Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến bằng kỹ thuật PCR-SSO để định hướng ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh Thalassemia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---***--- LÊ XUÂN THỊNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÒA HỢP HLA GIỮA BỆNH NHÂN VÀ NGƯỜI HIẾN BẰNG KỸ THUẬT PCR-SSO ĐỂ ĐỊNH HƯỚNG GHÉP T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

LÊ XUÂN THỊNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÒA HỢP HLA GIỮA BỆNH NHÂN VÀ NGƯỜI HIẾN BẰNG KỸ THUẬT PCR-SSO ĐỂ ĐỊNH HƯỚNG GHÉP TẾ BÀO GỐC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH THALASSEMIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

LÊ XUÂN THỊNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÒA HỢP HLA GIỮA BỆNH NHÂN VÀ NGƯỜI HIẾN BẰNG KỸ THUẬT PCR-SSO ĐỂ ĐỊNH HƯỚNG GHÉP TẾ BÀO GỐC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH THALASSEMIA

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS BS Trần Ngọc Quế

2 PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân

HÀ NỘI 12/2017

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn, em đã nhận được nhiều sự chỉ bảo tận tình, sự giúp đỡ to lớn đầy trách nhiệm và tình cảm từ các Thầy, Cô, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình, đặc biệt những bệnh nhân, những người hiến tế bào gốc máu dây rốn đã cho em những số liệu quý giá Với tình cảm và sự biết ơn sâu sắc,

em xin kính gửi lời cảm ơn trân trọng đến:

- Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học, khoa Sinh học và Bộ môn Di truyền học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

- Ban Giám đốc Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian công tác và học tập

Em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, Trưởng Bộ môn Di truyền học cùng toàn thể các Thầy, Cô trong bộ môn, những người Thầy nhiệt huyết đã dành cho em những tình cảm tốt đẹp, những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS.BS Trần Ngọc Quế, Giám đốc Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học -Truyền máu Trung ương; người Thầy, người Lãnh đạo luôn bên cạnh em, động viên em những lúc khó khăn hết lòng giúp đỡ, chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn em trong suốt thời gian công tác, học tập và làm luận văn

Em xin trân trọng cảm ơn tập thể Ngân hàng Tế bào gốc, khoa Di truyền sinh học phân tử, Trung tâm Thalassemia và nhiều khoa phòng khác đã luôn tạo điều kiện cho

em trong quá trình công tác, học tập cũng như quá trình hoàn thành luận văn

Em xin trân trọng cảm ơn các bạn học viên K24 về sự gắn bó, chia sẻ với em những khó khăn vất vả và những thành công trong học tập

Em xin trân trọng cảm ơn và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những bệnh nhân, người hiến tế bào gốc đã cho em những số liệu quý giá, nhờ đó mà bản luận văn của

em được hoàn thành

Nhân dịp này, em kính trọng tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Cha, Mẹ, Vợ, Con và các Anh, các Chị, các Em và những người thân trong gia đình, đã giành tất cả để em học tập, phấn đấu và trưởng thành trong cuộc sống và sự nghiệp

Xin cảm ơn tất cả bạn bè đã dành cho em nhiều sự giúp đỡ quý báu

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2017

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Kháng nguyên hệ bạch cầu người 3

1.1.1 Khái niệm human leukocyte antigen 3

1.1.2 Danh pháp 3

1.1.3 Hệ thống HLA 4

1.1.4 Chức năng của HLA 8

1.1.5 Phân bố gen HLA trong cơ thể 9

1.1.6 Kỹ thuật định danh HLA 9

1.2 Tế bào gốc 15

1.2.1 Khái niệm tế bào gốc 15

1.2.2 Tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi 15

1.2.3 Tế bào gốc từ máu dây rốn 16

1.3 Ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia 17

1.3.1 Bệnh thalassemia 17

1.3.2 Ghép tế bào gốc 18

1.4 Nghiên cứu hòa hợp HLA ở Việt Nam và trên Thế giới 19

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Thiết bị 21

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 21

2.3.2 Các bước tiến hành nghiên cứu 21

2.3.3 Chỉ số nghiên cứu 25

2.3.4 Xử lý số liệu 25

2.3.5 Đạo đức nghiên cứu 25

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 27

3.1.1 Đặc điểm đối tượng bệnh nhân 27

3.1.2 Đặc điểm đối tượng người hiến cùng huyết thống 29

3.1.3 Đặc điểm đối tượng người hiến không cùng huyết thống 30

3.2 Kết quả xác định HLA của bệnh nhân, người hiến 32

3.2.1 Kết quả xác định các alen của locus HLA-A 32

3.2.2 Kết quả xác định các alen của locus HLA-B 35

3.2.3 Kết quả xác định các alen của locus HLA-DRB1 37

3.3 Nhận xét về mức độ hòa hợp HLA bệnh nhân và người hiến 40

3.3.1 Kết quả tìm kiếm cho bệnh nhân có người hiến cùng huyết thống 40

3.3.2 Kết quả tìm kiếm cho bệnh nhân không có người hiến cùng huyết thống từ Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng 42

KẾT LUẬN 45

KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Tài liệu Tiếng Việt 47

Tài liệu Tiếng Anh 48 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Số alen HLA phát hiện được 5

Bảng 1.2: Một số đặc điểm và phân bố gen HLA trong cơ thể 9

Bảng 3.1: Đặc điểm của bệnh nhân có chỉ định ghép 27

Bảng 3.2: Đặc điểm của người hiến cùng huyết thống 29

Bảng 3.3: Kết quả định lượng của ADN tách từ mẫu tế bào ối 30

Bảng 3.4: Đặc điểm chung của đơn vị MDR 30

Bảng 3.5: Đặc điểm thể tích và tế bào có nhân của đơn vị MDR 31

Bảng 3.6: Tỷ lệ gặp các alen HLA-A của bệnh nhân 32

Bảng 3.7: Tỷ lệ gặp các alen HLA-A của người hiến 33

Bảng 3.8: Tỷ lệ gặp các alen HLA-A của máu dây rốn cộng đồng 33

Bảng 3.9: Tỷ lệ % một số alen HLA-A hay gặp ở một số quần thể 34

Bảng 3.10: Tỷ lệ gặp các alen HLA-B của bệnh nhân 35

Bảng 3.11: Tỷ lệ gặp các alen HLA-B của người hiến 35

Bảng 3.12: Tỷ lệ gặp các alen HLA-B của máu dây rốn cộng đồng 36

Bảng 3.13: Tỷ lệ % một số alen HLA-B hay gặp ở một số quần thể 36

Bảng 3.14: Tỷ lệ gặp các alen HLA-DRB1 của bệnh nhân 37

Bảng 3.15: Tỷ lệ gặp các alen HLA-DRB1 của người hiến 38

Bảng 3.16: Tỷ lệ gặp các alen HLA-DRB1 của máu dây rốn cộng đồng 38

Bảng 3.17: Tỷ lệ % một số alen HLA-DRB1 hay gặp ở một số quần thể 39

Bảng 3.18: Kết quả tìm kiếm giữa bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống 41

Bảng 3.19: Số mẫu máu dây rốn cùng huyết thống được lưu trữ 41

Bảng 3.20: Tỷ lệ người hiến cùng huyết thống hòa hợp HLA của bệnh nhân 42

Bảng 3.21: Tỷ lệ tìm thấy đơn vị MDR hòa hợp HLA 42

Bảng 3.22: Số mẫu máu dây rốn trung bình hòa hợp HLA tìm kiếm được 43

Bảng 3.23: Số mẫu máu dây rốn hòa hợp HLA đủ liều tế bào tối thiểu 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc tên HLA 4

Hình 1.2 Bản đồ vùng gen mã hoá HLA 5

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử HLA lớp I và lớp II 6

Hình 1.4 Kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể 9

Hình 1.5 Kỹ thuật PCR-SSP 10

Hình 1.6 Kỹ thuật PCR-SSO 11

Hình 1.7 Hạt nhựa được nhuộm với chất màu huỳnh quang 13

Hình 1.8 Hệ thống đọc Luminex 13

Hình 1.9 Hệ thống cảm biến Luminex 14

Hình 1.10 Kỹ thuật giải trình tự dựa trên điện di 14

Hình 1.11 Phần mềm phân tích kết quả xác định alen của HLA 23

Hình 1.12 Sơ đồ các bước nghiên cứu 24

Hình 1.13 Biểu đồ đặc điểm dân tộc 28

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CD Cluster of differrenciation (Cụm kháng nguyên biệt hóa) CDC Complement dependent cytotoxicity

(Kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể) DMSO Dimethyl sulfoxide

G-CSF Granulocyte colony - stimulating factor

(Yếu tố phát triển dòng bạch cầu hạt) GVHD Graft-versus-host disease (Bệnh ghép chống chủ)

HH-TM TW Huyết học - Truyền máu Trung ương

HLA Human leukocyte antigen (Kháng nguyên bạch cầu người) HST Huyết sắc tố

KN-KT Kháng nguyên - kháng thể

MCH Mean corpuscular hemoglobin

(Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu) MCV Mean corpuscular volume (Thể tích trung bình hồng cầu) MDR Máu dây rốn

MDRCĐ Máu dây rốn cộng đồng

NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) SBT Sequencing based typing (Định nhóm dựa trên trình tự)

SC Stem cells (Tế bào gốc)

SSO Sequence specific oligo - nucleotide

(Sợi oligonucleotid đặc hiệu trình tự) SSP Sequence - specific primer (Mồi đặc hiệu trình tự)

TBCN Tế bào có nhân

TSC Totipotent stem cells (Tế bào gốc toàn năng)

MỞ ĐẦU

Thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi globin và là bệnh di truyền phổ biến nhất Đông Nam Á và trên thế giới [14] Theo ước tính của Liên đoàn Thalassemia Thế giới, có khoảng 7% dân số mang gen bệnh thalassemia và hàng năm có khoảng 300.000 đến 400.000 trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia mức độ nặng [58] Ở Thái Lan

tỷ lệ người mang gen α-thalassemia là 14%, β-thalassemia từ 3-9%, HbE là 13% Với 1% dân số mang gen thì hàng năm có khoảng 12.000 trẻ sinh ra mắc căn bệnh này [68] Cũng theo ước tính trên, tại Việt Nam có khoảng 10% dân số mang gen bệnh này và mỗi năm có 20.000 đứa trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia [16] Người bệnh thalassemia phải điều trị thường xuyên bằng truyền máu, thải sắt và điều trị các biến chứng Chi phí điều trị bệnh thalassemia lớn làm kinh tế gia đình suy giảm, bệnh nhân trở thành gánh nặng cho xã hội và ảnh hưởng tới chất lượng giống nòi Hiện nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, tiến bộ của các phương pháp điều trị giúp cải thiện sức khỏe cho bệnh nhân thalassemia G ện

ghép tế bào gốc lấy nguồn từ anh/chị em ruột ngày càng tăng và cho kết quả cải thiện đáng kể trong ba thập kỷ qua [75, 76] Việc ghép thành công tế bào gốc đòi hỏi cần phải có nguồn cho tế bào gốc hòa hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA-Human leukocyte antigen) Các locus thường sử dụng để xác định sự hòa hợp trong ghép tế

bào gốc đồng loài bao gồm các locus quy định HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1

và HLA-DQB1, trong đó yêu cầu hòa hợp HLA đối với nguồn tế bào gốc là máu dây

rốn chỉ cần tối thiểu 4/6 locus HLA-A, HLA-B, HLA-DR ở độ phân giải cao [39]

Khả năng hòa hợp HLA của người nhận với người cho cùng huyết thống cao hơn so với người trong cộng đồng [75, 76] Trong gia đình càng có nhiều ngườ

ợc người cho hòa hợp ỷ lệ ghép thành công càng lớ

Tuy nhiên, đối với những trường

điều trị ghép gần như không còn Để giải quyết khó khăn này, nhiều trung tâm lớn trên Thế giới cũng như tại Việt Nam, Ngân hàng Tế bào gốc của Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã triển khai xây dựng Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng [11] Nguồn tế bào gốc này có một số ưu điểm nổi bật như sẵn có, thu thập dễ dàng, không ảnh hưởng đến sức khỏe của người hiến và đặc biệt là yêu cầu về hòa hợp HLA giữa người hiến và bệnh nhân không cao Chính vì vậy chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến bằng kỹ thuật PCR-SSO để định hướng ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia” với 2 mục tiêu:

1 Xác định được HLA của bệnh nhân thalassemia và người hiến tế bào gốc bằng

kỹ thuật RCR-SSO

2 Đánh giá được mức độ hòa hợp HLA của bệnh nhân thalassemia và người hiến để định hướng ghép tế bào gốc

Nội dung nghiên cứu gồm:

‐ Xác định HLA của bệnh nhân thalassemia có chỉ định ghép tế bào gốc và người hiến cùng huyết thống;

‐ Đánh giá mức độ hòa hợp HLA của bệnh nhân có người hiến cùng huyết thống với người hiến và của bệnh nhân không có người hiến cùng huyết thống với các đơn vị máu dây rốn cộng đồng

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng nguyên hệ bạch cầu người

1.1.1 Khái niệm human leukocyte antigen

HLA (Human Leucocyte Antigen) là tên gọi tắt quốc tế của kháng nguyên bạch cầu người Việc khám phá ra phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (Major Histocompatibility Complex - MHC) và vai trò của nó trong thải ghép, đáp ứng miễn dịch và cơ sở di truyền bệnh dẫn đến sự ra đời của một lĩnh vực khoa học mới là di truyền miễn dịch [60] Đây là lĩnh vực quan trọng không chỉ trong nghiên cứu y sinh học cơ bản mà còn trong y học lâm sàng Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu ở người là hệ thống kháng nguyên bạch cầu người được quy định bởi vùng gen nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6 (6p21) [61, 62]

HLA lần đầu tiên được phát hiện trên bề mặt tế bào bạch cầu nhờ vai trò trong thải ghép [71] Hiện nay khoa học đã chứng minh các protein của hệ thống gen HLA hiện diện trên bề mặt tế bào của đa số động vật có xương sống, kháng nguyên HLA tham gia vào nhiều công đoạn trong nhận diện miễn dịch bao gồm tương tác giữa các tế bào lympho khác nhau cũng như giữa các tế bào lympho với các tế bào trình diện kháng nguyên [60] Do vậy, việc xác định các kháng nguyên HLA hay định nhóm HLA (HLA typing) còn được gọi là định nhóm mô (tissue typing) [56]

1.1.2 Danh pháp

Theo Marsh SG và cộng sự (2010) danh pháp HLA như sau [69]:

Tên gen + dấu * + mã số alen + dấu : + mã số protein HLA riêng + dấu : + mã

số ADN tương ứng trong vùng mã hóa + dấu : + mã số ADN ngoài vùng mã hóa + Hậu tố:

- Hậu tố N: alen không được biểu hiện (Null);

- Hậu tố L: alen của protein biểu hiện ở bề mặt tế bào thấp hơn bình thường (Low);

- Hậu tố C: alen của protein ở trong tế bào chất chứ không ở bề mặt tế bào (Cytoplasm);

- Hậu tố A: khi nghi ngờ protein có được biểu hiện không (Aberrant);

- Hậu tố Q: alen có đột biến trước đó đã được chứng minh là có ảnh hưởng

đến việc biểu hiện trên tế bào nhưng chưa được xác nhận vị trí và vẫn còn nghi

vấn (Questionable)

Hình 1.1 Cấu trúc tên HLA [69]

Ví dụ: Khi viết alen HLA-A*11:01 thì có nghĩa là: locus HLA-A, alen 11, protetin 01

1.1.3 Hệ thống HLA

Dựa trên cấu trúc và chức năng, các kháng nguyên HLA được chia thành hai

lớp: HLA lớp I và HLA lớp II (Hình1.2) Kích thước tổng thể của hệ thống gen

HLA là khoảng 3,5 triệu cặp bazơ niơ [62] Trong đó, vùng gen HLA lớp I và lớp II

chiếm khoảng 1/3 mỗi loại Phần còn lại là vùng gen HLA lớp III mã hóa bổ thể,

hormon, xử lý peptide nội bào và một số chức năng khác Do đó, vùng gen HLA lớp

III không thực sự là một phần của hệ thống HLA, nhưng chúng nằm trong khu vực

HLA và có liên quan đến các chức năng của kháng nguyên HLA hoặc có cơ chế

kiểm soát tương tự như các gen HLA [60]

Cho tới nay, người ta đã biết khoảng 17330 alen của hệ thống HLA, các alen

này tạo ra kháng nguyên và phát hiện được bằng kháng thể đặc hiệu

Bảng 1.1: Số alen HLA phát hiện được (2017)

+ Loci A có 3997 alen + Loci DR có 2395 alen

+ Loci B có 4859 alen + Loci DP có 942 alen

+ Loci C có 3605 alen + Loci DQ có 1152 alen

Hệ thống HLA chia làm 3 lớp: Lớp I, II, III (Class I, Class II, Class III)

Class I: Có các nhóm (loci): ký hiệu là A, B, C, E, F, G, J… trong đó A, B, C

có vai trò quan trọng trong chức năng của lớp I

Class II: Có các nhóm DR, DQ, DN, DN, DP Trong đó, DR, DQ có vai trò

quan trọng trong chức năng của lớp II

Class III: Vùng của các thành phần tế bào và bổ thể: C2, C4, Bf, TNF α, TNF β

Hình 1.2 Bản đồ vùng gen mã hoá HLA [69]

 HLA lớp I

HLA lớp I gồm 3 locus chính là HLA-A, B, C, mã hóa cho các glycopeptide,

chúng biểu hiện trên bề mặt của hầu hết các tế bào có nhân của cơ thể Ngoài ra, chúng được tìm thấy ở dạng hòa tan trong huyết tương và được hấp phụ lên bề mặt của tiểu cầu Hồng cầu cũng hấp phụ kháng nguyên HLA lớp I ở mức độ khác nhau

tùy thuộc vào đặc trưng (ví dụ như HLA-B7, A28 và B57 được nhận biết trên hồng

cầu còn được gọi là kháng nguyên "Bg") Các nghiên cứu miễn dịch học chỉ ra rằng

nhất, tiếp theo là HLA-A và sau đó HLA-C Ngoài ra, HLA lớp I còn có các locus khác như HLA-E, F, G, H, J, K và L nhưng hầu hết trong số này không có vai trò

trong "trình diện peptide" [56]

Các kháng nguyên HLA lớp I bao gồm một chuỗi nặng glycopeptide xuyên màng (45 kDa) với ba domain (α1, α2, α3), liên kết không đồng hóa trị với một chuỗi nhẹ ngoại màng β2-microglobulin (12 kDa, mã hóa bởi một gen ngoài hệ thống HLA, không có tính đa hình) đóng một vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ cấu trúc của chuỗi nặng Các phân tử HLA lớp I được tổng hợp bên trong tế bào và cuối cùng định vị trên bề mặt tế bào với một phần ở lớp lipid kép của màng tế bào

và có một phần đuôi ngắn nằm trong tế bào chất [71]

Về mặt cấu trúc không gian, phân tử HLA lớp I tạo ra một khe có thể chứa được một peptide dài 9 axit amin Do sự đa hình của các locus lớp I, nhất là vùng

mã hóa domain α1 và α2, số peptide có thể tổ hợp được rất đa dạng lên tới 1011 [60]

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử HLA lớp I và lớp II [69]

Trong thực tế, nếu một tế bào bị nhiễm virus, các protein trong tế bào sẽ “cắt xén” virus thành các peptide nhỏ, sau đó những peptide được gắn vào khe liên kết của các phân tử HLA lớp I Vai trò của các phân tử HLA lớp I là trình diện những mảnh peptide (kháng nguyên) này trên bề mặt tế bào nhiễm cho tế bào T CD8 trong các

Phần ngoài màng

phản ứng miễn dịch (nhờ domain α3 tương tác với CD8) Các thụ thể trên tế bào T CD8 sẽ nhận diện phức hợp kháng nguyên - HLA lớp I, tạo ra tín hiệu đầu tiên để hoạt hoá các tế bào Ngoài ra phân tử CD8 và các cặp phân tử bám dính khác trên hai

tế bào này sẽ hoàn tất mối tương tác Kết quả là tế bào T CD8 sẽ được hoạt hoá, tiết

ra chất Perforin gây ly giải tế bào nhiễm [60] Vai trò quan trọng như vậy của HLA lớp I là lý do chúng cần có mặt trên tất cả các tế bào [56]

 HLA lớp II

HLA lớp II gồm HLA-DR, DQ, DP, cũng có bản chất glycopeptide Sự phân

bố của kháng nguyên HLA lớp II được giới hạn trên các tế bào "có thẩm quyền miễn dịch", bao gồm lympho B, đại thực bào, tế bào đuôi gai, các tế bào nội mô và lympho T đã hoạt hóa Trên các tế bào này, HLA lớp II không được biểu hiện thường xuyên mà được kích thích bởi các cytokine như interferon và trong ghép, điều này có liên quan đến tình trạng thải ghép cấp tính [60]

Phân tử HLA lớp II gồm hai chuỗi xuyên màng α (có hai domain α1, α2) và β (có hai domain β1, β2), đều được mã hóa bởi gen trong hệ thống HLA Khối lượng chuỗi α khoảng 33-35 kDa, chuỗi β khoảng 26-28 kDa [60] Tương tự như phân tử HLA lớp I, cấu trúc không gian của HLA lớp II tạo ra một khe có thể liên kết với một peptide kích thước 12-24 axit amin Các tế bào T liên kết với các phân tử HLA lớp II (nhờ domain β2), là những tế bào T CD4 Vi khuẩn, protein ngoại lai… được các tế bào lympho B, đại thực bào, tế bào đuôi gai thu tóm và xử lý thành các peptide kháng nguyên Phân tử HLA lớp II liên kết với peptide kháng nguyên này tạo phức hệ bộc lộ trên bề mặt các tế bào trình diện kháng nguyên Tế bào T CD4 nhận diện kháng nguyên thông qua thụ thể tế bào T tạo ra tín hiệu đầu tiên để hoạt hóa các tế bào Ngoài ra phân tử CD4 và các cặp phân tử bám dính trên cả hai tế bào sẽ hoàn tất mối tương tác Cuối cùng tế bào T CD4 hoạt hoá sản xuất các cytokin để tự kích hoạt và kích hoạt các tế bào hiệu ứng miễn dịch khác thực hiện chức năng tiêu diệt kháng nguyên [71]

1.1.4 Chức năng của HLA

HLA lớp I có chức năng hoạt hóa tế bào lympho T gây độc Trực tiếp tham gia vào phản ứng trung gian tế bào, tiêu diệt tế bào đích có kháng nguyên lạ đặc hiệu HLA lớp I có tác dụng tiêu diệt tế bào mang virus khi có peptid là virus trên bề mặt

tế bào và tiêu diệt tế bào ung thư HLA lớp I dùng để nhận diện kháng nguy

ế bào của cơ thể bị biến đổi

HLA lớp II tham gia hoạt hóa tế bào trình diện kháng nguyên Các kháng nguyên phân tử lớn từ bên ngoài vào cơ thể, đại thực bào ăn kháng nguyên này, rồi

xử lý kháng nguyên thành các mảnh nhỏ, các nhóm quyết định kháng nguyên sẽ chuyển lên màng tế bào, lắng đọng trên màng tế bào thực bào Thực bào lúc này trở thành tế bào trình diện kháng nguyên Tiếp theo tế bào trình diện kháng nguyên sẽ chuyển thông tin kháng nguyên cho tế bào miễn dịch (lympho T, B) HLA lớp II đóng vai trò quan trọ ạt hóa đại thực bào trong quá trình trình diện kháng nguyên, đồng thời tạo ra các cytokin và khuếch đại phản ứng miễn dịch của cơ thể

HLA lớp I và II hợp tác trong quá trình miễn dịch bao gồm cả ễn dịch và phản ứng kháng nguyên-kháng thể của miễn dịch tế bào (HLA lớp I với T-CD8) và miễn dịch thể dịch (HLA lớp II với T-CD4 và lympho B) Thiếu HLA tế bào miễn dịch sẽ không nhận biết được kháng nguyên, do đó khi ghép cơ quan tổ chức việc lựa chọn người cho tương đồng hệ HLA nhằm mục đích giảm nhận biết kháng nguyên lạ của tế bào miễn dịch thông qua hệ HLA [7]

HLA có ý nghĩa quan trọng trong ghép tế bào gốc và ghép tạng, hệ thống kháng nguyên bạch cầu HLA đóng vai trò rất quan trọng để tìm người cho hòa hợp HLA Sự không hòa hợp hoàn toàn sẽ gây ra hiện tượng thải ghép sớm và bệnh ghép chống chủ càng nhiều, mức độ hòa hợp HLA tối thiểu là 4/6 cơ thể có thể chấp nhận được, mức độ hòa hợp HLA càng ít thì nguy cơ đào thải ghép càng cao và ngược lại [51]

1.1.5 Phân bố gen HLA trong cơ thể

Bảng 1.2: Một số đặc điểm và phân bố gen HLA trong cơ thể

Phân bố trên các

tế bào

Tất cả các tế bào có nhân, nhưng chủ yếu là ở tế bào lympho B và T, bạch cầu hạt,

tiểu cầu

Có ở tế bào mono, lympho

B, tế bào dendritic, đại thực bào, lympho T hoạt hóa

Cấu trúc Chuỗi peptid lớn α

1.1.6 Kỹ thuật định danh HLA

Từ khi bắt đầu những ca ghép tủy (tế bào gốc: TBG) đồng loài đầu tiên, người

ta đã xác định sự hòa hợp HLA của người cho và người nhận [29] Các kỹ thuật đã

và đang được sử dụng để định nhóm HLA bao gồm:

 Kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể (complement dependent cytotoxicity test: CDC)

Hình 1.4 Kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể [78]

Đây là kỹ thuật đầu tiên định nhóm HLA được thực hiện từ những năm 1980 [78] Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý cơ bản của miễn dịch: sử dụng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với nhóm HLA và cho thêm vào đó bổ thể nên kỹ thuật này được gọi với tên vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể (complement dependent cytotoxicity-CDC)

Các tế bào có mang kháng nguyên HLA tương ứng với kháng thể đặc hiệu với

sự hiện diện của bổ thể Tế bào này sẽ bị gây độc và chết do sự hình thành phức hợp tấn công màng của bổ thể gắn vào kháng thể tương ứng Từ đó, ta có thể suy ra tế bào mang nhóm kháng nguyên nào Các kỹ thuật thuộc nhóm huyết thanh thường

chỉ cho kết quả tốt với định danh HLA nhóm I và dưới nhóm DR ở lớp II, còn khó khăn hơn với DQ Kỹ thuật này về cơ bản chỉ có thể xác định được nhóm HLA ở độ phân giải thấp với các protein chính đại diện cho alen HLA (ví dụ HLA-A*02)

 Kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi đặc hiệu - SSP (sequence - specific primer)

Hình 1.5 Kỹ thuật PCR-SSP [81]

Kỹ thuật PCR-SSP là kỹ thuật sử dụng các cặp mồi đặc hiệu với các gen cần quan tâm, thông qua phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen này và sau đó xác định sự có mặt của các đoạn gen đó thông qua điện di tren gel agarose [34, 81]

Kỹ thuật này được ứng dụng khá rộng rãi trong các trường hợp xác định hòa hợp ghép TBG tạo máu đồng loại với người cho cùng huyết thống, ghép tạng Tuy

nhiên một hạn chế của kỹ thuật là số lượng alen HLA phân tích không nhiều, do đó thường được sử dụng định nhóm HLA ở độ phân giải thấp [34]

 Kỹ thuật PCR sử dụng đầu dò đặc hiệu - SSO (sequence specific oligo - nucleotide)

Hình 1.6 Kỹ thuật PCR-SSO [81]

Cùng với sự ra đời của kỹ thuật Luminex với khả năng xử lý số lượng mẫu lớn, kỹ thuật PCR-SSO đã giúp cải thiện được đáng kể tính chính xác cũng như cho kết quả định nhóm HLA ở độ phân giải tốt hơn so với kỹ thuật PCR-SSP [29] Về nguyên lý, kỹ thuật này gồm các bước như sau:

DNA của mẫu được tách và ủ đoạn mồi đặc hiệu tương ứng với các gen HLA; sử dụng PCR để khuếch đại các gen này; sản phẩm PCR sau đó được ủ với các hạt nhựa đặc biệt Trên các hạt nhựa này có gắn các đoạn đầu dò DNA đặc hiệu với HLA ở độ phân giải cao đã biết và đồng thời mỗi loại hạt còn được mã hóa riêng bằng màu laser; sau khi lai, tiến hành chạy các hạt nhựa này trên máy đọc

để xác định các hạt nhựa có gắn với sản phẩm PCR; thông qua mã màu để xác định tên hạt nhựa nào có gắn sản phẩm PCR, qua đó biết được tên đầu dò DNA gắn trên hạt nhựa đó và tìm ra HLA của mẫu đó

Nhờ số lượng hạt nhựa có thể mã hóa tối đa lên đến tối đa 100 loại khác nhau,

quyết được khó khăn của PCR-SSP, đó là phân tích được nhiều gen HLA hơn và độ phân giải được nâng cao hơn.Thường kết quả định nhóm HLA của xét nghiệm này

có độ phân giải từ trung bình đến cao với mức chi tiết từ 4 chữ số trở lên (ví dụ:

A*02:03) so với độ phân giải thấp cho kết quả 2 chữ số của các xét nghiệm khác

như HLA-SSP (ví dụ A*02) Với kết quả độ phân giải ở mức trung bình, xét nghiệm

này là đủ để áp dụng cho việc tìm kiếm người cho có nguồn tế bào gốc đòi hỏi mức

độ hòa hợp vừa phải như máu dây rốn

Hệ thống Luminex là một hệ thống phân tích dựa trên nguyên lý Flow cytometry được thiết kế để đáp ứng nhu cầu của mọi labo nghiên cứu Hệ thống cho phép thực hiện tới 100 phân tích trong một giếng đơn và với lượng mẫu cần dùng rất nhỏ

Hệ thống Luminex là sự kết hợp của 3 công nghệ xMAP then chốt Thứ nhất

là hệ thống vi hạt xMAP, là các hạt nhựa polystyren 5.6 micron, được nhuộm huỳnh quang và hoạt động với vai trò là chất chỉ thị cũng như là bề mặt cứng (giá đỡ) để thực hiện xét nghiệm Thứ 2 là thiết bị Flow cytometry, còn gọi là máy phân tích Luminex, có tích hợp các thành phần để nhận biết xMAP như hệ thống laser, quang học, dịch lỏng và bộ xử lý tín hiệu kỹ thuật số Thứ ba là xét nghiệm thực hiện dựa trên hạt nhựa đó [82]

 Công nghệ xMAP

Công nghệ xMAP sử dụng hạt nhựa polystyren 5.6 micron được nhuộm sẵn với chất màu huỳnh quang đỏ và hồng ngoại Sử dụng những tỷ lệ khác nhau của 2 loại màu này ta sẽ tạo ra được khoảng 100 loại hạt nhựa Mỗi hạt sẽ khác biệt với phổ tín hiệu riêng tùy thuộc vào tỷ lệ trộn lẫn của 2 loại màu này Vì mỗi hạt có một tín hiệu khác nhau nên hệ thống phân tích xMAP có thể xác định được nguồn gốc của nó Do đó, có thể thực hiện tới khoảng 100 xét nghiệm cùng lúc [82]

Hình 1.7 Hạt nhựa được nhuộm với chất màu huỳnh quang [82]

 Hệ thống đọc Luminex

Hệ thống này bao gồm 2 đèn laser, hệ thống dịch lỏng, hệ thống xử lý tín hiệu số để phân biệt được tới 100 loại hạt có mã hóa màu khác nhau, mỗi loại sẽ dành cho một xét nghiệm Hệ thống đọc là công cụ thiết yếu để thực hiện chức năng của công nghệ này [82]

 Hệ thống dịch

Máy đọc được các hạt riêng lẻ nhờ vào cơ chế của tế bào dòng chảy (Flow cytometry) Hệ thống dịch lỏng sắp xếp các hạt di chuyển theo dòng đơn, trong dòng chảy của dung dịch chạy máy sheath fluid đi qua buồng flow Khi các hạt di chuyển thành dòng đơn, mỗi hạt sẽ được phân tích một cách riêng lẻ dựa trên màu huỳnh quang của hạt và màu huỳnh quang của xét nghiệm (màu nhuộm hạt và mật

độ huỳnh quang PE) [82]

 Laser:

Máy đọc sử dụng hệ thống đèn laser xanh 532 nm để phát hiện màu huỳnh quang PE của xét nghiệm (streptavidin PE) Laser đỏ 635 nm dùng để phân biệt màu của hạt và quyết định màu, vùng và phân biệt chúng [82]

 Cảm biến

Máy đọc có 4 cảm biến, mỗi cảm biến dành cho một chiều của hệ thống quang học Các cảm biến được dùng để đo lường mật độ huỳnh quang của xét nghiệm, để quyết định tên của hạt (1-100) và để phân biệt hạt đơn hay hạt bị ngưng kết [82]

Hình 1.9 Hệ thống cảm biến Luminex [82]

 Kỹ thuật giải trình tự (SBT-sequencing based typing)

Hình 1.10 Kỹ thuật giải trình tự dựa trên điện di [81]

Giải trình tự gen có thể được sử dụng để xác định chính xác trình tự DNA mã hóa cho phân tử HLA [29] Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật này sẽ là độ phân giải

cao, đạt mức chi tiết 6 chữ số (VD A*02:03:01), giúp cho việc đánh giá sự hòa hợp

HLA giữa người cho và người nhận được chính xác hơn Hiện nay, nó được đánh giá là hiện đại nhất, hiệu quả nhất trong việc xác định HLA vì không phải phụ thuộc vào một lượng hạn chế gen HLA biết tên trước đó Tuy nhiên khó khăn lớn nhất đó

là chi phí cao nên chỉ phù hợp cho những Trung tâm lớn có lượng mẫu xét nghiệm dồi dào, liên tục

Hiện nay có nhiều kỹ thuật định danh HLA, kỹ thuật giải trình tự là kỹ thuật hiện đại cho kết quả chính xác nhất, tuy nhiên giá thành đắt bên cạnh đó kỹ thuật PCR-SSO với ưu điểm lượng ADN ít, có thể phân tích đồng thời được nhiều mẫu vẫn đáp ứng các tiêu chuẩn đánh giá độ hòa hợp trong ghép tế bào gốc tạo máu

1.2 Tế bào gốc

1.2.1 Khái niệm tế bào gốc

Danh từ tế bào gốc (Stem cells = SC) có từ trên 60 năm nay, kể từ khi nghiên cứu thành công tạo colony tế bào lách (CFU-S) trong nghiên cứu sinh máu ở chuột (1950) Từ đó đến nay, dựa trên các tiến bộ về khoa học kỹ thuật, người ta đã phân lập và biết được quá trình phát triển của cơ thể người và động vật bắt đầu từ tế bào gốc “trùm” (gangleader-stem cells) hay còn gọi là tế bào gốc nguyên thủy (primitive stem cells), hay tế bào gốc toàn năng (Totipotent stem cells = TSC)

Tế bào gốc là tế bào có khả năng sinh sản, tự tái sinh và biệt hóa thành các tế bào gốc kế cận, rồi phát triển thành TBG có chức năng riêng, cuối cùng trở thành tế bào trưởng thành của toàn cơ thể người và động vật [52, 67]

1.2.2 Tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi

Đây là nguồn TBG định hướng sinh máu từ tủy xương, được huy động ra máu ngoại vi bằng cách sử dụng những yếu tố kích thích tăng trưởng, thường sử

lớn hơn hoặc bằng 10 tế bào/microlit trong máu thì có thể thu được khoảng 1x106 tế bào CD34/kg cân nặng của người cho Một số nghiên cứu cho thấy, có sự liên quan giữa số lượng TBG với thể tích máu xử lý trong quá trình gạn tách Khi xử lý thể tích máu lớn, có thể nhận được tỷ lệ tế bào CD34+ lớn hơn từ 2,5 đến 3 lần so với tỷ

lệ này trong máu tại thời điểm bắt đầu gạn tách [2, 53]

Thời gian mọc mảnh ghép có liên quan chặt chẽ với số lượng tế bào CD34+truyền vào cho bệnh nhân, thường trong ghép tự thân liều ghép tế bào CD34+ tự thân tối thiểu: 2 x 106 tế bào/kg cân nặng bệnh nhân và trong ghép đồng loài liều ghép tế bào CD34+ tối thiểu: 3 x 106 tế bào/kg cân nặng bệnh nhân

Các tế bào gốc ra máu sẽ được thu thập bằng máy gạn tách tế bào tự động Hiện nay đây là nguồn chính sử dụng cho ghép đồng loài khi có người cho cùng huyết thống Các nghiên cứu lâm sàng so sánh khi sử dụng TBG máu ngoại vi với

sử dụng TBG từ tủy cho thấy: kết quả mọc ghép sớm hơn, khả năng hồi phục miễn dịch nhanh hơn, tỷ lệ tử vong liên quan đến biến chứng ghép thấp hơn, nguy cơ xuất hiện bệnh ghép chống chủ cấp tương đương ở cả hai nhóm nhưng bệnh ghép chống chủ mạn lại gặp nhiều hơn ở bệnh nhân ghép TBG máu ngoại vi huy động [30]

1.2.3 Tế bào gốc từ máu dây rốn

Năm 1989, lần đầu tiên Gluckman và Broxmeyer đã tiến hành ghép thành công tế bào gốc MDR cho bệnh nhi bị bệnh Fanconi, và đến nay hàng nghìn trường hợp bệnh nhân bị bệnh máu ác tính và không ác tính đã được điều trị bằng ghép MDR [35, 36]

Trong khoảng 15 năm trở lại đây, MDR đã và đang trở thành nguồn quan trọng cung cấp TBG cho ghép đồng loài Đây là một nguồn cung cấp TBG rất lớn,

dễ thu hoạch mà bình thường sẽ bỏ đi Trong MDR rất giàu tế bào định hướng sinh máu ở giai đoạn sớm và giai đoạn đa dòng (early and committed progenitor-cell), số lượng tế bào CD34+

từ 1/100 đến 1/10000 TBCN, khả năng sinh sản gấp 2 lần TBG tủy và máu ngoại vi người trưởng thành [65] Tuy vậy, nó có nhược điểm là lượng TBG thu được nhỏ, liều TBG chỉ đủ ghép cho trẻ em dưới 30kg Tuy nhiên gần đây

một số tác giả đã dùng liều tế bào gốc “pool” của 2 mẫu máu dây rốn có gen HLA tương đồng [40], do đó có thể dùng cho cả người trưởng thành Nhưng muốn làm được điều này cần có một lượng lớn máu dây rốn để lựa chọn Đây là mục tiêu của việc xây dựng Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Xu hướng hiện tại của các nghiên cứu về tế bào gốc trong máu dây rốn tập trung vào các vấn đề:

- Tính an toàn và hiệu quả của ghép tế bào từ máu dây rốn

- Khả năng sử dụng TBG máu dây rốn ghép cho người lớn

- Phạm vi ghép không hòa hợp HLA rộng nhưng vẫn duy trì an toàn và hiệu quả mọc mảnh ghép

Các nghiên cứu lâm sàng ở những trẻ nhận tế bào gốc MDR từ người cho không có liên quan huyết thống cho thấy nguy cơ xuất hiện GVHD thấp hơn so với ghép TBG từ tủy xương [41, 45] Điều này phù hợp với số lượng thấp của lympho T trưởng thành ở máu dây rốn Thời gian phục hồi các dòng tế bào sinh máu cũng có khác nhau, đối với ghép TBG từ máu dây rốn, dòng bạch cầu hạt hồi phục sau 26 đến 27 ngày, dòng tiểu cầu sau 60 ngày, trong khi đó nếu ghép TBG tủy xương thì thời gian phục hồi bạch cầu hạt và tiểu cầu lần lượt là 18 đến 19 ngày và 29 ngày

1.3 Ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia

1.3.1 Bệnh thalassemia

Thalassemia là bệnh đơn gen phổ biến do rối loạn tổng hợp hemoglobin (Hb)

Bệnh có 2 nhóm lớn là α và β-thalassemia Trong nhóm thalassemia 1 và

α-thalassemia 2 xảy ra ở người có 2 hoặc 1 gen α-globin đột biến với thiếu máu nhược sắc nhẹ và thường không biểu hiện lâm sàng [66] Đối với nhóm β-thalassemia, thể

dị hợp tử mang 1 gen β-globin bị đột biến biểu hiện thiếu máu nhược sắc nhẹ [55]

Tỷ lệ người mang gen bệnh ở Việt Nam khá cao, thay đổi theo địa dư và nhóm dân tộc Một số nơi tỷ lệ mang gen β-thalassemia gần 25% và α-thalassemia 9% [4, 5]

Tổ chức Y tế Thế giới chọn thalassemia là một trong những ưu tiên hàng đầu về nghiên cứu di truyền ở người Đông Nam Á

Alpha thalasemia gây ra bởi đột biến gen α-globin nằm trên cánh ngắn của NST 16 dẫn đến thiếu hụt hoặc không tổng hợp chuỗi alpha globin Người bình thường bản sao gen α-globin nằm trên 2 NST số 16, trên mỗi một NST chứa 2 bản

sao gen α globin: HbA1 (chiều dài 840 bp, gồm 3 exon và 2 intron) gọi là gen α1 và HbA2 (chiều dài 830bp, gồm 3 exon và 2 intron) gọi là gen α2 Gen α1 và α2 đều

mã hóa chuỗi α globin gồm 141 acid amin nhưng do quá trình khởi động (promoter) của 2 gen khác nhau nên khả năng biểu hiện của gen α2 mạnh hơn gen α1 từ 2 đến 3

lần Vì vậy, các đột biến gen xảy ra ở gen α2 thường có hậu quả nặng nề hơn những đột biến ở gen α1 [27]

Beta thalasemia gây ra bởi đột biến β-globin bao gồm: β0 thalassemia là các đột biến làm mất chức năng gen β nên không tổng hợp được chuỗi β-globin, β+thalassemia là các đột biến làm giảm chức năng gen β nên giảm tổng hợp chuỗi β-globin ở nhiều mức độ khác nhau Đột biến điểm làm thay đổi một acid amin tổng hợp nên các biến thể chuỗi β-globin, biến thể khác tạo các Hb bất thường như βE Hiện nay đã phát hiện được hơn 200 đột biến β globin, chủ yếu là đột biến không mất đoạn, rất hiếm gặp đột biến mất đoạn gen Các đột biến mang tính đặc trưng và phân bố khác nhau giữa các vùng miền, dân tộc [24, 79]

1.3.2 Ghép tế bào gốc

Ghép tế bào gốc tạo máu là một phương pháp có giá trị cao trong điều trị không chỉ cho bệnh thalassemia mà còn với nhiều bệnh máu khác, đối với nhiều bệnh ghép tế bào gốc đồng loài có thể chữa khỏi được bệnh hay kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân Khác với ghép thận, ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài với nguồn tế bào gốc lấy từ tủy xương hoặc

tế bào máu ngoại vi, yêu cầu về mức độ hòa hợp HLA tối thiểu là 8/10 locus A, B,

C, DR, DQ [44] Nguồn TBG máu dây rốn rất non trẻ, chưa bị tác động về mặt miễn

dịch như người trưởng thành, nên trong ghép tế bào gốc từ máu dây rốn cho phép

hòa hợp HLA không hoàn toàn ở mức 4/6 locus A, B, DR [49, 54] Chính vì thế nên

khả năng tìm kiếm được mẫu máu dây rốn hòa hợp tối thiểu 4/6 cho bệnh nhân ghép lên rất cao tới 97,7% [6]

1.4 Nghiên cứu hòa hợp HLA bệnh thalassemia ở Việt Nam và trên Thế giới

Năm 2004 ở trường đại học Chulalongkorn, Bangkok, Thailand tác giả Vanichsetakul P, Wacharaprechanont T đã nghiên cứu và khẳng định máu dây rốn

là một lựa chọn hợp lý, khả quan để ghép cho bệnh thalassemia [74]

Nghiên cứu của tác giả Lê Xuân Hải và cộng sự (2013) với 761 trường hợp bệnh nhân ghép và người hiến tạng làm xét nghiệm HLA tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương chỉ có 32,2% bệnh nhân cần ghép tủy có thể tìm được người cho tế bào gốc tạo máu hòa hợp HLA từ anh, chị, em ruột [3]

Tương tự như thế, nghiên cứu của tác giả Trần Ngọc Quế và cộng sự (2015) với 175 bệnh nhân cần điều trị bằng ghép tế bào gốc đồng loài, chỉ có 41,5% số trường hợp tìm được người cho hòa hợp HLA cùng huyết thống Trong khi đó, với xét nghiệm HLA độ phân giải cao cho 1008 mẫu máu dây rốn cộng đồng tại Ngân hàng Tế bào gốc Viện HH - TM TW, có tới 97,7% số trường hợp bệnh nhân đã tìm

thấy mẫu máu dây rốn hòa hợp tối thiểu 4/6 alen của 3 locus chính A, B, DR [10]

Theo tác giả Smythe J và cộng sự (2007) có khoảng 25% bệnh nhân cần cấy ghép tế bào gốc đồng loài mà người anh/chị/em có HLA hòa hợp Đối với một số trẻ em, đặc biệt là những người dân tộc thiểu số và những người bị rối loạn di truyền như bệnh lý hemoglobin hoặc suy giảm miễn dịch, thì khả năng tìm được nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn của anh chị/em ruột cao hơn rất nhiều [63]

Khoảng 15 năm trở lại đây, máu dây rốn đã và đang trở thành nguồn quan trọng cung cấp tế bào gốc cho ghép đồng loài Đây là một nguồn cung cấp tế bào gốc rất lớn, dễ thu thập mà bình thường sẽ bỏ đi, máu rất giàu tế bào định hướng sinh máu ở giai đoạn sớm và giai đoạn đa dòng, số lượng tế bào CD34+ từ 1/100 đến 1/10000 tế bào có nhân, khả năng sinh sản gấp 2 lần tế bào gốc tủy và máu

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

80 bệnh nhân thalassemia có chỉ định điều trị bằng tế bào gốc, trong đó bao gồm: 58 bệnh nhân có người hiến cùng huyết thống là anh/chị/em ruột của bệnh nhân (55 mẫu tế bào ối và 3 người hiến tế bào gốc) và 22 bệnh nhân không có người

hiến cùng huyết thống

3000 đơn vị máu dây rốn từ Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Viện Huyết

học - Truyền máu TW

Tiêu chuẩn lựa chọn:

 Bệnh nhân: Bệnh nhân thalassemia mức độ nặng có chỉ định điều trị bằng tế bào gốc và đồng ý tham gia nghiên cứu

 Người hiến: Mẫu tế bào ối được sàng lọc chẩn đoán trước sinh bình thường hoặc mang gen; người hiến tế bào gốc máu ngoại vi không bị bệnh thalassemia, trình trạng sức khỏe đủ điểu kiện hiến tế bào gốc; các đơn vị máu dây rốn đã được thu thập, xử lý, làm các xét nghiệm đánh giá và lưu trữ tại Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học - Truyền máu TW; người hiến đồng ý tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ:

Không đạt tiêu chí của tiêu chuẩn lựa chọn

2.1.2 Hóa chất

Kit tách ADN OMEGA gồm: Cột lọc; các dung dịch đệm; OB Protease hoặc

Ficoll; Kit PCR HLA-SSO cho 3 locus HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 gồm: dung dịch

đệm cho PCR, hóa chất PCR, hóa chất cho phản ứng lai; dung dịch nhuộm huỳnh quang SA-PE; Taq polymerase và một số dung dịch phụ trợ khác

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

‐ Địa điểm nghiên cứu: Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học - Truyền máu TW

‐ Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2015 đến tháng 6/2017

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

‐ Nghiên cứu mô tả cắt ngang, hồi cứu và tiến cứu;

‐ Chọn mẫu thuận tiện

2.3.2 Các bước tiến hành nghiên cứu

2.3.2.1 Xác định HLA của bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống

Các trường hợp có chỉ định chọc hút dịch ối được chọc dịch ối tại Trung tâm

Mô phôi của Học viện Quân y 103, sau khi đã hội chẩn sản khoa đủ điều kiện chọc

ối Quá trình nuôi cấy tế bào dịch ối được thực hiện tại khoa Di truyền sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu TW

 Tách ADN

ADN được tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân thalassemia, dịch tế bào ối và máu dây rốn bằng kít tách ADN Omega Quy trình gồm các bước chính như sau: Hút 250 µl máu bệnh phẩm cho vào ống eppendorf 1,5 ml; thêm 25 µl OB Protease

và 250 µl đệm BL vào ống eppendorf, trộn đều và ủ 10 phút ở 65o

C; thêm 260µl cồn 100%, trộn đều trong 20 giây và ly tâm nhanh; chuyển hỗn hợp lên cột ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch; chuyển cột sang ống mới, bổ sung 500 µl đệm

Wash Buffer, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút, bỏ dịch, thấm miệng ống lặp lại bước này 2 lần; ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ sạch Wash Buffer; chuyển cột sang ống eppendorf 1.5 ml mới thêm 200 µl đệm EB, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột, thu dịch chứa ADN

Bước 1: Bước khuếch đại

Ủ ADN của mẫu với đoạn mồi đặc hiệu;

Chạy máy PCR theo chu trình: Biến tính lần đầu: 95oC trong 3 phút; lặp lại 12 chu kỳ (biến tính: 95oC trong 15 giây, gắn mồi: 60oC trong 30 giây, tổng hợp:

72oC trong 30 giây, tổng hợp bước cuối: 72oC trong 5 phút); lặp lại 28 chu kỳ (biến tính: 95oC trong 10 giây, gắn mồi: 63oC trong 30 giây, tổng hợp: 72oC trong 30 giây); tổng hợp bước cuối cùng: 72oC trong 2 phút; duy trì ở 4oC; Thu sản phẩm sau PCR

Bước 2: Lai

Ủ sản phẩm PCR với hạt bead gắn với đầu dò;

Lai trên máy ủ nhiệt theo chu trình: Biến tính: 95oC trong 2 phút; gắn mồi: 47oC trong 10 phút; tổng hợp: 56oC trong 8 phút; Giữ ở 56oC;

Thu sản phẩm sau lai

Pha sẵn dung dịch huỳnh quang PE;

Ủ sản phẩm lai với dung dịch huỳnh quang;

Thu sản phẩm sau ủ

Bước 4: Phân tích kết quả trên máy:

Chạy mẫu trên hệ thống Luminex theo chương trình tự động; Phân tích kết quả sau chạy mẫu

Hình 1.11 Phần mềm phân tích kết quả xác định alen của HLA

Kết quả minh họa locus A Hình 1.11 cho thấy rằng từ biểu đồ các tín hiệu của các đầu dò locus A (1), phần mềm sẽ lựu chọn các đầu dò locus A có tín hiệu dương tính (2), tiếp theo là đưa ra những gợi ý kết quả của locus A (3) và cuối cùng là tổng hợp kết quả của HLA-A (4)

Sự hòa hợp HLA giữa người hiến và người nhận: được mô tả mức độ hòa hợp

sử dụng 3 locus/(6 alen); người hiến mà có 1 bất đồng HLA được coi như là hòa hợp 5/6; người hiến mà có 2 bất đồng HLA được coi như là hòa hợp 4/6; nếu

hòa hợp hoàn toàn là 6/6 Trong đó yêu cầu tối thiểu HLA-A và HLA-B ở độ