Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang

37 Bảng 3.5 Hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non .... Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Đình Dũng

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN

VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Trương Hương Lan GS.TS Phạm Văn Ty

Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực tập tốt nghiệp và hoàn thành luận văn , tôi đã nhận được

sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trương Hương Lan - Chủ nhiệm bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm, người

đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cặn kẽ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Văn Ty - Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thầy đã hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể cán bộ, nhân viên trong Phòng Thực phẩm và dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm đã quan tâm, giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Tôi cũng xin cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo, trong Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã chỉ bảo, tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và những người thân đã ở bên tôi, tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2014

Học viên

Nguyễn Đình Dũng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về rượu vang 3

1.1.1 Vài nét về rượu vang 3

1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang 4

1.2 Vi khuẩn lactic 7

1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang 10

1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni 11

1.3 Quá trình lên men malolactic 12

1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic 12

1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic 14

1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất lượng rượu vang 15

1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic 18

1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic 18

1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic 19

1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong sản xuất vang 20

1.5 Các phương pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lượng rượu vang 21

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất 25

2.1.1 Nguyên liệu 25

2.1.2 Vi sinh vật 25

2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật 25

2.1.4 Hóa chất 26

2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp công nghệ 26

2.2.2 Phương pháp vi sinh vật 27

2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa 28

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rượu vang 31 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận 31

3.1.2 Xác định khả năng lên men malolactic của các chủng vi khuẩn phân lập 33

3.1.3 Xác định khả năng chịu SO 2 của 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được 36 3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng NT12 trên môi trường rượu vang non 37

3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic 42 3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu quá trình lên men malolactic O.oeni NT12 44

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên men malolactic 44

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic 47

3.4.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân tích rượu vang đỏ trước và sau lên men malolactic 15

Bảng 3.1 Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được 31

Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của các chủng vi khuân lactic phân lập được 34

Bảng 3.3Khả năng lên men malolactic của 8 chủng vi khuẩn phân lập được 35

Bảng 3.4 Hàm lượng axít malic và axít lactic trước và sau lên men Malolactic trên môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm lượng K2S2O5. bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v 37

Bảng 3.5 Hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 38

Bảng 3.6 Hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 39

Bảng 3.7 Hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 40

Bảng 3.8 Hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 41

Bảng 3.9 Một số chất bay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 02 chủng 43

Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau khi lên men rượu 45

Bảng 3.11 Hàm lượng axít malic (g/l) được phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác nhau theo thời gian 46

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự chuyển hóa axít malolaic thành axít lactic trong quá trình lên men malolactic 48

Bảng 3.13 Thành phần của rượu vang sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic 49

Bảng 3.14 Thời gian lên men và hàm lượng axít malic, axít lactic sau quá trình lên men malolactic ở các thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác nhau 51

Bảng 3.15 Rượu etanol được tạo thành và hàm lượng đường sót sau quá trình lên men malolactic 52

Bảng 3.16 Sự tạo thành 1 số chất bay hơi được tạo thành sau quá trình lên men malolactic 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng chuỗi của chủng O.oeni 10

Hình 1.2 Quá trình trao đổi chất của các vi khuẩn lactic lên men dị hình 13

Hình 1.3 Cơ chế của quá trình lên men malolactic 133

Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic 17

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho 27 Hình 3.1 So sánh hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 38

Hình 3.2 So sánh hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 39

Hình 3.3 So sánh hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 41

Hình 3.4 So sánh hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic 42

Hình 3.5 So sánh hàm lượng axit axetic tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng 43

Hình 3.6 Hàm lượng axít malic được phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác nhau theo thời gian 46

Hình 3.7 So sánh sự tạo thành rượu etanol sau quá trình lên men malolactic 52 Hình 3.8 So sánh sự tạo thành 1 số chất bay hơi sau quá trình lên men malolactic 53

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AG Acid Grape - Nước nho axít

CFU Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc HDL High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao LAB Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic

MRS De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS

NAD+ Nicotinamit Adenin Dinucleotide

NADH Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen

EO Chế phẩm Essential oenos

OD Optical density - Mật độ quang

MLF Melolactic fermentaeion - Lên men malolactic

MỞ ĐẦU

Rượu vang là đồ uống có cồn được sản xuất từ quá trình lên men dịch quả nói chung mà phổ biến nhất là từ quả nho Do nho là loại quả có thành phần hoá học thích hợp cho nấm men phát triển và có hương thơm đáp ứng được những yêu cầu cho sản xuất rượu vang chất lượng cao Trải qua lịch sử hình thành và phát triển lâu đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v là đồ uống có lợi cho sức khỏe của con người với giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon rất được ưa chuộng ở khắp nơi trên thế giới Từ nhiều năm nay, rượu vang nho đã trở thành thức uống phổ biến ở nước ta Thị trường rượu vang trong nước rất phát triển, tuy nhiên vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu cả về chất và lượng Theo số liệu của Tổng cục thống kê, kể từ năm 2010 đến nay, rượu vang nhập khẩu đã tăng khoảng 25%/ năm Trong đó, Ninh Thuận được biết đến là vùng trồng nho chính có sản lượng lớn nhất

cả nước, hiện trồng chủ yếu là giống nho Red Cardinal thường dùng để ăn tươi hơn

là để lên men rượu vì cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn Do vậy, chất lượng rượu vang Việt Nam hiện nay chưa thật cao khi so sánh với rượu vang nhập khẩu do hương và vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu hoá, sản phẩm bị lắng cặn…Với tiềm năng về thị trường lớn như ở nước ta, việc cải tiến công nghệ để sản xuất rượu vang nho là vấn đề đang rất được quan tâm

Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được vấn đề này bằng những nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất rượu vang nho đi sâu làm rõ các cơ chế như: sự chuyển hóa các thành phần trong nho thành các chất thơm trong rượu vang, tác động của điều kiện môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic trong quá trình lên men malolactic[26, 27]…Quá trình lên men rượu vang là quá trình lên men thực hiện chủ yếu nhờ nấm men và một phần bởi vi khuẩn lactic có mặt trên quả nho hoặc trên thiết bị làm rượu Nấm men sử dụng hệ enzym của mình để chuyển hóa glucoza và một số đường khác thành rượu và các sản phẩm phụ khác (rượu bậc cao, este, các axít hữu cơ ), trong khi đó vi khuẩn lactic chuyển hóa axít malic thành axít lactic và CO2 bằng quá trình lên men malolactic Lên men malolactic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất rượu vang đỏ và 1 số loại vang

trắng, đây là một quá trình không thể thiếu trong việc làm biến đổi các thành phần hóa học, mang lại cho rượu vang những hương vị đặc trưng Với điều kiện, công nghệ sản xuất rượu vang của Việt Nam hiện nay, việc phân lập và tuyển chọn một

số chủng vi khuẩn lactic để tối ưu hóa quá trình lên men malolactic là rất cần thiết Điều này đã giúp các nhà sản xuất rượu vang kiểm soát quá trình sản xuất rượu vang được tốt hơn, giảm rủi ro tạo ra các sản phẩm hỏng hoặc có chất lượng không

ổn định, đồng thời làm đa dạng các chủng loại rượu vang phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng Từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới cho công nghệ sản xuất rượu vang nho chất lượng cao của Việt Nam giải quyết những vấn đề thực tiễn của ngành

sản xuất rượu vang trong nước.Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang”

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về rượu vang

1.1.1 Vài nét về rượu vang

Rượu vang là thức uống có cồn được sản xuất bằng phương pháp lên men không chưng cất từ dịch nho Nhờ tác nhân lên men (lên men một giai đoạn) hoặc nhờ nấm men và vi khuẩn lactic (lên men hai gian đoạn) đã tạo cho rượu vang có hương vị đặc trưng, cũng như giá trị dinh dưỡng cao hơn hẳn các loại rượu khác

Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng la tinh là “vinum”, được bắt nguồn từ chữ “vinea”,

có nghĩa là cây nho Trước tiên việc sản xuất rượu vang được tiến hành bằng cách

ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tự nhiên trong các hang đá Người La

Mã có công truyền bá nghề trồng nho làm rượu sang Pháp Marseilles từ thế kỉ II, sau đó là vùng Champagne và Monselle Valley vào khoảng thế kỉ IV Pháp bắt đầu xuất khẩu rượu vang sang Anh và Đức vào thế kỉ XII Vào năm 1857, lần đầu tiên trong lịch sử, Louis Pasteur công bố những nghiên cứu về quá trình lên men, xác định rõ vai trò quan trọng của nấm men trong quá trình lên men rượu và sự biến đổi hoá sinh trong quá trình lên men của nấm men [8] Đến nay đã có hàng trăm loại rượu vang khác nhau đáp ứng được nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng Phân loại rượu vang được dựa trên màu sắc: vang màu và vang trắng, trong các loại vang màu thì rượu vang đỏ có giá trị cao nhất Ngày nay nguyên liệu chế biến rượu vang được

mở rộng ra các loại nguyên liệu quả khác nhau, phong phú về màu sắc và chất lượng

Trải qua nhiều thế kỷ, rượu vang đã khẳng định vai trò của nó với sức khỏe con người Louis Pasteur đã nhiều lần khẳng định: “Rượu vang là loại đồ uống rất

vệ sinh và rất có lợi cho sức khoẻ” Khoa học hiện nay đã phát hiện trong rượu vang đỏ có chứa chất trans-resveratrol là một chất chống oxi hóa, gặp trong vỏ của quả nho đỏ (vỏ mỗi quả chứa khoảng 2µg trans-resveratrol) Các polyphenol trong Chất này có tác dụng trung hòa các tác nhân oxi hóa, chẳng hạn các gốc tự do được tạo thành trong quá trình trao đổi chất bình thường của tế bào Các gốc tự do này sẽ gây hư hại mô nếu không nhanh chóng được loại bỏ Chính tác dụng nói trên của

trans-resveratrol đã góp phần làm giảm nguy cơ tử vong do bệnh nhồi máu cơ tim ở người [30]

1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang [7, 8, 12]

Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia các kiểu lên men khác nhau Có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng

sẽ chuyển hóa đường thành ethanol và CO2 Thực chất đây là quá trình oxi hoá - khử có mặt các enzyme của nấm men Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của nấm men hoặc bị tiêu hao dưới dạng nhiệt [7] Sự thay đổi nhiệt độ trong quá trình lên men có thể dẫn tới sốc nhiệt làm ảnh hưởng tới hoạt tính của nấm men

Do vậy giữ nhiệt độ ổn định trong quá trình lên men là một yếu tố quan trọng giúp quá trình lên men được hoàn thành Nấm men nhạy cảm nhất với nhiệt độ trong giai đoạn đầu phát triển và nhân lên và nó trở nên chống chịu tốt hơn trong giai đoạn sau Do vậy đối với lên men rượu vang thì giai đoạn đầu của quá trình lên men nên duy trì ở nhiệt độ 18-22oC và sau đấy cho phép tăng dần lên [7, 12] Nhiệt độ lên men ban đầu quá cao có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng ì ở cuối quá trình lên men

Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính:

- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối

- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2

Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp Ngoài ethanol còn nhiều chất khác như este, rượu bậc cao, các axit hữu cơ, glycerol, dầu fusel Tỷ lệ các sản phẩm phụ này phụ thuộc vào điều kiện của môi trường lên men

Trong quá trình này, nấm men chuyển hóa đường thành rượu và giải phóng

CO2 dưới tác dụng xúc tác của enzyme do nấm men tạo ra theo con đường

Enol-pyruvat [7]

Nho đỏ Nghiền/chà tách cuống Sulfite hóa Ngâm Tách dịch nho rỉ Tách cặn

Hiệu chỉnh thành phần

dich nho Lên men Lên malolactic

Ủ rượu

Ổn định rượu Làm trong Rót sản phẩm

Sơ đồ: 1.1 Quy trình công nghệ sản xuất rƣợu vang đỏ trên thế giới.

Trong quả nho và nhiều loại quả khác, hầu như chỉ có đường khử glucoza, fructoza Vì vậy nếu sử dụng dịch lên men hoàn toàn từ dịch ép quả thì quá trình lên men rất thuận lợi Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp Ngoài etanol, còn có nhiều các hợp chất khác như este, rượu bậc cao, các axít hữu cơ, glyxerol

Este: Các este được cho là có ý nghĩa lớn nhất đối với sự hình thành hương

vị rượu vang [40] Mùi quả đặc trưng của vang chủ yếu nhờ vào một hỗn hợp của hexyl axetat, etyl caprilat Este có mặt nhiều nhất trong rượu vang là etyl axetat Nó được hình thành trong quá trình lên men và trong quá trình lưu giữ ở thùng gỗ sồi Ngưỡng cảm nhận của etyl axetat là 160 mg/l [41] Trên ngưỡng này, nó ảnh hưởng xấu đến hương vị của rượu nhưng ở nồng độ thấp hơn thì nó lại đóng góp tích cực vào giá trị cảm quan của vang

Rượu bậc cao: Rượu bậc cao được hình thành trong quá trình lên men rượu

và đạt tới nồng độ từ 150-550 mg/l [41] Rượu bậc cao và các este của nó đóng vai trò quan trọng đến việc tạo hương cho rượu Các rượu bậc cao chủ yếu là các isobutyl và các amyl alcohol Ở nồng độ thấp hơn 300 mg/l, nó tạo hương rất tốt cho rượu nhưng ở nồng độ cao hơn, hương của nó không chấp nhận được

Các axít hữu cơ: Các axít hữu cơ có tác dụng làm bền và nâng cao giá trị

cảm quan của rượu, đặc biệt là rượu vang trắng [31] Đặc tính bảo quản của nó cũng làm tăng độ bền hóa lý và vi sinh vật của rượu vang Các axít hữu cơ chủ yếu được hình thành trong quá trình lên men là axít lactic, axít sucxinic, axít axetic, ngoài ra còn có một lượng nhỏ axít butyric, axít formic và propionic, nhưng nhiều hơn cả

là axít lactic và axít axetic Các axít hữu cơ có tác dụng làm giảm pH môi trường trong quá trình lên men Chúng ít ảnh hưởng đến thành phần hương của rượu trừ axít axetic tạo ra mùi dấm chua Không thể sản xuất ra rượu mà không có ít axít axetic nào Hàm lượng trung bình của nó trong rượu vang bàn là nhỏ hơn 0,4g/l

trong khi ngưỡng phát hiện của nó là 3g/l Nhiệt độ lên men malolactic cao thúc đẩy

sự tạo thành axít bay hơi nhiều hơn [27]

Ngoài ra, các thành phần như aldehyt, glyxerol được tạo ra bởi nấm men trong quá trình lên men đều có tác dụng tạo nên hương thơm đặc trưng của rượu vang Quá trình lên men rượu đã giải phóng 40 kcal năng lượng tự do trên một phân

tử đường Quá trình lên men thường chứa khoảng 180g đường/lít, do đó sự giải phóng nhiệt về lí thuyết sẽ làm cho nhiệt độ lên men tăng từ 20oC lên 45o

C [32]

Như vậy, ban đầu là quá trình lên men rượu được nấm men Saccharomyces

cerevissiae đảm nhận Tiếp theo là hoạt động của các vi khuẩn Leuconostoc oenos, Lactobacillus, Pediococcus chuyển hoá đường sót trong rượu vang non và quan

trọng hơn cả là quá trình lên men axít malic thành axít 1 actic và axít xitric thành axít axetic, axetoin, diaxetyl, butađiol 2-3, góp phần đáng kể vào sự hình thành

hương vị đặc trưng của rượu vang, “Đây chính là quá trình lên men Malolactic”

Trong công nghệ sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau khi lên men chính, dịch lên men được gọi là “vang non” được tiến hành lắng gặn cặn và được chuyển sang bồn hay nồi lên men tiếp theo [4]

1.2 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là một bộ phận của hệ vi sinh vật tự nhiên trên quả nho, trong dịch đường và rượu vang Vi khuẩn lactic là những tế bào Gram dương, dị dưỡng hoá năng hữu cơ, hoạt tính catalaza âm tính và axít lactic được xem là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất của chúng [4] Chính pH axít, hàm lượng êtanol và các thành phần khác của rượu vang tạo ra áp lực chọn lọc đối với các vi khuẩn lactic Chỉ có một số loài rất nhỏ có khả năng tự phát triển trong các loại dịch đường và rượu vang Các loài thường gặp trong sản xuất rượu vang chủ

yếu thuộc các giống sau: Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus và Lactobacillus

Sự xuất hiện của các loại vi khuẩn lactic này trên bề mặt quả nho là rất nhỏ, khoảng

100 tế bào/g quả [43] Mật độ quần thể vi khuẩn lactic phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện khí hậu trong những ngày cuối cùng của quá trình chín, độ chín và trạng thái

vệ sinh của quả nho Các quần thể vi sinh vật có mặt nhiều hơn trên vỏ quả nho chín

hoặc có tình trạng vệ sinh kém Khi quá trình chín của quả nho kết thúc bởi một giai đoạn nóng và ít mưa kéo dài, thì các vi khuẩn lactic sẽ xuất hiện nhiều hơn trên bề mặt quả nho Tuy nhiên, các loài vi sinh vật ban đầu này xuất hiện rất ít trong rượu vang mà phần lớn là các loại vi khuẩn nhiễm tạp từ các dụng cụ làm rượu trong các giai đoạn khác nhau diễn ra trong quá trình bơm dịch nước nho vào thùng lên men Mặc dù người ta có thể bắt gặp trong các loại rượu vang một số vi khuẩn tự nhiên từ quả nho, nhưng chủ yếu vẫn là các vi khuẩn có nguồn gốc từ các thiết bị trong hầm rượu Tương tự như vậy đối với trường hợp của nấm men Nấm men tự nhiên trên

bề mặt quả tự phát triển sau các thao tác công nghệ khác nhau diễn ra tiếp sau quá trình thu hái và quá trình chuyển bơm dịch nước nho vào thùng lên men, cho tới tận khi dịch đường nước nho được cấy giống Tuy nhiên, cũng có thể là có sự phát triển của các loại nấm men có nguồn gốc từ các vật liệu tiếp xúc với dịch nước nho Do vậy, sau giai đoạn thu hoạch nho, các nấm men nhanh chóng phát triển và chiếm lĩnh hầm rượu Trên thực tế, người ta vẫn chưa làm sáng tỏ được là con đường nào trong hai con đường gieo giống tự nhiên này là có vai trò quan trọng hơn

Trong suốt quá trình sản xuất rượu vang, các vi khuẩn lactic phát triển, không chỉ về số lượng mà còn có cả sự thay đổi của các loài Vi khuẩn phân lập

được trên vỏ quả nho trước khi thu hoạch thuộc chủ yếu là các loài Lactobacillus

plantarum, L hilgardii và L Casei Loài Oenococcus oeni trước đây được gọi là Leuconostoc oenos xuất hiện muộn hơn nhưng lại là quan trọng nhất, rất hiếm khi

chúng có mặt trên lá nho, quả nho và chỉ có số lượng rất ít Trong thực tế, loài này rất ít xuất hiện ở giai đoạn đầu của quá trình lên men Các loại trực khuẩn và cầu

khuẩn xuất hiện trên quả nho thường xuyên hơn so với O.oeni Trong số tất cả các loài này nói trên, loài cuối cùng O.oeni được coi là có khả năng chống chịu cao nhất

đối với các điều kiện môi trường bất lợi của rượu vang như pH thấp, hàm lượng cồn

và SO2 cao và do vậy chịu trách nhiệm chính cho quá trình lên men malolactic trong đa số các trường hợp[4]

Số lượng tế bào vi khuẩn lactic đạt 103 - 104 tế bào/ml sau quá trình ép nho [43] Dịch nước nho ngay sau khi được đưa đến thùng lên men có chứa một hệ vi

sinh vật rất đa dạng, phần lớn bao gồm các loài Lactobacillus plantamm, L casei, L

hilgardii, L brevis, Pediococcus dcimnosLis, p pentosaceus, Leuconostoc mensenteroides và Oenococcus oeni Tuy nhiên, trong tình trạng vệ sinh kém hoặc

trong các điều kiện vận chuyển hoặc mức độ sạch của các thiết bị trons, hầm rượu không cao, số lượng tế bào vi khuẩn lactic có thể lên tới 106 tế bào/ml Bên cạnh đó, trong giai đoạn đầu của quá trình lên men rượu, các tế bào nấm men cũng có số lượng tương tự Điều này rất có thể dẫn đến sự nguy cơ cạnh tranh pháp triển giữa

vi khuẩn và nấm men Hơn nữa pH của dịch nước nho chín kỹ thường rất cao tạo điểu kiện thuận lợi cho các vi khuẩn Đây là tác nhân quyết định chính tới số lượng của quần thể các vi khuẩn và đối với sự phát triển của chúng trong giai đoạn đầu của quá trình lên men Trong quá trình sản xuất rượu vang, có lên men malolactic, quần thể vi khuẩn tự nhiên pháp triển trải qua rất nhiều pha khác nhau Trong những ngày đầu tiên của quá trình lên men rượu, các loại vi khuẩn và nấm men tự phát triển Nhưng các nấm men thích nghi với dịch đường của nho nhiều hơn, tự sinh sản rất nhanh đạt tới các quần thể rất lớn Lafon- Lafourcade, 1983 đã bắt gặp, sự phát triển của các vi khuẩn lactic đồng thời với sự phát triển của các nấm men trong giai đoạn đầu của quá trình lên men nhưng nó chỉ dừng lại ở giới hạn từ 104 đến 105 tế bào vi khuẩn lactic/mL [43] Sự phát triển này phụ thuộc vào các điều kiện hoá lý của môi trường và sự phát triển này còn cao hơn khi pH cao và hàm lượng SO2 thấp [29] Sự phát triển của các vi khuẩn laclic trong giai đoạn đầu của quá trình lên men nrợu mang tính chuyển tiếp Trong giai đoạn hoạt động mạnh nhất của quá trình lên men rượu và tới tận khi hàm lượng đường đã bị cạn kiệt, số lượng các vi khuẩn giảm xuống nhanh chóng, chỉ còn 102 - 103 tế bào/ml và thậm chí còn thấp hơn do

sự cạnh tranh với các loại nấm men và các điều kiện môi trường Trong quá trình lên men rượu, sự cạnh tranh của nhiều loài vi khuẩn khác nhau diễn ra liên tục và tới cuối quá trình lên men rượu thì chỉ có những loài chịu được với môi trường

êtanol tốt hơn tồn tại được, đặc biệt là các vi khuẩn O.oeni [35] Cuối quá trình lên

men rượu, sẽ còn khoảng 102 - 103 tế bào/mL vi khuẩn O.oeni Chính loài này sẽ tự

sinh sản ngay sau đó và tạo ra hệ vi sinh vật chịu trách nhiệm lên men malolactic

Cũng có thể có các đại diện của các loài khác còn sống sót với số lượng rất nhỏ sau quá trình lên men, chúng có thể phát triển nếu như rượu vang không được bảo vệ tốt và đây chính là nguyên nhân làm hỏng rượu vang Liên quan tới quá trình

chuyển hoá axít malic, loài O.oeμni này được khởi động ngay sau khi số lượng quán

thể đủ lớn để khởi động (thường là 106 tế bào/mL) Sự phát triển này có thể kéo dài trong nhiều ngày hoặc nhiều tuần tuỳ theo các trường hợp Lên men malolactic có thể hoàn thành ở cuối pha tĩnh hoặc đầu pha suy vong Nhưng nếu có các điều kiện

là thích hợp, lên men malolactic có thể kết thúc ở cuối pha phát triển Cuối cùng, khi kết thúc lên men malolactic, cần phải Sulfit hoá rượu vang để loại bỏ hoàn toàn các vi khuẩn còn sống [14]

1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang

Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm các vi sinh vật Gram dương và do vậy được nhuộm mầu bằng phép thử Gram có liên quan tới cấu tạo của thành tế bào Các vi

khuẩn Leuconostoc và Oenococcus (hình 1-2) có dạng hình cầu Đó là các tế bào

nhỏ (kích thước từ 0,5 - 1 μm) tròn hoặc hơi dài tạo ra các cặp hoặc chuỗi

Hình 1.1 Tế bào dạng chuỗi của chủng O.oeni

Tuỳ vào sự đa dạng của các sản phẩm trao đổi chất của các loại đường, các

vi khuẩn lactic được phân biệt thành 2 nhóm:

- Nhóm sinh axít lactic (> 85%) từ glucoza được gọi là lên men đồng hình như các loài thuộc giống Pediococcus và loài Lactobacillus mali Các vi khuẩn này phân

huỷ glucoza thành pyruvat theo con đường đường phân truyền thống Pyruvat tiếp theo bị khử thành axít D và/hoặc L - lactic phụ thuộc vào từng loài bởi các enzim lactate dehydrogenaza L và/hoặc D Quá trình này cho phép ôxy hoá khử các phân

tử NADH2+ thu được từ quá trình đường phân thành NAD+

- Nhóm mà bên cạnh axít lactic, còn sản xuất axít axêtic, ethanol và CO2, được gọi là lên men dị hình Người ta phân biệt:

+ Các loài dị hình nghiêm ngặt như các loài thuộc giống Leuconostoc và một vài loài thuộc giống Lactobacillus (L brevis, L hilgardii ) Chúng không có enzim

aldolaza của hai con đường (đường và pentoza -photphat) phân và do vậy không thể lên men các loại đường theo con đường lên men dị hình của các pentoza-photphat

+ Các loài lên men dị hình tuỳ tiện như O.oeni, Lactobacillus casei và Lactobacillus plantarum có các enzym của cả hai con đường (đường phân và

pentoza-photphat) và chúng thích nghi với một trong hai con đường này phụ thuộc vào điều kiện môi trường [14]

1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni

Mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn malolactic sử dụng trong sản xuất rượu

vang nhưng O oeni vẫn là loài vi khuẩn được lựa chọn bởi đa số các nhà sản xuất rượu vang O oeni có tên gọi trước đây là Leuconostoc oenos, là một loài hiếu khí

tùy tiện và có thể sinh trưởng trên môi trường có pH thấp (pH 4,2-4,8) được bổ sung nước cà chua hoặc nước nho [26] Ở các vùng sản xuất rượu nho, nó có mặt trong dịch hèm cũng như trong rượu vang non Nguồn cacbon (có nguồn gốc từ các loại đường), nitơ (từ các axit amin tự do hoặc các chuỗi peptit ngắn), các vitamin (axit nicotinic, thiamin và uracil) là toàn bộ nhu cầu cho sự sinh trưởng tối ưu của vi

khuẩn này O.oeni có khả năng chuyển hoá axít L-malic thành axít L-lactic, lên

men fructoza, glucoza và trehaloza Quá trình lên men glucoza tạo ra axít D-lactic, C02, axít axetic và etanol Một số loài thuỷ phân arginin và một số khác lên men axít xitric khi có mặt các loại đường có thế lên men, nhưng các tính chất này bị mất

đi sau một vài lần cấy liên tiếp [46]

Tế bào O oeni có hình cầu và tồn tại ở dạng chuỗi khi sinh trưởng trên môi

trường rắn Sự sinh trưởng tương đối chậm và có thể mất từ 5-7 ngày để hình thành các khuẩn lạc có thể quan sát được tại nhiệt độ từ 20-30°C Mặc dù trước đây chúng

được xếp vào cùng nhóm với các loài Lenconostoc, nhưng phân tích ADN đã chỉ ra chúng là một nhóm tách biệt hoàn toàn với loài Leuconostoc [46]

O oeni được coi là ứng viên tốt nhất để tiến hành lên men malolactic nhờ

sự thích nghi của chúng với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường, đặc biệt là

điều kiện axít và hàm lượng cồn cao trong rượu Rượu vang cấy các chủng O oeni

đã tuyển chọn cho phép dễ dàng kiểm soát toàn bộ quá trình lên men malolactic

Ngoài ra, việc lựa chọn một chủng o oeni có thể cho phép các nhà sản xuất rượu

đảm bảo về các tính chất được tạo ra trong sản phẩm cuối cùng Do vậy, rượu vang tạo ra đặc trưng Mặc dù, thường chỉ một chủng vi khuẩn được lựa chọn, nhưng trong một số trường hợp thỉ một hỗn hợp các chủng có thể được sử dụng để cấy giống Điều này không chỉ tạo ra các đặc tính được yêu thích hơn của rượu vang,

mà còn tạo ra khả năng sống sót cao nhất của vi khuẩn nếu có một thực khuẩn thể trong rượu [26]

1.3 Quá trình lên men malolactic

1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic

Trong lên men rượu vang người ta gọi quá trình phân giải axit malic và

xitric dưới tác dụng của enzym malolacticase của O oeni là quá trình lên men

lactic, một quá trình quan trọng bậc nhất trong giai đoạn lên men phụ của rượu vang

và sâm panh [3, 42] Vi khuẩn lactic tự nhiên luôn có mặt trên vỏ quả nho sau khi chín với số lượng từ 103 đến 104 CFU/ml và đi vào vang non theo dịch nước quả Tuy nhiên, số lượng của chúng lúc này cũng bị giảm đáng kể do bị ức chế và tiêu diệt bởi S02 (khoảng 50 mg/ml) ở giai đoạn sunfit hoá và nồng độ cồn cao (khoảng 14-15° cồn) sinh ra sau quá trình lên men rượu Do vậy, trong rượu vang non, các loại trực khuẩn và cầu khuẩn lactic bị tiêu diệt gần như hoàn toàn và chỉ còn sót lại

số lượng ít ỏi các tế bào vi khuẩn O oeni từ 102

-103 CFU/ml Tuy nhiêu, đây chính

là tác nhân chính của một quá trình quan trọng nhất trong giai đoạn lên men phụ kéo dài đó là quá trình lên men malolactic

Hình 1.2 Quá trình trao đổi chất của các vi khuẩn lactic lên men dị hình [32]

Đặc trưng cơ bản nhất của quá trình này là sự chuyển hoá hoàn toàn các diaxít như malic và xitric có trong dịch quả và một phần sinh ra sau quá trình lên men chính (khoảng 10 g/1) thành các monoaxít như lactic và axetic bởi các vi

khuẩn O oeni [32] Axit malic và xitric chủ yếu vào dịch lên men từ quả và chỉ một

lượng ít được tạo ra từ quá trình lên men rượu Khi axit malic và xitric bị phân giải

sẽ làm vang chua dịu hơn và vị hài hoà hơn, một khi rượu vang không còn hai loại axit thì ít có nguy cơ biến đổi độ chua và làm chất lượng vang ổn định hơn Sản phẩm của quá trình lên men malolactic từ axit malic là axit lactic và CO2, còn từ axit xitric là diaxetyl, axetoin, 2,3 - butadiol đây là những tiền chất tạo nên hình thơm đặc trưng cho vang, ngoài ra còn tạo thành axít axêtic

Cơ chế của quá trình lên men malolactic được trình bày tóm tắt theo sơ đồ dưới đây:

Hình 1.3 Cơ chế của quá trình lên men malolactic

Lên men malolactic là một chuỗi các phản ứng hoá học phức tạp được xúc

tác bởi một hệ enzim có trong vi khuẩn L.oenos Ban đầu là enzim malat

dehydrogenaza chuyển hoá axít malic thành axít oxaloaxetic, tiếp theo là phản ứng decacboxy được xúc tác bởi enzim oxaloaxetat decacboxylaza để tạo thành axít pyruvic Sản phẩm trung gian này cuối cùng bị chuyển hoá thành axít D hoặc L-lactic bởi enzim D hoặc L-lactic dehydrogenaza [12]

1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic

Những nghiên cứu gần đây cho thấy, rượu vang được trải qua lên men malolactic cho chất lượng cao hơn hẳn khi không trải qua giai đoạn này Sự biến đổi chất lượng của vang sau quá trình lên malolactic đã được chỉ ra là vì ba lí do chủ yếu sau [3,4,42]

- Để giảm độ chua của vang do axit malic (diaxit) được chuyển thành axit lactic (monoaxit), điều này làm giảm độ axit và tăng đọ pH nhờ đó mà vang thay vì

vị chua gắt của axit malic sẽ trở nên dịu hơn và vị hài hòa hơn

- Làm tăng tính ổn định sinh học của rượu vang bởi vì sự phát triển của vi khuẩn sẽ làm nghèo nguồn dinh dưỡng và loại khỏi môi trường hai axit hữu cơ quan trọng là axit malic và axít xitric Đảm bảo giảm tối thiểu quá trình lên men chậm của vi khuẩn lactic khi bảo quản vang trong chai và sự phát triển một cách tự phát của các vi sinh vật không mong muốn gây nên các bệnh cho vang

- Làm tăng tổ hợp thơm của vang vì các hợp chất diaxetyl, axetoin và butanediol tạo ra từ quá trình chuyển hóa axit xitric bởi vi khuẩn là các hợp phần tạo nên hương thơm cho vang Những thành phần khác ảnh hưởng đến hương vị cũng tăng như axit bay hơi, dietyl suxinat, một số este bay hơi, etyl axetat, n-propanol, 2-butanol, n-hexanol, etyl lactate và 2,3 butanediol Một số thành phần khác cũng tăng nhẹ như 3-methy-n-butal axetat, n-hexyl axetat, 2-phenyletyl-axetat

2,3-và 2-etyl-n-hexanoat [42,44]

1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất lượng rượu vang

1.3.3.1 Sự giảm độ chua

Mỗi phân tử axit L-malic chuyển hóa tạo ra axit L-lactic do sự mất đi nhóm cacboxyl và làm giảm tương ứng độ axit của rượu vang Độ giảm axít sau quá trình lên men malolactic rất khác nhau phụ thuộc vào nồng độ axít malic Độ giảm này từ

2-3 g/l (H2SO4) Lên men 1 g axít malic trong 1 lít rượu vang non sẽ làm giảm axít tổng số xấp xỉ 0,4 g/1 Trong quá trình lên men malolactic, hàm lượng axít bay hơi thường xuyên tăng lên, có thể một phần là do sự phá hủy của axít xitric Vi khuẩn cũng sản xuất axít axetic từ sự phân giải đường pentoza Sự phân hủy axít malic dường như là không đủ cung cấp năng lượng cho hoạt động tế bào [28]

Bảng 1.1 Phân tích rượu vang đỏ trước và sau lên men malolactic

1.3.3.2 Những thay đổi về hương

Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn malolactic khác nhau

có thể tăng hoặc giảm cường độ của các đặc tính hương và vị của rượu vang và những thay đổi này phụ thuộc vào chủng vi khuẩn Ngoài ra, hương rượu vang chịu tác động của lên men malolactic có thể là mùi bơ, mùi hạt dẻ, mùi nấm men, mùi gỗ

sồi, mùi mồ hôi và mùi đất Lên men malolactic cũng tác động đến hương hoa và quả cũng như cảm giác mềm mại của rượu vang [28,32] Cơ chế ảnh hưởng của vi khuẩn malolactic đến hương rượu vang có thể là:

- Loại bỏ những hợp chất tạo hương có trong rượu vang non bởi sự trao đổi chất và hấp thụ với thành tế bào

- Tạo ra các họp chất tạo hương mới từ vi khuẩn nhờ quá trình trao đổi chất của đường, axít amin và các cơ chất khác

- Sự trao đổi chất và biến đổi các sản phẩm thứ cấp từ nấm men và nho tới các sản phẩm cuối cùng tạo ra tác động lớn hơn hoặc nhỏ hơn đối với giá trị cảm quan của rượu

Các chủng vi khuẩn lên men malolactic có khả năng tạo ra diaxetyl có mùi

bơ, mùi hạt dẻ Mặc dù hàm lượng thấp từ 1-4 mg/1 tạo ra hương bơ đặc trưng cho rượu vang nhưng hàm lượng vượt quá 5-7 mg/1 có thể ảnh hưởng bất lợi tới chất lượng rượu vang và gây hỏng rượu [17,39]

Sự tạo thành diaxetyl chịu ảnh hưởng bởi các vi sinh vật, môi trường và các yếu tố sản xuất Ngoài yếu tố chủng vi sinh vật, các yếu tố sản xuất cũng có một tác động đáng kể đến hàm lượng diaxetyl, bao gồm loại rượu, tương tác giữa cặn nấm men và vi khuấn, thời gian hoàn thành lên men malolactic, sự tiếp xúc giữa rượu vang và không khí, sự bổ sung S02, hàm lượng axit xitric và đường, nhiệt độ và pH Một số tiêu chí cho rằng để đạt được hàm lượng diaxetyl cao trong rượu vang bao gồm sử dụng một chủng vi sinh vật có khả năng tạo ra hàm lượng diaxetyl cao, tỷ lệ cấy giống vi khuẩn thấp, pH và nhiệt độ thấp hơn [11,37]

Hương quả của rượu vang không nhất thiết bị giảm bởi quá trình lên men malolactic, thậm chí trong một số trường hợp nó có thế còn tăng lên do nó có thể tạo ra các este như etyl lactat và isoamyl axetat Điều thú vị là sự tăng lên của hương quả nhờ quá trình lên men malolactic liên quan tới sự giảm đi của mùi rau

Sự giảm đi của mùi rau trong rượu vang Chardonnay sau quá trình lên men malolactic là loại bỏ mùi tỏi chín và mùi giống ure của 1-octanol và l-octene-3-ol [32]

1.3.3.3 Ảnh hưởng đến màu sắc của rượu vang đỏ

Lên men maloactic rượu vang đỏ có thể làm giảm cường độ màu của rượu vang đỏ Ví dụ như sự tăng lên của pH trong quá trình lên men malolactic có thể tác động đến sự cân bằng phụ thuộc pH của các chất màu anthocyanin, dẫn tới mất đi màu đỏ Sự giảm màu sắc của rượu vang đỏ tăng lên liên tục bởi sự kết tủa của các phân tử anthocyanin được giải phóng với các polysaccharit Lên men malolactic cũng làm tăng sự kết tủa anthocyanin và tannin Phản ứng này làm ổn định màu của rượu

Tính chất cảm quan của rượu cũng được tăng lên nhiều Hương của rượu trở nên quyến rũ hơn Rượu trở nên mềm mại hơn do sự khử gần như hoàn toàn axit malic thành axít lactic Kết thúc quá trình lên men malolactic, hương và vị của rượu đầy đủ hơn nhưng lại thanh hơn [7]

1.3.3.4 Các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và quá trình lên menmalolactic

Thành phần rượu vang, phương pháp sản xuất và mối tương tác giữa vi khuẩn malolactic và các vi sinh vật khác có thế ảnh hưởng tới sự sống sót và sinh trưởng củavi khuấn malolactic trong rượu vang và vì vậy ảnh hưởng tới quá trình lên menmalolactic Tuy nhiên, các điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ, độ cồn, tình trạng dinh dưỡng, và S02 cũng chiếm một vai trò đáng kể (hình 1.4)

Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic [7]

Giá trị pH nhỏ nhất mà tại đó vi khuẩn sinh trưởng được trong rượu vang

pH

xấp xỉ 2,9-3,0 Sự sinh trưởng của vi khuẩn nhanh hơn và quá trình lên men malolactic hoàn thành sớm hơn khi pH tăng trên 3,0 Mặc dù pH 6,3 là tối ưu cho hoạt động của các enzym malolactic, nhưng sự phân giải axit malic lại diễn ra nhanh nhất tại các giá trị pH thấp hơn

Khả năng chịu cồn là một đặc tính quan trọng của nhiều vi khuẩn malolactic Hầu hết các chủng không có khả năng phát triển trong rượu vang có hàm lượng cồn lớn hơn 15% v/v nhưng một số lại quan sát thấy sự sinh trưởng ở độ cồn 20% v/v

Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu đối với phòng thí nghiệm vi khuẩn lactic là từ 25-27°C và tỷ lệ phân giải malatcao nhất tại nhiệt độ gần đó Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và tốc độ lên men malolactic bị ức chế tại nhiệt độ thấp

SO2 có tác dụng ức chế vi khuẩn malolactic, SO2 còn có tác dụng thúc đẩy quá trình lắng trong dịch nho Theo Navarre (1994), đó là do sự ức chế hệ vi sinh vật có trong nguyên liệu của SO2 nên không xảy ra hiện tượng lên men tự nhiên trong hỗn hợp nho sau quá trình nghiền xé Nhờ đó mà sự kết lắng của các cấu tử lơ lửng trong dịch nho sẽ diễn ra nhanh và hiệu quả

Sự có mặt của thực khuẩn thể có thể cũng ức chế quá trình lên men malolactic trong rượu vang Các chủng thực khuẩn thể chống lại các điều kiện bất lợi và gây phán hủy tế bào vi khuẩn malolactic Chúng cũng có khả năng phá vỡ động học quần thể của quá trình lên men malolactic Mặc dù sự có mặt của các thực khuẩn thể có ảnh hưởng nghiêm trọng tới chất lượng của rượu vang, chúng có xu hướng bị ức chế trong suốt quá trình sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và ảnh hưởng của chúng là rất nhỏ nhờ các điều kiện đảm bảo thuận lợi cho sự sinh trưởng của các vi khuẩn malolactic [7]

1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic

1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic

Với mục đích khắc phục một cách hiệu quả các yếu tố bất lợi nói trên người ta

đã sử dụng chủng giống vi khuẩn thuần khiết có khả năng lên men malolactic mạnh trong quá trình sản suất rượu vang Để sử dụng các chế phấm này một cách hiệu

quả, các nhà sản xuất khuyến cáo không nên cấy trực tiếp chế phẩm vào vang non

mà trước tiên phải nhân giống bằng môi trường có bổ xung dịch nước quả và axít malic cho vi khuẩn từ từ lấy lại hoạt tính lên men malolactic rồi sau đó mới cấy vào

rượu vang non, nhờ vậy tỷ lệ sống của vi khuẩn L.oenos lúc này đạt trên 80% so với

khi cấy trực tiếp chỉ đạt 20%

Sử dụng cố định tế bào cho quá trình lên men malolactic

Lên men malolactic liên tục bằng phương pháp cố định tế bào vi khuẩn

L.casei trên gel polyacrylamit lần đầu tiên được thực hiện vào năm 1985 bởi Davis

và cộng sự Bên cạnh đó còn có nhiều nghiên cứu về lên men malolactic bằng cố

định tế bào vi khuẩn L.oenos trong gel aginat ở 25°c trong 24 giờ Kết quả cho thấy,

trong phương pháp cố định tế bào hoạt tính lên men malolactic được duy trì lâu hơn

so với lên men thông thường, ngay cả trong điều kiện môi trường có độ axít cao và hàm lượng SO2 lớn[12]

Trong một nghiên cứu khác, tế bào vi khuẩn Lactobacillussp 48 đã được cố

định trên gel k-carrageenan khi có hoặc không có mặt Pentagel (bentonit tinh khiết)

có tác dựng làm tăng kích thước lỗ của gel do vậy tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chuyển khối của hệ thống cố định tế bào Trong quá trình này, trực khuẩn

Lactobacilli có hoạt tính lên men axít malic, biến đổi pH môi trường, giảm độ chua,

tạo axít lactic tương đương với quá trình lên men malolactic truyền thống [43]

Nếu như sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic để thực hiện quá trình lên men malolactic thì thời gian lên men phụ có thể rút ngắn xuống còn vài tháng so với vài năm khi lên men theo truyền thống Tuy nhiên, thời gian lên men phụ để cho quá trình lên men malolactic diễn ra triệt để chỉ mất có vài ngày, thậm chí là vài giờ khi tiên hành lên men bằng cố định tế bào Chính vì vậy, lên men malolactic bằng cố định tế bào là một giải pháp có nhiều triển vọng để nâng cao chất lượng của rượu vang

1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic

Cho tới nay, sử dụng chế phẩm enzim malolactic có thể được coi là một giải pháp lý tưởng nhất để chuyển hoá axít malic Đã có rất nhiều chế phẩm enzim loại này được sản suất và thương mại hoá, đặc biệt là 5 loại enzym sau: EC 1.1.1.40-

enzym malic phụ thuộc NADP, EC 1.1.1.37 - enzym malic dehydrogenaza phụ thuộc NAD, EC 1.1.1.27- enzyme phụ thuộc NAD, chuyến hoá axít pyruvic thành axít lactic, EC 1.6.1.1- enzyme nicotiamit nucleotit transhydrogenaza, chuyển H từ NADPH sang NDA và enzim malolactic phụ thuộc NAD, chuyển hoá trực tiếp axít malic thành axít lactic

Hervé Vaillant và Pascal Formisyn, 1996, đã sử dụng phương pháp cố định

enzim malolactic tinh sạch từ chủng L.oenos 8406 trên màng Polysulfone nhằm

chuyển hoá axít malic thành axít lactic Kết quả cho thấy nhờ có quá trình tinh sạch

mà hoạt lực của enzim malolactic đã tăng 7,5 lần, tức là từ 1,7 đơn vị/mg lên 12,8 đơn vị/mg protein và khối lượng của enzim này là 131 kDa Trong điều kiện vang non có pH là 5.5 thì sau 1 tuần có tới 70% lượng axít malic có trong vang bị chuyển hoá thành axít lactic và tỷ lệ này là 1:1

1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong sản xuất vang

Để thực hiện quá trình lên men malolactic người ta còn đề cập tới một phương pháp hoàn toàn mới đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Đó chính là

sử dụng nấm men chuyển gien Người ta chuyển gien quyết định khả năng lên men

malolactic của vi khuẩn Leuconostoc oenos vào tế bào nấm men Saccharomyces để

thực hiện đồng thời quá trình lên men rượu và quá trình lên men malolactic nhằm rút ngắn qui trình sản xuất rượu vang mà vẫn thực hiệu đầy đủ các quá trình lên men Để có thể nâng cao năng suất và chất lượng rượu vang, thỏa mãn nhu cầu tiêu thụ vang ngày càng nhiêu của thị trường

Có thế nói xu hướng sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp vừa có khả năng lên men rượu vừa có khả năng lên men malolactic đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay Đã có rất nhiều thành công

trong việc đưa vào các chủng nấm men rượu vang S.cerevissiae mang đoạn gen mã

hoá cho enzim malolactat decacboxylaza Bằng cách sử dụng các mồi (primer) được sinh ra từ các vùng bao thủ của các đoạn protein của enzim malic, Cécile Labarre và

cộng sự, 1996 đã nhận được một đoạn ADN có kích thước 324-bp của L.oenos Lo

84.13 bằng phương pháp PCR và sử nó làm mồi để phân lập bộ genom của chủng vi khuẩn này 2990 gen khác nhau đã đựợc xác định và 7 đoạn ADN trùng nhau đã được phân lập Trong số chúng, một gen có kích thước 3453 bp được xác định có hai đầu đọc mở bao gồm hai đoạn chứa 1623 và 942 nucleotit tương ứng Protein được dịch mã từ đoạn gen đầu tiên có khối lượng 59118 Da rất giống với khối

lượng của enzim malolactic của vi khuẩn Lactobacillus lactỉs Đoạn gen này sau đó

đã được đưa vào vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4 Bằng phương

pháp đánh dấu người ta đã nhận thấy sự biểu hiện của gen mã hoá cho enzim malolactic nhờ vào các phân tử protein được tổng hợp có khối lượng gần bằng 60 KDa có hoạt tính enzim malolactic và khẳng định rằng hoạt tính lên men malolactic

đã được biểu hiện ở cả vi khuẩn E.coli CBT313 và S.cerevisiae RH100 - 4 tái tổ

hợp Thành công này cho phép nghĩ tới việc ứng dụng các chủng nấm men tái tổ hợp trong tương lai, khi chúng hội tụ đầy đủ các tính chất cần có của một chủng nấm men công nghiệp và đồng thời có hoạt tính lên men malolactic mạnh [43]

1.5 Các phương pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lượng rượu vang

Rượu vang mới chỉ xuất hiện ở nước ta cách đây hơn 100 năm nhưng nó đã nhanh chóng trở thành thứ đồ uống không thể thiếu Tuy nhiên, mức tiêu thụ rượu vang bình quân tính theo đầu người hiện nay ở nước ta còn thấp, chỉ là 3-5 lít/năm

Do gặp nhiều khó khăn về thiết bị và qui trình công nghệ lạc hậu nên chất lượng vang Việt nam chưa cao Để đáp ứng nhu cầu của thị trường, chúng ta đã thay đối qui trình công nghệ, rút ngắn thời gian lên men và dịch siro quả trước khi lên men

bị đem thanh trùng nhằm tiêu diệt vi sinh vật nhiễm tạp và cũng vô tình tiêu diệt

luôn quần thể vi khuẩn L.oenos quí giá có trong nguyên liệu còn sót lại sau quá

trình xử lý Chính vì vậy quá trình lên men malolactic không được thực hiện, khiến cho vang có vị chua “cứng”, chất lượng không ổn định, nhanh đục và hay bị nhiễm tạp Chúng ta không sản xuất được rượu vang có chất lượng giống như rượu ngoại

và do vậy chịu nhiều thua thiệt về giá cả, giá thành rượu nội chỉ bằng 5-10% so với rượu ngoại tương ứng và gây tiêu tốn ngoại tệ cho việc nhập khuẩn rượu [7]

Sản xuất vang theo truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự phát trong suốt quá trình bảo quản vang non trong thời gian vài tháng hoặc nhiều năm Vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc ở thùng gỗ Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất vang hiện đại với quá trình chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm tối thiểu thì quá trình lên men như vậy quá chậm chạp và không đủ độ tin cậy Như vậy lên men malolactic tự nhiên có những ưu điểm là thuận lợi và rẻ tiền, nhưng nhược điểm cũng rất nhiều như là: khó khởi động, diễn ra rất chậm chạp và khó kiểm soát được các chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình dẫn đến việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn Để khắc phục, hiện nay người ta thường áp dụng

phương pháp chủ động đưa vi khuẩn L.oenos thuần chủng vào môi trường để thực

hiện lên men malolactic Việc cấy vi khuẩn có thể diễn ra trong quá trình lên men rượu (đồng thời với nấm men) hoặc sau khi hoàn thành quá trình lên men rượu [3,18,38]

Để khắc phục hiện trạng thực tế này người ta đã sử dụng vi khuẩn thuần khiết để thực hiện quá trình lên men malolactic Ưu điểm của các chủng vi khuẩn này là có khả năng thích nghi cao với môi trường rượu vang non có độ cồn cao (15% v/v), pH thấp (3,0) và có khả năng lên men mạnh các loại đường, đặc biệt là lên men axít malic thành lactic và axít xitric thành axetic Có nhiều phương pháp sử

dụng vi khuẩn O.oeni thuần khiết để thực hiện quá trình lên men malolactic nhưng

nhìn chung dựa vào hai phương pháp sau đây:

Lên men một giai đoạn (lên men hỗn hợp): Lên men một giai đoạn có nghĩa là người ta cấy nấm men và vi khuẩn đồng thời trong quá trình lên men rượu Phương pháp này có những ưu điểm: vi khuẩn sẽ có điều kiện sinh trưởng tốt hơn trong môi trường có nồng độ cồn thấp và khi hàm lượng cồn tăng dần trong quá trình lên men rượu thì vi khuẩn sẽ được thích nghi dần với môi trường chứa rượu, chứ không bị sốc như khi đột ngột gặp môi trường có nồng độ cồn cao, hơn nữa khi

đó môi trường còn đang rất giàu chất dinh dưỡng nên thuận lợi cho sự sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn Nuôi cấy hỗn hợp còn tạo điều kiện cho sự lên men malolactic xảy ra đồng thời với lên men rượu, nếu lên men malolactic không xảy ra

tức thời thì có thể là do tỉ lệ vi khuẩn trong dịch lên men quá ít hoặc do hàm lượng

SO2 quá cao đã ức chế vi khuẩn [2]

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có hạn chế: đó là là sự cạnh tranh không lành mạnh chất dinh dưỡng và quan hệ đối kháng giữa vi khuẩn và nấm men Sự chuyển hóa đường của vi khuẩn lactic để sinh ra axit lactic gây ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men rượu của nấm men và chất lượng rượu vang Bên cạnh đó, khi vi khuẩn lactic phát triển mạnh sinh ra quá nhiều axít lactic và axetic gây ra sự mất cân bằng vị trong rượu vang làm mất giá trị cảm quan của sản phẩm Phương pháp này chỉ thực hiện khi các chủng vi sinh vật đã được lựa chọn kĩ, không có tính đối kháng và lượng tế bào cần có của mỗi chủng được xác định Do vậy, phương pháp lên men hai giai đoạn đã được tiến hành[7]

Lên men hai giai đoạn liên tiếp là quá trình lên men rượu và lên men malolactic riêng biệt Sau khi lên men rượu bởi nấm men kết thúc, đưa vi khuẩn vào thực hiện giai đoạn lên men phụ (lên men malolactic) Phương pháp này có ưu điểm sau: Cho phép điều chỉnh một cách dễ dàng các yếu tố môi trường thích hợp cho từng loài, điều này giúp thời gian lên men của mỗi giai đoạn có thể rút ngắn không ảnh hưởng đến hiệu suất lên men rượu vì nuôi cấy hai chủng riêng, cuối quá trình lên men, do nồng độ đường còn rất thấp nên lúc này vi khuẩn lactic buộc phải sử dụng các axit hữu cơ làm nguồn cơ chất chính để tồn tại pH dịch lên men lúc này

đã giảm còn khoảng 3.5 – 4, đây là khoảng pH thích hợp cho việc chuyển hóa axit malic nguy cơ đường bị chuyển hóa thành các sản phẩm khác như axit lactic, axit axetic giảm[7]

Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là khi kết thúc lên men rượu nồng độ cồn trong môi trường cao khoảng 12 – 15%v/v, do đó khi cấy vi khuẩn vào môi trường do gặp nồng độ cồn cao đột ngột nên vi khuẩn sẽ bị sốc, số lượng giảm đáng kể nên sẽ làm chậm quá trình lên men malolactic Do vậy mà phải chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng chịu được độ cồn cao và dùng phương pháp nuôi cấy trước, tức là nuôi vi khuẩn trong các môi trường giàu dinh dưỡng có bổ sung cồn ở khoảng pH 4,5 trong 5 – 7 ngày để vi khuẩn thích ứng dần sau đó mới đưa

vào vang non, qua đó có thể khắc phục tình trạng chết của vi khuẩn một cách đáng kể

Trong thực tế, không có một phương pháp nào chung cho việc khởi động quá trình lên men malolactic, vì vậy khi đưa một chủng vi khuẩn nào vào thực hiện quá trình này cần thiết phải xác định thời điểm bổ sung thích hợp chủng giống này

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu

- Syro nho nhập khẩu của Ý có nồng độ chất khô 65°Bx

- Chế phẩm Essential oenos (EO) do công ty Gusmer Enterprises cung cấp: là chế phẩm chứa chất dinh dưỡng cần cho sự sống sót của vi khuẩn malolactic, bao gồm các vitamin, các axit amin và muối khoáng

- Enzym Pectinex Ultra SP-L và Pectinex 3XL của hãng NoVo (Đan Mạch), mua tại Công ty EAC (Việt Nam)

2.1.2 Vi sinh vật

- Chủng nấm men: Chủng nấm men S.cerevisiae SH09 phân lập tại Ninh Thuận

năm 2008

2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật

Môi trường phân lập vi khuẩn lactic (MRS)

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn malolactic

Sử dụng môi trường MRS có bổ sung axít malic: môi trường MRS: 1 lít; axít malic: 5g; pH 5 (điều chỉnh bằng KOH 10N) và thạch: 30g

Môi trường lên men malolactic nước nho axít AG (Acide Grape)

2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị

Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu, phân tích của Viện Công nghiệp thực phẩm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình lên men rượu vang

Sy rô nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ chất khô 250 Bx Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09 Kết thúc quá

trình này, tiếp tục lên men dịch trong vòng 10 ngày ở nhiệt độ 25°C, thu được rượu vang non Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106

tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic

Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 106 tế bào/ml) để tiến hành lên men malolactic

Mẫu ĐC: Lên men malolactic tự phát

Mẫu F: Lên men Malolactic, cấy vi khuẩn lactic ngay đầu quá trình lên men rượu Mầu M: Lên men malolactic, cấy vi khuẩn lactic khi quá trình lên men rượu được 48h