Nghiên cứu mối liên hệ giữa một số đa hình đơn nucleotide của gen CYP19 và nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam

Bên cạnh đó, các nghiên cứu dịch tễ học đã xác định được một số yếu tố nguy cơ ung thư vú có liên quan tới tiền sử kinh nguyệt và sinh sản, cho thấy vai trò của estrogen

Phạm Thị Huyền

NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN HỆ GIỮA MỘT SỐ ĐA

HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE CỦA GEN CYP19A1 VÀ

NGUY CƠ MẮC UNG THƯ VÚ Ở PHỤ NỮ VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Ha ̀ Nô ̣i – 2017

Phạm Thị Huyền

NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN HỆ GIỮA MỘT SỐ ĐA

HÌNH ĐƠN NUCLEOTIDE CỦA GEN CYP19A1 VÀ

NGUY CƠ MẮC UNG THƯ VÚ Ở PHỤ NỮ VIỆT NAM

Chuyên ngành Di truyền học

Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Ha ̀ Nô ̣i – 2017

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Sinh học tại

trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giảng

dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hành kỹ thuật thí nghiệm

trong suốt quá trình nghiên cứu tại trường

Để có thể thực hiện và hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết

ơn PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân đã hướng dẫn nghiên cứu, tạo điều kiện

thuận lợi và động viên tôi trong thời gian nghiên cứu và làm thí nghiệm tại

phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị, và các bạn làm

việc tại Phòng thí nghiệm Di truyền học đã cùng chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức

và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cán bộ tại

Bệnh viện Đa khoa Phú Thọ, Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương đã

tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ đã sinh thành

và nuôi dưỡng Xin cám ơn những người thân trong gia đình và bạn bè, những

người đã luôn bên cạnh khích lệ động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học

tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 28 tháng 12 năm 2017

Học viên

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Ung thư vú 3

1.1.1 Tình hình ung thư vú 3

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ 4

1.1.3 Các giai đoạn ung thư vú 6

1.1.4 Phân độ mô học ung thư vú 8

1.1.5 Phân loại ung thư vú 10

1.1.6 Chẩn đoán ung thư vú 11

1.2 Đa hình đơn nucleotide (SNP) 13

1.2.1 Giới thiệu về SNP 13

1.2.2 Ứng dụng và triển vọng của SNP 18

1.3 Gen CYP19A1 và ung thư vú 19

1.3.1 Gen CYP19A1 19

1.3.2 Enzyme aromatase và quá trình sinh tổng hợp estrogen 21

1.3.3 Estrogen và ung thư vú 22

1.4 Đa hình đơn nucleotide của gen CYP19A1 và ung thư vú 23

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Vật liệu nghiên cứu 29

2.1.1 Mẫu sinh phẩm 29

2.1.2 Hoá chất 30

2.1.3 Trang thiết bị 30

iii

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 30

2.2.2 Tách ADN từ mẫu máu 31

2.2.3 Phương pháp đo mật độ quang học 32

2.2.4 Kỹ thuật PCR 33

2.2.5 Kỹ thuật PCR–RFLP 34

2.2.6 Kỹ thuật PCR–CTPP 35

2.2.7 Phương pháp điện di 36

2.2.8 Giải trình tự 37

2.2.9 Phương pháp phân tích thống kê 37

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Tách chiết ADN tổng số 39

3.2 Kết quả PCR nhân bản đoạn gen CYP19A1 40

3.3 Kết quả PCR–RFLP để xác định kiểu gen tại SNP rs10046 41

3.4 Kết quả PCR–CTPP để xác định kiểu gen tại SNP rs223672 43

3.5 Kết quả phân tích thống kê 44

3.5.1 Phân tích ảnh hưởng của SNP rs10046 trên gen CYP19A1 đối với nguy cơ mắc ung thư vú 44

3.5.2 Phân tích ảnh hưởng của SNP rs2236722 (Trp39Arg) trên gen CYP19A1 đối với nguy cơ mắc ung thư vú 46

3.6 Thảo luận 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 63

CTPP Confronting Two – Pair Primer

CYP19 Cytochrome P450 family 19

DDW Deionized Distilled Water

DCIS Ductal Carcinoma In Situ

DBD DNA Binding Domain

ER Estrogen Receptor

ERE Estrogen Response Elements

Her–2/neu Human Epidermal growth factor Receptor

IBC Inflammatory Breast Cancer

IDC Invasive Ductal Carcinoma

ILC Invasive Lobular Carcinoma

OR Odd Ratio (Tỷ suất chênh)

PR Progesterone Receptor

LCIS Lobular Cancer In Situ

NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RFLP Restriction Fragment Lenghth Polymorphism (Đa hình

chiều dài đoạn cắt giới hạn) SNP Single Nucleotide Polymorphism (Đa hình đơn nucleotide)

SSCP Single Strand Conformation Polymorphism

TAE Tris – Acetate – EDTA

v

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Đa hình đơn nucleotide (SNP)

Hình 2 Phân loại SNP

Hình 3 Phản ứng của enzyme cắt giới hạn

Hình 4 Nguyên lý của phản ứng PCR–CTPP

Hình 5 Cấu trúc và vị trí gen CYP19A1 trên NST 15

Hình 6 Vai trò của aromatase trong quá trình tổng hợp estrogen

Hình 7 Estrogen điều hoà hoạt động gen

Hình 8 Vị trí SNP rs2236722 và SNP rs10046 trên gen CYP19A1

Hình 9 Sơ đồ thí nghiệm

Hình 10 Kiểu gen tại vị trí SNP rs10046 của gen CYP19A1

Hình 11 Kiểu gen tại vị trí SNP rs2236722 của gen CYP19A1

Hình 12 Kết quả điện di ADN tổng số của đại diện một số mẫu nghiên cứu

Hình 13 Sản phẩm PCR của đại diện một số mẫu nghiên cứu

Hình 14 Kết quả phản ứng cắt với enzyme giới hạn của đại diện một số mẫu

nghiên cứu

Hình 15 Kết quả giải trình tự đoạn gen CYP19A1 dài 202 bp có vị trí SNP

rs10046 của đại diện một số mẫu nghiên cứu

Hình 16 Kết quả phản ứng PCR–CTPP của đại diện một số mẫu nghiên cứu

Hình 17 Kết quả giải trình tự đoạn gen CYP19A1 dài 427 bp có vị trí SNP

rs2236722 của đại diện một số mẫu nghiên cứu

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Ba ̉ ng 1: Tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư vú ở các chủng tộc khác nhau

Bảng 2: Cách tích điểm phân độ mô học theo tiêu chuẩn của Elson

Bảng 3: Một số nghiên cứu về mối liên hệ giữa các SNP trên gen CYP19A1 và

bệnh ung thư vú

Bảng 4: Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ các mẫu nghiên cứu

Bảng 5: Trình tự mồi cho phản ứng PCR

Bảng 6: Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR

Bảng 7: Thành phần và điều kiện phản ứng cắt với enzyme giới hạn

Bảng 8: Trình tự 2 cặp mồi trong phản ứng PCR–CTPP

Bảng 9: Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR–CTPP

Bảng 10: Kết quả OD của đại diện một số mẫu ADN tách chiết

Bảng 11: Phân bố kiểu gen và tần số alen của gen CYP19A1 tại SNP rs10046

Bảng 12: Sự phù hợp của các số liệu quan sát tại SNP rs10046 với cân bằng

HW trong nhóm bệnh và nhóm đối chứng

Bảng 13: Mối liên hệ giữa alen, kiểu gen tại SNP rs10046 của gen CYP19A1

với nguy cơ mắc ung thư vú

Bảng 14: Phân bố kiểu gen và tần số alen của gen CYP19A1 tại SNP rs2236722

Bảng 15: Sự phù hợp của các số liệu quan sát tại SNP rs2236722 với cân bằng

HW trong nhóm bệnh và nhóm đối chứng

Bảng 16: Mối liên hệ giữa alen, kiểu gen tại SNP rs2236722 của gen CYP19A1

với nguy cơ mắc ung thư vú

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú là một căn bệnh hay gặp và chiếm tỷ lệ tử vong hàng đầu trong số các bệnh ung thư ở nữ giới Tính trung bình cứ 10 bệnh nhân chẩn đoán bị ung thư thì có 1 người bị ung thư vú, 5 bệnh nhân mắc ung thư vú thì 1 người bị tử vong Trên thế giới, xét riêng ở nữ giới, ung thư vú dẫn đầu về số

ca mắc mới với tỉ lệ 28% và đứng thứ hai về số ca tử vong với 15%, chỉ sau ung thư phổi [3] Ở Mỹ, theo ước tính của tổ chức Ung thư Hoa Kỳ, vào năm

2017 này sẽ có khoảng 40.610 phụ nữ và 460 nam giới sẽ chết vì ung thư vú [77] Ở Việt Nam, đã xác định được 11.060 trường hợp ung thư vú ở phụ nữ

được chẩn đoán với 64,7% các trường hợp phụ nữ dưới 50 tuổi vào năm 2012 [51]

Hiện nay, các phương pháp chẩn đoán ung thư vú gồm chụp X–quang, siêu âm, chụp cắt lớp, hóa mô miễn dịch được áp dụng ở hầu hết các nước phát triển Còn ở Việt Nam, bệnh nhân thường được chẩn đoán ung thư khi ở giai đoạn 2, trong khi ở các nước phát triển là từ giai đoạn 1 hoặc 0 Vì vậy, tỉ lệ tử vong vì ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam cao hơn rất nhiều so với các nước phát triển Từ đó cho thấy việc tìm kiếm các chỉ thị góp phần chẩn đoán sớm nguy cơ mắc ung thư vú ở người Việt Nam là hết sức cần thiết

Có nhiều yếu tố liên quan đến sự hình thành và phát triển ung thư vú như tuổi tác, lối sống, môi trường, yếu tố di truyền, đột biến gen…Trong số đó, mặc

dù chỉ chiếm từ 5–10% số trường hợp mắc ung thư vú nhưng yếu tố di truyền lại có thể sử dụng cho việc chẩn đoán và phát hiện bệnh từ rất sớm, góp phần giảm tỉ lệ tử vong và định hướng cho các điều trị đích Các đa hình đơn nucleotit (SNP–Single Nucleotide Polymorphism) thuộc các gen tham gia vào sự điều hoà và phát triển của ung thư vú đang là đối tượng rất được quan tâm bởi tác

động của nó và các haplotype giữa các SNP đối với sự phát triển ung thư vú [3]

Trong số những SNP nhạy cảm với ung thư vú đang được quan tâm hiện nay có thể kể đến là SNP rs10046 (C>T) và SNP 2236722 (Trp39Arg) (T>C)

2

thuộc gen CYP19A1 Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy mối liên quan giữa

2 SNP này với bệnh ung thư vú là khác nhau ở các quần thể, dân tộc [10, 16,

19, 21, 23, 29, 36, 43, 52, 53] Ở Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu nào về mối liên quan giữa 2 đa hình này với nguy cơ mắc ung thư vú

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu mối liên hệ giữa một số

đa hình đơn nucleotide của gen CYP19A1 và nguy cơ mắc ung thư vú ở

phụ nữ Việt Nam”

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Xác định tần số alen tại hai locus SNP rs10046 (C>T) và SNP

rs2236722 (Trp39Arg) (T>C) thuộc gen CYP19A1 trong nhóm bệnh nhân ung

thư vú và nhóm đối chứng

- Xác định mối liên quan giữa hai SNP rs10046 (C>T) và rs2236722

(T>C) trên gen CYP19A1 và nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam

là 3% trong khi ở các châu lục khác chỉ là 0,5% [77]

Tại Việt Nam, ung thư vú hiện chiếm đến 21% trường hợp ung thư xảy

ra ở phụ nữ, hiện nằm trong top 5 các bệnh ung thư thường gặp và dự đoán sẽ vươn lên đứng đầu Trong đó, thành phố Hồ Chí Minh và Hà Nội là những nơi

có tỷ lệ ung thư vú cao nhất nước Cứ 100.000 phụ nữ ở Hà Nội thì có 30 người mắc ung thư vú, tại thành phố Hồ Chí Minh con số này là 20 [74] So sánh tỷ lệ mắc ung thư vú /100.000 dân ở Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh và Hà Nội năm 1996 và 2008: tại thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ này là 12,2 (năm1996)

đã tăng lên đến 19,4 (năm 2008); tại Hà Nội tỷ lệ này là 26,7 (năm 1996) đã tăng lên đến 29,7 (năm 2008) Mỗi năm, Việt Nam có khoảng 11.000 ca mắc mới, trên 5.000 ca tử vong do ung thư vú [74]

So sánh với các nước, tỉ lệ mắc ung thư vú tại Việt Nam thấp hơn (23/100.000 dân) nhưng xu hướng gia tăng lại nhanh hơn, giai đoạn phát hiện bệnh trễ hơn (thường đến ở giai đoạn muộn) và lứa tuổi thường gặp cũng trẻ hơn Thường độ tuổi mắc bệnh ung thư vú nhiều là trên 60 tuổi, còn dưới 40 chỉ chiếm khoảng 3,2% như Canada hay 4,5% như Mỹ (bởi ung thư vốn là bệnh

lý liên quan đến lão hóa) Trong khi, theo nghiên cứu của bệnh viện Ung bướu

4

thành phố Hồ Chí Minh, độ tuổi mắc ung thư vú dưới 40 là 11,9%, thấp hơn Hàn Quốc (12,5%) [74] Bên cạnh đó, tình trạng phát hiện trễ tại Việt Nam do nhiều yếu tố như trở ngại tâm lý, kinh tế khó khăn, thiếu kiến thức về bệnh dẫn đến khó khan trong chẩn đoán và điều trị Nếu phát hiện trễ, chỉ 1 trong 5 phụ nữ bị ung thư vú đã di căn sống thêm được 5 năm sau chẩn đoán

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ

Hiện nay, những yếu tố nguy cơ ảnh hưởng tới ung thư vú vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ Trong đó, yếu tố do tiểu sử gia đình chiếm xấp xỉ 5 đến 7% số trường hợp ung thư vú [31] Phụ nữ có mẹ, chị hoặc con gái mắc ung thư vú

có nguy cơ mắc bệnh cao gấp hai đến bốn lần người bình thường [30] Hầu hết

các trường hợp di truyền đều liên quan đến hai gen BRCA1 và BRCA2 Ngoài

ra còn một số gen khác khi bị sai hỏng cũng gây nguy cơ cao mắc ung thư vú

như ATM, P53, CHEK2, PTEN, CDH1 Đặc biệt, bệnh nhân ung thư vú mang đột biến ở gen BRCA1, BRCA2 có nguy cơ bị tử vong cao hơn so với những bệnh

nhân ung thư vú không có đột biến [50]

Bên cạnh đó, các nghiên cứu dịch tễ học đã xác định được một số yếu tố nguy cơ ung thư vú có liên quan tới tiền sử kinh nguyệt và sinh sản, cho thấy vai trò của estrogen trong quá trình phát sinh ung thư vú Cứ xuất hiện kinh nguyệt lần đầu chậm một năm thì giảm được 5% nguy cơ ung thư vú [42] Ngoài ra, phụ nữ mãn kinh muộn có nguy cơ mắc ung thư vú cao hơn phụ nữ mãn kinh sớm, với nguy cơ mắc tăng 3% cho mỗi năm còn có kinh nguyệt [51]

Có kinh nguyệt sớm (<12 tuổi), tuổi mãn kinh muộn (>55 tuổi), vô sinh hay có con đầu lòng muộn đều làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú Hơn hai phần ba số bệnh nhân mắc ung thư vú sử dụng liệu pháp hormone trong quá trình điều trị càng cho thấy rõ mối liên quan giữa estrogen và nguy cơ mắc ung thư vú Tiếp xúc với môi trường chứa hợp chất tương tự estrogen (chẳng hạn như thuốc bảo vệ thực vật clo hữu cơ) cũng có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh ở phụ nữ [11]

5

Ở những nước công nghiệp phát triển thì tỷ lệ mắc ung thư vú cao hơn so với những nước công nghiệp chưa phát triển Nguyên nhân chính là do sự tiếp xúc với các chất thải công nghiệp có khả năng tăng nguy cơ mắc ung thư ở phụ nữ [55] Theo Parkin (2011), có thai giúp phụ nữ giảm nguy cơ ung thư vú, phụ nữ

có ít nhất một lần sinh con sẽ giảm được 27% nguy cơ mắc ung thư vú so với phụ nữ chưa từng sinh đẻ [48]

Các yếu tố môi trường (tiếp xúc với chất gây ung thư, chế độ ăn uống, thói quen uống rượu bia, hút thuốc lá và béo phì) cũng được biết đến làm gia tăng nguy cơ mắc ung thư vú Tỷ lệ mắc ung thư vú cao ở các nước phương Tây có thể được giải thích một phần do chế độ ăn không hợp lý Chế độ ăn quá nhiều chất béo, ít rau quả và trái cây kèm theo thiếu sự luyện tập thể dục, thể thao Trong thực tế, phụ nữ gốc châu Á sinh sống ở phương Tây có nguy cơ mắc ung thư vú cao hơn 60% so với người gốc châu Á sinh sống ngay tại Châu

Á, do nguyên nhân chủ yếu là sự khác biệt về lối sống Một nghiên cứu khác cho thấy rằng phụ nữ ở Trung Quốc có chế độ ăn uống giàu chất béo thì nguy

cơ mắc ung thư vú cao gấp hai lần so với phụ nữ Trung Quốc có chế độ ăn ít chất béo và nhiều rau xanh [72]

Bên cạnh đó, một nhân tố khác có thể làm giảm nguy cơ mắc ung thư vú,

đó là cho con bú bằng sữa mẹ Một nghiên cứu rộng rãi với 4.500 phụ nữ ở Mỹ cho thấy những phụ nữ cho con bú trong 2 năm hoặc lâu hơn sẽ có nguy cơ mắc ung thư vú thấp hơn tới 40% so với những phụ nữ không bao giờ cho con bú Ngoài ra, một số nhân tố khác cũng làm tăng nguy cơ ung thư vú như đặt vòng

tránh thai, chế độ ăn giàu chất béo hay sử dụng cồn [55]

Các dữ liệu cho thấy chủng tộc là một yếu tố quan trọng trong việc làm gia tăng nguy cơ mắc ung thư vú (Bảng 1) Phụ nữ Hoa Kỳ, Châu Âu, Hawaii,

và phụ nữ Mỹ gốc Phi có tỷ lệ mắc ung thư vú xâm lấn cao gấp bốn lần so với phụ nữ Hàn Quốc, Ấn Độ và Việt Nam Ngoài ra, phụ nữ Mỹ gốc Phi có tỷ lệ

Người Mỹ gốc Ấn/

1.1.3 Các giai đoạn ung thư vú

Ung thư được phân chia theo các giai đoạn phát triển dựa vào kích thước, vị trí của khối u nguyên phát, mức độ xâm lấn cũng như khả năng di căn [17] Hiện nay, hệ thống phân loại giai đoạn ung thư vú đang được sử dụng phổ biến nhất là hệ thống TNM, dựa trên kích thước khối u (Tumor), số hạch nách phát sinh (Node) và mức độ di căn (Metastasized) Theo hệ thống phân loại này, ung thư vú, tiến triển của ung thư có thể chia thành các giai đoạn từ 0 đến IV

Giai đoạn 0 tương ứng với ung thư vú không xâm lấn, ví dụ như ung thư biểu mô ống dẫn sữa tại chỗ Giai đoạn này, các tế bào ung thư chỉ khu trú, không hề xuất hiện bất cứ một tế bào ung thư hay tế bào dị thường nào xuất hiện ngoài vùng vú, hay có biểu hiện tấn công các vùng mô lành xung quanh

Giai đoạn I tương ứng với ung thư vú xâm lấn, các tế bào ung thư bắt đầu lan tỏa và tấn công các phần mô lành của vú Ở giai đoạn này, sự xâm lấn

7

mới chỉ diễn ra rất ít, chủ yếu tại các đường ống dẫn sữa Giai đoạn I được chia làm IA, IB, trong đó, IA tương ứng với tình trạng hạch lympho không xuất hiện

tế bào ung thư, IB tương ứng với tình trạng hạch lympho xuất hiện tế bào ung thư

Giai đoạn II được chia ra làm IIA và IIB IIA mô tả ung thư xâm lấn dưới dạng khối u có kích thước nhỏ hơn 2cm, di căn hạch nách hoặc khối u có kích thước lớn hơn 2cm, không di căn hạch nách IIB mô tả ung thư xâm lấn dưới dạng khối u có kích thước lớn hơn 2cm và nhỏ hơn 5cm, có di căn hạch nách; hoặc khối u có kích thước lớn hơn 5cm và không di căn hạch nách

Giai đoạn III tương ứng với ung thư có di căn hạch lympho, các hạch này tập trung thành cụm hoặc gắn lên các cấu trúc khác, hoặc di căn hạch lympho gần xương ức Giai đoạn III được chia ra làm IIIA, IIIB và IIIC IIIA mô tả ung thư xâm lấn dưới dạng không có khối u, hoặc khối u với kích thước bất kỳ IIIB

mô tả ung thư xâm lấn dưới dạng khối u có kích thước bất kỳ và phát triển tới thành ngực và phần da của vú IIIC mô tả ung thư xâm lấn dưới dạng không hình thành khối u cố định ở vú, hoặc nếu có khối u thì không có kích thước cụ thể, và có thể lan tỏa đến thành ngực và/ hoặc đến da vú, đồng thời di căn hạch lympho trên hoặc dưới xương cổ và có thể di căn hạch nách

Giai đoạn IV mô tả ung thư vú xâm lấn dưới dạng di căn ra xa vú và hình thành các hạch lympho ở các cơ quan khác nhau trong cơ thể, hạch gần ở phổi, hạch xa ở da, xương, gan hay não [17]

Tình trạng ung thư vú thể hiện qua các bệnh nhân ở các giai đoạn khác nhau phụ thuộc phần lớn vào các chương trình chẩn đoán ung thư của mỗi quốc gia Ở những quốc gia, chính phủ chú trọng vào công tác chẩn đoán, có tới 50% bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến vú được chẩn đoán khi mới ở giai đoạn 0

8

hoặc I, với khả năng sống trong 10 năm rất cao, tới 95%, 88%, 66%, 36% và 7% tương ứng với các giai đoạn 0, I, II, III và IV [17]

1.1.4 Phân độ mô học ung thư vú

Trong nhiều thập kỷ qua, đã có nhiều tác giả nghiên cứu phân độ mô học ung thư biểu mô tuyến vú với mục đích chẩn đoán chính xác về hình thái học của khối u, đồng thời cung cấp nhưng thông tin quan trọng và hỗ trợ cho việc điều trị Tùy thuộc vào sự xuất hiện của các tế bào ác tính, tức là tế bào bất bình thường (về hình dáng, kích thước, cấu trúc nhân tế bào) mà khối u được phân chia thành các độ khác nhau (grade–G) Có nhiều cách phân chia cấp độ phụ thuộc vào từng loại ung thư

Năm 1957, Bloom và Richardson đã phân độ mô học theo hệ thống chia điểm gồm ba thông số: sự hình thành ống nhỏ, sự đa hình thái của nhân và hoạt động phân chia của nhân Những thông số này chỉ áp dụng cho ung thư biểu

mô ống xâm nhập Đây là loại ung thư chiếm tỉ lệ cao nhất (79%) trong các loại ung thư vú [34] Mỗi loại thông số đều được cho điểm từ 1 đến 3 tương ứng lần lượt với mức độ nhẹ, trung bình và nặng Tổng điểm sẽ thay đổi từ 3 đến 9 Khối u có số điểm từ 3 đến 5 là độ I, 6 hoặc 7 là độ II, 8 hoặc 9 là độ III Bloom

và Richardson tìm thấy trong số 1409 trường hợp ung thư vú ở phụ nữ Mỹ có 26% là độ I, 45% là độ II và 29% là độ III [8]

Năm 1993, Elson và CS đã đề xuất một phương pháp chia độ hoàn thiện thêm các tiêu chí từ cách chia độ của Bloom và Richardson [20] Hệ thống chia độ của Elson chủ yếu áp dụng cho ung thư biểu mô ống xâm nhập Phân độ này dựa vào sự hình thành ống nhỏ, mức đa hình thái nhân và hoạt động phân chia nhân Mỗi yếu tố được cho từ 1 đến 3 điểm theo Bảng 2

Mức độ đa hình thái của nhân

1 điểm

Phần lớn tổn thương

có hình thành ống nhỏ (>75%)

0-5 nhân có sự phân chia

Kích thước nhân tế bào khối u tương đối đồng đều, hình dạng ít thay

đổi

2 điểm

Có những vùng ống

tuyến rõ xen lẫn với

các đám tế bào không

có cấu trúc ống tuyến

(10–75% ống nhỏ)

6-10 nhân có sự phân chia Mức độ trung gian

Với các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư vú có tiêu chí dựa vào tình trạng di căn hạch lympho, đặc biệt là hạch nách và phân độ mô học ung thư biểu mô vú như trên, khi đánh giá tình trạng bệnh, có hai tiêu chí trong chẩn đoán cần được đặc biệt quan tâm là số hạch nách di căn và độ mô học của ung thư vú

10

1.1.5 Phân loại ung thư vú

Ung thư vú thường xuất hiện ở các tế bào biểu mô thùy tuyến sữa hay ống dẫn sữa Có thể phân biệt ung thư vú thành 2 dạng chính: ung thư tại chỗ

và ung thư xâm lấn Ung thư vú tại chỗ được chia thành ung thư ống tại chỗ (Ductal carcinoma in situ–DCIS) và ung thư tiểu thùy tại chỗ (Lobular cancer

in situ–LCIS) Ngoài ra còn một số dạng ung thư vú khác ít gặp hơn như ung thư vú viêm nhiễm (Inflammatory breast cancer–IBC) liên quan đến vùng da của vú; ung thư vú dạng Paget có đặc điểm là ngứa và đóng vảy ở núm vú Ung thư vú xâm lấn chủ yếu bắt đầu từ ống tuyến (80–90%), ít xuất phát từ tiểu thùy (10–20%) Khoảng 70–75% các ca mắc ung thư vú là có xâm lấn [75]

 Ung thư tại chỗ

Ung thư biểu mô ống dẫn tại chỗ (DCIS): là loại ung thư không xâm lấn phát sinh trong ống dẫn sữa của vú và không lan ra ngoài ống dẫn sữa Khoảng 30–50% phụ nữ bị DCIS được điều trị bằng phẫu thuật sẽ phát triển thành ung thư vú xâm lấn trong vòng 10 năm [48] Hàng năm, tại Hoa Kỳ có khoảng 62.000 trường hợp DCIS được chẩn đoán qua chụp nhũ ảnh DCIS xuất hiện trên nhũ ảnh là một cụm vôi rất nhỏ và thường được điều trị bằng cách cắt bỏ khối u [75]

Ung thư tiểu thùy tại chỗ (LCIS): là tình trạng các tế bào bất thường được phát hiện trong tiểu thùy của vú Hội ung thư Mỹ ước tính có khoảng 25 % bệnh nhân mắc LCIS sẽ mắc bệnh ung thư vú xâm lấn trong vòng 25 năm kể từ khi chẩn đoán Do vậy, việc chẩn đoán này được dùng để tìm bệnh nhân có nguy

cơ mắc bệnh ung thư vú xâm lấn cao [75]

 Ung thư xâm lấn

Ung thư biểu mô ống dẫn xâm lấn (Invasive Ductal Carcinoma–IDC): IDC là loại ung thư vú phổ biến nhất, có đến 80–90% các ca mắc ung thư vú xâm lấn là thuộc loại này Đây là loại ung thư bắt đầu từ ống dẫn sữa, vượt qua

11

thành ống và xâm lấn các mô gần đó [75]

Ung thư tiểu thùy xâm lấn (Invasive Lobular Carcinoma–ILC): ILC là loại ung thư xuất phát từ một tiểu thùy vú ra mô gần đó Khoảng 10–20 % các

ca mắc ung thư vú xâm lấn là thuộc loại này [75]

1.1.6 Chẩn đoán ung thư vú

 Chẩn đoán lâm sàng

Đa phần ung thư vú được phát hiện do chính người bệnh, khi họ ghi nhận thấy một sự thay đổi ở tuyến vú, thường là một khối bướu hay một chỗ dày cứng lên không đau ở vú Trong y khoa, dấu hiệu lâm sàng được sử dụng để chẩn đoán mắc ung thư vú là: khối u vú thường không gây đau, một số trường hợp có chảy dịch đầu vú (dịch máu hoặc dịch vàng chanh), khối u có mật độ cứng rắn, mặt gồ ghề, ranh giới có thể rõ hoặc không Trong những trường hợp bệnh nhân đến thăm khám muộn, khối u có thể xâm lấn vào thành ngực làm hạn chế di động hoặc xâm nhiễm da tạo hình ảnh "sần da cam" hoặc vỡ loét Đôi khi ung thư vú cũng biểu hiện như một viêm tấy lan toả vùng vú (ung thư

vú thể viêm) Trong nhiều trường hợp bệnh nhân thường có hạch nách cùng bên, hạch có thể có các mức độ tổn thương từ mềm đến cứng hoặc xâm nhiễm dính vào xung quanh tuỳ theo mức độ tiến triển bệnh Trong mọi trường hợp đều phải lưu ý khám hạch thượng đòn và tuyến vú đối bên [3]

 Chẩn đoán hình ảnh

- Chụp nhũ ảnh: Là một phương pháp chụp X quang vú có ý nghĩa đặc biệt trong việc tầm soát ung thư vú Hình ảnh chụp X quang tuyến vú của bệnh nhân ung thư vú sẽ cho thấy tổn thương điển hình có dạng hình sao nhiều chân,

co kéo tổ chức tuyến vú, có nhiều chấm vi can–xi hoá tập hợp thành đám Tỷ lệ tử vong của bệnh giảm 22% ở nhóm phụ nữ trên 55 tuổi và 15% ở nhóm tuổi

từ 40–49 tuổi có sàng lọc bằng nhũ ảnh [75]

12

- Siêu âm: Là phương tiện thay thế cho chụp nhũ ảnh đối với các bệnh nhân trẻ, hay kèm theo bệnh xơ nang vú Siêu âm có thể chẩn đoán phân biệt khối u đặc hay nang và hướng dẫn cho việc chọc hút sinh thiết [75]

 Chẩn đoán tế bào, mô bệnh học

- Sinh thiết: Nếu một trong ba phương pháp chuẩn đoán lâm sàng, chụp X–quang tuyến vú và xét nghiệm tế bào vẫn chưa thể kết luận, bác sỹ lâm sàng

có thể chỉ định sinh thiết kim, sinh thiết tức thì hoặc sinh thiết mở thường quy

để khẳng định chẩn đoán Sinh thiết kim: cho phép lấy mảnh tổ chức làm xét nghiệm giải phẫu bệnh định loại mô bệnh học (xác định độ mô học ung thư vú)

và các xét nghiệm khác Sinh thiết tức thì: cho phép chẩn đoán xác định ung thư ngay khi bệnh nhân ở trên bàn mổ Sinh thiết mở: trong nhiều trường hợp chỉ phát hiện được ung thư sau khi đã phẫu thuật lấy khối u Vì vậy, mọi trường hợp mổ u vú đều bắt buộc phải kiểm tra giải phẫu bệnh khối u, đặc biệt là đối với các bệnh nhân trên 35 tuổi [1] Xét nghiệm có độ nhậy đạt tới 90–98% (phụ thuộc chủ yếu vào kỹ năng và kinh nghiệm của xét nghiệm viên) [74]

- Xét nghiệm tế bào học: Xét nghiệm tế bào học trên tuyến vú có độ nhậy 93,16% Bệnh phẩm được phết lên phiến kính để khô, rồi nhuộm theo kỹ thuật Giemsa hoặc nhuộm heamatoxyline và eosin Xét nghiệm tế bào học thường cho thấy các tế bào ung thư mất sự kết dính, đa hình thái, tỷ lệ nhân/nguyên sinh chất tăng, nhiều nhân quái phân chia, bào tương kiềm tính [1] Phương pháp đơn giản, nhanh, ít tốn kém, ít gây thương tổn và có thể thực hiện ở các tuyến cơ sở khi chưa có phòng xét nghiệm chẩn đoán mô bệnh học [3] Tuy nhiên, kết quả lại phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm kỹ thuật viên

- Hóa mô miễn dịch: Trong nhiều trường hợp, bệnh nhân được chỉ định làm xét nghiệm hoá mô miễn dịch nhằm dự đoán đáp ứng điều trị, xác định các liệu pháp bổ trợ thích hợp Kỹ thuật này dựa trên các dấu ấn sinh học của tế bào

13

khối u, được tiến hành khi bệnh nhân đã phẫu thuật cắt bỏ khối u Đối với ung thư vú, Her–2/neu, ER, PR là ba dấu ấn sinh học quan trọng Tùy vào mức độ biểu hiện của các dấu ấn sinh học này trên khối u mà các bác sỹ quyết định phương thức điều trị là hóa trị, xạ trị hay điều trị nội tiết Xác định thụ thể estrogen, progesteron bằng kháng thể đơn dòng, chất nền thường dùng là diaminobenzidine, được soi trên kính hiển vi thông thường để bán định lượng dựa vào số protein có mặt Nhiều nghiên cứu cho thấy khi áp dụng phương pháp hóa mô miễn dịch trên một mẫu bệnh phẩm được xử lý, cố định tốt, thì dựa vào kết quả cho thấy một sự tương ứng khá chặt chẽ giữa mức độ khuếch đại của gen với mức độ biểu hiện của protein do gen đó mã hóa [3] Ưu điểm của phương pháp là tiện lợi, ít tốn kém, mẫu thử nghiệm dễ bảo quản sau khi đã phân tích, và chỉ cần sử dụng kính hiển vi thông thường khi quan sát Nhược điểm của phương pháp là chịu ảnh hưởng bởi điều kiện bảo quản trước đó, thời gian, kỹ thuật cố định bệnh phẩm và quan trọng hơn cả đó là khó khăn khi áp dụng bảng tính điểm để có kết luận chính xác, kết quả phụ thuộc nhiều vào sự chủ quan của người soi kính [75]

1.2 Đa hình đơn nucleotide (SNP)

1.2.1 Giới thiệu về SNP

SNP được viết tắt từ chữ Single Nucleotide Polymorphism, có nghĩa là các dạng đa hình đơn nucleotide SNP là những biến thể trình tự ADN xảy ra khi một nucleotide (A, T, C, hoặc G) trong trình tự hệ gen bị thay đổi (Hình 1)

Ví dụ một SNP có thể thay đổi trình tự ADN: TGCCAGTT thành TGCTAGTT

SNP là chỉ thị phân tử thường được sử dụng để phân tích hệ gen người

và nhiều sinh vật khác với số lượng lớn nhất trong số các loại chỉ thị ADN khác nhau (tạo nên khoảng 90% các biến thể di truyền ở người) Đối với một biến thể được coi là một SNP thì phải xảy ra trong ít nhất 1% dân số 2/3 số SNP liên quan đến sự thay thế của cytosine (C) thành thymine (T) [76]

14

Hình 1 Đa hình đơn nucleotide (SNP)

SNP có thể xảy ra trong cả vùng mã hoá và vùng không mã hoá của hệ gen (Hình 2) SNP xảy ra tại vùng mã hoá có thể là các SNP đồng nghĩa (sự thay thế một nucleotide biến đổi bộ ba này thành bộ ba khác nhưng mã hoá cùng 1 axit amin), SNP sai nghĩa (sự thay thế một nucleotide làm thay đổi bộ

ba quy định axit amin này thành bộ ba quy định axit amin khác) hoặc SNP thay thế vô nghĩa (sự thay thế một nucleotide làm biến đổi bộ ba quy định axit amin thành bộ ba kết thúc)

Do đó, sự phát triển của bản đồ chi tiết về đa hình đơn nucleotide ở genome người kết hợp với công nghệ di truyền hiệu suất cao có thể cho phép chúng ta làm sáng tỏ các đặc tính phức tạp của di truyền Đồng thời, do SNP tiến hoá ổn định, không thay đổi nhiều từ thế hệ này sang thế hệ khác làm cho chúng ta dễ dàng hơn khi nghiên cứu dân số Dự đoán có 100.000 hoặc nhiều hơn nữa chỉ thị SNP (trong quãng 30 kb hoặc 5 marker cho một gen) trong hệ gen người (Collin và cs năm 1997) [76]

Các phương pháp có sẵn hiện nay để xác định kiểu gen của các đa hình đơn nucleotide như:

- Phân tích đa hình sợi đơn (identification of single strand conformation polymorphisms–SSCP) Phương pháp này cho tỉ lệ thành công từ 70–95%, nhược điểm của phương pháp là tốn nhiều công sức và có hiệu suất tương đối thấp [76]

- Phân tích dị sợi kép (heteroduplex analysis) là phương pháp phổ biến cho phát hiện SNP do sự đơn giản, giá thành thấp và tỉ lệ phát hiện cao (95–100%)

- Giải trình tự trực tiếp ADN cũng là một phương pháp được sử dụng nhiều Một khi phản ứng giải trình tự được hoàn thành, dye giải trình tự sẽ phát hiện 95% các dị hợp tử, các dye đắt tiền hơn và cần nhiều công sức hơn có thể phát hiện 100% [76]

16

- Các mảng phát hiện biến thể (variant detector arrays–VDA) có nhiều ưu điểm và tỷ lệ phát hiện cao, cho phép phát hiện các SNP bằng quá trình lai sản phẩm PCR với mảng array sử dụng đầu dò oligonucleotide trên một chip thuỷ tinh và đo sự khác biệt trong liên kết lai giữa oligonucleotides phù hợp và không phù hợp

- Kỹ thuật ADN microarrays (DNA microarray) được áp dụng nhưng phương pháp này hiện nay rất đắt tiền

- Trong các nghiên cứu di truyền với một kích thước mẫu tương đối lớn, RFLP đã trở thành phương pháp phổ biến vì đây là kỹ thuật đơn giản với chi phí thấp Phương pháp PCR–RFLP (Polymerase Chain Reaction of Restriction Fragment Lenghth Polymorphism) là phương pháp nghiên cứu tính đa hình của các phân đoạn ADN dựa trên điểm cắt của các enzyme giới hạn Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhân biết của chúng trên ADN hệ gen Khi ủ với enzyme giới hạn ở dung dịch đệm, pH, nhiệt độ và thời gian thích hợp, đoạn ADN sẽ bị enzyme giới hạn cắt

ở vị trí đặc hiệu để tạo ra những phân đoạn ADN với kích thước khác nhau Dựa vào kích thước các đoạn sau khi cắt để xác định alen và kiểu gen tại vị trí SNP tương ứng Nhược điểm của phương pháp RFLP là bước ủ cùng enzyme giới hạn mất khá nhiều thời gian, tuỳ thuộc vào enzyme giới hạn

Hình 3 Phản ứng của enzyme cắt giới hạn

17

- Phương pháp PCR–CTPP (Polymerase Chain Reaction with Confronting Two Pair Primers) là phương pháp sử dụng hai cặp mồi đối nhau, được sử dụng để phát hiện các đa hình đơn nucleotide Kỹ thuật PCR–CTPP không sử dụng sản phẩm PCR, hơn nữa có thể xác định đa hình SNP mà không cần vị trí giới hạn [45] Sản phẩm khuếch đại bao gồm một băng phổ biến và một băng cụ thể xác định cho từng alen Các kiểu gen sau đó sẽ được xác định trực tiếp bằng phương pháp điện di Kỹ thuật này đơn giản hơn so với kỹ thuật PCR–RFLP và phù hợp cho xác định kiểu gen trong các nghiên cứu di truyền

với cỡ mẫu lớn Nguyên lý của kỹ thuật PCR–CTPP được biểu diễn trên Hình 4

Hình 4 Nguyên lý của phản ứng PCR–CTPP [45]

a: kích thước băng cụ thể xác định alen X

b: kích thước băng cụ thể xác định alen Y

c: kích thước băng phổ biến giữa mồi F1 và R2

d – 1: tổng kích thước của mồi F2 và R1

Các sản phẩm ADN được khuếch đại có các kích thước băng đặc thù cho mỗi alen X, Y tương ứng là các băng có kích thước a bp và b bp Các kích thước băng a và b bp phải có khác biệt đủ lớn để các sản phẩm được phân biệt sau khi điện di Với kiểu gen đồng hợp tử XX, quan sát được băng a bp (sản phẩm từ

18

phản ứng khuếch đại với cặp mổi F1/R1) và băng c bp (sản phẩm từ phản ứng khuếch đại với cặp mổi F1/R2), chuỗi ADN giữa 2 mồi F2/R1 không được khuếch đại Với kiểu gen đồng hợp tử YY, các băng quan sát được là băng b

bp (sản phẩm từ phản ứng khuếch đại với cặp mổi F2/R2) và băng c bp Kiểu gen dị hợp tử XY, sản phẩm sau phản ứng gồm 3 băng: a bp, b bp, c bp trong

đó c = a + b – (d – 1) bp, và d là tổng độ dài cặp mồi F2 và R1

Bên cạnh việc chọn lựa phương pháp cho phát hiện SNP, thì quần thể sử dụng để phát hiện SNP cũng cần được chọn lọc Các quần thể và dân tộc khác nhau sẽ cho những khác biệt đáng kể trong tần số alen SNP Nhóm người đa sắc tộc là đối tượng được chọn lựa sử dụng trong các nghiên cứu phân tích về SNP, mục đích để tối đa hoá cơ hội phát hiện SNP Một nhóm đối tượng khác cũng được ưu tiên lựa chọn trong các nghiên cứu phân tích về SNP đó là nhóm người mang bệnh, theo logic là các biến thể góp phần vào giai đoạn bệnh sẽ xuất hiện với tần số cao ở nhóm người này

1.2.2 Ứng dụng và triển vọng của SNP

Vật liệu di truyền của mỗi người có một mô hình SNP độc đáo được tạo thành nhiều biến thể di truyền khác nhau, nó như là các dấu hiệu sinh học để xác định chính xác một căn bệnh trên bản đồ gen người SNP không gây bệnh, nhưng có thể xác định khả năng phát triển một căn bệnh cụ thể do nó thường nằm gần một gen có liên quan đến một bệnh Một số những khác biệt di truyền

đã được chứng minh là rất quan trọng trong việc trong việc nghiên cứu về sức khoẻ con người Thỉnh thoảng, một SNP thực sự có thể gây ra một căn bệnh,

và do đó, có thể được sử dụng để tìm kiếm và cô lập các gen gây bệnh

Các nhà khoa học tin rằng xây dựng bản đồ SNP sẽ giúp họ xác định được nhiều gen liên quan với các bệnh phức tạp như ung thư, bệnh tiểu đường,

và một số hình thức của bệnh tâm thần Để tạo một thử nghiệm di truyền, gen gây bệnh nào đó đã được xác định bởi các nhà khoa học Sau đó, tiến hành thu

19

thập mẫu máu từ một nhóm các cá nhân bị ảnh hưởng bởi căn bệnh này và phân tích ADN của họ tại các vị trí SNP mục tiêu Tiếp theo, các nhà nghiên cứu so sánh các mô hình với các mẫu thu được bằng cách phân tích ADN từ một nhóm các cá nhân không bị ảnh hưởng bởi căn bệnh này Quá trình so sánh này có thể phát hiện sự khác biệt giữa các mô hình SNP của hai nhóm, qua đó cho thấy đó

là mô hình rất có thể liên quan với gen gây bệnh Cuối cùng, hồ sơ SNP là đặc trưng của nhiều loại bệnh khác sẽ được thành lập Sau đó, các bác sĩ có thể xác định một người có thể nhạy cảm với một căn bệnh nào đó chỉ bằng cách phân tích các mẫu ADN của họ cho mô hình cụ thể SNP

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy SNP có thể giúp dự đoán phản ứng của một cá nhân với một số loại thuốc nhất định Bởi vì yếu tố di truyền cùng ảnh hưởng đến phản ứng của một người điều trị bằng thuốc, đa hình ADN chẳng hạn như SNP sẽ là hữu ích trong việc giúp các nhà nghiên cứu xác định và hiểu

lý do tại sao các cá nhân khác nhau có thể hấp thụ các loại thuốc nhất định, cũng như để xác định lý do tại sao một cá nhân lại chịu tác động bởi tác dụng phụ bất lợi của một loại thuốc cụ thể Vì vậy, những phát hiện gần đây của SNP hứa hẹn mang đến một cuộc cách mạng không chỉ là trong quá trình phát hiện bệnh mà còn ứng dụng trong cả quá trình phòng ngừa và chữa bệnh

SNP có thể được sử dụng để theo dõi các gen bệnh được thừa kế qua các thế hệ trong gia đình Ngoài ý nghĩa nghiên cứu trong chẩn đoán, y sinh học, thì SNP còn giúp để xác định hàng ngàn các dấu hiệu bổ sung trong hệ gen

1.3 Gen CYP19A1 và ung thư vú

1.3.1 Gen CYP19A1

CYP19A1 nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 15 ở người (15q21),

kích thước khoảng 123 kb Vùng mã hoá (exon 2 đến exon 10) dài khoảng 34,3

kb, trong khi vùng điều hoà dài hơn ba lần (khoảng 95 kb) Vùng điều hoà nằm trong vùng 5' của gen và bao gồm ít nhất 10 promoter khác nhau [9]

20

Gen CYP19A1 mã hoá cho enzyme aromatase, còn được gọi là enzyme

tổng hợp estrogen Các nghiên cứu đã cho thấy sự biểu hiện của gen aromatase trong sự phụ thuộc estrogen ở các mô ung thư vú, ung thư nội mạc tử cung, ung thư ruột kết, dạ dày, gan, phổi, buồng trứng, tụy và ung thư tuyến tiền liệt [26, 58] Sự biểu hiện của aromatase ở các tế bào cụ thể xác định hoạt tính aromatase trong mô và do đó xác định được lượng estrogen

Hình 5 Cấu trúc và vị trí gen CYP19A1 trên NST 15

Quy trình phiên mã của aromatase đã được nghiên cứu rộng rãi từ những năm 1980 Nhiều cơ chế đã được đề xuất để giải thích sự kiểm soát cơ bản của

biểu hiện gen CYP19A1, nhằm mục đích làm sáng tỏ vai trò sinh lý của

aromatase trong quá trình phát triển của ung thư [58] Một số cơ chế ở mức phiên mã, sau phiên dịch đã được công bố Ngoài các cơ chế này, các biến thể

di truyền rộng rãi của gen CYP19A1 đã được xác định có ảnh hưởng đến hoạt

động của aromatase và có thể được coi là các yếu tố tiên lượng nguy cơ mắc

ung thư [15, 66].

21

1.3.2 Enzyme aromatase và quá trình sinh tổng hợp estrogen

Gen CYP19A1 mã hoá cho enzyme aromatase, còn được gọi là enzyme

tổng hợp estrogen, là một thành viên quan trọng của cytochrome p450, phân họ

19 Trong quá trình tổng hợp estrogen, biến đổi androgen thành estrogen là bước biến đổi cuối cùng và được xúc tác bởi enzyme aromatase thực hiện chức năng oxi hoá nhóm methyl Estrone (E1) được tạo thành từ androstenedion và estradiol (E2) được tạo thành từ testosterone sau phản ứng tạo nhóm OH (hydroxylation) từ các tiền chất tương ứng (Hình 6) [60]

Hình 6 Vai trò của aromatase trong quá trình tổng hợp estrogen

Estrogen hoạt động trong suốt giai đoạn tăng trưởng và phát triển quan trọng của vú, có vai trò trong việc kích thích phân chia tế bào vú, hỗ trợ sự tăng trưởng của các khối u [27] Do đó, bất kỳ thay đổi nào trong quá trình tổng hợp estrogen đều có thể thay đổi hàm lượng estrogen được sản xuất, nhưng đặc hiệu hơn cả là tác động vào quá trình biến đổi từ androgen thành estrogen dưới sự xúc tác của enzyme aromatase

22

Các thay đổi di truyền của gen CYP19A1 có thể làm thay đổi hoạt tính

của aromatase [7, 42], dẫn đến thay đổi hàm lượng estrogen được sản xuất Tuy nhiên, cơ chế phân tử của chúng không rõ ràng

1.3.3 Estrogen và ung thư vú

Estrogen là một loại hormone mang bản chất là steroid, có thể tan trong chất béo Trong máu, estrogen thường tồn tại dưới dạng tự do và một ít tồn tại dưới dạng liên kết với protein nhưng phức hợp protein-hormone này thường không có hoạt tính Nồng độ estrogen trong huyết tương rất thấp so với các hợp chất khác, chỉ khoảng 10–15pmol/l (ở phụ nữ không mang thai) Tuy hàm lượng estrogen có rất ít trong cơ thể nhưng các tế bào mô chuyên biệt vẫn có sự đáp ứng với estrogen do có các thụ thể của nó (ER) Các thụ thể này cho phép quy

tụ các estrogen bên trong tế bào và quan trọng hơn là giúp khơi mào cho các đáp ứng của tế bào

Hình 7 Estrogen điều hoà hoạt động gen

23

Estrogen nằm rải rác bên ngoài tế bào, ER cư trú trên màng nhân tế bào Khi không có mặt estrogen, các thụ thể của nó (ER) bị bất hoạt Khi có mặt estrogen, chúng đến tế bào đích và do có bản chất là steroid nên có thể dễ dàng xuyên qua màng tế bào để vào trong tế bào chất và tương tác với thụ thể của nó (ER), cho phép sự trùng hóa, biến đổi hình dạng và cấu trúc từ bất hoạt sang dạng hoạt động và nhờ vùng DBD (DNA Binding Domain) của ER gắn với ADN tại yếu tố đáp ứng estrogen (ERE) và mang hormone vào nhân tế bào Khi phức hệ estrogen–ER được gắn với ERE trên ADN, ERE sẽ gắn với protein đồng hoạt hóa hay protein đồng ức chế để kích thích hay kìm hãm sự phiên mã của nhiều gen liên tiếp (Hình 7) ERE kích hoạt hay kìm hãm sự phiên mã gen ảnh hưởng đến nhiều protein khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào có liên quan

Các gen này liên quan đến hoạt động của enzyme protease, ubiquitin

ligase, ATPase, kinase và protein Cyclin D1 (sản phẩm của gen CCND1 có tác

dụng điều hòa chu kỳ tế bào) Trong điều trị và tiên lượng ung thư vú, hàm lượng estrogen và thụ thể ER được xem là thông số quan trọng liên quan chặt chẽ với sự hình thành khối u và phát triển ung thư xâm lấn [19]

1.4 Đa hình đơn nucleotide của gen CYP19A1 và ung thư vú

Ung thư vú là ung thư thường gặp nhất ở tất cả các chủng tộc và mọi nhóm dân tộc Estrogen làm tăng sinh và phát triển tế bào ở vú Do đó, đa hình của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp estrogen và sự trao đổi chất

đã được coi là các yếu tố ảnh hưởng đến nguy cơ ung thư vú Các nghiên cứu được thực hiện từ những năm đầu thập kỷ 70 cho thấy nguy cơ chính và tiền nhân tố gây nên bệnh ung thư vú là tăng tiếp xúc với estrogen và progesterone [22] Hơn nữa, sản xuất estrogen ở mô vú đã cho thấy vai trò chính trong việc gia tăng hàm lượng các hocmon trong mô ngực, do đó đẩy nhanh sự phát triển

24

và tăng trưởng của tế bào và sự chuyển đổi ác tính [46] Các yếu tố di truyền làm tăng khả năng phát triển ung thư vú, và trong những năm 1990, từ việc xác định hai gen nhạy cảm với ung thư vú, BRCA1 và BRCA2, đã dẫn đến những nghiên cứu về ung thư vú hiện nay thường tập trung vào hướng tìm kiếm các marker di truyền có thể nhạy cảm với ung thư vú Nghiên cứu mở rộng đã dẫn đến sự tích lũy thông tin về các biến đổi di truyền trong các gen khác nhau, bao

gồm gen CYP19A1, do sản phẩm gen của nó là enzyme aromatase có vai trò

quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp estrogen

Bảng 3 tóm tắt một số nghiên cứu đã được thực hiện về các SNP của

gen CYP19A1 từ nhiều quần thể khác nhau Một số SNP có liên quan đến nguy

cơ ung thư vú, trong khi một số khác thì không Một số ảnh hưởng đến sự biểu hiện lâm sàng của bệnh, tiên lượng bệnh, trong khi số khác lại điều chỉnh hiệu quả của quá trình điều trị và các biến chứng liên quan

Thực tế cho thấy, có một số nghiên cứu kết luận rằng không có mối

liên hệ nào giữa nguy cơ ung thư vú và các SNP phổ biến của gen CYP19A1, mặc dù sự biến đổi gen ở CYP19A1 tạo ra sự khác biệt trong mức estrogen Tuy

nhiên, theo một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Hoa Kỳ ở phụ nữ Caucasian, đã chỉ ra rằng sự khác biệt có ý nghĩa về sự biến đổi ở intron 4 của

gen CYP19A1 ở người giữa nhóm mắc bệnh và nhóm đối chứng (phụ nữ

Causian) và một alen có nguy cơ cao ở locus này Họ kết luận rằng gen

CYP19A1 liên quan đến tăng nguy cơ phát triển ung thư vú [12] Các nghiên

cứu khác của các nhà khoa học ở Trung Quốc cho thấy các đa hình trong gen

CYP19A1 có thể có tác động đến tiên lượng ung thư vú [16] Các đa hình do

thay thế đồng nghĩa (G/A tại Val80) trong exon 3 đã được mô tả trước đây có liên quan tới nguy cơ mắc ung thư vú [12] Santa–Maria và cs gần đây đã báo cáo rằng một vài SNP ảnh hưởng đến mức lipid huyết tương ở bệnh nhân điều trị với letrozole, ở đó rs4646, rs10046, rs700518, rs749292, rs2289106, rs3759811 và rs4775936 làm giảm mức triglyceride [57]

rs10046 Phụ nữ

Inuit Có liên hệ với ung thư vú [23] rs10046 Iran Liên hệ với ung thư vú [21] rs762551

rs4646

Trung quốc

Liên quan đến DFS (disease-free survival) trong giai đoạn sớm của ung thư vú

[62]

rs700518

rs11856927

Mỹ và Mexico

Liên quan tới làm tăng nguy cơ

26

SNP của gen

Tài liệu tham khảo

rs700519 Ấn Độ Có thể sử dụng như marker phân

tử để dự đoán ung thư vú [13]

Liên quan đến các biểu hiện lâm sàng: tuổi, cân nặng, sự mãn kinh, loại khối u, kích thước khối

u, giai đoạn ung thư…

[37]

rs4646 Mĩ Dấu hiệu để dự đoán phản ứng

với anastrozole ở bệnh nhân [28] rs10046

Đa hình gen CYP19 không ảnh

hưởng đến chức năng của enzyme aromatase ở bệnh nhân mắc ung thư vú (sau mãn kinh)

[40]

rs4646

rs7167936 Thụy Điển

Liên quan đến nguy cơ và dự

Arg264Cys Trung

Quốc Không có mối liên hệ nào [32]

27

SNP của gen

Tài liệu tham khảo

Arg264Cys Hàn Quốc Tăng nguy cơ mắc ung thư vú [38]

Arg264Cys Trung

Quốc Không có mối liên hệ [63] rs1008805 Mĩ Alen G liên quan tới ung thư vú [66]

rs2236722 Nhật Bản Tăng nguy cơ mắc ung thư vú ở

phụ nữ sau mãn kinh [24] rs1870049

Không có mối liên quan tới nguy

cơ mắc ung thư vú tuy nhiên kiểu gen TC và CC liên quan đến việc tăng nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ tiền mãn kinh (mang thai lần

1 và chỉ số khối cơ thể cao)

[29]

rs2236722 Úc Không có mối liên hệ với nguy

cơ mắc ung thư vú [35]

28

Với mong muốn tiếp tục tìm hiểu về mối liên hệ giữa các đa hình của

gen CYP19A1 với nguy cơ mắc ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam nói riêng và thế

giới nói chung để phần nào giúp chẩn đoán và đưa ra phác đồ điều trị, chúng tôi đã thực hiện đề tài nghiên cứu này, tập trung phân tích 2 vị trí đa hình đơn

nucleotide cụ thể trên gen CYP19A1 là SNP rs2236722 (Trp39Arg) và SNP

rs10046 (Hình 8)

Hình 8 Vị trí SNP rs2236722 và SNP rs10046 trên gen CYP19A1

Trên gen CYP19A1, vị trí SNP rs10046 thuộc vùng 3’UTR của gen CYP19A1, có sự thay đổi một nucleotide C thành T, đã được phân loại như một

biến thể lành tính, và gần đây được chứng minh là liên quan đến sự thiếu hụt enzyme aromatase [71] Vị trí SNP rs2236722 (Trp39Arg) tại nucleotide 115

thuộc exon thứ 2 của gen CYP19A1, là một SNP hiếm, chỉ xuất hiện ở một số

ít người SNP rs2236722 có sự thay đổi một nucleotide T thành C làm thay đổi bộ ba quy định axit amin Tryptophan (TGG) thành bộ ba quy định axit amin Arginine (CGG)

Bảng 4: Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ các mẫu nghiên cứu

- Đã từng được điều trị bằng liệu pháp hormone

- Đang trong thời kỳ mang thai hoặc cho con bú

- Có những rối loạn chức năng ở tim, phổi, gan, thận hoặc các cơ quan khác trước đó