Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản : Luận văn ThS. Hóa học: 60 44 29

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội – Năm 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV 3

1.2 Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 6

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV 7

1.3.1.Các phương pháp sắc ký 7 1.3.2.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) 8 1.4 Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao quản 9

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản 9

1.4.2 Thiết bị của phương pháp điện di mao quản 10

1.4.3 Các quá trình xảy ra trong mao quản 11

1.4.4 Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản 12

1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE) 12

1.4.6 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 13

1.4.7 Phân tích định lượng theo điện di mao quản 23

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Điều kiện nghiên cứu 24

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 26

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC,NVP và AZT 29

3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện chất 29

3.1.2 Mao quản và xử lý mao quản .31

3.1.3 Chọn phương pháp bơm mẫu 32

3.1.4 Độ điện di và độ điện di hiệu dụng 33

3.1.5 Lựa chọn cơ chế tách 34

3.1.6 Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di 36

3.1.7 Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm 39

3.1.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS 39

3.1.9 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm 41

3.1.10 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu 43

3.1.11 Khảo sát ảnh hưởng thế điện di 45

3.1.12 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản 46

3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ưu 47

3.1.14 Định tính 3TC, AZT và NVP trong điều kiện điện di thiết lập 47

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 50

3.2.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống 50

3.2.2 Tính đặc hiệu 50

3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 52

3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 56

3.2.5 Độ lặp lại của phương pháp 57

3.2.6 Độ đúng của phương pháp 58

3.2.7 Kết quả định lượng trong chế phẩm 61

3.3 Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 63

3.4 Hướng phát triển của đề tài 64

KẾT LUẬN 65

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC 19

3.2 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống 49 3.3 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tương ứng 52 3.4 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tương ứng 54 3.5 Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tương ứng 55 3.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 57

3.7 Kết quả xác định độ lặp lại của MEKC trong định lượng

3.14 Kết quả định lượng viên nén Lamivudine 150mg &

Zidovudine 300mg

62

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 11

1.3 Cấu trúc của Mixen và dòng EOF trong MEKC 15 1.4 Cấu trúc không gian của β- cyclodextrin 20 1.5 Cấu trúc không gian của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 21 1.6 Cấu trúc phân tử của phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 22

3.3 Điện di đồ ở pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17 37 3.4 Điện di đồ tại nồng độ SDS 25mM; 50mM và 75mM 40 3.5 Điện di đồ tại nồng độ đệm 5mM; 10mM và 20mM 42 3.6 Điện di đồ tại thời gian bơm mẫu 3s, 5s và 7s 44 3.7 Điện di đồ tại thế điện di 15kV; 20kV và 22 kV 46 3.8 Điện di đồ của 3TC, AZT và NVP tại điều kiện tối ƣu 48 3.9 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP tại

điều kiện tối ƣu

48

3.10 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi

thêm 3TC tại điều kiện tối ƣu

49

3.11 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi

thêm AZT tại điều kiện tối ƣu

49

3.12 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP sau khi

thêm NVP tại điều kiện tối ƣu

49

3.14 Điện di đồ của chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT và NVP 51

3.15 Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP 51 3.16 Điện di đồ của chế phẩm làm việc 3TC, AZT và NVP

3.21 Điện di đồ viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine

300mg

63

DANH MỤC VIẾT TẮT

HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human

Immunodeficiency Virus)

AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người

(Acquired immunodeficiency syndrome)

ARV Thuốc kháng virut

USP Dược điển Mỹ (United State Pharmacopiea)

CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)

CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography)

CGE Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis)

CZE Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)

DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector)

EOF Dòng điện thẩm (Electro- osmotic Flow)

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography)

MEKC Sắc ký điện động micell (Micellar Electrokinetic

chromatography)

S pic Diện tích pic

t m Thời gian di chuyển (Migration times)

SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

RSD % Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

STT Số thứ tự

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantity)

MỞ ĐẦU

Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV vẫn đang tiếp tục duy trì sự sống ngày càng được tăng cao là hệ quả của hai tác động chủ yếu Một là số người nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn ở mức cao Chỉ tính riêng năm 2008, thế giới vẫn có khoảng 2,7 triệu người mới nhiễm HIV Hai là do kết quả tích cực của liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số người tử vong, kéo dài sự sống cho người bệnh Đến tháng 12/2008 ước tính khoảng 4 triệu người nhiễm HIV ở các nước có thu nhập thấp và trung bình được điều trị bằng thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần trong vòng 5 năm Trong vòng 4 năm (2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số người chết do AIDS đã giảm 10% [12]

HIV/AIDS đang là vấn đề lớn hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Ở nước ta Thành Phố Hồ Chí Minh là nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS nhất (Sau đó là Hội An, An Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh, ) Chúng ta không chỉ ngăn chặn sự lây lan của bệnh mà còn điều trị hiệu quả để giảm nguy cơ tử vong kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống cho người HIV/AIDS Trong điều trị thì kháng Retrovirut đóng vai trò rất lớn Trước đây nước ta chưa đầy đủ các loại thuốc Retrovirut nên thường dùng đơn hóa hoặc phối hợp hai loại thuốc trong điều trị HIV/AIDS Giờ có thể kết hợp 3 hoặc 4 loại thuốc trong những trường hợp lâm sàng nặng hơn Hiện nay, nước ta đã sản xuất được thuốc chống HIV là Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg) Tuy nhiên phần lớn vẫn đang sử dụng thuốc kháng HIV theo chương trình quốc gia được cấp [12]

Để đảm bảo trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc quản lý chất lượng thuốc kháng HIV là rất cần thiết Vì vậy cần có phương pháp phân tích có độ tin cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lượng thuốc HIV Cho tới nay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hóa lý

đa số được sử dụng để định lượng các loại thuốc Ưu điểm của phương pháp này

là độ lặp lại, độ chính xác và khả năng tách tốt Đồng thời thiết bị HPLC hiện đã

được tích hợp với hầu hết các kỹ thuật hóa lý hiện có (phổ UV-VIS, phân tích điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện của phương pháp Tuy vậy, phương pháp HPLC đòi hỏi sử dụng dung môi

có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hưởng xấu, gây ô nhiễm môi trường Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn và phát triển phương pháp định lượng thuốc dựa trên kỹ thuật hóa lý khác thay thế cho HPLC mà chúng tôi thực hiện trong nghiên cứu này Kỹ thuật tách mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho nghiên cứu này là điện di mao quản (CE) [15]

CE là phương pháp mới được phát triển, tuy nhiên có nhiều ưu điểm vượt trội là hiệu lực tách rất cao, kinh tế và đặc biệt là thời gian phân tích nhanh có thể đáp ứng không những cho phân tích trong phòng thí nghiệm mà còn phục vụ cho phân tích lâm sàng và trong sản xuất Vì thế đây là kỹ thuật rất hữu hiệu để thay thế hay hỗ trợ HPLC trong nhiều lĩnh vực phân tích, trong đó có nghiên cứu

về Dược

Hơn nữa, chuyên luận chung về CE đã được quy định trong Dược điển một

số nước như Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên ở Việt Nam, CE chưa được ứng dụng nhiều và kinh nghiệm ứng dụng trong phân tích dược phẩm còn hạn chế Do vậy chúng tôi nhận định hướng nghiên cứu của mình sẽ rất có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lượng thuốc ở nước ta

Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng của phương pháp điện di mao quản vào định lượng thuốc kháng HIV với đề tài:

“Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản”

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV

Nhóm 1: thuốc ức chế men sao chép ngược có gốc nucleosides (nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NRTIs): Zidovudine (AZT, ZDV), Didanosine (DDI), Zalcitabine (DDC), Stavudine (D4T), Lamivudine (3TC), Abacavir (ABC), Tenofovir disoproxil fumarate

Nhóm 2: thuốc ức chế men sao chép ngược không có gốc nucleosides nucleoside reverse transcriptase inhibitors = NNRTIs): Nevirapine, Delavirdine, Effavirenz

(non-Nhóm 3: là thuốc ức chế proteases (protease inhibitors = PIs): Indinavir, Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir

Qua nghiên cứu, người ta thấy không nên đơn hóa trị liệu mà nên phối hợp các thuốc nhóm 1 với nhau và với một thuốc nhóm 2 hoặc với một thuốc nhóm 3 để đạt được hiệu quả điều trị cao

Phác đồ phối hợp Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong điều trị

Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleosid có tác dụng kháng retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzym phiên mã ngược của virus Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để điều trị HIV Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết hợp Nevirapine trong 6 tháng cho kết quả khá khả quan Các chỉ số đánh giá tình trạng bệnh nhân được cải thiện rõ rệt và có ý nghĩa thống kê Người bệnh tăng cân, có số lượng tế bào lymphocyte tăng rõ rệt (từ 1273/mm3 lên 1547/mm3), số lượng tế bào CD4 từ 70/mm3 lên 145/mm3 làm cho số lượng tế bào CD4 bị phá hủy giảm đi Như vậy, phác đồ D4T/3TC/NVP có thể khống chế sự phát triển của virus Liệu pháp kháng retrovirus làm tăng thời gian sống sót của người bệnh có số lượng tế bào CD4 dưới 500 trong 1mm3 Liệu pháp này cũng có thể dùng cho những người bệnh có mật độ virus HIV trên 30000/ml huyết tương, không phụ thuộc vào số lượng tế bào CD4, vì mật độ HIV là một yếu

tố tiên lượng sự tiến triển của bệnh [12]

Liều dùng dựa trên thể trọng và tuổi của người bệnh, bệnh lý mắc kèm 150mg 3TC, 30mg d4T ngày hai lần và NVP 200mg ngày một lần trong hai tuần đầu sau đó NVR 200mg ngày hai lần cho người cân nặng dưới 60kg với người lớn

và thiếu niên trên 16 tuổi kể cả phụ nữ có thai, trẻ em, bệnh nhân lao và bệnh nhân đồng nhiễm viêm gan B

* Lamivudin:

(3TC)

Công thức phân tử: C8H11N3O3S Phân tử lượng 229,3

Tên khoa học: 4-amino-1[2-(hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5- yl]-2(1H) pyrimidinon

Lamivudin hấp thụ UV ở bước sóng hấp thụ cực đại là 278nm; A1%1cm trong H+ 1M

oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-Tính chất : Tinh thể trắng hoặc hơi nâu

Nhiệt độ nóng chảy: ~ 1240C Khó tan trong nước, ít tan trong cồn

Năng suất quay cực + 60,50 → + 63,00 ( C = 1% trong EtOH) ; + 990 (C = 0,5% trong nước)

Hằng số pKa= 9,36

Sau khi uống Zidovudin khoảng 0,5- 1giờ, sinh khả dụng 60-70%, bị ảnh hưởng khi ăn nhiều chất béo Đạt Tmax khoảng 1h sau khi dùng thuốc Nồng độ đỉnh sau khi uống 250mg là khoảng 1,2 μg/ml

*Nevirapin

(NVP)

Công thức phân tử C15H14N4O Phân tử lượng 266.888 g/mol

Tên khoa học:

1.2 Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay

Tính đến 31/5/2012, trên toàn quốc có 66.191 người nhiễm HIV trong đó có

62.654 người lớn và 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012 Kết quả báo cáo

tại 10 tỉnh có số người được điều trị cao nhất là 46.332 bệnh nhân, chiếm 70% số người nhiễm HIV đang được điều trị trên toàn quốc Thành phố Hồ Chí Minh tiếp tục là thành phố dẫn đầu cả nước về số lượng người nhiễm HIV đang điều trị Tính đến 31/5/2012, thành phố Hồ Chí Minh có 20.435 người nhiễm HIV đang

điều trị, chiếm 30,9% số lượng bệnh nhân đang điều trị trên toàn quốc[10]

Tốc độ tăng trưởng bệnh nhân điều trị ARV trung bình là 950 bệnh nhân/tháng Phác đồ bậc 1 chiếm đa số với tỷ lệ là 96,76%, phác đồ bậc 2 là 2,97% và có 0,27% thuộc phác đồ khác

- Thực hiện chỉ đạo của Lãnh đạo Bộ Y tế tại Quyết định số 4139/QĐ-BYT ngày 26/11/2011 về việc sửa đổi, bổ sung một số nội dung “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị HIV/AIDS” được ban hành kèm theo Quyết định số 3003/QĐ-BYT ngày 19/8/2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế, Cục Phòng, chống HIV/AIDS đã ban hành các văn bản hướng dẫn về việc điều trị bằng thuốc ARV tại các địa phương với các nội dung chính như sau:

- Bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV: Phác đồ chỉ định là TDF/3TC/EFV hoặc TDF/3TC/NVP Không sử dụng phác đồ có Stavudin (d4T) cho các bệnh nhân bắt đầu điều trị ARV

- Đối với bệnh nhân đang điều trị ARV với phác đồ có Stavudin (d4T): thay thế dần tiến đến loại trừ việc sử dụng thuốc d4T vào tháng 6/2013 Thuốc d4T chủ yếu được chuyển đổi sang phác đồ có TDF hoặc AZT

Hiện nay Cục Phòng, chống HIV/AIDS đang điều phối toàn bộ các nguồn thuốc ARV do các chương trình, dự án hỗ trợ để cung cấp thuốc ARV điều trị cho bệnh nhân trên toàn quốc Phối hợp chặt chẽ với các đối tác trong việc nhập khẩu các dạng bào chế mới của thuốc ARV nhằm tăng cường sự tuân thủ điều trị

ở người bệnh đặc biệt việc mua thuốc viên kết hợp 3 loại thuốc TDF/3TC/EFV ngày uống 1 lần.[10]

Kể từ ca nhiễm HIV được phát hiện đầu tiên tại Mỹ từ năm 1981, cho đến nay loài người đã trải qua 30 năm đối phó với một đại dịch quy mô lớn, phức tạp, tính đến cuối năm 2009, có 33,3 triệu người đang bị nhiễm HIV, tỷ lệ người nhiễm HIV trong nhóm tuổi 15-49 là 0,8% Riêng năm 2009 ước tính có 2,6 triệu người nhiễm mới HIV và 1,8 triệu người tử vong do AIDS So sánh với năm 1999, số người nhiễm mới HIV đã giảm 21% Báo cáo UNAIDS cũng ghi nhận tính cuối năm 2009

đã có 33 nước có số ca nhiễm mới giảm, trong đó 22 nước khu vực cận Saharan, Châu Phi Tuy nhiên hiện vẫn còn 7 nước tỷ lệ nhiễm mới tăng trên 25% khi so sánh giữa năm 1999 và 2009[11]

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV

độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC Đối với

phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với pha động là 20mM đệm Natri photphats (8mM muối Natrioctanesulphonic acid) : axetolnitril (04:01,v/v), pH= 3,5 điều chỉnh bằng acid photphoric Pha tĩnh là Cột C18-ODS Hypersil (5µm x 250mm x 4,6mm) Thời gian lưu của mỗi chất là Stavudine là 2,85 phút, Lamivudine là 4,33 phút và Nevirapine là 8,39 phút.[26]

Xác định bằng Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với dung môi pha động là chloroform: methanol(9:1,v/v), pha tĩnh là bản mỏng Silicagen 60F254 và định lượng các chất ở bước song hấp thụ 265nm Hệ số lưu giữ của Stavudine, Lamivudine và Nevirapine lần lượt là 0.21-0.27, 0.62-0.72 và 0.82-0.93.[26]

Xác định thuốc HIV trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với metaxalone là chất chuẩn nội với giai đoạn đầu tiên là Chiết pha rắn, sau đó sử dụng cột C18 (5µm x 150mm x 3.9mm) pha động là 0.5% acetic băng trong nước : axetolnitril (20:80,v/v) Các ion được tách ra và theo dõi trên máy phổ khối tứ cực.[21]

1.3.2 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định thuốc HIV trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

Xác định Lamivudin (3TC), Stavudine( d4T) và Nevirapin (NVP) bằng phương pháp MEKC Tác giả đã sử dụng Cột mao quản silica trần dài 73,5 cm (chiều dài hiệu dụng 62cm), đường kính trong là 75µm Dung dịch điện li nền bao gồm 10mM sodium tetraborat (pH= 9,8), 100mM sodiumdodecylsunphat (SDS) và 15%(v/v) 2-propanol Áp thế 20kV.Bơm mẫu bằng áp suất 50mbar trong 9s Tất cả các chất được tách ra trong vòng 14 phút Khoảng tuyến tính 20-200 µg/ml (r2

= 0,9996) cho 3TC; 5-50 µg/ml (r2= 0,9985) cho d4T và 25-250 µg/ml (r2= 0,9987) cho NVP[24] Nhóm nghiên cứu đã tách được lamivudin và tạp đồng phân hoàn toàn (độ phân giải 1,95) với điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường

kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 250C, điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm… Về định lượng lamivudin trong chế phẩm, với dung dịch đệm natri tetraborat (pH khoảng 9,2) và sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt là SDS (sodium dodecyl sulfat) có thể phân tích đồng thời lamivudin và chất phối hợp zidovudin…; điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 250C, điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm, dung dịch đệm natri tetraborat 50 Mm chứa 50 mM SDS [9]

Micellar điện động sắc ký (MEKC) phương pháp để tách và định lượng đồng thời lamivudine và zidovudine trong dược phẩm đã được phát triển Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tách, chẳng hạn như pH, nồng độ chất hoạt động bề mặt (sodium dodecyl sulfate, SDS), dung môi hữu cơ và điện áp áp dụng đã được tối ưu hóa Dung dịch điện ly nền bao gồm 12,5 decahydrate tetraborat mM sodium và 15

mM axit boric điều chỉnh pH 10,8, có chứa 90 mM SDS 5% (v / v) acetonitrile (ACN) đã được khảo sát là phù hợp cho việc tách các loại thuốc p-aminobenzoic acid (PABA) đã được sử dụng như là chất chuẩn nội (IS) Phát hiện chất phân tích

và IS được thực hiện ở bước sóng 210 nm Điện di đồ đã được quan sát thấy rằng cả hai loại thuốc và IS đã được di chuyển trong vòng 20 phút ở điện áp 10 kV Đánh giá của phương pháp này đã được thực hiện về tính chính xác, độ tuyến tính, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) Khoảng tuyến tính từ 10-80

mg / ml cho Lamivudine và 10-100 mg / ml cho Zidovudine Các giới hạn phát hiện cho Lamivudine và Zidovudine được tìm thấy là 2,5 và 2,0 mg / ml, tương ứng Phương pháp đã được áp dụng để xác định đồng thời Lamivudine và Zidovudine trong huyết tương Độ thu hồi của cả hai thuốc ở dạng bào chế viên thuốc và trong huyết tương ≥ 99,72% (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 1,84%) và

≥80,4% (RSD ≤ 5,4%), tương ứng.[25]

1.4 Giơ ́ i thiê ̣u chung về phương pháp Điê ̣n di mao quản

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản

Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển -

Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đường kính 25 - 100 m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm

pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu

và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao

Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao

quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dưới tác dụng của lực điện trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trưng) của dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thước của chúng (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm thấu, hay dòng điện thẩm)

1.4.2 Thiết bị của phương pháp điện di mao quản

Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy phải có các bộ phận chính như sau:

1 Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt)

2 Cột tách (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản),

3 Nguồn cấp thế cao một chiều (15-40 kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển quá trình điện di của các chất

4 Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách)

5 Bộ phâ ̣n phát hiê ̣n các chất sau khi tách (detector)

6 Bộ phận điều nhiệt cho mao quản

7 Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu

Các bộ phận này có thể xem trong sơ đồ nguyên lý mô tả ở hình 2.1

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

1.4.3 Các quá trình xảy ra trong mao quản

Trong quá trình điện di, dưới tác dụng của lực điện trường E, do điện thế V

đặt vào hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là:

1 Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản

2 Trong mao quản có dòng điện i (5 – 200 A)

3 Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu EOF

4 Sự tương tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản

5 Sự khuếch tán, hay hội tụ của vùng mẫu các chất, khi di chuyển

6 Sự phân bố của các chất giữa 2 pha (động và tĩnh), khi mao quản có pha tĩnh thật hay pha tĩnh giả (Mixen, trong hệ MEKC)

7 Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên

8 Sự phân tán, gradient và truyền nhiệt từ tâm mao quản ra xung quanh

9 Sự di chuyển (sự điện di) của các chất (như các ion âm, ion dương, và phần tử trung tính) trong mao quản Đây là quá trình chính tạo ra sự sắc ký của các chất Nhưng các quá trình trên (1-8) lại có tương tác và ảnh hưởng đến quá trình 9, nó có thể làm tốt và cũng có thể làm xấu quá trình điện di chuyển này của chất

Đó là các quá trình luôn xẩy ra trong mao quản của HPCEC Trong 9 quá trình xẩy ra đó, chỉ có quá trình 9 là dẫn đến sự tách của các chất, nhưng các quá trình khác (1-8) lại ảnh hưởng đến quá trình 9, hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp Vì thế,

muốn có kết quả điện di tốt, nhất thiết chúng ta phải luôn xem xét tất cả các quá trình đó và các yếu tố liên quan đến các quá trình đó trong mao quản Tức là phải tối ứu hoá các điều kiện điện di cho một loại đối tượng mẫu và các chất cần xác định, để có được hiệu quả tách cao

1.4.4 Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản

Sắc ký điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh

và phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xẩy ra trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu (Mode) khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân

biệt và sử dụng chúng cho thích hợp Cụ thể các kiểu đó là:

1 Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE)

2 Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary Electro-Kenetic:MEK hay MCEK)

3 Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis: Gel-CE),

4 Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF)

5 Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP)

1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE)

Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophiresis- CZE) là phương pháp

phân tích cơ bản nhất của kỹ thuật CE vì đơn giản, linh hoạt và dễ thao tác Phương pháp này có phạm vi ứng dụng rộng trong việc tách và phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, bao gồm các amino acid, peptid, các hợp chất cấu tạo ion, các hợp chất đồng phân không gian và nhiều loại hợp chất có khả năng ionic hóa [8]

Đây là phương pháp tách dựa trên sự di chuyển của chất tan có điện tích trong điện trường với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào độ linh động điện di của chúng Độ linh động điện di là đại lượng phụ thuộc vào điện tích ion, chính xác hơn là tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng của ion, bán kính của ion, trạng thái của ion như mức

độ ion hóa, trạng thái liên kết với các đối ion Do đó độ linh động điện di phụ thuộc vào hằng số điện môi, pH, độ nhớt của dung dịch Khi ta đặt một điện áp cao vào

hai đầu mao quản, các tiểu phân tích điện sẽ bắt đầu di chuyển, tất nhiên là về phía điện cực trái dấu Các ion có độ linh động cao hơn sẽ di chuyển nhanh hơn, hình thành các vùng mà ở từng vùng, các ion tại đó có độ linh động điện di tương tự nhau Mặt khác khi đặt một điện áp cao vào hai đầu của mao quản, ở một vùng pH

đủ lớn, sẽ hình thành một dòng điện thẩm

Hình 1.2 : Quá trình tách các chất trong CZE

Trong mao quản silica dòng này hướng về phía cực âm (catod) Do các ion dương có cùng hướng với dòng này cho nên tốc độ được tăng thêm, các ion âm do không cùng hướng với dòng điện di thẩm thấu cho nên di chuyển chậm lại và nếu không vượt được nó thì cũng bị cuốn đi về phía cực âm Các phân tử không tích điện sẽ di chuyển cùng tốc độ với dòng điện thẩm

CZE là mô hình phân tích đơn giản nhất của CE Hệ thống phân tích CZE cũng chính là cơ sở xuất phát cho các kỹ thuật CE khác Từ xuất phát điểm là một mao quản với một dung dịch điện ly nền nhất định, người sử dụng chỉ cần thêm vào một hay nhiều chất phụ gia thích hợp là có thể chuyển sang các kỹ thuật điện di khác Tùy thuộc vào chất phụ thêm vào thì sẽ có nhiều kỹ thuật khác nhau

1.4.6 Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) [8,15]

Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis)

và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh Nó là một trong các kiểu tách sắc ký (separation

mode) của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dược Nó là một kiểu kỹ thuật điện di mao quản có sức mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho việc tách cả các chất phân tử trung hoà và các chất mang điện tích (hợp chất liên kết ion) Vì thế nó bổ sung và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di

Nguyên lý tách của phương pháp giống như sắc ký nhưng phương pháp MEKC sử dụng hiện tượng điện động học để thực hiện quá trình phân bố chất phân tích MEKC sử dụng điện áp cao tạo ra dòng EOF mang chất phân tích di chuyển dọc mao quản và phân bố vào các mixen Sự khác nhau về linh độ điện di của các chất phân bố trong và ngoài mixen và linh độ của dòng điện thẩm là bản chất của quá

trình tách Sự tách của các phân tử chất tan trung hoà bằng kỹ thuật MEKC được

điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch điện di Khi chất hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ ngưỡng của Mixen (giới hạn hình thành Mixen, CMC: Critial Micellary Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), có CMC=9 mM, thì một tổ hợp của các phần tử tiểu phân của chất hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành (hay tạo ra) trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân SDS Nó chính là các Mixen (pha tĩnh giả) Các Mixen này là các tiểu phân có đầu kị nước của chất hoạt động bề mặt, định hướng vào trung tâm của Mixen và để cho đầu ưa nước của nó ra ngoài và sẽ tương tác với ion chất đệm, hay ion chất tan Nghĩa là đầu mang điện tích của chất hoạt động bề mặt sẽ hướng ra chất đệm Cấu trúc tiêu biểu của Mixen được mô tả trong hình 2.3 Các Mixen ở đây hoạt động như một pha tĩnh Các phân tử của chất mẫu (chất phân tích) được phân bố vào trong cả Mixen và cả ở ngoài Mixen (trong pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố Ki xác định, trong những điều kiện nhất định đã được chọn để chạy điện di và mỗi chất tan Xi sẽ có một hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đó Nếu các Ki của các chất tan là khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt

Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có điện tích Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF, là tuỳ thuộc vào điện tích của chất

hoạt động bề mặt và cấu trúc của Mixen Các chất hoạt động bề mặt Aniônic, ví dụ như SDS, sẽ di chuyển về Anốt (cực dương), nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF Trong dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di chuyển nhanh hơn tốc độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen

là theo hướng của dòng EOF Trong khi di chuyển như thế, các Mixen có thể tương tác với các phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình điện di

Hình 1.3 Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC

: dòng EOF O: Chất hoạt động bề mặt ': Chất tan (chất PT). : Dòng điện di của chất

Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào trong Mixen và ở ngoài Mixen theo một cân bằng động học có hằng số phân bố Kinhất định trong điều kiện đã chọn Chính sự phân bố theo kiểu cân bằng động học này gây ra sự lưu giữ khác nhau của các chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký các chất phân tích theo kiểu Mixen Vì thế các Mixen trong ống mao quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh giả Nhiều chất tan tương tác với Mixen khá bền, nó tồn tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi các Mixen mang nó (các

chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng EOF

Khi mà các chất tan lại không tương tác với các Mixen, thì nó được dòng EOF mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất mạnh với các Mixen, và nó bị lưu lại khá lâu trong mao quản, nên làm tăng thời gian lưu giữ của chất tan

Cơ chế của sự tách các phần tử trung tính trong MEKC về cơ bản vẫn là kiểu tương tác phân bố của chất tan, tương tự như trong sắc ký cột lỏng-rắn (LC) hấp phụ, nhưng lại được điều khiển bới lực điện trường E của thế cao V giữa hai đầu mao quản tạo ra, mà không phải bằng áp suất đẩy pha động như trong HPLC Trong

kỹ thuật phân tích MEKC, các tính toán về hệ số dung tích ki‟, số đĩa N của cột mao quản, độ phân giải R, cũng dựa trên cơ sở tương tự với các tính toán của hệ sắc kí cột LC, và tất nhiên có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn cho hệ pha MEKC Chính tỷ số giữa tổng số mol của chất tan (total moles of solute)

ở trong Mixen và tổng số mol của chất tan ở trong pha động (dung dịch đệm điện di), cũng được xem như là dung lượng của cột mao quản, và nó được biểu diễn theo công thức sau

k i ‟ = ( t i – t 0 )/[t 0 (1- t i /t mc )] = K i (V MC /V MP ) (1)

Trong đó:

ti : Thời gian lưu của chất tan

t0 : Thời gian không lưu giữ của chất

tMC : Thời gian không lưu giữ của Mixen

Ki : Hệ số phân bố nhiệt động của chất tan giữa hai pha (VMC và VMP)

Với VMC : Thể tích của pha Mixen , và VMP : Thể tích của pha động

Và tỷ số q = (V MC /V MP ) cũng được gọi là tỷ số pha của hệ MEKC Đồng thời từ

biểu thức (1) chúng ta cũng rút ra được thời gian lưu của chất tan t R như sau

t i = [ t 0 t MC ( 1+ k i ‟) ] / [ t MC + t 0 k i ‟ ) ] (2)

Nếu như mà ( tMC << t0.k‟ ) thì chúng ta lại có:

t i = [ t MC ( 1 + k i ‟) ] / k i ‟ ] (3)

Nghĩa là thời gian lưu t R có quan hệ chặt chẽ với hệ số dung tích ki‟ Khi hệ số ki‟

lớn, thì thời gian lưu t i cũng lớn Mặt khác, trong MEKC, tỷ số pha q là phụ thuộc

vào nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này được biểu diễn bởi công thức sau đây

q = [V.( C SP - C MC )] / [ 1 – v mc (C SP – C MC )] (4)

Trong đó:

V : Điện thế sử dụng để tạo ra điện trường E của sự điện di

CSP : Nồng độ của Mixen (mol/l.)

CMC : Nồng độ giới hạn chuẩn của Mixen (mol/l.)

Vmc : Tốc độ trung bình của Mixen

Ki : Hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen

Và khi nồng độ Mixen không lớn, thì hệ số dung tích ki‟, và tốc độ của dòng EOF, được tính như sau

k i ‟ = K i v mc ( C SP - C MC ) (5)

vEOF = ( e + MC ).E (6)

Cùng với các tham số t R , k i ‟ , R ij đã nói ở trên, hệ số phân bố nhiệt động

Ki của chất tan trong hệ MEKC, cũng là một đại lượng quan trọng có liên quan đến các quá trình xẩy ra trong mao quản và được xác định theo biểu thức sau

lnK i = (H 0 /R.T) + ( S 0 /R ) (7)

Trong đó: H0, S0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan R là hằng

số khí, và T là nhiệt độ (0K) của cột mao quản Biểu thức này cho chúng ta thấy hằng số phân bố Ki luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ Nó cũng là một hằng số nhiệt động

Nhìn chung, chúng ta thấy khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố Ki đều giảm dần ở tất cả các chất Với các chất khác nhau, thì hệ số Ki này cũng thay đổi rất khác nhau Đó chính cũng là yếu tố thuận lợi cho sự tách trong kỹ thuật điện di Đồng thời với các chất hoạt động bề mặt khác nhau thì cũng gây ảnh hưởng đến hệ

số Ki khác nhau

Ngoài các đại lượng trên, độ phân giải R cũng là một thông số quan trọng của kỹ thuật MEKC Độ phân giải Rij của hai chất , ví dụ như I và J trong hệ MEKC cũng được biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản

ti : Thời gian lưu của chất tan

t0 : Thời gian không lưu giữ của chất

tmc: Thời gian không lưu giữ của Mixen

Công thức (8) và (9) này cho chúng ta thấy rằng, độ phân giải Rij có thể được tăng cao khi tối ưu hoá được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để có

độ chọn lọc  và hệ số dung tích ki‟ của các chất tan là phù hợp nhất Để có được hệ

số dung tích ki‟ tốt, trong MEKC, có thể đạt được bằng cách thay đổi pH, thay đổi nồng độ của chất hoạt động bề mặt, thêm dung môi hữu cơ vào pha động (dung dịch đệm điện di) Nói chung, hệ số dung tích ki‟ của chất tan là tăng tuyến tính cùng với

sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng nhất định Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt nhiều, thì một vấn đề xuất hiện ở đây là khi dùng các chất hoạt động bề mặt loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt Công suất điện trong vùng từ 5 - 7 W/m mao quản trong môi trường lực ion trung bình, thì cũng đã làm nhiệt độ mao quản đã tăng rõ rệt (có thể đến 10oC) Lúc này hiệu suất sắc ký bị giảm Mặt khác với các ống mao quản có đường kính nhỏ (từ 25 - 100 m), việc sử dụng từ trường điện thế V càng cao, thì đương nhiên sẽ càng làm nóng mao quản nhiều Vì thế nên tránh dùng thế quá cao và cột mao quản đường kính (ID) lớn hơn

100 m và cần phải điều nhiệt mao quản

Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản Hướng di

chuyển của chất tan và của các Mixen, là cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng EOF Nói chung, các hệ đệm điện di có pH tương đối cao, thường được sử dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di chuyển ổn định của các Mixen

Bảng 1.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC

Chất hoạt động bề mặt

Nồng độ ngưỡng của mixen (mM) Anionic

Cationic

Hình 1.4: Cấu trúc không gian của β-cyclodextrin

Nhóm hợp chất hiện được biết tới dưới tên các Cyclodextrin (CD) hay còn gọi

là “cellulosine” được miêu tả lần đầu tiên bởi A.Villiers năm 1891 Sau đó một thời gian, F Schardinger phát hiện ra 3 CD tự nhiên là α-, β-và γ- Những hợp chất này thời gian đó gọi là “đường Schardinger” Trong suốt 25 năm, từ giữa năm

1911 và 1935, Pringsheim ở Đức đã nghiên cứu giải thích cho việc cyclodextrins

là hợp chất vững bền không bị phân hủy bởi nước hay các hợp chất hóa học khác Năm 1954, Carmer đã miêu tả cấu trúc và các tính chất hóa lý của α-, β- và γ- CD như: cấu trúc hóa học, kích thước lỗ trống, độ hòa tan, khả năng tạo phức, ảnh hưởng tới độ bền vững hóa học của dược chất ít tan Từ đó đến nay, qua hơn 100 năm phát triển, CD đã được nghiên cứu nhiều và đưa vào sử dụng trong nhiều lĩnh vực Hiện nay, CD vẫn tiếp tục được nghiên cứu với nhiều khả năng tiềm ẩn Các Cyclodextrin (còn được gọi là cycloamyloses) là các hợp chất có cấu trúc vòng được tạo thành từ nhiều phân tử đường liên kết với nhau (vòng oligosaccaride)

Các Cyclodextrin được tạo ra từ 5 phân tử α- D- glucopyranoside trở lên liên kết 1-4, giống như amylase (một phần của tinh bột) Đặc biệt, cyclodextrin lớn nhất có chứa 32 phân tử 1,4 anhydroglucopyranoside Điển hình cyclodextrin

có chứa một số lượng đơn phân tử glucose liên kết với nhau thành vòng chứa từ 6 đến 8 phân tử trong một vòng, có cấu trúc không gian hình nón cụt với liên kết hydro 3-OH ở bên trong và 2-OH ở bên ngoài, có 3 loại:

- α- CD : 6 đường trong một phân tử vòng (18 nhóm hydroxyl)

- β - CD: 7 đường trong một phân tử vòng (21 nhóm hydroxyl)

- γ – CD: 8 đường trong một phân tử vòng (24 nhóm hydroxyl)

Hình 1.5: Cấu trúc không gian của phân tử α- CD, β- CD, λ-CD

Các 6-OH nhóm hydroxyl linh hoạt cũng có khả năng hình thành các liên kết hydro xung quanh mép dưới cùng nhưng không ổn định do ảnh hưởng lưỡng cực, dễ dàng phân ly trong dung dịch nước và không thường thấy trong các tinh thể cyclodextrin Các liên kết hydro 3-OH (nhóm cho electron) và 2- OH (nhóm nhận electron) trong α- CD, ngược lại điều này 3-OH (nhóm nhận electron) và 2-OH (nhóm cho electron) trong β-và γ- CD

Hình 1.6: Cấu trúc phân tử của α-, β-, λ- CD

Phân tử Cyclodextrin gồm hai phần: các nhóm hydroxyl hướng ra ngoài tạo thành bề mặt thân nước còn khoang trung tâm chứa khung cacbon, với các cầu nối hydro và oxy tạo thành vùng kỵ nước Do sự sắp xếp này nên các phân tử dược chất sẽ liên kết một phần hoặc toàn bộ với khoảng không gian trung tâm của CD khi các khoang kỵ nước của CD bao trọn lấy phân tử hoạt chất hoặc phần thân dầu của các phân tử lớn Quá trình này gắn với sự giải phóng các phân tử nước từ khoảng không gian trung tâm đó Khi thay thế phân tử nước này bằng những phân tử khác thích hợp thì phức hợp tạo thành sẽ

có năng lượng hòa tan thấp hơn nên dễ hòa tan hơn Phức hợp này bền nhờ lực Van der Waals yếu, cầu nối hydro và tương tác giữa các phần thân dầu

Sự hình thành các phức hợp làm thay đổi đặc tính vật lý và hóa học của các phân tử liên kết, chủ yếu là về độ hòa tan với nước Đây là lý do tại sao các cyclodextrin đã thu hút sự quan tâm nhiều trong lĩnh vực, đặc biệt trong ứng dụng dược phẩm: bởi vì các cyclodextrin có phân tử kỵ nước có thể thấm qua các màng sinh học của cơ thể, chúng có thể được sử dụng để giải phóng hợp chất hiệu quả

CD có cấu trúc vòng đặc biệt, hình thể dạng nón cụt, nhóm hydroxyl thứ nhất định vị ở đáy nhỏ còn nhóm hydroxyl thứ hai định vị ở đáy lớn, các nhóm hydroxyl này là đích cho việc tổng hợp ra các dẫn chất khác nhau của CD như:

carboxylmethyl- β- CD, hydroxypropyl- β (-γ)- CD, methyl- β- CD…

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng CD và dẫn chất trong ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược phẩm và các ngành công nghiệp khác như: làm giảm mùi vị không mong muốn, giải phóng mùi hương khi là quần áo hoặc dưới thân nhiệt… Đặc biệt trong ngành dược CD được dùng như một tá dược làm tăng độ tan, tốc độ tan và độ ổn định của dược chất ít tan, làm tăng sinh khả dụng của thuốc, ngăn cản tương tác thuốc- thuốc và thuốc- tá dược… Hiện nay, CD còn được ứng dụng rất nhiều trong kiểm nghiệm để định tính, định lượng các đồng phân quang học của một số dược chất trong các kỹ thuật sắc ký

và điện di Việc sử dụng các CD và các dẫn xuất CD vào CE liên tục được nghiên cứu

1.4.7 Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản

Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất Còn chiều cao

H của pic sắc ký hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ C x của

chất Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta luôn có biểu

thức xác định mối quan hệ đó là:

H i = k 1 C i (12)

và S i = k 2 C i (13)

Trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i

Ci là nồng độ của chất ứng với thời gian lưu t Ri

k1, k2 là hằng số điều kiện thực nghiệm

Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật CE, chúng ta dựa theo phương trình cơ bản trên và có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là

phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm tiêu chuẩn để xác định nồng độ

chất phân tích trong mẫu

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 ĐIỀU KIỆN NGHIÊN CỨU

2.1.1.1 Các chất chuẩn đối chiếu

- Chuẩn quốc gia Lamivudine (200mg/ lọ) hàm lượng 99,45 % C8H11N3O3S

tính theo nguyên trạng, SKS 031214603, bảo quản nhiệt độ 50C, tránh ánh sáng - Viện kiểm nghiệm – Bộ Y Tế

- Chuẩn quốc gia Zidovudin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,64 % C10H13N5O4 (HPLC) tính theo nguyên trạng, SKS 0105143, bảo quản nhiệt độ 50C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế

- Chuẩn quốc gia Nevirapin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,49 % C15H14N4O tính theo nguyên trạng, SKS WS 0109263, bảo quản nhiệt độ 20C – 80C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế

2.1.1.3 Thiết bị và dụng cụ

- Máy điện di mao quản Aligent CE system 9001 được điều khiển bằng phần mềm Chemstation 100001 (sản xuất tại hãng Hewlett Packard, Đức) của bộ môn Hóa phân tích- Độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội

- Máy lọc nước tinh khiết Sartorius arium 611: model SARTORIUS AG GOTYINGEN, áp suất tối đa 100psi/ 6,9bar

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H ( sản xuất tại hãng Elma, Đức)

- Máy đo pH EUTECH Instrument

- Cân phân tích Sartorius TE214S

- Giấy lọc đường kính lỗ lọc 11cm- Trung Quốc

- Màng lọc PTFE với kích thước lỗ lọc 0,2 µm

- Bộ lọc hút chân không màng lọc cenlulose với kích thước lỗ lọc 0,45 µm

- Các dụng cụ chính xác: bình định mức, pipet chính xác với các thể tích khác nhau

- Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, ống nghiệm, đũa thủy tinh, chày và cối

2.1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.2.1 Chế phẩm làm việc

- Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg, Nevirapine 200mg & Zidovudine 300mg

do công ty Ranbaxy laboratories Limited Ấn Độ sản xuất Ngày sản xuất 9/2011 Hạn sử dụng 9/ 2013

- Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg do công ty Matrix Laboratories Limited Ấn Độ sản xuất Ngày sản xuất 9/2011 Hạn sử dụng 10/2013

2.1.2.2 Chuẩn bị mẫu

* Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử:

- Dung dịch gốc chuẩn: cân chính xác khoảng 30,9 mg Lamivudin, 39,7 mg Nevirapin và 59,6 mg Zidovudin vào cốc có mỏ Thêm vào 10,0 ml MeOH hòa tan, sau đó thêm nước cất deion hòa tan Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, siêu âm cho tan hoàn toàn, thêm nước deion đến thể tích vừa đủ và lắc đều

- Dung dịch chuẩn: hút chính xác 5,0ml dung dịch gốc chuẩn pha vào bình định mức 10ml, thêm nước deion vừa đủ thể tích và lắc đều Lọc qua màng lọc 0,2µm

- Dung dịch mẫu thử: Cân 20 viên thuốc viên, xác định khối lượng trung bình một viên và nghiền thành bột mịn Cân một lượng bột viên tương ứng với 15,00 mg Lamivudin, 20,00 mg Nevirapin và 30,00 mg Zidovudin cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm 70 ml nước deion siêu âm cho tan hết, thêm nước deion đến vừa đủ thể tích, lắc đều Lọc qua giấy lọc đường kính lỗ lọc 11cm Bỏ 20 ml dịch lọc đầu Dịch lọc được tiếp tục lọc qua bộ lọc hút chân không màng lọc 0,45µm Tiếp tục bỏ

20ml dịch lọc đầu Dịch lọc được lọc qua màng lọc 0,2µm trước khi tiêm vào lọ

đựng mẫu

-Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị như mẫu chuẩn nhưng không có chất phân tích

*Chuẩn bị dung dịch điện ly nền:

- Dung dịch điện ly nền Na2B4O7 10mM: Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na2B4O7 vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm và hòa tan hoàn toàn Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều

- Dung dịch điện ly nền Na2B4O7 10mM + SDS 50mM : Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na2B4O7 và 0,7210 g SDS vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu

âm đuổi khí và hòa tan hoàn toàn Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều Dung dịch điện ly nền này điều chỉnh pH đến pH 8,5 ; pH 9,2 và pH 10

- Dung dịch điện ly nền Na2B4O7 10mM + β-cyclodextrin 10mM: Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na2B4O7 và 0,4820g β-cyclodextrin vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm đuổi khí và hòa tan hoàn toàn Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

Tham khảo và nghiên cứu các tài liệu về CE và các đặc tính lý hóa của hoạt chất cần phân tích Trên cơ sở đó khảo sát các điều kiện điện di nhằm tìm ra điều tối

ưu nhất để tách và định lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong chế phẩm viên nén Từ phương pháp đã xây dựng được, tiến hành kiểm tra chất lượng các thuốc có cùng hoạt chất đang được sử dụng trên thị trường

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Hai kỹ thuật được lựa chọn ở đây là CZE, MEKC xem ở kiểu điện di nào có thể

tách tốt các hoạt chất

Sau đó tiến hành khảo sát các điều kiện để chọn chương trình điện di thích hợp,

cụ thể là:

- Lựa chọn kiểu (mode) điện di phù hợp

- Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách 3 hoạt chất và định lượng đồng thời như:

pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ…

- Đánh giá thống kê phương pháp phân tích

- Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc

- Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp

Yêu cầu đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan r  0,99

 Độ lặp lại của phương pháp

Tiến hành phân tích ở mức nồng độ đã xác định với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của diện tích pic của ba chất cần phân tích Đánh giá độ phân tán số liệu dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD(%)

RSD(%)=

x

SD

x 100 Yêu cầu RSD(%) không được quá 5%

 Độ đúng của phương pháp

Độ đúng của phương pháp được xác định bằng tỷ lệ tìm lại của một mẫu thử đã được cho thêm những lượng chuẩn nhất định Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành lặp lại sáu lần, chuẩn thêm vào 20% so với lượng có trong mẫu Phương pháp thêm chuẩn vào mẫu được chuẩn bị như sau:

Mẫu thử: là dung dịch chế phẩm được pha với hệ đệm ở nồng độ nằm trong khoảng

tuyến tính Hệ đệm chúng tôi dùng trong nghiên cứu này là nước cất deion và 10% Metanol (v/v)

Mẫu thêm chuẩn: được tiến hành song song cùng mẫu thử, thêm 20% chuẩn so với

hàm lượng có trong mẫu

Tính độ thu hồi: Dựa vào phương trình chuẩn hồi quy tính toán được nồng độ của

từng mẫu (Cmẫu ) và nồng độ của từng mẫu thêm chuẩn (Cmẫu thêm chuẩn)

Cthu hồi = Cmẫu thêm chuẩn- Cmẫu

Tỷ lệ phần trăm thu hồi (%)=Cthu hồi/ Cchuẩn

 Tính tương thích hệ thống

Tính tương thích hệ thống được xác định bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu hỗn hợp ba chuẩn đã được xác định nồng độ Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) và giá trị độ phân giải Rs của hai pic

Rs = 2 x [(tR)B- (tR)A] / (WA+WB)

Trong đó (tR)A: thời gian dịch chuyển của chất A

(tR)B : thời gian dịch chuyển của chất B

WA, WB : độ rộng chân pic trên điện di đồ của hai chất A và B

 Tính đặc hiệu của phương pháp

Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng xác định một cách chắc chắn sự có mặt của các chất cần phân tích khi có các thành phần khác bằng cách điện di lần lượt mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử trong cùng một điều kiện điện di đã lựa chọn Trong đó mẫu trắng chính là dung môi (trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nước deion và 10% metanol (v/v) làm dung môi) đã dùng để pha mẫu thử và mẫu chuẩn

2.2.2.2 Áp dụng phương pháp đã nghiên cứu vào định lượng các loại viên nén 2 hoạt chất và 3 hoạt chất

Trên cơ sở đã khảo sát, chọn nồng độ định lượng của mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính

Từ đường chuẩn đã xây dựng được khi xác định khoảng tuyến tính, tính ra được hàm lượng chất cần phân tích có trong mẫu định lượng Tiếp đó tính ra hàm lượng hoạt chất có trong chế phẩm

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC, AZT và NVP

3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện chất

Để khảo sát phổ 3TC,AZT và NVP, detector được chọn là DAD Do 3 hoạt chất đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tôi sử dụng máy điện di với detector DAD để quét phổ trực tiếp với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm để xác định các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này Các chất được pha với nồng độ 120µg/ml trong 10 mM đệm Borat, 50

mM SDS, pH=9,3 Phổ thu được thể hiện hình 3.1

3TC

AZT

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của 3TC, AZT và NVP

Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm, xem xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng

Kết quả quét phổ cho ta thấy: Lamivudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 270,5nm, Zidovudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 264,5nm và Nevirapin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 268,5nm.Chúng tôi chọn các bước sóng hấp thụ cực đại cho từng chất trong phép định lượng để cho kết quả chính xác nhất Detector

sử dụng của máy điện di là detector DAD của hãng HP

3.1.2 Mao quản và xử lý mao quản

Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn 100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và

do vậy mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 – 30kV Hơn nữa kích thước mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lượng nhỏ như mẫu huyết thanh Tuy nhiên, nếu mao quản có đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện Khoảng đường kính trong của mao quản thường là 25 – 150 µm Tốt nhất nên dùng mao quản có đường kính trong từ 25- 75 µm Vì mao quản có ID lớn hơn 75 µm thường cho hiệu ứng nhiệt Jun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong

nghiên cứu này có đường kính trong là 75 µm

NVP