Nghiên cứu đặc tính kháng kháng sinh và mối liên hệ kiểu gen của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Bệnh viện Việt Đức : Luận văn ThS. Sinh học: 84201

aeruginosa gây bệnh trong bệnh viện, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu đặc tính kháng kháng sinh và mối liên hệ kiểu gen của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập tạ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS TRẦN HUY HOÀNG

PGS.TS BÙI THỊ VIỆT HÀ

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.BS Trần Huy Hoàng, Trưởng Phòng Thí nghiệm Kháng sinh, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, là người trực tiếp hướng dẫn tôi trong công việc thí nghiệm Thầy đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo cho tôi những hiểu biết trong lĩnh vực nghiên cứu chuyên sâu về vi khuẩn và tạo những điều kiện thuận lợi để tôi tiến hành công việc thí nghiệm một cách tốt nhất và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, là giáo viên đồng hướng dẫn của tôi Cô

đã dạy dỗ, giúp đỡ, đưa ra những lời khuyên và góp ý quan trọng cho tôi trong suốt quá trình học tập để tôi hoàn thành luận văn này một cách tốt nhất

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã dạy cho tôi những kiến thức về sinh học để tôi hoàn thành công việc nghiên cứu tốt nhất

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, bạn bè đồng nghiệp tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã giúp đỡ, chỉ dẫn, khuyên bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thí nghiệm để tôi có thể hoàn thành công việc một cách thuận lợi nhất

Cuối cùng tôi muốn gửi lời biết ơn sâu sắc của mình tới gia đình, anh chị, bạn bè đã luôn sát cánh bên tôi, động viên tôi, tiếp thêm cho tôi sức mạnh trong những lúc tôi gặp khó khăn trong cuộc sống cũng như trong học tập để tôi luôn vững vàng bước trên con đường mình đã chọn

Hà Nội, ngày 5 tháng 10 năm 2018

Tác giả

Vũ Thị Thu Hiền

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về kháng sinh 3

1.1.1 Khái niệm về kháng sinh 3

1.1.2 Sự kháng kháng sinh (đề kháng) của vi khuẩn 3

1.1.2.1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn 3

1.1.2.2 Phân loại đề kháng 4

1.1.3 Cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn 5

1.1.3.1 Thay đổi đích tác đô ̣ng 5

1.1.3.2 Tạo ra các enzym 5

1.1.3.3 Giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất 5

1.1.4 Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm 6

1.2 Một số nét về Pseudomonas aeruginosa 9

1.2.1 Đặc điểm vi sinh vật 9

1.2.2 Nhiễm trùng lâm sàng do P aeruginosa gây ra 11

1.2.3 Khả năng gây bệnh 12

1.2.4 Độc lực 13

1.2.4.1 Các yếu tố hỗ trợ cho sự gắn kết của P aeruginosa vào tế bào vật chủ 13

1.2.4.2 Các yếu tố hỗ trợ sự xâm nhập của P aeruginosa vào mô và ức chế đáp ứng miễn dịch của vật chủ 13

1.2.5 Cơ chế kháng kháng sinh 16

1.2.5.1 Kháng trung gian qua porin màng ngoài 16

1.2.5.2 Kháng kháng sinh thông qua hệ thống bơm đẩy 17

1.2.5.3 Thay đổi đích tác động 21

1.2.5.4 Sản sinh enzym phân hủy kháng sinh 21

1.2.5.5 Cơ chế kháng bằng việc hình thành màng sinh học-biofilm 24

1.2.6 Tình hình kháng kháng sinh của P aeruginosa 24

1.2.6.1 Tình hình kháng kháng sinh của P aeruginosa trên thế giới 24

1.2.6.2 Tình hình kháng kháng sinh của P aeruginosa ở Việt Nam 26

1.2.7 Các kĩ thuật thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh của P aeruginosa 27

1.2.7.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch 27

1.2.7.2 Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 28

1.2.7.3 Kỹ thuật E-test 28

1.2.8 Các kĩ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gen của P aeruginosa 28 1.2.8.1 Kĩ thuật RAPD-PCR (Random amplified polymorphic ADN fingerprinting) 28

1.2.8.2 Kĩ thuật điện di xung trường (PFGE) 29

1.2.8.3 Kĩ thuật phân loại trình tự đa vị trí (Multi Locus Sequence Typing-MLST) 29

1.2.8.4 Kĩ thuật giải trình tự gen 30

1.3 Tính mới, tính thời sự và ý nghĩa khoa học của nghiên cứu 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 33

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 33

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN 33

2.2.1 Thời gian thực hiện 33

2.2.2 Địa điểm thực hiện thí nghiệm 33

2.2.3 Thiết kế nghiên cứu 33

2.2.4 Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm và vật tư tiêu hao 33

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) 34

2.3.1.1 Các bước tiến hành 35

2.3.1.2 Đọc và phân tích kết quả 38

2.3.2 Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE) 39

2.3.2.1 Quy trình tiến hành 39

2.3.2.2 Phân tích kết quả 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43

3.1 Mức độ nhạy cảm kháng sinh của P aeruginosa 43

3.1.1 Sự phân bố của P aeruginosa theo mẫu bệnh phẩm và theo Khoa 43 3.1.2 Mức độ nhạy cảm kháng sinh của P aeruginosa 44

KẾT LUẬN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Sự phát triển đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 3

Bảng 1.2: Cơ chất và các gen điều hòa của các hệ thống bơm đẩy ở P aeruginosa 20

Bảng 2.1: Các kháng sinh được thử nghiệm và diễn giải MIC với 35

P aeruginosa 35

Bảng 2.2: Các hóa chất được sử dụng trong kỹ thuật PFGE 40

Bảng 3.1: Mức độ nhạy cảm kháng sinh của P aeruginosa đối với các loại kháng sinh 46

Bảng 3.2 Sự phân bố kiểu gen của các chủng P aeruginosa với nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cơ chế của sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn 6

Hình 1.2: Đặc điểm hình thái của P aeruginosa trên môi trường nuôi cấy 10

Hình 2.1: Cách pha loãng bậc 2 cho 16 nồng độ kháng sinh từ dung dịch mẹ 36

Hình 2.2: Sơ đồ chấm chủng bằng bộ cấy 32 giếng 38

Hình 3.1: Tỉ lệ P aeruginosa phân lập được trong các mẫu bệnh phẩm 43

Hình 3.2: Tỉ lệ phân bố các chủng P aeruginosa theo Khoa 44

Hình 3.3: Chủng mọc trên đĩa thạch không có kháng sinh và có kháng sinh 45 Hình 3.4: Tỉ lệ P aeruginosa kháng hoàn toàn và kháng trung gian với các loại kháng sinh 47

Hình 3.5: Hình ảnh đại diện cho kiểu gen của các s ố chủng P aeruginosa phân lập tại bệnh viện Việt Đức 49

Hình 3.6: Cây phân nhóm kiểu gen của các chủng P aeruginosa phân lập tại bệnh viện Việt Đức 50

Control and Prevention

Trung tâm kiểm soát và

Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

Typing

Phân loại dựa trên đa điểm của trình tự gen

electrophoresis Điện di xung trường WGS Whole Genome Sequence Giải trình tự toàn bộ hệ

gen vi khuẩn

1

MỞ ĐẦU

Việc phát minh ra kháng sinh ở thế kỷ 20 đã đóng một vai trò quan trọng trong việc khống chế các bệnh nhiễm trùng Cùng với việc cải thiện điều kiện vệ sinh, nhà ở, dinh dưỡng và chương trình tiêm chủng mở rộng đã góp phần quan trọng làm giảm tỷ

lệ tử vong của các bệnh nhiễm trùng và tuổi thọ của con người đã được nâng cao Tuy nhiên, hiện nay thực trạng vi khuẩn kháng kháng sinh là một trong những vấn đề nghiêm trọng nhất mà nhân loại đang phải đối mặt trong thế kỷ 21 và được xác định đóng vai trò trọng tâm trong công tác chăm sóc sức khoẻ toàn cầu với chiến lược đánh giá được tác động của vi khuẩn kháng kháng sinh lên cộng đồng giai đoạn 2020-2025 Trên thế giới, vi khuẩn đã kháng lại kháng sinh ở mức độ nguy hiểm Các kháng sinh thế hệ một hầu như không được lựa chọn để điều trị trong rất nhiều các trường hợp, các kháng sinh thế hệ mới đắt tiền như cephalosporin thế hệ 3, 4, đặc biệt kháng sinh nhóm carbapenem cũng đang mất dần hiệu lực do sự lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc [35, 81] Trong khi đó không có kháng sinh mới được phát hiện để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra, đặc biệt là vi khuẩn Gram âm Theo dự báo của GS Jim O’Neill đến năm 2050, mỗi năm vi khuẩn kháng kháng sinh sẽ gây tử vong khoảng 10 triệu người, cao hơn tỷ lệ người tử vong do bất kỳ nguyên nhân nào, kể cả ung thư (8,2 triệu) và gây thiệt hại cho nền kinh tế bao gồm chi phí điều trị và tạo ra ít sản phẩm lao động khoảng

100 nghìn tỷ USD ở trên toàn thế giới [89]

Pseudomonas aeruginosa hay còn được gọi là trực khuẩn mủ xanh được biết

đến là một trong các tác nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện, như là viêm phổi, nhiễm trùng tiết niê ̣u , viêm da và viêm mô mềm [79] Các lựa chọn kháng

sinh trong điều tri ̣ P aeruginosa bị hạn chế do vi khuẩn này có xu hướng phát triển

kháng lại với nhiều dòng kháng sinh nhờ cơ chế kháng đa dạng như sự biểu hiện quá mức của hệ thống bơm đẩy, giảm tính thẩm thấu màng ngoài (OM), hoặc sản

sinh β-lactamase phân hủy kháng sinh nhóm β-lactama [54] Tính đa kháng của P

aeruginosa đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình điều trị, làm tăng tỉ lệ bệnh tật,

2

tăng tỉ lệ tử vong và tăng chi phí điều trị Đã có nhiều báo cáo trên thế giới cho thấy

mức độ kháng đa kháng sinh và gây ra hậu quả nặng nề do P aeruginosa [24, 98]

Ở Việt Nam, phần lớn các nghiên cứu chỉ tập trung vào tỷ lệ kháng kháng

sinh/ đa kháng kháng sinh của P aeruginosa, chưa có nhiều nghiên cứu sâu về kiểu gen, xác định nguồn gốc để đánh giá khả năng lây lan của các chủng P

aeruginosa trong bệnh viện [1, 10] Có thể kể đến nghiên cứu của Tada và cộng

sự trên 40 chủng P aeruginosa phân lập tại bệnh viện Bạch Mai cho thấy các chủng P aeruginosa ST235 mang gen IMP-26 có khả năng ly giải mạnh kháng

sinh nhóm carbapenem [105] Tuy nhiên, nghiên cứu này không được tiến hành ơ Việt Nam mà được thực hiện tạ phòng thí nghiệm ở Nhật Bản Hiện nay, điện di xung trường (Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) là kỹ thuật sinh học phân tử được nhiều nhà khoa học sử dụng để nghiên cứu và đánh giá sự lây truyền của các

vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện va cộng đồng Bệnh viện Việt Đức là bệnh viện tuyến đầu Trung ương với quy mô lớn Bệnh nhân của bệnh viện này khá đa dạng với đủ các lứa tuổi, thành phần và đ ến từ nhiều tỉnh thành khác nhau Đây cũng là bệnh viện sử dụng kháng sinh với quy mô lớn tạo áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh Do vậy, để góp phần làm rõ hơn bức tranh toàn thể về tính kháng kháng sinh cũng như để đánh giá mối liên hệ kiểu gen, sự lưu hành của các

chủng P aeruginosa gây bệnh trong bệnh viện, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

―Nghiên cứu đặc tính kháng kháng sinh và mối liên hệ kiểu gen của các chủng

Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Bệnh viện Việt Đức‖ với mục tiêu sau:

1 Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng Pseudomonas aeruginosa

phân lập tại Bệnh viện Việt Đức

2 Xác định mối liên hệ kiểu gen của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân

lập tại Bệnh viện Việt Đức bằng kĩ thuật điện di xung trường (PFGE)

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về kháng sinh

1.1.1 Khái niệm về kháng sinh

Kháng sinh là những chất được chiết xuất từ vi sinh vật hoặc được tổng hợp hóa học, với liều rất nhỏ có tác dụng ức chế hoặc giết chết vi sinh vật một cách đặc hiệu, có thể dùng tại chỗ hoặc toàn thân, ít độc hoặc không độc cho cơ thể

1.1.2 Sự kháng kháng sinh (đề kháng) của vi khuẩn

1.1.2.1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn

Trong tự nhiên, phần lớn các vi khuẩn đều sở hữu riêng các gen kháng kháng

sinh Điều này được quan sát thấy trên một số chủng Staphylococcus đã đề kháng

với penicillin ngay sau khi được đưa vào sử dụng năm 1946 Dưới áp lực chọn lọc

tự nhiên, các loài vi khuẩn đã xuất hiê ̣n khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh,

ví dụ streptomycin được đưa vào sử dụng năm 1943 và đến năm 1959 người ta quan sát thấy hiện tượng vi khuẩn kháng lại nhóm kháng sinh này (Bảng 1.1) Hiện nay, hầu hết các vi khuẩn gây bệnh đã kháng lại một hoặc nhiều loại kháng sinh [112]

Bảng 1.1: Sự phát triển đề kháng kháng sinh của vi khuẩn [112]

4

Trong thời gian gần đây, khoảng 70% các chủng vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất 1 loại kháng sinh thường dùng trong điều trị, đặc biệt

một số vi khuẩn như E coli, K pneumoniae, P aeruginosa và A baumannii đã

kháng lại tất cả các loại kháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay như cephalosporin và carbapenem Đây là một mối lo ngại và thách thức lớn đối với nền y học hiện đại [118-120, 122]

1.1.2.2 Phân loại đề kháng

Hiê ̣n tượng vi khuẩn vẫn có khả năng phát triển trong môi trường kháng sinh

ở nồng độ thường dùng được gọi là đề kháng [6] Đề kháng được chia làm hai loại

đề kháng giả và đề kháng thật

Đề kháng giả: là hiện tượng có biểu hiện đề kháng nhưng bản chất không

phải do di truyền Ví dụ, khi vi khuẩn nằm trong ổ áp xe hoặc nằm trong các tổ chức hoại tử bao bọc, kháng sinh không thấm được tới ổ viêm chứa vi khuẩn nên không phát huy được hết tác dụng Hoă ̣c khi vi khuẩn ở trạng thái nghỉ (không nhân lên, không chuyển hóa) thì sẽ không chịu tác dụng của thuốc kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách Thêm vào đó, ở một số bệnh nhân bị suy giảm hệ thống miễn dịch hay chức năng của thực bào bị hạn chế, khi đó cơ thể không đủ khả năng loại trừ những vi khuẩn đã bị ức chế ra khỏi cơ thể, vì thế khi không còn thuốc kháng sinh vi khuẩn sẽ phục hồi và phát triển trở lại [6]

Đề kháng thật bao gồm đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được:

+ Đề kháng tự nhiên: Là do cấu trúc di truyền của một số loài vi khuẩn Ví

dụ, một số loài vi khuẩn không có hệ thống vận chuyển kháng sinh hoặc không có đích tác động của kháng sinh, như là Mycoplasma thuộc loại vi khuẩn không có vách sẽ không chịu tác động của kháng sinh -lactam, ức chế tổng hợp vách tế bào

Ở một số vi khuẩn Gram âm, tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi một lớp vỏ bên

ngoài sẽ ngăn không cho kháng sinh xâm nhập vào bên trong tế bào [6]

+ Đề kháng thu đƣợc: Có rất nhiều cơ chế đã được vi khuẩn phát triển để

kháng lại kháng sinh Các đề kháng thu được này liên quan đến sự thay đổi vâ ̣t chất

di truyền của vi khuẩn đó hoặc do được truyền các gen kháng kháng sinh nằm trên

5

các plasmid và intergron lớp 1 từ vi khuẩn cùng và khác loài thông qua hình thức biến nạp và tiếp hợp [6]

1.1.3 Cơ chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn

Có rất nhiều cơ chế tham gia vào tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Những

cơ chế này có thể bao gồm thay đổi đích tác động, tạo ra các enzym, ngăn cản khả năng gắn vào tế bào vi khuẩn và làm thay đổi đường chuyển hóa (tạo ra các isoenzym)

1.1.3.1 Thay đổi đích tác đô ̣ng

Vi khuẩn thay đổi đích tác động của kháng sinh do thay đổi một protein cấu trúc hoặc một nucleotid trên tiểu phần 30S hoặc 50S của ribosom nên kháng sinh

không bám được vào đích và mất đi tác dụng [6] Ví dụ: A baumannii kháng lại imipenem và P aeruginosa kháng tycarcilline và imipenem do chúng thay đổi vị trí

gắn vào protein của các kháng sinh Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolone là ức chế hoạt động của đoạn gen mã hóa tổng hợp các tiểu đơn vị nhóm

A của GyrA DNA gyrase A) và ParC (topoisomerase IV) của tế bào vi khuẩn Ví

dụ, tính kháng quinolone của S typhi xảy ra do đột biến điểm của các đoạn gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym GyrA và ParC trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn

1.1.3.2 Tạo ra các enzym

Các enzym do gen đề kháng tạo ra có thể biến đổi cấu trúc hóa học của phân

tử kháng sinh làm kháng sinh mất tác dụng, ví dụ, acetyl hóa hoặc photphoryl hóa hay adenyl hóa các aminoxid hoặc chloramphenicol, hay như β-lactamase thủy phân nhóm kháng sinh β-lactam Ngày nay người ta đã tìm thấy hơn 20 loại enzym phá hủy kháng sinh nhóm β-lactam và 17 enzym phá hủy kháng sinh nhóm aminosid

[6]

1.1.3.3 Giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất

Vi khuẩn làm giảm mức độ thấm của màng nguyên sinh chất, ví dụ kháng sinh tetracyclin, oxacillin; gen đề kháng tạo ra một protein bám màng ngoài, ngăn cản kháng sinh thấm vào tế bào, hoặc làm mất khả năng vận chuyển qua màng do cản trở protein mang

6

Hình 1.1: Cơ chế của sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn [44]

1.1.4 Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm

Việc tìm ra kháng sinh ở thế kỷ 20 đã đóng một vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các bệnh nhiễm trùng Cùng với việc cải thiện điều kiện vệ sinh, nhà ở, dinh dưỡng và chương trình tiêm chủng mở rộng đã góp phần quan trọng làm giảm tỷ lệ tử vong của các bệnh nhiễm khuẩn Cho đến nay các nhà khoa học đã nghiên cứu và tổng

hơ ̣p thành công nhiều thế hệ kháng sinh khác nhau nhằm đáp ứng kịp thời cho công tác điều trị Tuy nhiên sự gia tăng tỷ lệ kháng thuốc của các vi khuẩn trong bệnh viện và trong cộng đồng là mối quan tâm về y tế được tổ chức Y tế thế giới xếp vào một trong

năm vấn đề quan trọng hàng đầu cần được giám sát một cách chặt chẽ

Theo nhiều báo cáo trên thế giới, tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn đang gia tăng một cách nhanh chóng Các kháng sinh ―thế hệ một‖ gần như không được lựa chọn

để điều trị trong hầu hết các trường hợp Các kháng sinh thế hệ mới đắt tiền cũng đang mất dần hiệu lực Theo báo cáo của trung tâm phòng chống bệnh tật châu Âu (ECDC), hàng năm có khoảng trên 25.000 ca tử vong do bị nhiễm các chủng vi khuẩn đa kháng

thuốc Chỉ tính riêng ở Thụy Điển, số lượng bệnh nhân mắc các chủng S aureus kháng

methicillin (MRSA) tăng từ 300 (2000) lên 1400 ca, và đặc biệt số lượng các ca bệnh mắc các chủng vi khuẩn kháng các loại kháng sinh phổ rộng (ESBL) cũng tăng nhanh từ

<500 ca (2005) lên 3500 ca (2009) Vào năm 2014, hệ thống Giám sát kháng kháng

lên 36% trong suốt mấy năm qua Tương tự, giám sát của EARS-Net cũng ghi nhận

sự kháng kháng sinh ở các chủng P aeruginosa, với 14,9% chủng phân lập kháng

với ít nhất ba lớp kháng sinh và 5,5% đối với cả năm nhóm kháng sinh Sự gia tăng sức đề kháng của vi khuẩn với nhiều nhóm kháng sinh chỉ cho phép một vài phương pháp điều trị thay thế cho bệnh nhân bị nhiễm trùng gây ra bởi các tác nhân gây bệnh này Kháng sinh nhóm carbapenem luôn được sử dụng như là lựa chọn cuối

cùng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do Enterobacteriaceae Thật không may, việc

sử dụng kháng sinh sau một thời gian đã tạo ra nguy cơ gia tăng tỉ lệ vi khuẩn kháng carbapenem và giờ đây đã và đang trở thành vấn đề nan giải ở nhiều nước trên thế giới Theo nghiên cứu của CDDEF-Trung tâm Nghiên cứu Biến động Bệnh dịch, Kinh tế và Chính sách tại Ấn Độ (Center for Disease Dynamics, Economics &

Policy), tỉ lệ vi khuẩn E coli và K pneumonie kháng carbapenem tăng lần lượt từ 10%

(2008) lên tới 13% (2013) và 29% (2008) lên tới 57% (2014) [36]

Ở Việt Nam, tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng trở nên phức tạp

và gây ra nhiều khó khăn trong công cuộc điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn

đa kháng gây ra Cho đến nay rất nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn gây bệnh

như Salmonella, A baumannii, E coli và K pneumonia, P aeruginosa… tại Việt

Nam đã kháng nhiều loại kháng sinh thông thường Tính đa kháng thuốc của các loại

vi khuẩn này liên quan đến các gen kháng kháng sinh nằm trên plasmid của tế bào

vi khuẩn Ở Việt Nam, những năm gần đây vi khuẩn không chỉ kháng với các kháng sinh thông thường, mà còn kháng lại nhiều kháng sinh thế hệ mới, phổ rộng gây nhiều khó khăn cho công tác điều trị Điển hình như tại các bệnh viện lớn như Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện TWQĐ 108, Bệnh viện TW Huế… các vi khuẩn nêu trên đã có tỷ lệ kháng rất cao với các kháng sinh thường dùng, cụ

thể là với E coli các kháng sinh hay sử dụng để điều trị là gentamicin và cefotaxim

8

đã bị kháng lần lượt là 51% và 50,3% Tụ cầu vàng kháng methiciline là 41,7% [2],

đây chính là các chủng MRSA Đặc biệt với A baumannii, một căn nguyên nhiễm

trùng bệnh viện hàng đầu hiện nay thì tỷ lệ kháng kháng sinh đã ở mức báo động

đỏ, cụ thể là với hơn 3.000 chủng A baumannii phân lập được tại 7 bệnh viện lớn,

đại diện cho 3 miền Bắc, Trung, Nam trong năm 2012-2013 Kết quả cho thấy vi khuẩn này đã có tỷ lệ kháng cao với hầu hết các kháng sinh thông thường dùng trong bệnh viện (tỷ lệ kháng trên 70% ở 13 trên tổng số 15 loại kháng sinh được thử nghiệm) Trong đó, tỷ lệ kháng với nhóm carbapenem với 2 đại diện imipenem và meropenem lần lượt là: 76,5% và 81,3% Nhóm cephalosporin kháng trên 80%, trong đó kháng 83,9% với cefepim, 86,7% với ceftazidin, 88% với efotaxim, 93,1% với ceftriaxone [9] Năm 2014, theo nghiên cứu ở viện Pasteur TP Hồ Chí Minh về tình trạng đa kháng thuốc của K pneumoniae cho thấy, K pneumoniae kháng với tất

cả các loại kháng sinh với tỉ lệ kháng colistin (10,7%), fosfomycin (24%), aztreonam (36%), amikacin (42,9%), ciprofloxacin (48,2%), cefepime (45,8%), imipenem (46,2%), gentamicin (55,6%), cefoperazone (54,2%), ticarcillin/a.clavulanic (54,2%), tobramycin (54,2%), Piperacillin (60,7%), cefsulodin (62,5%), sulfamides (64%) [1] Theo báo cáo của tác giả Trần Huy Hoàng (2014) về tình trạng vi khuẩn kháng carbapenem ở bệnh viện Việt Đức - Hà Nội cho

thấy, A baumannii chiếm tỉ lệ cao nhất 63,8%, tiếp theo là các chủng Acinetobacter spp 15,5%, Enterobacter spp 6,9%, K pneumoniae 6,1%, E coli 4,8%, C freundii 2,4% và thấp nhất là Providencia rettgeri 0,4% [5]

Hậu quả của vi khuẩn kháng đa kháng sinh để lại rất nặng nề, theo như báo cáo của Trung tâm phòng chống và kiểm soát bệnh tật tại Mỹ (CDC), hơn 70% trong tổng số 1,7 triệu ca nhiễm trùng tại các bệnh viện của Mỹ kháng lại với ít nhất một loại kháng sinh được khuyến cáo sử dụng để điều trị cho tác nhân nhiễm khuẩn

đó, và tỷ lệ tử vong do nhiễm khuẩn bệnh viện là 99.000 ca hàng năm Hay tại châu

Âu, tỷ lệ tử vong hàng năm là 25.000 ca có liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện do

vi khuẩn kháng kháng sinh Thêm vào đó khi bị nhiễm khuẩn do các vi khuẩn kháng kháng sinh gây ra sẽ có nguy cơ cao gây thất bại trong điều trị, tăng chi phí, kéo dài

9

thời gian điều trị và gây thiệt hại cho nền kinh tế (do ốm đau, mất sức và tạo ra ít sản phẩm lao động) Chẳng hạn như, liên minh châu Âu mất 1,5 tỉ EUR và Mỹ mất 1,87 tỉ đô la hàng năm, cao hơn rất nhiều số tiền sử dụng cho công tác phòng chống dịch cúm hàng năm tại các quốc gia này [121]

Ngoài ra vi khuẩn kháng đa kháng sinh còn tác động đến nhiều lĩnh vực khác nhau như sức khỏe con người, kinh tế, dịch tễ học, ngành công nghiệp dược phẩm

và các biện pháp phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh Thêm vào đó, các nghiên cứu sâu về các đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn kháng kháng sinh cũng rất quan trọng để phát hiện ra nguồn truyền và phương thức lây lan qua đó chúng ta có thể đề ra các biện pháp nhằm hạn chế sự lây lan của các vi khuẩn kháng kháng sinh trong bệnh viện và cộng đồng

1.2 Một số nét về Pseudomonas aeruginosa

1.2.1 Đặc điểm vi sinh vật

P aeruginosa là một vi khuẩn Gram âm hiếu khí, có khả năng tồn tại trong

nhiều môi trường khác nhau Sinh vật này thường dài 1,5-5 μm, rộng 0,5-1,0 μm và

có khả năng di động nhờ tiên mao ở một cực duy nhất P aeruginosa lần đầu tiên

được phân lập ngoài môi trường tự nhiên bởi Schroeter vào năm 1872 [78] Ngoài

ra, nó cũng được Carle Gessard phân lập lần đầu tiên ở người trên những người lính

bị thương vào năm 1882 [37] P aeruginosa thuộc họ Pseudomonadaceae trong nhóm Gammaproteobacteria Các đặc tính điển hình của P aeruginosa bao gồm các

xét nghiệm dương tính với oxydase, khả năng nuôi cấy ở nhiệt độ 42oC (dù được phân loại như là sinh vật hiếu khí) và khả năng phát triển trong điều kiện kị khí khi

có mặt của một chất nhận điện tử cuối cùng là nitrit hoặc arginine [28]

P aeruginosa là một loại vi khuẩn không lên men lactose, thường được phân

lập từ các bệnh nhân nằm viện và có thể được tìm thấy trong một loạt các dung dịch lỏng, bao gồm các chất tẩy uế, xà bông và thuốc nhỏ mắt Nó cũng có thể được tìm thấy trong bồn rửa, bồn nước nóng, thiết bị hô hấp, vòi hoa sen Nó có khả năng sản xuất sắc tố hòa tan trong nước pyoverdine và pyocyanin tạo ra màu xanh lá cây là

10

màu đặc trưng của sinh vật khi nuôi cấy trên môi trường thạch để phân lập

Pseudomonas [49, 50]

P aeruginosa có thể gây ra nhiều bệnh và có thể được phân lập từ hầu hết

mẫu vật Nhiễm trùng do P aeruginosa có thể thu được từ cộng đồng và từ các cơ

sở y tế P aeruginosa hiếm khi gây bệnh ở người khỏe mạnh nhưng có thể cư trú ở

đường tiêu hóa của bệnh nhân đặc biệt là những người đã được điều trị kháng sinh trước đó [28] Trên môi trường thạch thường ở 37ºC, hình thái khuẩn lạc là tròn đều nhẵn, mịn, trung tâm hơi lồi, có màu xanh ánh kim và có xu hướng mọc lan Khi nuôi cấy vi khuẩn này trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc mọc gây tan máu hoàn toàn (tan máu β) Trong môi trường lỏng, vi khuẩn mọc thành váng có màu xanh ở trên mặt môi trường, môi trường đục (Hình 1.2 -C)

Hình 1.2: Đặc điểm hình thái của P aeruginosa trên môi trường nuôi cấy

A: Môi trường thạch thường B: Môi trường thạch máu C: Môi trường lỏng

Các khuẩn lạc của P aeruginosa thường có màu và thực tế tên gọi của loài

xuất phát từ nghĩa của từ aeruginosa là "màu của gỉ đồng", có nghĩa là các khuẩn lạc

có màu xanh lá cây là do vi khuẩn có khả năng sản sinh sắc tố pyocyanin là loại sắc

tố tan trong nước và cloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu

xanh Đa số P aeruginosa sinh sắc tố này Đó là lí do tại sao các vết mủ nhiễm trùng do P aeruginosa gây ra thường có màu xanh Ngoài ra, pyoverdin huỳnh

quang và pyorubin (đỏ-nâu) là các sắc tố thông thường khác có trong vi khuẩn này

[78] Sắc tố của P aeruginosa dưới ảnh hưởng các nhân tố hoá học có thể thay đổi

A B C

11

thành màu nâu, đen Bên cạnh đó P aeruginosa cũng có khả năng sản xuất chất

thơm là kimetylami

P aeruginosa có nhiều kiểu di chuyển khác nhau như bơi, co giật và trôi dạt

P aeruginosa bơi trong môi trường nước bằng cách chuyển động lông đơn cực Đặc

biệt, với khả năng di chuyển hóa ứng động có thể cho phép nó di chuyển trong các

bề mặt lỏng và rắn

1.2.2 Nhiễm trùng lâm sàng do P aeruginosa gây ra

P aeruginosa có thể gây nhiễm trùng ở hầu hết mọi bộ phận cơ thể nhưng

hiếm khi gây nhiễm trùng ở người khỏe mạnh Vi khuẩn này là một mầm bệnh cơ hội gây nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng tiết niê ̣u, viêm da, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng mô mềm và một loạt các nhiễm trùng toàn thân Nó được tìm thấy chủ yếu ở những bệnh nhân bị bỏng nặng, ung thư, và ở những người bị AIDS có hệ thống miễn dịch suy giảm Sự bùng phát của sinh vật này đã được báo cáo ở các môi trường khác nhau [80] Trong số các ca bệnh bị nhiễm trùng máu do vi khuẩn

Gram âm gây ra, có khoảng 25% là liên quan tới P aeruginosa P aeruginosa cũng

gây viêm màng não do nó có khả năng xâm nhâp các cơ quan ở hệ thống thần kinh trung ương như xoang, tai trong, hoặc xâm nhập trực tiếp thông qua các thiết bị,

dụng cụ trong phẫu thuật hoặc chẩn đoán P aeruginosa là tác nhân gây viêm tai

ngoài, thường là những người hay đi bơi Loài vi khuẩn này cũng là một trong các tác nhân gây bệnh trên mắt, điển hình là gây nhiễm trùng mắt (thông qua chấn thương hoặc do đưa thuốc bị nhiễm khuẩn vào) gây viêm màng kết mạc mắt, viêm giác mạc mắt [103] Gây viêm tuỷ sống, thông qua con đường tiêm trực tiếp vào xương và là tác nhân gây bệnh viêm xương khớp phổ biến nhất sau khi chích các

vết thương ở bàn chân P aeruginosa có thể gây bệnh ở bất kỳ vị trí nào của đường

tiêu hóa từ miệng đến trực tràng

Nhiễm trùng do P aeruginosa thay đổi tùy thuộc vào mức độ nhiễm bệnh của bệnh nhân Theo báo cáo của Solomon năm 2003, P aeruginosa được coi là

nguyên nhân phổ biến nhất gây viêm phổi (17%), nhiễm trùng tiết niê ̣u (7%), nhiễm trùng sau phẫu thuật (8%), nhiễm trùng máu (2%) và là vi khuẩn phổ biến thứ năm

12

trong tất cả các vi khuẩn phân lập được (9%) tại các cơ sở chăm sóc sức khỏe [100]

P aeruginosa cũng được biết đến là một tác nhân chủ yếu gây viêm phổi cô ̣ng đồng

mắc phải(community-acquired pneumonia –CAP) trên bệnh nhân bị bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, người ở nhà dưỡng lão và bệnh nhân mới xuất viện [32] Vi khuẩn này thường phân bố trong môi trường tự nhiên và thường được tìm thấy trong đất và nước Nó cũng là nguyên nhân chính gây tử vong ở những bệnh nhân xơ nang [106]

1.2.3 Khả năng gây bệnh

P aeruginosa là một mầm bệnh cơ hội gây nhiễm trùng cấp tính và mạn tính

ở bệnh nhân có các tình trạng như xơ nang, thông khí cơ học, suy giảm miễn dịch

hoặc bị mắc các bệnh về đường hô hấp có từ trước Khả năng gây bệnh của P

aeruginosa chủ yếu là do các yếu tố độc tính khác nhau của vi khuẩn và sự linh hoạt

trong di truyền Hệ genome của loài vi khuẩn Gram âm này nằm trong số những vi khuẩn có kích thước hệ gen lớn nhất với 6,26 Mbp chứa khoảng 5567 gen cộng thêm một số lượng lớn các gen có thể được truyền ngang giữa các vi khuẩn Điều

này cung cấp cho P aeruginosa khả năng thích nghi cực cao với những biến động

của môi trường bao gồm áp lực do kháng sinh, cho phép nó tồn tại trong các môi

trường khác nhau [53] Những tổn thương ở phổi do nhiễm trùng P aeruginosa

thường là kết quả của những tác động phá huỷ trực tiếp của vi khuẩn lên nhu mô phổi và hệ thống đáp ứng miễn dịch của vật chủ Các yếu tố góp phần vào sinh bệnh

học của P aeruginosa phục thuộc vào tình trạng sức khoẻ của vật chủ Bệnh nhân

có tiền sử bệnh lý về đường hô hấp khi nhập viện, đặc biệt là những bệnh nhân phải

thở bằng máy hầu hết đều có nguy cơ cao bị viêm phổi do P aeruginosa gây ra

Ngoài ra, trong điều kiện ẩm ướt, nếu thêm yếu tố giàu chất khoáng, giàu dinh

dưỡng thì rất thuận lợi cho sự tồn tại và phát triển của P aeruginosa (như dụng cụ

làm ẩm oxy, ống hút, lavabo rửa tay…) Để gây ra bất kỳ loại nhiễm trùng nào,

trước hết P aeruginosa phải xâm nhập được vào vật chủ và cư trú trong đó Quá

trình xâm nhập thường bắt đầu khi tuyến phòng thủ đầu tiên (hàng rào bảo vệ không đặc hiệu ở da, niêm mạc) bị phá vỡ (như khi bị vết thương) hoặc vi khuẩn được đưa

13

trực tiếp vào cơ thể thông qua dụng cụ nội soi hoặc ống thông khí quản Tại chỗ vi khuẩn gây viêm có mủ, điển hình là mủ có màu xanh Nếu cơ thể giảm sức đề kháng, chúng có thể xâm nhập vào sâu hơn bên trong cơ thể và gây viêm ở các phủ tạng như các nhiễm trùng có mủ và những áp xe ở những phần khác nhau của cơ thể người hoặc đi vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc Nhiễm khuẩn

do P aeruginosa ngày càng trở nên trầm trọng do vi khuẩn có khả năng đề kháng

đa kháng sinh và thường kháng ở nồng cao Hiện nay P aeruginosa được xem là

căn nguyên chủ yếu gây nhiễm trùng bệnh viện

1.2.4.1 Các yếu tố hỗ trợ cho sự gắn kết của P aeruginosa vào tế bào vật chủ

Các yếu tố độc lực đóng vai trò quan trọng trong quá trình bám dính của P

aeruginosa lên bề mặt vật chủ bao gồm pili, flagella, polysaccharide ngoại bào Sự

bám dính được xem là bước quan trọng đầu tiên trong quá trình lây nhiễm của vi khuẩn vào bề mặt tế bào biểu mô của vật chủ Khi đã bám dính được vào bề mặt tế bào chủ, P aeruginosa sẽ kích hoạt các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ

1.2.4.2 Các yếu tố hỗ trợ sự xâm nhập của P aeruginosa vào mô và ức chế đáp

ứng miễn dịch của vật chủ

Hệ thống bài tiết loại III: cho phép P aeruginosa sản sinh độc tố vào tế bào

chủ Các độc tố loại III bao gồm exoenzym S (ExoS), exoenzym U (ExoU), exoenzym T (ExoT), và exoenzym Y (ExoY) Chúng đóng góp ở các mức độ khác nhau trong việc gây độc tế bào dẫn tới sự xâm nhập và lan rộng của vi khuẩn [30] Trong số những exoenzym này, ExoU có tính độc lực cao nhất [43, 94] Các chủng

14

P aeruginosa biểu hiện các độc tố của hệ thống bài tiết loại III có khả năng làm

tăng nguy cơ tử vong ở bệnh nhân bị viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết, suy hô hấp [92]

Hệ thống bài tiết loại II bao gồm các ngoại độc tố:

+ Protease: gần 90% các chủng P aeruginosa có khả năng phân giải protein Ít nhất ba protease khác nhau đã được xác định trong P aeruginosa và hai trong số chúng là elastase và alkaline protease có liên quan đến độc lực của P

aeruginosa [70] Các enzym này phá hủy các phân tử protein của vật chủ một cách

đặc hiệu gây nên những đặc tính lâm sàng riêng của bệnh

+ Các elastase (LasB elastase, LasA elastase): Phân cắt cấu trúc protein của

tế bào nhân chuẩn như collagen, elatin và hủy hoại cấu trúc protein của các tế bào này Đồng thời nó cũng phá vỡ hệ thống miễn dịch đặc hiệu của cơ thể (IgG, IgA,

bổ thể), các phân tử ngoại bào làm cho nhiễm trùng lan tỏa đến các khu vực xa hơn với các biểu hiện lâm sàng như viêm màng keratin, hoại tử tổ chức trong bỏng và tạo các xơ nang Ngoài ra, elastase còn dung giải fibronectin giúp cho vi khuẩn dễ dàng bám vào màng nhầy phổi Elastase phá vỡ biểu mô và cản trở chức năng của các lông mao bên trong đường hô hấp Elastase cũng hỗ trợ vi khuẩn trong việc trốn tránh thực bào tại các vị trí tổn thương bằng cách ức chế hóa hướng bạch cầu

+ Alkalinne protease: Can thiệp vào sự hình thành fibrin và phân giải fibrin Đồng thời, elastase và alkaline protease phân hủy chất nền của giác mạc và những cấu trúc bảo vệ khác cấu tạo nên fibrin và elastin Hai enzym này cũng được cho rằng gây ra sự bất hoạt đối với hai yếu tố quan trọng của hệ miễn dịch là interferon gamma (IFN) và TNF (Tumor Necrosis Factor) Elastase và protease kiềm có khả năng can thiệp vào chức năng của tế bào lympho ở người do sự thoái hóa của IL-2 Alkaline protease và elastase cũng có thể ức chế chức năng của bạch cầu trung tính, đặc biệt là can thiệp vào hóa ứng động cho phép vi khuẩn có lợi thế trong việc thoát khỏi các thực bào của hệ thống phòng vệ vật chủ [48]

+ Phospholipase C: tất cả các chủng P aeruginosa đều có khả năng sản xuất một phospholipase C không chịu nhiệt nằm trong một polypeptid đơn

15

Phospholipase C là một enzym gây tan máu, có vai trò phân hủy lecithin và lipid, tạo ra các lỗ thủng trên màng tế bào làm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào trong tế bào vật chủ Nó thường tác động kết hợp với glycolipide và protease alkaline gây xuất huyết, hoại tử tại chỗ tổn thương Phospholipase C có biểu hiện cao nhất ở những chủng phân lập không chứa mucoid, còn ở những chủng phân lập

có chứa mucoid thì khả năng sản xuất enzym này rất thấp [14]

+ Exotoxin A: Phần lớn P aeruginosa sinh ra độc tố này Exotoxin A là một

proenzym có trọng lượng phân tử 66000-71000 Dalton, không bền với nhiệt và là

một độc tố mạnh nhất của P aeruginosa Chúng có vai trò làm kìm hãm sự tổng

hợp protein và gây chết tế bào bằng cách xúc tác chuyển ADP-ribosyl từ nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) thành yếu tố kéo dài -2 (EF-2) theo phản ứng sau:

Kết quả là phức hợp ADP-ribosyl-EF-2 không hoạt động trong quá trình tổng hợp protein Exotoxin A hoạt động tương tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipid, gây tổn thương nhiều cơ quan,

nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan 90% số chủng P aeruginosa sản xuất

Exotoxin A nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng [60]

+ Lypopolysacharide (LPS): là nội độc tố ở thành phần của vách tế bào vi khuẩn LPS có vai trò quan trọng trong việc gây ra nhiễm khuẩn huyết Nó tác động đến bạch cầu, tiểu cầu, kích hoạt hệ thần kinh giao cảm làm tăng tiết các chất như renin, histamin, serotonin, đồng thời hoạt hóa hệ kallikreinogenkinin gây rối loạn vi tuần hoàn, rối loạn vận mạch, đông máu gây ức chế miễn dịch Ngoài ra LPS còn gắn lên thụ thể CD4 trên bề mặt monocyte và đại thực bào kích thích chúng gây hoại tử tổ chức

16

1.2.5 Cơ chế kháng kháng sinh

P aeruginosa có khả năng đề kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh thông

qua những cơ chế khác nhau, bao gồm các cơ chế kháng qua việc giảm sự hấp thu thuốc do mất protein porin màng ngoài, phân hủy kháng sinh bằng việc sinh các enzym β-lactam, đẩy thuốc kháng sinh ra khỏi tế bào bởi các cơ chế bơm đẩy, bất hoạt và thay đổi đích tác dụng của kháng sinh [54]

1.2.5.1 Kháng trung gian qua porin màng ngoài

Màng ngoài vi khuẩn (OM-outer membrane) là một cấu trúc rất quan trọng đối với tế bào, hoạt động như một hàng rào thẩm thấu có chọn lọc đối với các phân

tử kị nước và ưa nước Nó được ví như là rây phân tử giúp cho các phân tử có kích

thước rất nhỏ đi qua như β-lactam và quinolone Chính vì thế OM đóng một vai trò

quan trọng trong sự thẩm thấu của vi sinh vật với kháng sinh Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các vi khuẩn khác nhau có độ thẩm thấu màng khác

nhau OM của P aeruginosa có độ thẩm thấu thấp hơn 100 lần so với E coli [41] Đặc tính này của P aeruginosa được xác định là có liên quan tới các protein xuyên màng gọi là porin P aeruginosa có khả năng sản xuất nhiều porin khác nhau, trong

đó oprF là porin chính có trong tất cả các chủng [17] Những chủng đột biến thiếu oprF đã được báo cáo không phải là nguyên nhân chính gây ra kháng kháng sinh

Tuy nhiên, OprD được coi là porin quan trọng nhất có liên quan đến việc giảm đáng

kể tính nhạy cảm tới kháng sinh OprD là một porin chuyên biệt có vai trò đặc biệt trong việc hấp thu các axit amin tích điện dương như lysine Mất oprD thường liên quan đến tính kháng carbapenem, đặc biệt là imipenem, sẽ làm tăng nồng độ ức chế tối thiểu từ 1-2 đến 8-32 mg/L và 17% tỷ lệ kháng đã được báo cáo trong quá trình điều trị [54] Các nghiên cứu về chức năng đã cho thấy các vòng 2 và 3 trong OprD chứa các vị trí liên kết cho imipenem[56] Do đó, đột biến như thay thế nucleotide,

mất hoặc chèn các trình tự trong gen oprD hoặc vùng promoter có thể làm giảm

hoặc mất sản xuất OprD [25, 55], dẫn đến khả năng kháng imipenem Mặc dù hầu hết các báo cáo chỉ ra rằng những đột biến xảy ra trong gen mã hoá porin chủ yếu được tìm thấy trong các chủng kháng imipenem, một số nghiên cứu khác báo cáo

17

rằng đột biến oprD có thể xảy ra ở các chủng nhạy cảm với kháng sinh

carbapenems [76] Tuy nhiên, việc mất oprD không ảnh hưởng tới tính kháng của vi khuẩn với meropenem, điều này cho thấy rằng kháng carbapenem dường như phức tạp hơn vì nó còn liên quan đến kênh axit carboxylic OM khác hoặc các cơ chế mã hoá nhiễm sắc thể (như sản xuất dư thừa AmpC hoặc sự biểu hiện quá mức của các bơm đẩy như MexAB-OprM, MexXY-OprM, và MexCD-OprJ)[31, 90]

1.2.5.2 Kháng kháng sinh thông qua hệ thống bơm đẩy

Trong khi cơ chế mất porin OprD là một rào cản hiệu quả đối với sự xâm nhập của thuốc kháng sinh vào tế bào vi khuẩn, thì cơ chế liên quan đến hệ thống bơm đẩy cũng giúp vi khuẩn giảm sự hấp thụ chất diê ̣t khuẩn Các hệ thống bơm đẩy thường kết hợp với tính thẩm thấu thấp của OM làm cho vi khuẩn trở thành đa kháng (MDR-multidrug-resistant) [29] Hệ thống bơm đẩy gồm có ba thành phần protein, một protein phụ thuộc năng lượng nằm trong màng tế bào chất, một porin

OM và một protein xuyên màng Sự sắp xếp này giúp vi khuẩn loại bỏ các phân tử

độc đối với tế bào Mười hệ thống bơm đẩy khác nhau đã được mô tả trong P

aeruginosa là: MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MeXY, MexJK,

MexGHI-OpmD, MexVW, MexPQ-OpmE, MexMN và TriABC [59] OprM, MexXY- OprM là hai hệ thống luôn được biểu hiện ở chủng hoang dại Tuy nhiên, sự biểu hiện của MexXY- OprM thấp hơn nhiều so với MexAB Cả hai hệ thống đều hoạt động dựa trên cơ chế cảm ứng tiếp xúc với thuốc kháng sinh Những

MexAB-hệ thống còn lại không được biểu hiện trong chủng hoang dại nhưng có thể đóng góp vào khả năng kháng kháng sinh hoặc chất diệt khuẩn khi biểu hiện trong chủng kháng [13] Tất cả các lớp kháng sinh ngoại trừ các polymyxin đều dễ bị đẩy ra ngoài bởi một hoặc nhiều hệ thống bơm đẩy

Trong số 10 hệ thống bơm đẩy, thì MexAB-OprM được coi là quan trọng nhất và có liên quan trong tính kháng với fluoroquinolones và β-lactam [110, 116]

Hệ thống này cũng liên quan đến sự đề kháng với carbapenem như meropenem nhưng không liên quan đến imipenem Các gen mã hóa cho các hệ thống này có ở

tất cả các chủng P aeruginosa nhưng chúng không được biểu hiện ở mức độ cao

đa kháng biểu hiện quá mức MexAB-OprM do sự biến đổi trong gen điều hòa [61]

Sự sản xuất quá mức của MexAB-OprM cũng được quan sát thấy ở hơn 82% chủng

đa kháng phân lập từ Đức [46] Do đó, các đột biến xảy ra ở gen mã hóa cho MexAB-OprM đã khẳng định vai trò của hệ thống bơm đẩy trong cơ chế kháng nội tại

Thể đột biến nalC là dạng có gen mexR nguyên vẹn [101] Các thể đột biến nalC có nguồn gốc từ chủng hoang dại P aeruginosa PAO1 và được đặc trưng bởi một đột biến ở gen PA3721 [19] Protein được mã hóa bởi gen này là một chất ức

chế của một operon gồm hai gen, chức năng của nó là không rõ ràng và sự biểu hiện quá mức của nó trong thể đột biến nalC dẫn đến sản xuất quá mức của hệ thống

bơm đẩy MexAB-OprM Gần đây, mô ̣t đột biến ở gen PA3574 đã dẫn đến phát sinh

thể đột biến nalD, thể này cũng có sự biểu hiện quá mức của hệ thống bơm đẩy MexAB-OprM [99] Masuda và Ohya là người đầu tiên báo cáo rằng, sự biểu hiện

quá mức của MexAB-OprM ở P aeruginosa làm giảm tính nhạy cảm với

meropenem, nhưng không ảnh hưởng đến hoạt động của các carbapenem khác như imipenem Điều này là do cấu trúc phân tử khác nhau của carbapenem - meropenem

có một chuỗi bên kỵ nước ở vị trí thứ hai, làm cho nó trở thành cơ chất cho hệ thống này, trong khi imipenem có chuỗi bên có sự trao đổi và ưa nước mạnh [66]

Cấu trúc bơm đẩy MexC–mexD–oprJ được biểu hiện quá mức ở chủng P

aeruginosa có gen nfxB mã hóa cho yếu tố ức chế phiên mã của cụm gen đó bị đột

biến [86, 87] Hệ thống bơm đẩy này chủ yếu đẩy nhóm cephem phổ rộng (cefepime và cefpirome) ra khỏi tế bào vi khuẩn, cũng như nhóm quinolone, macrolide, tetracycline và chloramphenicol [57]

Hệ thống MexE–mexF–oprN có liên quan tới sự đề kháng với quinolone,

chloramphenicol, trimethoprim và được biểu hiện quá mức ở chủng P aeruginosa

19

thể đột biến nfxC (có đột biến ở locus mexT) [52] Thể đột biến nfxC cũng thể hiê ̣n

sự kháng chéo với carbapenem (chủ yếu là imipenem) vì chúng đồng thời giảm sự

biểu hiện của protein OM-OprD

Masuda và cộng sự đã phát hiện ra rằng các protein MexX và MexY đẩy các kháng sinh aminoglycoside, tetracycline và erythromycin ra khỏi các tế bào vi khuẩn và liên kết chặt chẽ với các protein màng ngoài OprM, tham gia vào tính

―kháng nội tại‖ của P aeruginosa đối với các tác nhân kháng khuẩn Giống như

MexAB–OprM, các protein MexXY có thể được sản xuất quá mức do đột biến

trong gen ức chế mexZ nằm gần đó và phiên mã độc lập với operon MexXY [61,

111] Sự gia tăng biểu hiện của MexXY–OprM làm giảm tác động của aminoglycoside và fluoroquinolone đến vi khuẩn [64]

Fluoroquinolones, β-lactams, chất ức chế β-lactamase, tetracyclines, chloramphenicol, macrolides, novobiocin,

trimethoprim, sulfonamides

[12, 19, 71, 99]

mexCD-OprJ NfxB (chất ức chế)a Fluoroquinolones, β-lactams,

tetracycline, chloramphenicol, macrolides, trimethoprim, novobiocin

[87]

mexEF-OprN MexT (chất hoạt hóa)a

MexS (chất ức chế)bMvaTb

Fluoroquinolones, chloramphenicol, trimethoprim

[33]

mexXY MexZ (chất ức chế)a Fluoroquinolones, β-lactams,

tetracycline, aminoglycosides, macrolides, chloramphenicol

a: Protein trực tiếp kiểm soát sự biểu hiện của các hệ thống bơm đẩy

b: Protein gián tiếp kích hoạt biểu hiện hệ thống khi bị biến đổi

NI: không xác định

21

1.2.5.3 Thay đổi đích tác động

Các enzym có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào thường là đích tác đô ̣ng của kháng sinh Những biến đổi trong enzym đích khiến kháng sinh không còn nhận ra được đích tác động, do vậy làm cho kháng sinh mất

đi tác dụng Sự đột biến các gen nằm trên nhiễm sắc thể mã hoá cho các tiểu đơn vị cấu trúc của ADN gyrase và topoisomerase IV (hai enzym thuô ̣c lớp topoisomerase

II) là cơ chế quan trọng nhất của sự đề kháng fluoroquinolone ở P aeruginosa Những đột biến điểm ở các gen gyrA/gyrB dẫn đến sự thay đổi trình tự axit amin trong các tiểu đơn vị A và B của ADN gyrase Những đột biến điểm ở gen parC và

parE mã hóa cho 2 tiểu đơn vị ParC và ParE dẫn đến sự biến đổi của topoisomerase

IV Kết quả là cấu trúc của topoisomerase II bị biến đổi, do đó ái lực gắn kết với các phân tử quinolone cũng bị thay đổi Các đột biến trong tiểu đơn vị GyrB và ParE ít phổ biến hơn so với GyrA và ParC Các đột biến ở gen điều hòa sự biểu hiện của các enzym phân hủy kháng sinh cũng có thể làm tăng sức đề kháng của vi khuẩn

với kháng sinh Ví dụ như đột biến gen ampR sẽ dẫn đến sự biểu hiện quá mức AmpC và do đó làm tăng khả năng đề kháng của P aeruginosavới β-lactam [59]

Sự m ethyl hóa 16S rRNA được biết đến là cơ chế liên quan tới tính kháng aminoglycoside của các vi khuẩn gây bệnh Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae

và vi khuẩn không chuyển hóa glucose bao gồm các loài P aeruginosa và

Acinetobacter Enzym methyl hóa 16S rRNA đầu tiên gọi là RmtA được phát hiện

trong cơ chế kháng aminoglycoside ở P aeruginosa phân lập tại Nhật Bản vào năm

2003 [115] Enzym này giúp vi khuẩn có khả năng đề kháng cao với hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside bao gồm mikacin, tobramycin, kanamycin

và gentamicin

1.2.5.4 Sản sinh enzym phân hủy kháng sinh

Biểu hiện β-lactamase là cơ chế kháng phổ biến nhất của P aeruginosa đối

với kháng sinh họ β-lactam [102] β-lactamase có thể thủy phân bốn thành viên của kháng sinh họ β-lactam bao gồm carbapenem, penicillin, cephalosporin và monobactam Theo phân loại dựa trên chuỗi axit amin, β-lactamases được chia

22

thành các enzym lớp A, C và D, sử dụng dư lượng serine để thủy phân vòng lactam và các enzym loại B MLBs (metallo-β-lactamase), trong đó sự thủy phân carbapenem đòi hỏi phải có Zn2+ [18]

β-Các enzym ESBLs (Extended spectrum Beta-lactamase) lớp A có khả năng

ly giải nhiều loại kháng sinh, không chỉ đối với carboxypenicillin và ureidopenicillin mà còn có thể mở rộng phổ kháng tới cephalosporin (ceftazidime, cefepime, cefpirome) và aztreonam [113] Hoạt động của những enzym này bị ức chế bởi acid clavulanic và tazobactam [74] Các enzym thuộc nhóm này được phát

hiện ở P aeruginosa trong các chủng phân lập từ lâm sàng sau năm 1990 Ngoài những enzym TEM, SHV thường được biết đến trong họ Enterobacteriaceae, ở P

aeruginosa còn xuất hiện những enzym hiếm gặp như PER, VER, GES, BEL Từ

giữa năm 1992 đến 1998 ở Pháp, các enzym TEM đươ ̣c phát hiê ̣n nhiều ở các chủng

P aeruginosa phân lập bao gồm: TEM- 42, TEM-4, TEM-21 và TEM-24 [26, 65,

72, 84] PER-1 được mã hóa bởi gen nằm trên NST và được tìm thấy lần đầu tiên ở Pháp vào năm 1991 trong một chủng phân lập từ nước tiểu trên bệnh nhân ở Thổ Nhĩ Kỳ [75], và sau đó nó cũng được tìm thấy ở nhiều nước khác như Ý, Bỉ và Ba Lan [62, 75] Enzym β-lactam VEB-1 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1998 ở Pháp [73]; sau đó Girlich tìm thấy một gen có tỷ lệ tương đồng cao (93%) với gen

mã hóa blaVEB trong các chủng P aeruginosa lâm sàng kháng ceftazidime ở Bệnh

viện Đại học ở Thái Lan, gen này được gọi là VER-2 [39] Vào cuối thế kỉ 20,

GES-1 và GES-2 đã được tìm thấy ở Pháp, Brazil và Nam Phi [2GES-1, 27, 85] GES-GES-1 có hoạt tính thấp và thường bị ức chế bởi các chất như axit clavulanic và imipenem

Metallo-beta-lactamase nhóm B (MBLs) có khả năng ly giải hầu hết các kháng sinh phổ rộng bao gồm: penicillin, cephalosporin và carbapenem, tuy nhiên các vi khuẩn sinh enzym này còn nhạy cảm với aztreonam EDTA có thể ức chế các enzym thuộc nhóm B thông qua viê ̣c ức chế Zn2+ tham gia vào quá trình hoạt hóa enzym Các enzym MBLs thường gặp nhất được phát hiện trên các chủng vi khuẩn

P aeruginosa bao gồm: IMP, VIM, SPM, GIM

23

IMP-1 được phát hiện lần đầu tiên trên các chủng P aeruginosa tại Nhật Bản

trong một nghiên cứu quy mô lớn về các chủng phân lập lâm sàng kháng carbapenem trong giai đoạn 1992-1994 [96] Sau đó, nhiều báo cáo khác nhau trên thế giới cũng công bố viê ̣c phát hiện được gen này Vào năm 2004, Koh và cộng sự

đã báo cáo sự có mặt của IMP-1 trong số các chủng P aeruginosa kháng

carbepenem phân lập ở hai bệnh viện ở Singapore [51] Từ năm2000 đến năm 2001, các biến thể khác của IMP được tìm thấy ở nhiều loại vi khuẩn Gram âm khác nhau

trên toàn thế giới blaIMP-7 được xác định trong các chủng P aeruginosa ở Canada

[38] và Singapore và blaIMP-9 được tìm thấy ở Trung Quốc và blaIMP-13 ở Ý [77,

114] Năm 2002, IMP-16 được tìm thấy trong chủng P aeruginosa từ Brazil, được

mã hóa bởi gen nằm trên nhiễm sắc thể và nằm trong integron, mang gen mã hóa cho các enzym biến đổi aminoglycoside [67] Hiện nay có khoảng 58 loại enzym

thuộc nhóm IMP được xác định ở P aeruginosa có khả năng ly giải carbapenem

được phát hiện tại nhiều quốc gia như Australia, USA, Canada và một số nước Châu Âu

Enzym VIM là một trong số enzym thuộc MBLs được phát hiện nhiều nhất

trên các chủng P aeruginosa Tính đến nay có khoảng 51 biến thể của VIM được tìm thấy, trong đó VIM-2 được mô tả rộng rãi ở P aeruginosa Mặc dù gen

blaVIM-2 được phát hiện lần đầu tiên ở Pháp vào năm 2000 [83], ghi chép sớm nhất

về gen này lại được thực hiện ở Bồ Đào Nha năm 1995 [20] Hầu hết các vi khuẩn mang VIM-2 có khả năng kháng với nhiều dòng kháng sinh và mang các cơ chế

kháng khác nhau Gen blaVIM-2 được tìm thấy trên vi khuẩn ở nhiều quốc gia trên thế giới Một vụ dịch lớn do MDR P aeruginosa sản xuất VIM-2 gây ra đã được

báo cáo ở miền Nam châu Âu, đặc biệt là ở Tây Ban Nha và Hy Lạp [108] Bên cạnh đó, enzym VIM-2 này cũng đã được báo cáo ở các nước có mức độ kháng carbapenem ở mức độ thấp bao gồm Thụy Điển, Đan Mạch và Na Uy [42, 93] Điều

đó cho thấy sự lây lan của của vi khuẩn mang gen blaVIM-2 là mối quan tâm lớn

đối với vấn đề vi khuẩn kháng carbapenem và các kháng sinh khác ở nhiều nước trên thế giới

24

Những enzym thuộc nhómβ-lactamases đã được phát hiện trong P

aeruginosa bao gồm: TEM, SHV, CTX-M và những loại hiếm như PER, VEB,

GES, IBC và BEL, ngoài ra còn có các MLBs làm giảm độ nhạy của tất cả các kháng sinh carbapenem như IMP, VIM, SPM, GIM Trong số này, đáng chú ý là AmpC, một β-lactamase thuộc lớp C được mã hóa bởi gen trên NST có thể thủy phân hầu hết các β-lactam và không bị ức chế bởi các chất ức chế β-lactamase hiện

có, gen này thường xuất hiện đột biến và có khả năng thay đổi biểu hiện nhanh chóng dưới tác động của môi trường dẫn tới sự đáp ứng kháng kháng sinh kịp thời cho sự sống còn của vi khuẩn [15] Enzym này thường được sản xuất với số lượng thấp trong vi khuẩn và đồng thời có khả năng thủy phân các aminopenicillin và

phần lớn các cephalosporin thế hệ đầu Tuy nhiên, hoạt tính cephalosporinase ở P

aeruginosa có thể tăng từ 100 đến 1000 lần do sự cảm ứng với β -lactam (đặc biệt là

imipenem) P aeruginosa cũng thu nhâ ̣n các gen nằm trên plasmid mã hoá các

enzym biến đổi kháng sinh nhóm aminoglycoside, bằng cách gắn các gốc phosphate, acetyl hoặc adenyl vào vùng ngoại vi của phân tử kháng sinh, do đó làm giảm khả năng liên kết của kháng sinh với đích tác đô ̣ng

1.2.5.5 Cơ chế kháng bằng việc hình thành màng sinh học-biofilm

Màng biofilm là một cấu trúc chung của các tế bào vi khuẩn bám dính vào nhau bên trong lớp màng cao phân tử ngoại bào và bám dính vào một bề mặt trơ

hoặc bề mặt vật sống Màng biofilm bảo vệ P aeruginosa khỏi những biến đổi của

môi trường và là một yếu tố giao tiếp nội bào Trong màng sinh học có mật độ tập trung vi khuẩn cao và có khả năng loại trừ các tác dụng vật lý của thuốc kháng sinh

1.2.6 Tình hình kháng kháng sinh của P aeruginosa

1.2.6.1 Tình hình kháng kháng sinh của P aeruginosa trên thế giới

Sự gia tăng tính k háng kháng sinh trong nhiễm khuẩn P aeruginosa là vấn

đề đáng lo nga ̣i đối với sức khoẻ cộng đồng toàn cầu, đặt ra nhiều thách thức về mặt điều trị Đặc biệt, những năm gần đây đã có nhiều phát hiện quan trọng về khả năng thích ứng của loại vi khuẩn này nhằm kháng lại các loại kháng sinh, điều này cho thấy loại vi khuẩn này là một mối đe dọa đến thời đại kháng sinh hiện nay của

25

chúng ta Ngoài ra , đã có nhiều báo cáo về sự xuất hiện của các chủng P

aeruginosa có khả năng kháng lại nhiều kháng sinh, do vậy cần phải giám sát chặt

chẽ và nhanh chóng đưa ra các hành động cụ thể nhằm ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn này trên hệ thống y tế toàn thế giới

Theo báo cáo của hệ thống giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia tại Mỹ,

P aeruginosa đứng thứ hai trong số các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện liên

quan đến bệnh viêm phổi Tỷ lệ ca nhiễm khuẩn bệnh viện do P aeruginosa gây ra

đã tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới Cùng với sự gia tăng về tỷ lệ nhiễm khuẩn là sự gia tăng về khả năng kháng kháng sinh Tốc độ xuất hiê ̣n khả năng kháng của vi khuẩn này với các nhóm kháng sinh cũng tăng nhanh và lan rộng

ở hầu hết các cơ sở y tế trên toàn cầu Theo dữ liệu từ các nước châu Âu, bao gồm

hệ thống giám sát kháng kháng sinh (EARSS, hiện nay là EARS-Net), cho thấy xu

hướng ngày càng tăng về tỷ lệ kháng carbapenem của chủng P aeruginosa thay đổi

từ 4,4% đến 58,5% giữa các nhóm quốc gia khác nhau Tại Litva, tỷ lệ nhiễm các chủng kháng carbapenem cũng tăng từ 21% lên 29% trong giai đoạn 2006-2014 [47] Theo báo cáo mới nhất của CDC Hoa Kỳ, ước tính có hơn hai triệu người bị bệnh mỗi năm, ít nhất 23.000 người chết do vi khuẩn kháng kháng sinh và có

khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P aeruginosa Trong đó, hơn 6.000 ca

(13%) là đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng [24] Tại Vương quốc Anh, theo nghiên cứu của Pitt TL vào năm 2003, cho thấy 50% số

chủng P aeruginosa kháng gentamicin, 39% kháng ceftazidime, 32% kháng

piperacillin và 30% kháng ciprofloxacin [82] Trong công bố của Sheetal Sharma

vào năm 2016, tỉ lệ P aeruginosa kháng với ciprofloxacin, ceftriaxone, piperacillin,

cefoperazone tương ứng là 31,74%; 76,6%; 53,96%; 36,5% [98]

Sự nổi lên của các chủng MDR P aeruginosa thường xảy ra ở bệnh nhân

điều tri ̣ ta ̣i các Khoa hồi sức tích cực (ICU) Manian và cộng sự đã phân tích tỷ lệ

kháng thuốc giữa các chủng P aeruginosa được phân lập từ ICU, thấy rằng tỷ lệ

kháng penicillin và cephalosporin thường liên quan đến việc trước đó bệnh nhân đã điều trị với cephalosporin thế hệ thứ ba [63] Nhìn chung, tỷ lệ vi khuẩn MDR ở

26

châu Âu là 5%, châu Á và Mỹ là 2%, trong khi tỷ lệ này ở Mỹ Latinh thường >8%

Một nghiên cứu về sự đề kháng của P aeruginosa đối với kháng sinh β-lactam cho

thấy, bệnh nhân điểu tri ̣ ta ̣i ICU có nguy kháng cao với imipenem, piperacillin/tazobactam và cefotaxime Theo nguồn dữ liệu thu thập được từ các

chủng P aeruginosa phân lập từ bệnh nhân tại các ICU ở châu Âu từ năm 1990 đến

năm 1999, tỷ lệ vi khuẩn MDR tương đối cao, như kháng ceftaidime đạt 57%, kháng aminoglycoside đạt 37-70%, kháng imipenem đạt 52%, kháng ciprofloxacin đạt 56% và kháng piperacillin/tazobactam đạt 53% [91] Theo báo cáo đã được công bố của Hệ thống Giám sát Nhiễm trùng Hoa Kỳ (NNIS) năm 2004, tỷ lệ kháng

của P aeruginosa đối với quinolone ở mức 29,5% và imipenem ở mức 21,1%

Trong các chủng phân lập đươ ̣c ta ̣i ICU, tỷ lệ kháng thuốc thậm chí còn tăng lên đến 23,6% đối với ceftazydime, 31,4% đối với piperacillin/tazobactam, 38% đối với imipenem và 51,6% đối với ciprofloxacin [104]

1.2.6.2 Tình hình kháng kháng sinh của P aeruginosa ở Việt Nam

Ở Việt Nam, dưới tác động của công cuộc đổi mới kinh tế vào đầu những thập niên 1990 đã dẫn tới sự bùng nổ của các nhà thuốc tư nhân, các thuốc kháng sinh có thể mua dễ dàng không cần đơn thuốc hay chỉ định của bác sỹ, điều này dẫn tới việc

sử dụng không đúng và lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam Đây là những yếu tố nguy

cơ quan trọng dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn ở Việt Nam

Hiện nay, khi bệnh truyền nhiễm vẫn chiếm một tỷ lệ lớn trong mô hình bệnh tật thì việc sử dụng kháng sinh một cách hiệu quả đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm tỷ lệ mắc và tử vong do các bệnh nhiễm khuẩn Tuy nhiên sự gia tăng tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến đến sức khỏe của người dân cũng như tổn thất về kinh tế

Ở khu vực miền Nam, tác giả Hoàng Doãn Cảnh, Vũ Lê Ngọc Lan và cộng

sự đã tiến hành khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh và xác định khả năng sản xuất

carbapenemase từ 28 chủng P aeruginosa phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm tại Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Kết quả cho thấy có 48,2% bệnh nhân nhiễm P

aeruginosa là những bệnh nhân lớn tuổi, chủ yếu từ 50 tuổi trở lên P aeruginosa

27

kháng lại với hầu hết các kháng sinh với tỷ lệ khá cao (trên 40%), đặc biệt là tỷ lệ kháng khá cao với imipenem (46,2%) Chỉ một tỷ lệ nhỏ kháng lại colistin (10,7%)

và 17,9% số chủng P aeruginosa có khả năng sản xuất carbapenemase kháng lại

các kháng sinh thuộc nhóm carbapenem [1] Theo nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Tuấn

và cộng sự tại bệnh viện đa khoa thống nhất Đồng Nai cho thấy P aeruginosa đã

kháng trên 50% với hầu hết các kháng sinh, trừ colistin, cefoperazone/sulbactam, piperacillin/tazobactam [11] Ở Miền Bắc theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Phú

Hương Lan và cộng sự năm 2010 về mức độ kháng kháng sinh của P aeruginosa

tại Bệnh viên Nhiệt Đới cho thấy ở các loại mẫu khác nhau vi khuẩn này có tỉ lệ

kháng kháng sinh khác nhau Cụ thể đối với các chủng P aeruginosa phân lập được

từ dịch hút khí quản tỉ lệ kháng với các kháng sinh là từ 18-32% trong đó cefatazidin là 31%, ciprofloxacin là 28%, piperacillin/tazobactam là 31%, amikacin

là 25%, trừ imipenem và meropenem còn tương đối thấp là 4,1% và 1,4% Trong

khi đó các mẫu cấy máu dương tính với P aeruginosa vẫn còn nhạy với các kháng

sinh thường dùng Các kháng sinh như cefatazidin, ciprofloxacin, amikacin đều

nhạy cảm hoàn toàn với các chủng P aeruginosa gây nhiễm trùng huyết [8] Một

nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc trong năm 2006–2007 bao gồm 2 bệnh viện Trung ương, 17 bệnh viện tuyến tỉnh, 17 bệnh viện tuyến huyện cho thấy 553/7571 (7,8%) bệnh nhân bị nhiễm trùng bệnh viện Có 3 loại nhiễm khuẩn chính: viêm phổi (41,9%), nhiễm khuẩn vết mổ (27,5%), nhiễm khuẩn tiêu hóa

(13,1%) Căn nguyên chính là A baumannii (23,3%) và P aeruginosa (31,5%) [7]

Theo kết quả nghiên cứu từ 4 bệnh viện tại Hà Nội: Việt Đức, Xanh Pôn, Bệnh viện

108 và Bệnh viện 103 từ năm 2005 -2008 cho thấy P aeruginosa phân lập từ các

bệnh phẩm đề kháng rất cao với các loại kháng sinh như tetracycline (92,1%), ceftriaxone (58,5%) và gentamicin (54%) [3]

1.2.7 Các kĩ thuật thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh của P aeruginosa

1.2.7.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch

Nguyên lý: kháng sinh trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueller- hinton đã cấy các chủng vi khuẩn thử nghiệm Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với

28

kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh [32] Tuy nhiên kỹ thuật là chỉ phát hiện được mức độ nhạy cảm nồng độ kháng sinh đã biết trước, nhưng đây là kỹ thuật đơn giản và giá thành rẻ nên hiện vẫn được sử dụng phổ biến tại các quốc gia đang phát triển để điều trị và giám sát dịch tễ học

1.2.7.2 Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch Mueller-hinton hoặc canh thang có chứa nồng độ kháng sinh khác nhau Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được xác định khi mật độ khuẩn lạc ≤3 Đây là kỹ thuật chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả giúp các bác sỹ lựa chọn và tính toán liều kháng sinh cho bệnh nhân [23] Tuy nhiên kỹ thuật này có giá thành cao, phức tạp, đầy đủ trang thiết bị và cán bộ có kinh nghiệm để thực hiện

1.2.7.3 Kỹ thuật E-test

Kỹ thuật E-test được sử dụng rộng rãi tại các quốc gia phát triển Thanh giấy kháng sinh E-test chứa các phổ kháng sinh có các nồng độ kháng sinh khác nhau được đặt lên đĩa thạch đã được trải huyền dịch vi khuẩn, khả năng ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp nhất sẽ được phát hiện ở phổ kháng sinh (điểm gãy) dựa vào đó các bác sỹ có thể tính toán liều điều trị phù hợp cho bệnh nhân [23]

1.2.8 Các kĩ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gen của P aeruginosa

1.2.8.1 Kĩ thuật RAPD-PCR (Random amplified polymorphic ADN

fingerprinting)

Đây là phương pháp đơn giản xác định nhanh chóng kiểu hình của các loại vi khuẩn Nguyên lý: sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên đơn có kích thước ngắn khoảng 10 nucleotide, qua chu trình nhiệt của phản ứng PCR các đoạn mồi này có thể gắn vào nhiều vị trí khác nhau của ADN để khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn gen của vi khuẩn có kích thước từ 100-1000bp Dựa vào sự khác nhau của các đoạn ADN của các chủng có thể so sánh mối liên quan của các chủng vi khuẩn trong các nghiên cứu dịch tễ học [88] RAPD-PCR là kỹ thuật đơn giản, có khả năng phân

29

loại nhanh và tốt hơn so với phương pháp phân loại kinh điển, tuy nhiên kỹ thuật này chỉ định loại được vi khuẩn ở mức độ giới hạn khi so sánh với kỹ thuật PFGE

1.2.8.2 Kĩ thuật điện di xung trường (PFGE)

Nguyên lý: Kỹ thuật được sử dụng để phân loại và xác định nguồn gốc của các loại vi khuẩn Kỹ thuật này sử dụng những enzym giới hạn phù hợp để cắt ADN nhiễm sắc thể thành những phân đoạn không đều (10 đến 30 vạch ADN), các phân đoạn ADN này sẽ được điện di để phân tách các phân đoạn từ 1kb đến 1000kb Quá trình phân tích dựa trên sự so sánh các đoạn ADN của các chủng vi khuẩn để xác định mối liên quan và nguồn gốc của các chủng vi khuẩn ở các vùng và thời gian khác nhau PFGE là kỹ thuật sinh học phân tử được các nhà khoa học sử dụng để nghiên cứu và đánh giá sự lây truyền của các vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện và cộng đồng Ở Việt Nam, kỹ thuật PFGE được sử dụng để phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh như phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng đa kháng sinh [107]

1.2.8.3 Kĩ thuật phân loại trình tự đa vị trí (Multi Locus Sequence MLST)

Typing-Kỹ thuật phân loại trình tự đa vị trí (MLST) được đánh giá kỹ thuật tốt để

phân loại kiểu gen của nhiều loại vi khuẩn như: Streptococcus pneumoniae, S

aureus và A baumannii Nguyên lý của kỹ thuật này là dựa vào các trình tự gen của

các vùng bảo tồn của 7 loại gen giữ nhà của từng loại vi khuẩn để phân loại kiểu gen của vi khuẩn Ví dụ, Gomila và cộng sự đã sử dụng kĩ thuật này để phân loại

trình tự gen của P aeruginosa dựa trên 7 vùng gen bảo tồn bao gồm: acsA (Acetyl coenzym A synthetase), aroE (Shikimate dehydrogenase), guaA (GMP synthase),

mutL (DNA mismatch repair protein), nuoD (NADH dehydrogenase I chain C, D), ppsA (Phosphoenolpyruvate synthase) và trpE (Anthralite synthetase component I)

[40] Kỹ thuật MLST được đánh giá để phân loại kiểu gen tốt hơn kỹ thuật PFGE và

là một trong rất ít các kỹ thuật được gọi là ―thư viện‖ để xắp xếp, phân loại và được

sử dụng trong các nghiên cứu dịch tễ học của các chủng vi khuẩn, qua đó có thể xác

30

định các chủng gây dịch, kháng kháng sinh, hay sinh độc tố nhằm giám sát sự lây truyền của chúng trong phạm vi quốc gia và trên thế giới

1.2.8.4 Kĩ thuật giải trình tự gen

Đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để giải trình tự các gen kháng kháng sinh, đặc biệt là phân tích các plasmid mang gen kháng kháng sinhcủa vi khuẩn Đây là phương pháp chính xác nhất để xác định các đặc tính kháng kháng sinh của

vi khuẩn

Phương pháp giải trình tự gen của Sanger bằng điện di mao quản vẫn luôn được coi là chuẩn vàng trong các phương pháp giải trình tự gen hiện nay Trong lĩnh vực nghiên cứu về kháng kháng sinh, phương pháp này chủ yếu được sử dụng

để giải trình tự các gen kháng vì các gen này thường có kích thước < 2 kb Tuy nhiên với nhu cầu tìm hiểu cấu trúc của các yếu tố di truyền di động (4 ~ 10 kb) hay các plasmid mang gen kháng có kích thước từ vài chục đến hàng trăm kb thì phương pháp này lại không đáp ứng được

Hiện nay, đã có nhiều bước đột phá trong kỹ thuật giải trình tự gen như kỹ thuật ―next-generation sequencing‖ với đỉnh cao là phương pháp Whole Genome Sequence - WGS cho phép giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn một cách nhanh chóng trong một lần giải mã so với hệ thống giải mã trình tự cũ (chỉ giải mã được 35-700bp) Đây là kỹ thuật hữu hiệu để nghiên cứu dịch tễ học cũng như các đặc tính sinh học phân tử, độc tố hay các đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Qua

đó có thể đưa ra các biện pháp phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh một cách có hiệu quả

1.3 Tính mới, tính thời sự và ý nghĩa khoa học của nghiên cứu

P aeruginosa là một trong số những tác nhân nhiễm khuẩn bệnh viện hàng

đầu và cực kì nguy hiểm do mức độ đề kháng kháng sinh mạnh Có nhiều cơ chế

kháng kháng sinh đã được tìm thấy ở P aeruginosa Đặc biệt, hệ genome của P

aeruginosa nằm trong số những vi khuẩn có kích thước hệ gen lớn nhất với 6,26

Mbp chứa khoảng 5567 gen, cộng thêm một số lượng lớn các gen có thể được truyền ngang giữa các vi khuẩn làm cho vi khuẩn này có khả năng thích nghi rất cao

31

với những biến động của môi trường bao gồm áp lực do kháng sinh Do vậy, P

aeruginosa được tổ chức Y tế thế giới xếp vào nhóm vi khuẩn ưu tiên số 1 trong

giai đoạn hiện nay

Việt Nam nằm trong khu vực châu Á được xem là "điểm nóng" của vi khuẩn kháng kháng sinh Nhận thức sâu sắc được tầm quan trọng vấn đề này, trong những năm vừa qua, Bộ Y tế cùng các ban ngành liên quan đang phối hợp triển khai các hoạt động phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh, tích cực tham gia vào các hoạt động phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh với các tổ chức, quốc gia trên thế

giới như Liên Hiệp Quốc (2016), nhóm G20 (2017), các quốc gia ASEAN (2017)

P aeruginosa là căn nguyên thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện ở Việt Nam và

đã kháng lại kháng sinh trong các bệnh viện ở mức độ cao Ở Việt Nam, phần lớn các nghiên cứu chỉ tập trung vào tỷ lệ kháng kháng sinh/ đa kháng kháng sinh của

P aeruginosa, chưa có nhiều nghiên cứu sâu về kiểu gen, xác định nguồn gốc để

đánh giá khả năng lây lan của các chủng P aeruginosa trong bệnh viện Có thể kể đến nghiên cứu sâu về hệ gen của Tada và cộng sự trên một số chủng P aeruginosa

phân lập tại bệnh viện Bạch Mai Tuy nhiên nghiên cứu này không được thực hiện tại Việt Nam mà được tiến hành tại phòng thí nghiệm ở các quốc gia đang phát triển [114]

Tính đa kháng kháng sinh của P aeruginosa đã gây ra nhiều khó khăn trong

quá trình điều trị các ca bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra cũng như làm tăng

tỉ lệ bệnh tật, tăng tỉ lệ tử vong và tăng chi phí điều trị Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu ở các mức độ khác nhau, từ các phương pháp truyền thống tới các kĩ thuật sinh học phân tử chuyên sâu để đánh giá tình trạng kháng kháng sinh, đặc

điểm dịch tễ học cũng như hệ gen của P aeruginosa Mỗi kỹ thuật đều có các điểm

mạnh và hạn chế khác nhau như đã trình bày ở mục 1.2.7 Do vậy việc vận dụng các

kỹ thuật sinh học phân tử phù hợp cho từng nghiên cứu cần cân nhắc đến mục tiêu, kết quả cần đạt được, phù hợp với kinh phí và điều kiện của từng quốc gia Kĩ thuật PFGE được coi là một trong các kỹ thuật hữu ích trong việc phân loại dịch tễ học, xác định nguồn gốc vi khuẩn Phương pháp này có giá cả vừa phải và cách tiến