổ hợp rDEN 2 được phát triển dựa trên việc thay thể vùng mã hóa prM và E của rDEN4∆30 bằng các vùng mã hóa tương ứng từ chủng DENV-2 NGC, tạo ra virút khảm rDEN2/4∆30(ME) [13] Chủng virút tái tổ hợp rDEN 3 được phát triển dựa trên cấu trúc toàn bộ hệ gen chủng DENV-3 Slemen/73 hoang dại được gây đột biết mất đoạn ∆30 tương tự các chủng trên và thêm một đột biến mất 31 nucleotide ở 3’-UTR ở vị trí 55 nucleotide phía trên của đột biến ∆30 [14] (Hình 1.11) Các chủng vắc xin dự tuyển đơn lẻ đều được đánh giá tiền lâm sàng trên mô hình chuột hepatoma và trên khỉ nhằm xác định mức độ giảm độc lực của virút cũng như hiệu quả sinh đáp ứng miễn dịch trước khi tiến hành các nghiên cứu lâm sàng trên người