Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư đại trực tràng: Luận án TS. Sinh học: 624201

Tôi xin chân thành cảm ơn to n th Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Sinh lý học và Sinh họ người, Khoa Sinh họ Trường Đại học Khoa học Tự nhi n truy n ạt cho tôi những ki n thức quý báu trong su

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Ờ Đ N

T i xin m o n y l ng tr nh nghi n ứu t i thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.Trịnh Hồng Thái v TS.T Th nh Thúy ũng như sự hỗ trợ, giúp ỡ củ á ồng nghiệp á số liệu k t quả ủ lu n án l trung thự một phần k t quả ược công bố trên các tạp chí khoa học Việc sử dụng các dữ liệu trong lu n án củ t i ược sự chấp thu n bằng văn bản củ á ồng tác giả

Lu n án hư từng ược tác giả khác công bố

Nghiên cứu sinh

Ph m Thị Bích

LỜ N

Lời ầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và bi t ơn s u sắ n PGS.TS.Trịnh Hồng Thái và TS.Tô Thanh Thúy những người thầy/ lu n t n tình dìu dắt, hướng dẫn ộng viên khích lệ ịnh hướng và chỉ bảo cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong quá trình thực hiện lu n án

T i xin h n th nh ám ơn á bá sĩ y tá Kho Giải phẫu bệnh – T bào, Bệnh viện K Hà Nội, Bệnh viện Quân Y 103, á bá sĩ y tá Kho S ng lọ máu Viện Huy t họ v Truy n máu Trung ương nhiệt t nh giúp ỡ, cung cấp mẫu nghi n

ứu ũng như thông tin v i m bệnh họ ủ bệnh nhân UTĐTT húng t i thự hiện nghi n ứu n y

Tôi xin chân thành cảm ơn to n th Quý Thầy, Cô trong Bộ môn Sinh lý học và Sinh họ người, Khoa Sinh họ Trường Đại học Khoa học Tự nhi n truy n ạt cho tôi những ki n thức quý báu trong suốt thời gian học t p và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn n Ban giám hiệu Phòng S u ại họ Kho Sinh họ Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo i u kiện cho tôi hoàn thành các thủ tục bảo vệ

T i ũng xin h n th nh ảm ơn á ồng nghiệp và các bạn sinh viên Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng i m Công nghệ Enzyme v Protein Trường Đại học Khoa học Tự Nhi n lu n hỗ trợ giúp ỡ trong quá trình tôi làm thực nghiệm và sử lý số liệu k t quả

Lu n án ược thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí củ á tài KC.04.10/11-15, QGTĐ.13.06 QG.15.05 v tr ng th t bị ơ sở v t chất của phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng i m Công nghệ Enzyme và Pro-tein, Phòng thí nghiệm Sinh họ người thuộc Bộ môn Sinh lý học và Sinh họ người, Khoa Sinh họ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng bi t ơn tới gi nh v người th n lu n tạo i u kiện tốt nhất tôi hoàn thành lu n án

NCS Phạm Thị Bích

1

MỤC LỤC

Ờ Đ N i

LỜ N ii

MỤC LỤC 1

N Ụ Ữ VI T TẮT 4

N Ụ NG 5

DANH MỤC HÌNH 6

MỞ ĐẦU 7

Ư NG 1 T NG QUAN TÀI LI U 10

1.1 NG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG 10

1.1.1 Thực trạng mắ ung thư ại trực tràng 10

1.1.2 Các y u tố nguy ơ g y ung thư ại trự tr ng 11

1.1.3 Một số i m bệnh học phản ánh ti n tri n củ ung thư ại trực tràng 11

1.1.4 Các chỉ thị sinh học củ ung thư ại trực tràng 15

1.2 H GEN TY TH VÀ HI N TƯỢNG DỊ T BÀO CHẤT 16

1.2.1 Hệ gen ty th và chứ năng 16

1.2.2 Hiện tượng dị t bào chất v ngưỡng bi u hiện củ ột bi n ADN ty th 17

1.3 Đ T BI N ADN TY TH VÀ B N NG T Ư 18

1.3.1 Bi n ổi của một số gen ty th mã hóa cho các protein 19

1.3.1.1 Biến đổi trên gen ND1 19

1.3.1.2 Biến đổi trên gen ND3 20

1.3.1.3 Một số biến đổi của gen COX-1 và COX-2 21

1.3.2.Mất oạn lớn trên ADN ty th 23

1.3.3 Sự th y ổi số bản sao ADN ty th và bệnh ung thư 25

1.4 NG N Ứ N Đ Ủ ADN T T Ở T N 26

1.5 Ư NG T N BI N Đ I GEN TY TH 27

1.5.1 Kỹ thu t PCR k t hợp với RFLP 27

1.5.2 Xá ịnh trình tự gen 28

1.5.3 á phương pháp ịnh lượng mứ ộ bi n ổi ADN ty th 29

Ư NG 2 NG N Ư NG NG IÊN CỨU 30

2.1 NGUYÊN LI U 30

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 30

2.1.2 Các hóa chất 33

2.2 MÁY VÀ TRANG THI T BỊ 33

2

2.3 Ư NG NG N ỨU 34

2.3.1 Tá h hi t ADN tổng số từ mẫu m ung thư ại trực tràng 34

2.3.2 Tách chi t ADN tổng số từ mẫu máu 35

2.3.3 Điện di trên gel agarose và gel polyacrylamide 35

2.3.4 Nhân bản oạn gen ty th chứ ột bi n quan tâm bằng kỹ thu t PCR 35

2.3.5 Kỹ thu t P R v h nh hi u d i á oạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) 39

2.3.6 Nhân dòng trực ti p oạn gen chứ ột bi n vào vector pJET1.2 40

2.3.7 Giải tr nh tự á oạn gen hứ ột bi n 42

2.3.8 Tinh sạch sản phẩm PCR 42

2.3.9 Định lượng mứ ộ mất oạn số bản s o ADN ty th 42

2.4 ẦN T N N Ọ Ư NG T NG

ĐƯỢ Ử DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 46

Ư NG 3 T QU VÀ TH O LUẬN 48

3.1 BI N Đ I CỦA CÁC GEN ND1, ND3, COX-1 VÀ COX-2 TY TH 48

3.1.1 Bi n ổi T4216 v 4164G ủ gen ND1 ty thể 48

3.1.1.1 Biến đổi A4164G và một số biến đổi khác 48

3.1.1.2 Tần suất biến đổ 4 64 v ố n qu n v đặ đ ể n 51

3.1.2 Bi n ổi A10398G thuộc gen ND3 ty thể 53

3.1.3 Một số vị tr bi n ổi ủ gen COX-1 và COX-2 ty th 57

3.2 MẤT Đ ẠN LỚN CỦA ADN TY TH Ở B N N ÂN NG T Ư

ĐẠI TRỰC TRÀNG 65

3.2.1 Xá ịnh mất oạn 4977 bp và một số mất oạn lớn khác 65

3.2 X định mất đoạn 4977 bp 65

3.2 .2 X định các mất đoạn l n khác 4977 bp 68

3.2.2 Mối liên quan giữ t lệ mất oạn 4977 bp với á i m bệnh học 69

3.2.3 Xá ịnh mứ ộ mất oạn lớn của ADN ty th ở bệnh nh n ung thư ại trực tràng bằng phương pháp re l-time PCR 71

3.2.3 X n đ n u n o kỹ thuật r -t P R địn độ

ất đoạn n của ADN ty thể 72

3.2.3.2 X định m độ mất đoạn trên các mẫu nghiên c u 73

3.2.4 Mối liên quan giữa mứ ộ mất oạn lớn với á i m bệnh học 74

3.3 SỰ T Đ I S B N SAO ADN TY TH Ở CÁC B NH NHÂN

NG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG 76

3.3.1 Số bản sao ADN ty th ở các mẫu nghiên cứu 76

3.3.2 Mối liên quan giữa số bản sao ADN ty th với á i m bệnh họ 77

3

3.4 T Đ NG T NG HỢP CỦA M T S BI N Đ I, MỨ Đ MẤT Đ ẠN,

S B N SAO CỦA ADN TY TH VỚI TI N TRI N TĐTT 80

3.4.1 Đối với sự di ăn hạch 80

3.4.2 Đối với sự ti n tri n gi i oạn ung thư 81

3.5 VAI TRÒ CỦA MẤT Đ ẠN, S B N SAO VỚ NG

MẮ NG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG 83

3.5.1 Mối tương qu n v mứ ộ mất oạn, số bản sao ADN ty th giữa mẫu mô và mẫu máu, giữa mứ ộ mất oạn và số bản sao ADN ty th 84

3.5.2 Mứ ộ mất oạn tăng l m tăng nguy ơ mắ ung thư ại trực tràng 88

BÀN LUẬN CHUNG 92

T ẬN 99

N NG Ị 100

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GI LIÊN QUAN Đ N LUẬN ÁN 101

T T O 102

PHỤ LỤC 1 Hệ thống ph n loại TNM ối với ung thư ại trự tr ng - 1 -

PHỤ LỤC 2 Vị trí và chứ năng ủa các gen ty th - 2 -

PHỤ LỤC 3 nh sá h i m bệnh họ v nồng ộ ADN tổng số từ á mẫu của bệnh nh n ung thư ại trự tr ng - 3 -

PHỤ LỤC 4 Ảnh iện di ADN tổng số từ một số mẫu nghiên cứu 9

-PHỤ LỤC 5 Bản cam k t cho mẫu của bệnh nhân - 10 -

PHỤ LỤC 6 Phi u lấy mẫu ung thư - 11 -

PHỤ LỤC 7 So sánh trình tự oạn ADN của gen ND1, ND4, HBB với trình tự

ADN ty th chuẩn, gen HBB bằng hương tr nh BL ST - 12 -

PHỤ LỤC 8 Một số bi n ổi, mất oạn 4977 bp, mứ ộ mất oạn, số bản sao

ADN ty th củ m ung thư ại trự tr ng - 13 -

PHỤ LỤC 9 K t quả real-time P R ồ thị củ h i ường chuẩn ND1 và ND4 - 18 -

PHỤ LỤC 10 Mứ ộ mất oạn số bản s o ADN ty th củ 40 bệnh nh n UTĐTT từ Bệnh viện Qu n Y 103 - 20 -

PHỤ LỤC 11 Dự oán khả năng mắ UTĐTT dựa vào mứ ộ mất oạn

từ phân tích hồi quy ơn bi n - 24 -

PHỤ LỤC 12 Dự oán khả năng mắ UTĐTT dựa vào số bản sao ADN ty th và mất oạn từ phân tích hồi quy ơn bi n - 26 -

PHỤ LỤC 13 Mối liên quan giữa mứ ộ mất oạn, số bản sao ADN ty th với á i m bệnh họ ủ bệnh UTĐTT - 30 -

4

N Ụ Ữ VI T TẮT

AJCC American Joint Committee on Cancer (hiệp hội ung thư Ho Kỳ) ATP Adenosine triphosphate

bp Base pair (c p b zơ)

COX-1 Cytochrome c oxidase I

COX-2 Cytochrome c oxidase II

Cyt c Cytochrome c

D-loop Displacement loop

EtBr Ethidium bromide

GĐ Gi i oạn

HPLC High-performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng o) KSS Kearns-Sayre syndrome (hội chứng KSS)

LHON Leber’s heredit ry opti neurop thy (hội chứng liệt thần kinh thị giác

di truy n theo Leber) LCU Lân c n u

MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes

(hội chứng não gi t ơ tăng id l ti máu v giả tai bi n mạch) mtADN Mitochondrial ADN (ADN ty th )

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng khử)

ND1 NADH dehydrogenase 1

ND3 NADH dehydrogenase 3

OXPHOS Oxidative phosphorylation (phosphoryl hóa oxy hóa)

PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase)

RFLP Restri tion fr gment length polymorphism ( h nh hi u dài các

oạn cắt giới hạn) ROS Reactive oxygen species (dạng oxy hoạt ộng)

TNM Tumor- lymph Node- Metastases

UTĐTT Ung thư ại trự tr ng

Tm Melting temperature (nhiệt ộ nóng chảy)

5

N Ụ NG

Bảng 1.1 Ph n hi gi i oạn UTĐTT ủa AJCC -2002 14

Bảng 2.1 Số lượng bệnh nh n UTĐTT theo i m bệnh học 31

Bảng 2.2 á h hất h nh ượ sử dụng trong nghi n ứu 33

Bảng 2.3 Tr nh tự á p mồi d ng trong nghi n ứu 36

Bảng 2.4 Đi u kiện phản ứng P R ối với á p mồi 38

Bảng 2.5 á enzyme giới hạn d ng trong nghi n ứu 39

Bảng 2.6 á ve tor m ng oạn h n 40

Bảng 2.7 Tr nh tự á p mồi sử dụng trong phản ứng P R nh n oạn ADN

nh n dòng ho dựng ường huẩn v Re l-time PCR 43

Bảng 3.1 Tần suất của bi n ổi 4164G v mối li n qu n với á i m bệnh họ ủ bệnh UTĐTT 52

Bảng 3.2 Tần suất bi n ổi 10398G v mối li n qu n với á i m bệnh họ

ủ bệnh UTĐTT 55

Bảng 3.3 á vị tr bi n ổi tr n gen COX-2 ty th ở 31 mẫu m UTĐTT 58

Bảng 3.4 Tần suất bi n ổi G7853 v mối li n qu n với á i m bệnh họ

ủ bệnh UTĐTT 60

Bảng 3.5 á vị tr bi n ổi tr n gen COX-1 ty th ở 25 mẫu UTĐTT 62

Bảng 3.6 Mất oạn 4977 bp v một số mất oạn lớn khá 68

Bảng 3.7 T lệ mất oạn 4977 bp v mối liên quan với một số i m bệnh họ

ủ bệnh UTĐTT 70

Bảng 3.8 Phương tr nh v á th ng số củ h i ường chuẩn d ng ho ịnh lượng

mứ ộ mất oạn lớn ADN ty th 73

Bảng 3.9 Mứ ộ mất oạn theo i m bệnh họ ủ bệnh nh n UTĐTT 75

Bảng 3.10 Số bản s o ADN ty th tương ối theo á i m bệnh họ ủa

bệnh nh n UTĐTT 78

Bảng 3.11 Tá ộng tổng hợp của các bi n ổi n sự di ăn hạch củ UTĐTT 81

Bảng 3.12 Tác ộng tổng hợp của các y u tố n gi i oạn củ UTĐTT 82

Bảng 3.13 Mứ ộ mất oạn, số bản sao ADN ty th ở các vị trí mẫu khác nhau của 40 bệnh nh n UTĐTT v máu ối chứng 84

Bảng 3.14 K t quả phân tích các mối tương qu n 85

Bảng 3.15 Mứ ộ mất oạn, số bản sao ADN ty th v nguy ơ mắ UTĐTT trong phân tích hồi quy ơn bi n v bi n 90

6

DANH MỤC HÌNH

H nh 1.1 á gi i oạn phát tri n ủ UTĐTT 14

Hình 1.2 Bản ồ hệ gen ty th người 16

H nh 1.3 Hiện tượng dị t b o hất ủ ADN ty th v ngưỡng ảnh hưởng n chức năng huỗi hô hấp 17

Hình 1.4 Hệ gen ty th và mất oạn 4977 bp 23

H nh 2.1 Sơ ồ á bước nghiên cứu 34

Hình 3.1 Ảnh iện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme NlaIII 49

Hình 3.2 Trình tự oạn ADN thuộ gen ND1 hứ vị tr 4216 v 4164 50

Hình 3.3 Trình tự oạn gen ND1 có chứa bi n ổi 51

Hình 3.4 Ảnh iện di sản phẩm PCR-RFLP và trình tự một oạn gen ND3 54

H nh 3.5 Một số vị tr bi n ổi ủa gen COX-2 ty th 58

H nh 3.6 Ảnh iện di sản phẩm P R-RFLP và oạn ADN ủ gen COX-2 59

Hình 3.7 Một số vị trí bi n ổi của gen COX-1 ty th 62

H nh 3.8 Ảnh iện di sản phẩm P R-R LP oạn ADN ủ gen COX-1 63

H nh 3.9 Minh họ vị tr bắt p ủ á p mồi phát hiện mất oạn 4977 bp 66

Hình 3.10 Ảnh iện di sản phẩm P R từ á p mồi Mt, 4977-2, 10398 67

Hình 3.11 Trình tự ADN ty th ượ nối lại sau xuất hiện á mất oạn lớn 69

Hình 3.12 Bi u ồ so sánh mứ ộ mất oạn ADN ty th giữ m u v m l n n u 74 Hình 3.13 Bi u ồ so sánh số bản sao ADN ty th giữ m u v l n n u 77

Hình 3.14 Mối tương qu n giữ mứ ộ mất oạn v số bản s o ADN ty th 87

Hình 3.15 Ðồ thị th hiện mối tương qu n giữ mứ ộ mất oạn số bản s o ADN ty th với nguy ơ mắ UTÐTT 89

H nh 3.16 M h nh giải th h sự mở rộng ủ trạng thái ồng t b o hất ủ ột bi n ADN ty th trong á khối u 93

Hình 3.17 Quá trình hình thành mất oạn ADN ty th do ứt gãy trên sợi i 95

7

MỞ ĐẦU

Ung thư ại trự tr ng (UTĐTT) ứng thứ ba v mứ ộ phổ bi n và là nguyên nhân gây tử vong cao thứ tư do ung thư tr n to n ầu [23] Nhi u y u tố có th là nguy ơ g y bệnh như h ộ ăn uống thi u lành mạnh, sự lão hóa, lối sống ít v n ộng, lạm dụng thuốc, chất k h th h c thù ngh nghiệp hay hội chứng polyp theo gi nh [25] Tuy bệnh nh n thường ti n lượng tốt n u ược chẩn oán v

i u trị khi còn ở gi i oạn sớm, song t lệ tử vong do UTĐTT vẫn ở mứ o c biệt là ở á nước ch m phát tri n [124] i u này cho thấy khả năng hẩn oán bệnh

ở gi i oạn sớm còn hạn ch Do v y, việc tìm ra các chỉ thị giúp chẩn oán bệnh sớm ược quan tâm rất nhi u trong hướng nghiên cứu mối liên quan giữa sự

bi n ổi ADN ty th với bệnh

Đượ oi l “nh máy” sản xuất năng lượng, ty th có vai trò quan trọng cho mọi hoạt ộng sống của t b o v ơ th Đ c biệt, ty th có hệ gen riêng và nhân bản

ộc l p với hệ gen nhân Ở người, ADN ty th k h thước 16.569 bp, sợi i dạng mạch vòng chứa 37 gen ượ i u khi n chung bởi một v ng i u khi n D-loop ADN ty th không có trình tự intron, không protein Histone Hơn nữ ơ h sửa chữa sai hỏng của ADN ty th òn ơn giản nên rất dễ bị tá ộng và bi n ổi [20]

Sự bi n ổi này có th ảnh hưởng n hoạt ộng chứ năng ủa ty th qu g y r những rối loạn và bệnh t t Những nghiên cứu gần y ho thấy bi n ổi của ADN ty th gây ra những khi m khuy t trong phức hệ hô hấp và li n qu n n nhi u

loại ung thư [29, 44, 101] Cụ th hơn một số bi n ổi của các gen ND1, ND3 thuộc phức hệ hô hấp I, COX-1, COX-2 thuộc phức hệ hô hấp IV, các mất oạn lớn và sự

th y ổi số bản sao ADN ty th ược xá ịnh ở nhi u loại ung thư trong UTĐTT [29, 44, 76] Hơn nữa, một số công bố còn cho thấy sự bi n ổi ADN ty th trong mối liên quan với bệnh t nh trưng theo v ng ịa lý và chủng tộc [32, 51] Tr n ối tượng người Việt N m nghi n ứu v bi n ổi của ADN ty th

ượ qu n t m trong những năm gần y, tuy nhiên, các nghiên cứu chủ y u t p

trung vào các bệnh ơ thần kinh [4, 5], bệnh ung thư vú [1, 6, 12] hay trên một số nhóm tộ người Việt Nam [2, 3] Đối với bệnh UTĐTT mới có công bố của Dim-

berg và cs (2014) với một số dữ liệu b n ầu v ột bi n mất oạn 4977 bp ở một

t ạ tr tr ” với hai mục tiêu:

1 Khảo sát một số dạng bi n ổi ( ột bi n h nh) ủa các gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, xá ịnh v ịnh lượng mứ ộ mất oạn lớn số bản s o ADN

ty th ở mẫu m v mẫu máu ủ một nh m bệnh nh n UTĐTT Việt N m

2 Tìm hi u mối liên quan giữa các dạng bi n ổi của gen, t lệ mất oạn lớn,

mứ ộ mất oạn lớn v sự th y ổi số lượng bản sao ADN ty th với một số

i m bệnh học của bệnh UTĐTT qu t m r những bi n ổi ti m năng th phát tri n thành chỉ thị hỗ trợ hẩn oán v ti n lượng bệnh ho các nghiên cứu ti p sau

Đ t ợng nghiên c u v ị m th c hi n ề tài luận án

Nghiên cứu ược thực hiện trên mẫu m u m l n n u (L U) v một số mẫu máu ượ ung ấp k m theo mẫu m ủa một nhóm bệnh nh n UTĐTT Mẫu m

và mẫu máu của bệnh nh n ung thư ược cung cấp từ Kho Giải phẫu bệnh -T bào, Bệnh viện K, Hà Nội và Bệnh viện Quân y 103, từ năm 2012 n năm 2016 Mẫu máu củ người khỏe mạnh b nh thường (máu ối chứng) do Kho S ng lọ máu Viện huy t học và Truy n máu Trung ương ung ấp

Các nghiên cứu của lu n án ược thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng i m Công nghệ Enzyme và Protein, Bộ môn Sinh lý học và Sinh họ người thuộc Khoa Sinh họ Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên

Đạo c nghiên c u.

9

Lu n án luôn tuân thủ ạo ức trong nghiên cứu khoa học Quy trình lấy mẫu theo úng quy ịnh của Bệnh viện Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu Các thông tin cá nhân của bệnh nhân tham gia nghiên cứu ược mã hóa và bảo m t

Ý ĩ k o ọc và th c tiễn c ề t uậ

- K t quả ủ lu n án ung ấp bộ dữ liệu ũng như mối liên quan giữa các bi n

ổi của một số gen ty th , t lệ và mứ ộ mất oạn lớn, sự th y ổi số lượng bản sao ADN ty th với một số i m bệnh học ở một nh m bệnh nh n UTĐTT Việt N m Đ y là nguồn dữ liệu tham khảo quan trọng cho các nghiên cứu v bệnh học phân tử củ UTĐTT

- Lu n án x y dựng ược trình tự cụ th á bướ xá ịnh một số ột bi n

h nh ịnh lượng mứ ộ mất oạn lớn số bản s o ADN ty th Tr nh tự các bướ n y th ượ ứng dụng ở á ơ sở nghi n ứu v x t nghiệm có liên quan ở Việt Nam

- K t quả ủ lu n án th ược sử dụng l m ơ sở kho họ ho á nghi n ứu

ti p theo: x y dựng m h nh dự oán ảnh hưởng ủ một số bi n ổi tr n á gen

ND1, ND3, COX-1, COX-2 ũng như t lệ v mứ ộ mất oạn lớn sự th y ổi

số bản s o ADN ty th n nguy ơ mắ v ti n tri n ủ UTĐTT

i m bệnh họ ủ bệnh UTĐTT người Việt N m

- Lu n án phát hiện thấy ba mất oạn mới của ADN ty th l 5093 bp 5167

bp v 5104 bp ở một số bệnh nh n UTĐTT

- Đ c biệt, k t quả của lu n án cho thấy tăng mứ ộ mất oạn lớn và số bản sao ADN ty th xu hướng l m tăng nguy ơ mắ UTĐTT v xá ịnh thấy mối tương qu n nghịch giữa mứ ộ mất oạn và số bản sao ADN ty th ở mô của bệnh UTĐTT

th giới [23]

T lệ mắ v tử vong củ UTĐTT khá nh u áng k giữ á v ng tr n th giới

Ướ t nh n 55% á trường hợp ung thư xảy r tại á nướ phát tri n o nhất tại á nướ như ustr li /New Ze l nd ( ứ 100.000 người d n trung b nh 44 8

v 32 2 trường hợp UTĐTT ượ phát hiện tương ứng ở n m giới v nữ giới) T lệ UTĐTT phát hiện thấp nhất tại á nướ T y phi (trung b nh khoảng 4 5 trường hợp

ở n m giới v 3 8 trường hợp ở nữ giới tr n 100.000 d n) T lệ tử vong trung b nh

củ UTĐTT l 8 5% trong khi t lệ n y ở á nướ h m phát tri n l n n 52% [124]

Tại Việt Nam, số ca bệnh UTĐTT ược chẩn oán hi m t lệ khoảng 7% trong tổng số á ung thư v ứng vị trí thứ năm s u ung thư g n ung thư phổi ung thư

dạ d y v ung thư vú T lệ tử vong do UTĐTT o thứ tư s u ung thư g n ung thư phổi v ung thư dạ dày [124]

Nhìn chung, t lệ mắc mới và tử vong do bệnh UTĐTT vẫn ng xu hướng tăng ở các quốc gia có thu nh p thấp và trung bình, ổn ịnh v xu hướng giảm ở

á nước có thu nh p cao [23] Tuy nhiên, t lệ mắc mới và tử vong củ UTĐTT vẫn òn o i u ho thấy y l ăn bệnh nguy hi m và vẫn ng l gánh n ng toàn cầu

11

1.1.2 Các yếu tố uy ơ ây u ự

Nhi u y u tố ược bi t li n qu n n nguy ơ mắ UTĐTT như tuổi tác, lối sống, y u tố di truy n, ti n sử gi nh v ti n sử cá nhân

Nguy ơ mắ UTĐTT gi tăng theo ộ tuổi, có tới 90% á trường hợp UTĐTT

ược chẩn oán ở sau 50 tuổi [25]

Hơn nữa, so với người có ti n sử gi nh không bị ung thư th nguy ơ mắc bệnh

sẽ o hơn từ 2 n 3 lần ở người có quan hệ huy t thống gần với người bệnh UTĐTT Khoảng 20% tổng số trường hợp bị UTĐTT l qu n hệ huy t thống gần với những người bị mắ ăn bệnh này, khoảng 5% số bệnh nh n UTĐTT là do hội chứng di truy n Phổ bi n nhất là hội chứng u tuy n polyp theo dòng họ (familial adenomatous polyposis - FAP) và hội chứng ung thư ruột k t không polyp di truy n (hereditary

nonpolyposis colon cancer - HNPCC) hay còn gọi là hội chứng Lynch [25]

Ngoài ra, những người bị polyp tuy n c biệt là những trường hợp có nhi u polyp, polyp to, những người bị bệnh ti u ường, béo phì, ít v n ộng, ch ộ ăn

nhi u chất ạm, ít chất xơ ũng tăng nguy ơ mắ UTĐTT [25]

Bên cạnh các y u tố như lối sống, tuổi tác, ti n sử gi nh ti n sử cá nhân thì

y u tố di truy n như ột bi n gen RAS, BRAF trong nhân và các bi n ổi ADN ty th

ũng ược bi t n là các y u tố li n qu n n UTĐTT [25, 29, 45, 76]

1.1.3 Một số ặ ểm bệnh học phản ánh tiến triển của u i trực tràng

Đối với UTĐTT một số i m như ộ tuổi, giới tính, vị tr ung thư mứ ộ biệt h gi i oạn bệnh thường ược sử dụng ánh giá nguy ơ v ti n tri n của ung thư

12

Theo giới tính, t lệ mắ ung thư giữa nam giới và nữ giới có sự khác nhau ở các nghiên cứu trên các chủng tộ người khác nhau Theo một số nghiên cứu dịch tễ học UTĐTT t lệ mắ UTĐTT ở nam giới o hơn so nữ giới khoảng 1,3 lần (56% ở nam giới và 44% ở nữ giới) tại Úc và Malaysia [15, 28] Nhìn chung, t lệ mắc và tử vong do UTĐTT ở nam giới o hơn 30- 40% so với nữ giới Tuy nhiên, nguyên nhân sự chênh lệch giữa hai giới vẫn hư ược giải thích rõ ràng [25]

ớc u

K h thước khối u ượ xá ịnh li n qu n áng k n sự di ăn ủ ung thư

Tr n ối tượng ung thư th n khi k h thướ u tăng 1 m th nguy ơ di ăn tăng 1 25 lần Đ c biệt, t lệ sống sót củ người bệnh kh ng di ăn li n qu n n kích thướ u (p<0 01) Đối với những bệnh nh n k h thước u nhỏ hơn 3 m th nguy

ơ di ăn thấp (1/787 trường hợp) [107] Đối với ung thư trự tr ng k h thước u ũng ượ xá ịnh li n qu n áng k với thời gian sống của bệnh nhân và t lệ tái phát s u 5 năm Với những bệnh nh n k h thước u nhỏ hơn 5 m t lệ sống

s t s u 5 năm l 82 6% v sự tái phát l 1 4% trong khi với những bệnh nhân có

k h thước u lớn hơn 5 m th khả năng sống s t v tái phát tương ứng là 71,2% và 23% Như v y k h thướ u l i m bệnh học quan trọng ti n lượng thời gian sống, sự tái phát v di ăn ung thư [37]

G a u i trực tràng

Việc phát hiện ung thư ở gi i oạn sớm là y u tố quan trọng làm giảm t lệ tử vong, giảm hi ph i u trị v k o d i thời gi n sống ho người bệnh UTĐTT Liệu pháp i u trị bệnh sẽ ược dựa trên k t quả chẩn oán gi i oạn ti n tri n của ung thư [25] Đối với UTĐTT hệ thống ph n gi i oạn bệnh ược sử dụng thường xuyên nhất là phân loại dựa theo khối u-hạch-sự di ăn (Tumor - lymph Node - Me-tastasis – phân loại TNM) của hiệp hội ung thư Ho Kỳ (Americant Joint Committee

on Cancer -AJCC) và liên minh ki m soát ung thư quốc t - Union for International Cancer Control (UICC) [25, 40, 128]

13

Hệ thống phân loại TNM giúp ho á bá sĩ ph n gi i oạn ung thư từ 0 n IV dựa vào chủ y u 3 y u tố là khối u (Tumor, T), hạch (Node, N) và di ăn (Met st sis M) [18, 104] Trong ph n gi i oạn TNM thì:

T: Mô tả khối u nguyên phát cho bi t kích cỡ, mứ ộ lan sâu vào thành ruột của khối u Trong :

Tx: kh ng xá ịnh ược u nguyên phát

Tis: ung thư bi u mô tại chỗ

To: không có dấu hiệu u nguyên phát

T1: u xâm lấn lớp dưới niêm mạc

No: không phát hiện di ăn hạch vùng

N1: di ăn từ 1 n 3 hạch bạch huy t qu nh ại trực tràng

14

á gi i oạn củ ung thư ược tóm tắt trong Bảng 1.1 và minh họa ở Hình 1.1, chi ti t á i m của từng gi i oạn ung thư v thời gian sống của bệnh nh n ối với từng gi i oạn bệnh ược trình bày trong Phụ lục 1

ộ biệt h kh ng xá ịnh ược (Undifferentiated)

15

1.1.4 Các chỉ thị sinh học của u i trực tràng

UTĐTT l một vấn toàn cầu, vì v y, tìm chỉ thị chẩn oán sớm ung thư l một nhiệm vụ quan trọng v thu hút ược sự quan tâm củ nhi u nh nghi n ứu trên th giới Trong lĩnh vực sinh họ ũng nhi u nghiên cứu ở mứ ộ gen, pro-tein ượ thự hiện nhằm mụ h t m r những chỉ thị chẩn oán v hỗ trợ chẩn oán sớm UTĐTT

Năm 2008 nghi n ứu của Han và cs với mụ h x y dựng phương pháp phát hiện sự bi u hiện của một số gen trong máu làm chỉ thị sinh họ ho UTĐTT Nghiên cứu ược ti n hành trên 211 mẫu máu (101 mẫu của bệnh nh n UTĐTT 110 mẫu máu củ người không bị bệnh) Sử dụng phương pháp mi ro r y v P R ịnh

lượng, nghiên cứu t m ược một panel gồm 5 gen (CDA, MGC20553, BANK1, BCNP1 và MS4A1) có th sử dụng cho các sàng lọ UTĐTT từ mẫu máu [63] Năm

2001 ong v s nghi n ứu ột bi n trên 3 gen TP53, BAT26 và K-RAS của

UTĐTT từ sản phẩm ADN tách chi t từ mẫu phân của bệnh nhân K t quả cho thấy tất cả những ột bi n ược phát hiện khi nghiên cứu trên ADN tách từ mẫu mô ung thư th ột bi n ũng ược phát hiện trên mẫu phân của bệnh nhân, vì v y, nghiên cứu n y ung ấp thêm một phương pháp xá ịnh ột bi n dựa trên sản phẩm ADN tách chi t từ mẫu phân là nguồn mẫu dễ lấy và không xâm lấn [53]

Số liệu tổng hợp của Markowitz và cs, (2009) ư r một số chỉ thị ADN ối

với UTĐTT như ột bi n dòng mầm của gen APC với tần suất (80-100%), gen TP53 (35-55%), gen KRAS (35-45%), gen BRAF (8-12%) hay sự methyl hóa của gen MLH1 ở bệnh nh n UTĐTT [86]

Như v y ối với UTĐTT hướng nghiên cứu tìm các chỉ thị sinh học giúp hỗ trợ chẩn oán ung thư ạt ược những k t quả nhất ịnh Tuy nhi n ho n nay, các nhà nghiên cứu vẫn hư t m ra một chỉ thị sinh họ n o ủ ộ nhạy v c hiệu cho một loại ung thư [134]

là sợi n ng và sợi giàu Cytosine là sợi nhẹ [29] Vị trí và chứ năng ủa các gen ty

th ược trình bày trong Phụ lục 2

Hình 1.2 Bả ồ gen ty thể ời [105]

Khác với ADN nhân, ADN ty th chỉ v ng loop i u khi n phiên mã chung cho tất cả á gen Đ c biệt, t lệ ột bi n của ADN ty th o hơn ADN nhân khoảng 10 n 100 lần do ADN ty th không có trình tự intron, không có protein bảo vệ Histone và chịu nhi u tá ộng của các gốc tự do - sản phẩm phụ ủ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa [20]

Ty th ng v i trò l “nh máy” năng lượng của t bào, tham gia vào quá trình apoptosis (quá trình t bào ch t theo hương tr nh) [54, 80, 114], quá trình lão hóa

củ ơ th [30] i u chỉnh tín hiệu canxi [96] và một số chứ năng khá Nhi u

17

nghiên cứu hỉ ra rằng, bi n ổi của hệ gen ty th li n qu n n một số bệnh ty

th và bệnh ung thư [29, 34, 52]

1.2.2 Hiệ ợng dị tế bào chấ ỡng biểu hiện của ột biến ADN ty thể

Trong mỗi t bào, số lượng bản sao ADN ty th d o ộng từ h ng trăm n hàng nghìn bản sao.Các bản sao có th giống nhau (dạng ồng t b o hất homopl smy) hay không giống nhau (dị t bào chất, heteroplasmy) (Hình 1.3) [52] Đ số á ột

bi n ADN ty th tồn tại ở dạng dị t b o hất [52, 59, 115] Bi u hiện lâm sàng của bệnh do ột bi n ADN ty th có th phụ thuộc vào t lệ bản sao bị ột bi n so với bản sao dạng b nh thường (mứ ộ dị t bào chất) [20, 52, 103] Mứ ộ dị t bào chất th y ổi trong một phạm vi rộng [103] Đ n n y một số lượng lớn á ột bi n ADN ty th g y bệnh ượ xá ịnh [115, 125] Tuy nhiên, mứ ộ ảnh hưởng

củ ột bi n n tình trạng bệnh phụ thuộc vào tính chất củ ột bi n mứ ộ dị t bào chất, tính chất củ m ơ qu n á ơ qu n khá nh u mứ ộ nhạy ảm khá nh u ối với mứ ộ dị t bào chất ủ ty th Trong bộ n o l ơ qu n nhạy ảm nhất với á khi m khuy t ủ ADN ty th ti p n l m ơ tim m ơ

v n th n v hệ ti t niệu [115] Sự bi u hiện ra ki u hình của bệnh thường l do ột

bi n ạt n ngưỡng nhất ịnh như một số nghiên cứu t m r l từ 50% n 90% [13, 27] Hơn nữ ngưỡng bi u hiện củ ột bi n ũng th th y ổi phụ thuộc từng loại ột bi n và từng loại mô [115]

1.3 ệ ợ ị ế ấ ủa ADN ty thể ỡng ả ở ến chứ ă uỗi hô hấp [74]

18

Như v y, ADN ty th có hiện tượng th l hiện tượng dị t bào chất Các

ột bi n ADN ty th thường tồn tại ở dạng dị t bào chất.Vai trò củ ột bi n ối với

sự bi u hiện bệnh phụ thuộc mứ ộ dị t bào chất củ ột bi n

1.3 BI N Đ I ADN TY TH VÀ B N NG T Ư

Một số nghiên cứu hỉ ra rằng, các gốc tự do hoạt ộng chứa oxi (Reactive oxygen spe ies ROS) li n qu n n sự tăng trưởng của t bào, sự ch t của t bào, sự hình thành mạch, sự phát sinh ti n tri n v di ăn ủ ung thư [49, 68] ROS là sản phẩm phụ của quá trình hô hấp ty th (oxidative phosphorylation, OXPHOS), có từ 2-4% oxi tiêu thụ trong hô hấp ty th ược chuy n thành ROS [49] Hơn nữa, các

ột bi n của ADN ty th có th l m gi tăng á gốc ROS [29, 35], tuy nhiên, sự gia tăng ROS nội sinh lại tá ộng trở lại và có th gây tổn hại thêm cho cả ADN ty th

và ADN nhân [35] Ngoài ra, sự hoạt ộng của NADPH-oxid se 1 (Nox1) ũng tạo

ra một lượng áng k ROS trong t bào Nox1 lại ược ki m soát bởi sự hoạt ộng của các gen trong ty th , sự mất ki m soát của các gen ty th góp phần tạo ra khối u

ở một số loại ung thư như ung thư vú ung thư buồng trứng [49] Như v y, hoạt ộng

và một số bi n ổi của ADN ty th có th ảnh hưởng trực ti p n việc tạo ra ROS

ho c có th tá ộng thông qua Nox1 từ có th ảnh hưởng n quá trình phát sinh

và phát tri n ung thư M t khác, các khi m khuy t trong hoạt ộng của chuỗi hô hấp

do ột bi n ADN ty th có th dẫn n sự bi u hiện quá mức quá trình sản xuất surperoxide, kháng lại quá tr nh poptosis tăng hư hại và bi u hiện quá mức của ADN nhân Những bi n ổi này trong ki u hình t b o ược bi t n góp phần vào

sự hình thành, phát tri n củ ung thư [101] Bên cạnh sự rối loạn kênh v n chuy n canxi của màng ty th ũng li n qu n n k h thước u và sự di ăn hạch ở ung thư vú [110] Như v y, các bất thường trong hệ gen ty th có th xem là một trong các y u tố quan trọng li n qu n n sự hình thành và phát tri n ung thư

ho n n y nhi u dạng bi n ổi tr n ADN ty th như ột bi n mất oạn, sự

th y ổi số lượng bản sao ADN ty th , ột bi n i m v á h nh thường xuyên ược quan sát thấy trong nhi u loại ung thư khác nhau [20, 76, 101]

ở cả v ng i u khi n và vùng mã hóa của ADN ty th và ượ xá ịnh ở nhi u loại ung thư khá nh u Một số nghiên cứu hỉ ra rằng, alen 10398A thuộc gen

ND3 l m tăng nguy ơ ung thư vú ở những bệnh nh n người Mỹ gốc Phi (OR= 1,60; 95% CI, 1,10-2,31; p =0.013) [32], hay một số ột bi n gen COX-1 l m tăng

nguy ơ phát tri n ung thư tuy n ti n liệt [94] Đ c biệt, các bi n ổi trên gen mã

hóa cho các protein thuộc các phức hệ hô hấp t b o như gen ND1, ND3 thuộc phức hệ hô hấpI, COX-1, COX-2 thuộc phức hệ hô hấp IV ượ xá ịnh trên

nhi u loại ung thư trong UTĐTT [19, 36, 55, 122, 123]

1.3.1.1 Bi i trên gen ND1

Gen ND1 (NADH dehydrogenase 1) dài 955 bp, vị trí từ bazơ 3307 n 4262

trong hệ gen ty th , mã hóa cho protein NADH dehydrogenase 1, là protein thuộc phức hệ hô hấp I - phức hệ ầu tiên trong chuỗi v n chuy n iện tử của ty th [133]

Bi n ổi của gen ND1 có th l m tăng á iện tử tự do, dẫn n sự gi tăng á gốc

ROS do l m tăng mứ ộ stress oxy hóa trong t b o ung thư [122] Bi n ổi tại

một số vị trí trên gen ND1 ượ xá ịnh ở ung thư vú [106] ung thư buồng

trứng [79], u th n [87] v UTĐTT [122]

Yusnita v s (2010) xá ịnh ượ 11 ột bi n i m và 13 loại h nh khá

nh u thuộ gen ND1 ở bệnh nh n UTĐTT Trong b ột bi n T3394C, A3434G

và C3497T xảy ra trong một khu vực gen có tính bảo thủ cao có th li n qu n n việ th y ổi cấu trúc và chứ năng ủa enzyme NADH dehydrogenase 1 Tất cả các

ột bi n n y u ượ xá ịnh l ột bi n dòng mầm trong 10 ột bi n ược công bố tr n ơ sở dữ liệu ngân hàng gen ty th MITOMAP [122] Đột bi n T4216C

l m th y ổi axit amin Tyrosin (Y) thành Histidin (H) xảy ra với t lệ 8/30 mẫu (27%); 7 ột bi n khác gồm T3290C, T3456C, A3480G, C3622T, C3741T, T3777C

20

và T3847C với tần suất 1/30 mẫu ũng ượ xá ịnh trên gen ND1 ở bệnh nhân

UTĐTT Đ c biệt á ột bi n này chỉ xá ịnh ược ở mô u, không thấy trên mô LCU (p<0,05) [19] Ngo i r ột bi n G3380 l m th y ổi axitamin Agrinine thành Glycine ở trạng thái ồng t bào chất, h y ột bi n mất 15 nu ũng ược

xá ịnh trên gen ND1 ở bệnh nh n UTĐTT [62, 116] Bên cạnh h nh

4164G ũng ượ xá ịnh ở ung thư vú [1] ung thư phổi hay trên một số ối

tượng bị mắc bện ơ thần kinh [125]

M c dù một số bi n ổi của gen ND1 ty th ượ xá ịnh ở UTĐTT nhưng

việ ánh giá mối liên quan của bi n ổi với á i m bệnh học của bệnh vẫn còn thi u Vì v y, nghiên cứu sàng lọc bi n ổi và k t hợp ánh giá mối liên quan với á i m bệnh học là cần thi t có th hi u rõ hơn v i trò ủa bi n ổi với

ti n tri n củ ung thư

1.3.1.2 Bi i trên gen ND3

Gen mã hóa cho protein NADH dehydrogenase 3 (ND3) vị trí từ b se 10059 n base 10404 trong hệ gen ty th [133] Bi n ổi trên gen ND3 ượ xá ịnh ở ung

thư vú [32, 43, 48] ung thư phổi [123] và một số bệnh lý khác [112, 125] Trong số

h nh 10398G (bi n ổi nucleotide A thành G tại vị trí 10398) dẫn n thay

ổi axitamin từ Threonin thành Alanine trong sản phẩm của gen ND3 [91] Vai trò

củ h nh 10398G ối với bi u hiện bệnh vẫn òn nh u qu n i m khá nh u v

hư thống nhất ng tr n ối tượng ung thư vú nghi n ứu của Canter và cs (2005) phát hiện mối liên quan giữ h nh 10398G với bệnh ung thư vú trong len

10398 l m tăng nguy ơ mắc trên những người phụ nữ Mỹ gốc Phi (OR = 1,6; 95% CI: 1,10-2 31; p = 0 013) nhưng lại không thấy mối liên quan này ở người Mỹ da trắng [32] Vẫn tr n ối tượng bệnh ung thư vú ở người Mỹ gố u ov rrubi s v

s (2008) hỉ ra rằng h nh 10398G l m tăng nguy ơ ung thư vú (OR = 1 8; 95% CI: 1,14–2 81) Đ c biệt, những phụ nữ m ng ồng thời bi n th 10398G và 12308G th l m tăng hơn nguy ơ phát tri n ung thư vú (OR = 3 03; 95% I = 1 53–6,11), trái lại, n u m ng ồng thời bi n th 10398A và 12308G thì lại giảm nguy ơ

21

phát tri n ung thư vú (OR = 0,46; 95% CI = 0,24–0,88) [43] Tr n ối tượng ung thư

vú người B L n ũng xá ịnh thấy tần suất bi n ổi A10398G ở nhóm bệnh nhân

o hơn ý nghĩ thống kê so với nh m ối chứng [44] Trong khi nghi n ứu

củ Ji ng v s (2014) lại ho thấy không có sự khác biệt v bi n ổi A10398G trong nhóm bệnh nh n ung thư vú v nh m ối chứng [70] Ở ối tượng bệnh nh n ung thư

vú người Việt Nam, trong nghiên cứu củ Linh v s (2014) xá ịnh h nh tại vị trí 10398 ty th có liên quan với mứ ộ biệt hóa của t b o ung thư (p<0 05) nhưng

không liên quan với á i m bệnh học khác củ ung thư vú [6] Đối với ung thư

phổi h nh 10398G ượ xá ịnh ở dạng dị t bào chất với mứ ộ dị t bào chất rất khác nhau ở các bệnh nh n Đ c biệt ở những bệnh nhân có mứ ộ dị t bào chất thấp là một dấu hiệu ti n lượng xấu của bệnh [123]

Nh n hung h nh tại vị tr 10398 ược nghiên cứu ở một số loại ung thư

c biệt ược nghiên cứu khá kỹ tr n ung thư vú Tuy nhi n v i trò v ơ h tác ộng củ h nh n y ối với sự bi u hiện bệnh vẫn hư ược giải th h rõ v hư

thống nhất Đối với bệnh UTĐTT dữ liệu li n qu n n bi n ổi của gen ND3 còn

thi u trên cả th giới và ở Việt Nam nên vẫn cần ti p tụ ược nghiên cứu

1.3.1.3 M t s bi i c a gen COX-1 và COX-2

Gen mã hóa cho protein cytochrome c oxidase I (COX-1) và cytochrome c dase II (COX-2) ượ ịnh vị trên sợi n ng của ADN ty th từ vị tr b zơ 5904 n

oxi-7445 (COX-1) v 7586 n 8269 (COX-2) [133] Protein cytocrome c oxidase I

thuộc phức hệ hô hấp IV là enzyme thứ ba và cuối cùng của chuỗi v n chuy n iện

tử của quá trình hô hấp ty th [129] Nhi u ột bi n sôma trên gen COX-1 và COX-2

ty th ược công bố ở một số bệnh khác nhau [125]

Ở bệnh nh n UTĐTT bằng phương pháp P R-RFLP và giải trình tự sản phẩm PCR của 28 c p mồi ược thi t k gối l n nh u hih r v s (2011) s ng lọc ược nhi u bi n ổi tr n á gen khá nh u trong bi n ổi G6709A thuộc gen

COX-1 Bi n ổi G6709 l m th y ổi axit amin Glycine thành Glutamic tại vị trí

269 (G269E) có th dẫn n l m th y ổi cấu trú α-helix của phân tử protein Ngoài ra, các bi n ổi G5973A, A6277G, G6718A và 6146G ũng ượ xá ịnh

ở gen này [36,61, 116]

22

Tr n ối tượng bệnh nh n ung thư vú người Ấn Độ Gh t k v s (2014) xá

ịnh ượ 88 ột bi n trên gen COX-1 ty th trong n 24 ột bi n hư ược

báo áo Như v y ph n t h ột bi n ADN ty th có khả năng phát hiện các y u tố nguy ơ li n qu n n ung thư vú [57] Ngo i r h i ột bi n dòng mầm C7028T, T7175 ũng ượ xá ịnh [106] Đột bi n T6124C ở trạng thái dị t b o hất

l m th y ổi axit amin từ Methionine thành Threonine (từ một axit amin không phân cực thành một axit amin phân cự ) ượ xá ịnh ở bệnh nh n ung thư tuy n ti n liệt Đột bi n này có th dẫn n làm suy y u quá trình oxy hóa của cytochrome c trong phức hệ IV v tăng sản phẩm của quá trình oxi hóa [22] ũng tr n bệnh nhân ung thư tuy n ti n liệt, một nghiên cứu khá xá ịnh ược 102 loại h nh ơn

nu leotit trong á h nh T6221 v T7389 6340T li n qu n n bệnh ung thư n y (p<0,05) [17, 94]

Đ c biệt ột bi n G6930 thuộc gen COX-1 ty th ở dạng dị t b o hất g y h u

quả nghiêm trọng l m th y ổi bộ ba mã hóa cho Glycine thành bộ ba mã hóa k t thúc dẫn n làm mất 170 axit amin cuối ng ( hi m 33%) ủa chuỗi polypeptit

cytochrome c oxidase, làm giảm 90% sản phẩm của gen COX-1 Đột bi n G6930A ở gen COX-1 ượ xá ịnh là một ột bi n gây bệnh [31]

Trên gen COX-2 ty th một số bi n ổi ũng ượ xá ịnh tr n nh m bệnh

nhân hội hứng M P (MUTYH sso i ted polyposis) l hội chứng nguy ơ o

dẫn n UTĐTT Đ biệt một số ột bi n tr n gen COX-1 và COX-2 li n qu n

n ột bi n gen KRAS l gen tr n nh n ượ xá ịnh li n qu n n hội hứng

MAP [113] ũng tương tự Erri hiello v s (2015) chỉ ra rằng ột bi n ADN ty

th xảy ra chủ y u ở bệnh nhân MAP (p=0,0055) so với nhóm bệnh nhân FAP

(Famil-ial Adenomatous Polyposis), phân bố chủ y u ở gen COX-2 (p<0 0001) v thường là dạng bi n ổi từ nucleotide G thành A [55] Ngoài ra, trên gen COX-2, a hình

G7853 ượ xá ịnh tr n ối tượng bệnh nhân bị hội chứng liệt thần kinh thị giác di truy n theoLeber – hội chứng LHON) và ở một số bệnh ơ thần kinh khác [125] Tuy nhiên, h nh G7853A hư thấy ược công bố ở UTĐTT

Như v y, một số bi n ổi trên gen COX-1 và COX-2 ty th ượ xá ịnh có

li n qu n n một số bệnh ung thư trong UTĐTT V v y, sàng lọ v ánh giá

sự lão hóa [26, 39, 92] Theo Krishn n v s (2008) mất oạn xảy ra là do quá trình sửa chữa ADN ty th bị sai hỏng [72]

Trong các loại mất oạn lớn th mất oạn 4977 bp l mất oạn phổ bi n xảy r từ

vị tr 8470 n 13447 l m mất i á gen m h ho 4 polypeptide ủa phức hệ I

(ND3, ND4, ND4L và ND5), 1 polypeptide (COXIII) của phức hệ IV và 2 polypeptide của phức hệ V (ATP8, ATP6), 5 tARN v n chuy n các axitamin Mất oạn 4977 bp

xảy ra giữ 2 oạn trình tự l p dài 13 nu (ACCTCCCTCACCA) ở h i ầu vị trí 8470–

8482 (thuộc gen ATP 8) v 13447–13495 (thuộc gen ND5) [38, 39, 47], (Hình 1.4)

24

xá ịnh có 20 trong tổng số 104 bệnh nh n UTĐTT người Trung Quốc có mất oạn 4977 bp ở mô u ho c mô LCU ho c ở cả 2 mô với mứ ộ mất oạn ở mô u luôn thấp hơn so với mô LCU trên cùng một bệnh nhân và mứ ộ mất oạn liên

qu n n gi i oạn bệnh (p<0,031) nhưng kh ng li n qu n n sự di ăn hạch, ộ tuổi và cân n ng của bệnh nhân Từ k t quả , nhóm nghiên cứu k t lu n rằng mất oạn 4977 bp ở ADN ty th có th ng v i trò trong gi i oạn ầu của UTĐTT Hơn nữa, k t quả ịnh lượng số bản sao cho thấy, trong hầu h t á trường hợp, số bản sao ở mô u o hơn so với mô LCU Trên mô u, số bản sao ADN ty th ở những bệnh nhân bị mất oạn o hơn so với những bệnh nhân không có mất oạn Số bản

s o li n qu n n gi i oạn bệnh và sự di ăn hạch (p<0,01) Như v y, mất oạn

4977 bp trên ADN ty th v sự th y ổi v số bản sao của ADN ty th có th trở thành một chỉ thỉ sinh học ti m năng hỗ trợ cho chẩn oán UTĐTT [38]

Ở một số loại ung thư khá như ung thư phổi [46] ung thư vú [47, 50], ung thư dạ d y v ung thư v ng ầu cổ [47], k t quả nghiên cứu ũng hỉ ra rằng t lệ mất oạn tr n m L U lu n o hơn so với mô u Vai trò của mất oạn 4977 bp với một số i m bệnh họ ũng ượ ánh giá Ở bệnh nh n ung thư phổi, t

lệ mất oạn liên quan với ộ tuổi và thói quen hút thuốc lá [46] Ở bệnh nhân ung thư vú t lệ mất oạn 4977 bp o hơn áng k ở những bệnh nhân có thụ th estrogen (ER) dương t nh di ăn hạch so với những bệnh nhân có ER âm tính, không có hạ h di ăn [50] Trái lại, có nghiên cứu lại chỉ ra rằng mất oạn 4977

bp kh ng ng v i trò qu n trọng ối với ung thư ho kh ng li n qu n n ung thư [21, 119]

Đ c biệt, một số nghiên cứu còn cho thấy, t lệ mất oạn 4977 bp khác biệt ở các chủng tộ người khác nhau [50, 51]

Như v y, nghiên cứu v mất oạn 4977 bp tr n ối tượng UTĐTT v á loại ung thư khá d nh ược sự quan tâm của nhi u nhóm nghiên cứu trên th giới Phần lớn k t quả từ các nghiên cứu u cho thấy y l dạng mất oạn phổ bi n, t

lệ mất oạn ở mô u có xu hướng thấp hơn so với mô LCU Một số nghiên cứu ánh giá ược mối liên quan của mất oạn với một số i m bệnh học và ti n

25

tri n củ ung thư Tuy nhi n ở bệnh nh n UTĐTT người Việt Nam, t lệ và mối liên quan giữa mất oạn 4977 bp với á i m bệnh học vẫn còn thi u và vẫn cần ti p tụ ược nghiên cứu

1.3.3 Sự ay ổi số bản sao ADN ty thể và bệ u

Sự th y ổi số lượng bản sao ADN ty th ượ c p n trong các nghiên cứu ở các loại ung thư vú [85, 109, 111, 118, 121], ung thư phổi [65] UTĐTT [56,

95, 108] ung thư g n [120] ung thư th n [117] và một số dạng ung thư khá [76] Trong số số bản sao ADN ty th giảm ở ung thư g n ung thư dạ d y ung thư vú nhưng tăng trong ung thư bi u mô tuy n nước bọt ung thư v ng ầu cổ ung thư tuy n giáp ung thư buồng trứng ung thư nội mạc tử ung ung thư tuy n ti n liệt và UTĐTT [76]

Ph n t h tổng hợp (meta-an lysis) từ 36 nghi n ứu bệnh - hứng của Hu và cs (2016) cho thấy mối li n qu n áng k giữ sự th y ổi số bản s o ADN ty th với nguy ơ mắc một số loại ung thư như ung thư vú ung thư hạch lympho Đ c biệt, những người phương T y hịu ảnh hưởng nhi u hơn so với người châu Á [66] Năm

2012, nghiên cứu của Thyagarajan và cs chỉ ra rằng, sự tăng h y giảm số lượng bản sao ADN ty th u l m tăng nguy ơ mắ UTĐTT (mối quan hệ hình chữ U giữa

sự th y ổi số bản sao ADN ty th v nguy ơ mắ UTĐTT) [108] Trong khi nghiên cứu của Qu và cs (2011) cho thấy, số bản sao ADN ty th tăng mới l m tăng nguy ơ mắ UTĐTT số bản sao ADN ty th ở các mẫu UTĐTT o hơn áng k

so với nhóm ối chứng (p<0,001) [95] Đ c biệt, một số nghiên cứu khác còn ti n

h nh xá ịnh số bản sao ADN ty th trên mô u và mô LCU của cùng bệnh nhân UTĐTT [42, 56, 90] eng v s (2011) ho thấy tỉ lệ số bản sao ADN ty th tương

ối ở m u tăng so với mô LCU (p<0,01), sự th y ổi số bản sao ADN ty th liên quan với á gi i oạn bệnh nhưng kh ng li n qu n với giới tính [56] Khác với k t quả nghiên cứu củ eng v s Mohiden v s lại cho thấy trên 60% số bệnh nhân

có số bản sao ADN ty th giảm ở mô u so với mô LCU, sự th y ổi số bản sao ADN

ty th ũng xu hướng li n qu n n gi i oạn bệnh (p=0 0075) nhưng kh ng li n

26

qu n n á i m như giới t nh ộ tuổi, vị tr ung thư mứ ộ biệt hóa củ bệnh UTĐTT [90] ũng tr n ối tượng bệnh nh n UTĐTT ui v s (2013) hỉ ra rằng th y ổi số bản sao ADN ty th li n qu n n sự di ăn hạch (p<0,05), không

li n qu n n á i m như ộ tuổi, giới tính, mứ ộ biệt h v gi i oạn bệnh [42]

Mối liên quan giữ tăng số bản s o v nguy ơ mắ ung thư hạ h bạ h huy t (OR

= 1,645; 95% CI = 1,117-2,421; p = 0,012) ung thư vú (OR =1,721; 95% CI = 1,130-2,622; p = 0,011) ũng ượ xá ịnh [66] Tuy nhi n số bản s o ADN ty

th tăng l m giảm nguy ơ mắ ung thư xương [89] Như v y, các k t quả nghiên cứu nêu trên ho thấy sự th y ổi số bản sao ADN ty th có ảnh hưởng khác nhau

n các loại ung thư khá nh u, sự tăng số bản sao ADN ty th có th áp ứng với stress oxi hóa [77] Tuy nhiên, các thông tin v mối liên quan giữa sự th y ổi số bản sao ADN ty th với á i m bệnh học củ ung thư òn nhi u i u hư rõ

1.4 NG N Ứ N Đ Ủ ADN T T Ở T N

Ở Việt N m, nghi n ứu v bi n ổi của gen ty th dành ượ sự qu n t m

ủ một số nh m nghi n ứu trong những năm gần y Phần lớn á nghi n ứu t p trung v o s ng lọ á ột bi n h nhở một số gen ty th tr n các ối tượng bệnh

nhân nghi hội chứng ơ n o [4], hội chứng MELAS [5] bệnh thần kinh ơ [9] và ung thư vú [1, 6, 12] Ngo i r một số nghi n ứu khá ũng ti n h nh s ng lọ á

bi n ổi thuộ ADN ty th ở một số á th người Việt N m [8,10,11] ho c trên một

số tộ người Việt Nam [2, 3] Tuy nhiên, ối với UTĐTT nghi n ứu v bi n ổi

ADN ty th và mối liên quan giữa bi n ổi với i m bệnh học vẫn là một hướng nghiên cứu mới

M t khác, qua tìm hi u các k t quả nghiên cứu trên th giới cho thấy nghiên cứu

v bi n ổi ADN ty th có ti m năng t m ra các chỉ thị giúp hỗ trợ chẩn oán i u trị bệnh ho c cung cấp thêm những hi u bi t v một số y u tố có th li n qu n n

sự phát sinh, ti n tri n củ ung thư Vì v y, việc thự hiện t i lu n án n y ũng không nằm ngoài mục tiêu ung ấp dữ liệu có hệ thống v á bi n ổi tr n một số

27

gen ty th trong mối liên quan với á i m bệnh học của bệnh UTĐTT người Việt Nam qu hy vọng sẽ t m ược những bi n ổi có ti m năng th phát tri n thành chị thị giúp hỗ trợ chẩn oán sớm bệnh

1.5 Ư NG T N Đ T BI N GEN TY TH

Hiện nay, á phương pháp phân tích ADN nói chung và ADN ty th nói riêng là những phương pháp hiện ại cho phép phát hiện nh nh v h nh xá á ột bi n gen gây bệnh S u y l một số kỹ thu t v ng ược sử dụng phát hiện các

bi n ổi ADN ty th

1.5.1 Kỹ thuật PCR kết hợp với RFLP (PCR-RFLP)

PCR- RFLP là sự k t hợp kỹ thu t phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) với kỹ thu t

h nh ộ d i á oạn cắt giới hạn (RFLP) Nguyên tắc của kỹ thu t này là k t hợp giữa PCR nhân bản á oạn ADN mục tiêu lên hàng triệu lần so với b n ầu,

s u dùng enzyme cắt giới hạn xá ịnh bi n ổi Khi trình tự nucleotide của ADN th y ổi có th dẫn n sự th y ổi vị tr nh n bi t của enzyme, vì v y, th thêm hay bớt á i m phân cắt của enzyme giới hạn Cá oạn ADN phân cắt có

k h thướ khá nh u th nh n bi t ượ qu phổ băng khi iện di Đ phát hiện

bi n ổi trong ADN thì phải lựa chọn ược enzyme giới hạn phù hợp Dựa trên trình

tự nh n bi t của enzyme có sẵn tr n oạn ADN chứa bi n ổi có th xá ịnh ược mẫu bị bi n ổi ho c không bị bi n ổi s u khi iện di sản phẩm của phản ứng cắt enzyme Hiện nay, nhi u nghiên cứu sử dụng kỹ thu t PCR-R LP xá ịnh các bi n ổi của ADN trong ADN ty th Akouchekian và cs (2011) [19]

xá ịnh thấy 8/30 bệnh nh n UTĐTT ột bi n T4216C thuộc gen ND1 ty th

bằng phương pháp P R-R LP Tương tự ũng bằng phương pháp n y h nh 10398G ượ xá ịnh ở bệnh nhân ung thư vú [67, 70] Ở Việt Nam, PCR-

R LP ũng ược sử dụng phổ bi n xá ịnh bi n ổi trên ADN ty th ở bệnh ung

thư vú [1, 6], bệnh nhân bị hội chứng MELAS [4, 10] Nhìn chung, PCR-RFLP là

kỹ thu t ơn giản, ít tốn kém vì v y nó ược sử dụng phổ bi n ở nhi u phòng thí

28

nghiệm xá ịnh á ột bi n i m tr n ADN nhân và ADN ty th Tuy nhiên,

n u t lệ ột thấp thì kỹ thu t này kh phát hiện ượ [33]

1.5.2 X ị ột biế a ằng giải trình tự gen

Giải trình tự gen l phương pháp khẳng ịnh h nh xá ột bi n h nh của gen ho n nay, giải trình tự gen ược cải ti n thành giải trình tự tự ộng với ưu i m lớn nhất là cung cấp ầy ủ th ng tin như: loại bi n ổi và vị trí bi n ổi Hiện nay, giải trình tự gen ược nhi u nghiên cứu sử dụng sàng lọc các bi n ổi trên hệ gen ty th Chiharavà cs (2011) [36] ti n hành giải trình tự toàn bộ ADN ty th trên 11 dòng t b o UTĐTT sàng lọc các bi n ổi,

k t quả xá ịnh ược nhi u bi n ổi tr n á gen khá nh u trong xá ịnh ược 4 bi n ổi ở dạng ồng t bào chất, 6 bi n ổi ở dạng dị t bào chất là

các bi n ổi mới ũng bằng phương pháp n y các bi n ổi trên gen COX-1 ty

th ở bệnh nh n ung thư tuy n ti n liệt ung thư ruột k t ượ xá ịnh [17, 83] Ở Việt Nam, giải trình tự gen ũng v ng ược sử dụng phổ bi n

sàng lọc và khẳng ịnh các bi n ổi của ADN ty th ở một số bệnh ung thư [1, 12], bệnh nhân hội chứng MELAS [5] hay sàng lọc các bi n ổi của ADN ty th

ở các nhóm tộ người Việt Nam [2, 3] Tuy nhi n phương pháp giải trình tự gen

òi hỏi thi t bị ắt ti n và khó phát hiện ột bi n khi chúng xuất hiện với mứ ộ thấp [103]

Ngo i r một số kỹ thu t như: l i dot-blot, ph n t h h nh ấu hình sợi ơn

SS P (single-str nded onform tion l polymorphism) ũng ượ sử dụng phát

hiện á ột bi n gen ty th [103]

Tóm lại phát hiện các bi n ổi trong hệ gen ty th có nhi u phương pháp

và kỹ thu t ược sử dụng, với những ưu v nhượ i m ri ng Tuy nhi n ho n nay PCR-RFLP và giải trình tự gen vẫn là những kỹ thu t ơn giản, hiệu quả và ược sử dụng phổ bi n sàng lọ á ột bi n h nh ủa hệ gen ty th

29

1.5.3 Các kỹ thuậ ù ể ị ợng mứ ộ ị ế ấ ố bản sao ADN ty thể

á ột bi n ADN ty th có th tồn tại ở cả dạng ồng t bào chất và dị t bào chất với mứ ộ khác nhau Mứ ộ dị t b o hất ủa ADN ty th là một trong những y u tố có th ảnh hưởng n sự bi u hiện của bệnh [13], vì v y, việ ịnh lượng mứ ộ dị t b o hất ủa ADN ty th là cần thi t vì nó có th là chìa khóa cho chẩn oán với từng cá th [103] Ngo i r á phương pháp, kỹ thu t ịnh lượng òn ược sử dụng phát hiện ột bi n với t lệ rất thấp mà kỹ thu t PCR-

R LP kh ng ph n t h ược Cá phương pháp ịnh lượng ược sử dụng phổ bi n hiện nay gồm:

Kỹ thuật real-time PCR

Real-time P R (P R ịnh lượng) là một kỹ thu t ược phát tri n dựa trên nguyên tắc củ P R d ng khu h ại v ịnh lượng một oạn ADN h với ộ nhạy o Khá với P R k t quả khu h ại trong real-time P R ược hi n thị ngay sau mỗi chu kì phản ứng Hiện n y y l kỹ thu t ược sử dụng nhi u nhất trong nghiên cứu bi n ổi số lượng bản sao ADN v ịnh lượng mứ ộ ột bi n của ADN ty th [103] Real-time PCR ho ph p xá ịnh số bản sao ADN b n ầu có trong mẫu thử với ộ h nh xá v ộ nhạy cao Phương pháp n y thường sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN, khi có m t của sợi ADN mạch kép chất nhuộm màu

có ái lực rất cao và phát ược ánh sáng huỳnh quang khi nh n ược nguồn sáng kích thích Bên cạnh sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN còn có kỹ thu t sử dụng ầu

dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh qu ng ịnh lượng Kỹ thu t Real-time

P R ược sử dụng ịnh lượng số bản sao, mứ ộ dị t bào chất ủ ADN ty

th ở mẫu từ một số bệnh ung thư [38, 65, 109, 121] Hơn nữa, kỹ thu t real-time

P R ho ph p ịnh lượng ột bi n ADN ty th với ộ nhạy cao, có th phát hiện ột

bi n ở mức thấp dưới 1% [100, 103, 119]

Ngo i r phương pháp HPL (High-performance liquid chromatography-sắc ký lỏng hiệu năng o) ũng ược sử dụng xá ịnh số bản sao và mứ ộ dị t bào chất của ADN ty th [78]

30

Ư NG 2 NG N Ư NG NG N ỨU

2.1 NGUYÊN LI U

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

126 c p mẫu mô gồm mô u và mô lân c n u (LCU) của 126 bệnh nh n UTĐTT cùng với các thông tin của bệnh nhân ược cung cấp từ Kho Giải phẫu bệnh - T bào, Bệnh viện K và Bệnh viện Quân Y 103 Mẫu nghiên cứu ược thu th p từ năm

2012 n năm 2016 Trong Bệnh viện K cung cấp 86 c p mẫu mô, Bệnh viện Quân Y 103 cung cấp 40 c p mẫu mô và có kèm theo 40 mẫu máu ngoại vi của các bệnh nh n tương ứng, mẫu máu ược lấy trước khi phẫu thu t Đối tượng nghiên cứu ký giấy ồng ý tham gia nghiên cứu và cho mẫu (Phụ lục5)

Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm và thu th p thông tin v một số c

i m như ộ tuổi, giới tính, vị tr k h thướ u ộ biệt h v gi i oạn bệnh của bệnh nh n UTĐTT y l những i m phản ánh mứ ộ và ti n tri n củ ung thư Trong ộ biệt h v gi i oạn bệnh (theo phân loại TNM) ược phân chia theo tiêu chuẩn của tổ chứ ung thư Ho Kỳ [18], ộ tuổi x p thành 2 nhóm là trên 50 và dưới 50 tuổi (vì theo thống kê của tổ chứ ung thư Ho kỳ thì trên 90% số ca mắc UTĐTT ượ xá ịnh sau 50 tuổi [25], vị tr ung thư ược chia thành hai nhóm là ung thư ại tràng và trực tràng theo cấu tạo giải phẫu K h thước khối u ược chia

th nh 3 nh m: k h thước nhỏ hơn 3 m; từ 3 n 3,5 cm và lớn hơn 3 5 m

Tuy nhiên, trong 126 bệnh nh n ung thư th m gia nghiên cứu, một số bệnh nhân chúng tôi không thu th p ượ ầy ủ á th ng tin như: 2 bệnh nhân thi u thông tin

v ộ tuổi, 7 bệnh nhân thi u thông tin v k h thước u, 3 bệnh nhân thi u thông tin

v gi i oạn bệnh và 34 bệnh nh n kh ng xá ịnh ược mứ ộ biệt hóa

nh sá h bệnh nh n v một số thông tin v i m bệnh họ ủa từng bệnh

nh n UTĐTT phi u lấy mẫu ược trình bày ở các Phụ lục 3 và Phụ lục 6 Thống kê

số lượng mẫu theo i m bệnh học của 126 bệnh nh n UTĐTT ược trình bày

trong Bảng 2.1

Ghi chú: T: Tumor (khối u), N: Node (hạ ) M: M t st s s ( ăn), đoạn I:

T1-2N0M0; đoạn II: T3-4N0M0; đoạn III: T bất kỳ N1-2M0; đoạn IV: T bất kỳ N bất kỳ M1

Ngoài ra, 67 mẫu máu củ người khỏe mạnh ượ Kho S ng lọ máu Viện Huy t học và Truy n máu Trung ương ung ấp ượ d ng l m ối chứng với mẫu máu của bệnh nh n ung thư

32

Các mẫu nghiên cứu ược thu th p v v n huy n từ Bệnh viện v Phòng th nghiệm bằng b nh nitơ lỏng ho c hộp á lạnh và bảo quản ở tủ lạnh -800C (với mẫu mô) và -250 ( ối với mẫu máu) chuẩn bị cho các phân tích ti p sau

Tiêu chuẩn l a chọn mẫu u t

- Mẫu ược Bệnh viện cung cấp từ những bệnh nh n ược phẫu thu t với

- Mẫu mô sau khi phẫu thu t ược rửa bằng ệm Kali phosphate 100mM, pH

8 0 v ược chia vào các ống 1,5 ml riêng biệt chuẩn bị tách chi t ADN tổng số

- Đối với mẫu máu: Máu ngoại vi ược chống ng bằng E T ược tách huy t tương Máu ượ lưu trữ trong các ống chống ng bảo quản ở tủ lạnh -250C

Tiêu chuẩn loại trừ không lấy mẫu

Bệnh nhân bị UTĐTT do ung thư ở á ơ qu n khá di ăn n, bệnh nh n

qu i u trị hóa trị, xạ trị, UTĐTT tái phát ho c mẫu m bị hoại tử

Mini Kit Norgen, Canada

2 Agarose Invitrogen, Mỹ Điện di

4 qPCR BIO SyGreen Mix

LO-ROX 2X Biosystem, Anh

Real-time PCR

5 Các enzyme cắt giới hạn erment s Đức; New England

Biolabs (NEB), Anh PCR-RFLP

6 CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Scientific, Mỹ Nh n dòng

7 GeneRuler 100bp ADN Ladder Thermo Scientific, Mỹ ADN chuẩn

Các hóa chất còn lại u ạt ộ sạch phân tích cho nghiên cứu sinh học phân tử

2.2 MÁY VÀ TRANG THI T BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

á máy ược dùng trong nghiên cứu bao gồm: máy o nồng ộ ADN NanoDropTM 2000c (Thermo Scientific, Mỹ), máy nhân gen PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ) máy real-time PCR MyGo Pro (IT-IS Life Science Ltd, Anh), máy

ly t m 5417R (Eppendorf Đức), thi t bị iện di (Bior d Mỹ) hệ thống chụp ảnh iện di Geldoc (Biorad, Mỹ), tủ lạnh -200C và -800 tủ n to n sinh họ (Nu ire Mỹ) v á á dụng cụ, trang thi t bị ơ bản khác của phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng i m Công nghệ Enzyme và Protein

Mẫu m UTĐTT b o gồm mẫu mô u và mẫu mô LCU của cùng một bệnh

nh n ược chia với lượng tương ương khoảng 0,02-0,05g/mẫu vào hai ống ly tâm 1,5ml riêng biệt Mẫu m ược lấy ra từ tủ -800 r ng chuẩn bị tách ADN tổng

số ADN tổng số ượ tá h bằng kit tá h hi t QIAamp ADN Mini Kit (QIAGEN, Đức) Chi ti t của quy trình tá h hi t theo hướng dẫn ủa nhà sản xuất [137]

35

2.3.2 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu

Mẫu máu ngoại vi của bệnh nh n UTĐTT v mẫu máu củ người khỏe mạnh ược tách huy t tương v ược chia với lượng 200 µl /mẫu vào các ống ly tâm 1,5 ml riêng biệt chuẩn bị tách ADN tổng số ADN tổng số từ mẫu máu ượ tá h bằng kít Blood Genomic ADN Isolation Mini Kit (Norgen, Canada) Chi ti t á bước củ quy tr nh tá h hi t theo hướng dẫn ủa nhà sản xuất [138]

Ki m tr sản phẩm ủa quá trình tách chi t ADN từ mô và máu bằng iện di trên gel agarose nồng ộ 0 8 n 1% nhuộm bằng ethidium bromide (EtBr) v hụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh iện di Geldoc (Biorad, Mỹ) Nồng ộ v ộ sạ h ủ ADN tổng số ượ xá ịnh bằng máy N no rop 2000

2.3.3 Đ ện di trên gel agarose và gel polyacrylamide

Điện di l phương pháp thường ượ d ng xá ịnh sự m t phân tách hay tinh sạ h á ại phân tử sinh họ như ADN và protein Đối với ADN t h iện m

tr n b m t ở PH 7 n n khi iện di húng di huy n v ự dương ủ iện trường

Tố ộ di huy n ủ ph n tử ADN phụ thuộ v o k h thướ ph n tử ADN nồng

ộ gel v iện trường Gel agarose và polyacrylamide là hai loại gel thường d ng phân tích ADN Việc lựa chọn loại gel nồng ộ gel dự v o k h thướ ph n tử ADN cần ki m tr á bước thực hiện tham khảo theo quy trình của Sambrook và

cs (2001) [97]

2.3.4 Nhân bả n gen ty thể chứa ột biến quan tâm bằng kỹ thuật PCR

á oạn ADN của các gen ND1, ND3, COX-1, COX-2 và củ oạn ADN ty th

ược nối lại sau khi có mất oạn 4977 bp ược khu h ại bằng phản ứng PCR với các c p mồi c hiệu Khuôn cho phản ứng PCR là ADN ty th có trong ADN tổng

số ược tách chi t từ các mẫu nghiên cứu

t k p u o p

36

Sử dụng phần m m thi t k mồi: Primer - BLAST trên NCBI [132] v tr nh tự ADN ty th th m hi u m số N 012920.1 thi t k á p mồi hiệu ho phản ứng P R á p mồi ược chúng tôi thi t k dùng chung cho việc nhân bản á oạn gen qu n t m tr n á ối tượng UTĐTT ung thư vú v một số bệnh khá Tr nh tự vị tr bắt p k h thướ sản phẩm P R nh n l n từ á p mồi

Gen

p o p -RFLP