Khảo sát đa hình gen CYP2C9*3 và VKORC1 trên bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống đông ACENOCOUMAROL: Luận văn ThS. Sinh học: 84201

Tuy nhiên, trở ngại cho bệnh nhân và các thầy thuốc là khoảng an toàn của thuốc chống đông máu nhóm AVK rất hẹp, nên việc xác định liều lượng đủ hiệu lực điều trị nhưng tránh được nguy c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đỗ Thị Lệ Hằng

KHẢO SÁT ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 VÀ VKORC1

TRÊN BỆNH NHÂN THAY VAN TIM SỬ DỤNG THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đỗ Thị Lệ Hằng

KHẢO SÁT ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 VÀ VKORC1

TRÊN BỆNH NHÂN THAY VAN TIM SỬ DỤNG THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Vũ Thị Thơm PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn

thạc sĩ khoa học

TS Vũ Thị Thơm PGS.TS Nguyễn Huy Hoàng

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Đỗ Thị Lệ Hằng, học viên cao học khóa 25 (2016-2018), chuyên ngành

Sinh học Thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của:

TS Vũ Thị Thơm và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực

và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơi nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Người viết cam đoan

Đỗ Thị Lệ Hằng

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS Vũ Thị Thơm

và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung là những người hướng dẫn khoa học, những người Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này Tôi xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp Đại học Quốc Gia Hà Nội, mã số: QG.17.29 đã cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này Tôi xin cảm ơn PGS.TS Phạm Trung Kiên, chủ nhiệm đề tài đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy cô, các nhà Khoa học trong Hội Đồng chấm đề cương và luận văn tốt nghiệp đã đóng góp những ý kiến quý báu, giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời biết ơn tới Ban Giám Hiệu nhà trường, phòng Đào Tạo sau Đại Học, các Thầy Cô Khoa Sinh học và các Thầy Cô bộ môn Sinh học Tế Bào - Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Các cán bộ Bộ môn Y Dược học cơ sở, Ban lãnh đạo Khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập Các bác sĩ và nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn này

Xin bày tỏ lòng biết ơn đối với Bố Mẹ và những người thân trong gia đình cùng với bạn bè đồng nghiệp là chỗ dựa vững chắc của tôi, luôn thương yêu, khuyến khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tinh thần giúp tôi hoàn thành tốt chương trình học tập và thực hiện thành công luận văn này

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhóm nghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi có thành công này

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh lý van tim và thay van tim 3

1.2 Sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim 4

1.3 Dược di truyền học của acenocoumarol 6

1.4 Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C9*3 và gen VKORC1 9

1.4.1 Khái niệm về đa hình đơn nucleotide 9

1.4.2 Vị trí, cấu trúc gen CYP2C9 và mối liên quan tới liều thuốc

acenocoumarol 11

1.4.3 Vị trí, cấu trúc gen VKORC1 và mối liên quan tới liều thuốc

acenocoumarol 15

1.4.4 Các phương pháp phân tích xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 18

1.5 Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa di truyền học và liều thuốc acenocoumarol trên thế giới và trong nước 21

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 21

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 24

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 26

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 26

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 27

2.3.1 Hóa chất 27

2.3.2 Thiết bị 28

2.3.3 Dụng cụ 28

2.3.4 Mẫu nghiên cứu 28

2.4 Các bước nghiên cứu 29

2.4.1 Quy trình nghiên cứu 29

2.4.2 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu 30

2.4.3 Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số 30

2.4.4 Trình tự mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 32

2.4.5 Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 bằng phương pháp PCR 32

2.4.6 Tinh sạch sản phẩm PCR 33

2.4.7 Xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 sử dụng phương pháp giải

trình tự gen 34

2.4.8 Xác định kiểu gen của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 sử dụng phương pháp RFLP có đối chiếu với phương pháp giải

trình tự gen 35

2.4.9 Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và

SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 37

2.5 Xử lý và phân tích số liệu 37

2.6 Các loại sai số và cách khắc phục 37

2.6.1 Sai số có thể mắc phải 37

2.6.2 Cách khắc phục sai số 37

2.7 Đạo đức nghiên cứu 38

Chương 3 KẾT QUẢ 39

3.1 Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân trong nghiên cứu 39

3.2 Kết quả phân tích kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,

SNP rs9934438 trên gen VKOCR1 40

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 40

3.2.2 Tối ưu quy trình PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và

SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 41

3.2.3 Kết quả khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,

SNP rs9934438 trên gen VKORC1 47

3.2.4 Kết quả phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231,

SNP rs9934438 trên gen VKORC1 50

3.3 Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 55

3.3.1 Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 55

3.3.2 Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và rs99 rs9934438 trên gen VKORC1 56

3.4 Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934438 trên gen VKORC1 57

Chương 4 BÀN LUẬN 58

4.1 Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 59

4.2 Phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438

trên gen VKORC1 60

4.3 Xác định tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934348 trên gen VKORC1 62

KẾT LUẬN 66

KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC 76

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AHA American Heart Association: Hiệp hội Tim mạch Mỹ

AVK Anti Vitamin K : Kháng vitamin K

AF Atrial Fibrillation: Rung nhĩ

bp Base pair (cặp bazơ)

cs cộng sự

COA Thuốc chống đông máu đường uống họ Coumarinic

DVT Deep Venous Thrombosis: Huyết khối tĩnh mạch sâu

dNTP Deoxyrinucleotide Triphosphate

ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate

DNA Deoxyribonucleic Acid (Acid deoxyribonucleic)

HVR Heart Valve Replacement: Thay Van Tim

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

INR International Normalized Ratio: Chỉ số bình thường hoá Quốc Tế NST Nhiễm sắc thể

PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi polymerase

PT Prothrombin

RE Restriction Enzym: enzym cắt giới hạn

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism: Đa hình chiều dài

đoạn cắt giới hạn SNP Single Nucleotide Polymorphism: Đa hình đơn nucleotide

TAE Tris base, acetic acid and EDTA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Mối liên quan giữa đa hình gen CYP2C9 với liều dùng acenocoumarol 14

Bảng 1.2 Mối liên hệ giữa kiểu gen VKORC1 với liều thuốc acenocoumarol 16

Bảng 1.3 Tần số phân bố alen của gen CYP2C9 ở các quần thể người 23

Bảng 1.4 Tần số phân bố alen của gen CYP2C9 ở các quần thể người 23

Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen chứa các alen 32

Bảng 2.2 Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9923231 trên gen VKORC1 35

Bảng 2.3 Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của rs9923231 trên gen VKORC1 36

Bảng 3.1 Một số đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 39

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số 41

Bảng 3.3 Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 47

Bảng 3.4 Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 48

Bảng 3.5 Quy trình khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 48

Bảng 3.6 Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP CYP2C9*3 55

Bảng 3.7 Kết quả tần số phân bố alen, kiểu gen của SNP rs9923231 và

SNP rs9934438 trên gen VKORC1 56

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Buồng tim và vị trí các van tim 3

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của acenocoumarol 7

Hình 1.3 Ảnh hưởng của gen CYP2C9 và gen VKORC1 tới acenocoumarol 8

Hình 1.4 Mô tả Single nucleotide polymorphisms 9

Hình 1.5 Mô tả Haplotype 10

Hình 1.6 Vị trí nhiễm sắc thể số 10 trong bộ NST người 12

Hình 1.7 Vị trí gen CYP2C9 trên nhiễm sắc thể số 10 12

Hình 1.8 Vai trò của Cytochrome P450 trong chuyển hoá thuốc 13

Hình 1.9 Vị trí nhiễm sắc thể số 16 trong bộ NST người 15

Hình 1.10 Vị trí gen VKORC1 trên nhiễm sắc thể số 16 15

Hình 1.11 Gen VKORC1 15

Hình 1.12 Giải trình tự gen bằng máy tự động 19

Hình 1.13 Enzym cắt tạo đầu dính và cắt tạo đầu bằng 20

Hình 3.1 Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,7% 40

Hình 3.2 Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 42

Hình 3.3 Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 42

Hình 3.4 Kết quả PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 43

Hình 3.5 Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 44

Hình 3.6 Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9923231 trên gen VKORC1 45

Hình 3.7 Kết quả PCR tối ưu nồng độ mồi (A) và nồng độ DNA (B) cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP rs9934438 trên gen VKORC1 46

Hình 3.8 Điện di sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C9*3, SNP rs9923231, SNP rs9934438 49

Hình 3.9 Kết quả giải trình tự SNP CYP2C9*3 50

Hình 3.10 Sản phẩm RFLP của SNP rs9923231 trên gen VKORC1 51

Hình 3.11 Sản phẩm RFLP của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 52

Hình 3.12 Kết quả giải trình tự SNP rs9923231 trên gen VKORC1 53

Hình 3.13 Kết quả giải trình tự SNP rs9934438 trên gen VKORC1 54

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ kiểu gen phối hợp của SNP rs9923231 và SNP rs9934431

trên gen VKORC1 57 Biểu đồ 4.1 Tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3 ở một số quần thể người

khác nhau 63

Biểu đồ 4.2 Tần số phân bố alen của SNP rs9923231 trên gen VKORC1 ở một số

quần thể người khác nhau 64

Biểu đồ 4.3 Tần số phân bố alen của SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở một số

quần thể người khác nhau 65

Do vậy, ngay sau khi thay van tim bệnh nhân phải sử dụng thuốc chống đông máu trong một thời gian dài hoặc suốt đời nhằm ngăn ngừa sự hình thành cục máu đông, tránh các nguy cơ gây huyết khối hoặc tắc mạch [62] Có rất nhiều loại thuốc chống đông máu nhưng được sử dụng rộng rãi và nhiều nhất là thuốc chống đông máu nhóm kháng vitamin K (AVK) [17] Các thuốc chống đông máu nhóm AVK làm giảm quá trình sản xuất các yếu tố đông máu (yếu tố II, VII, IX và X) ngăn ngừa sự hình thành cục máu đông và ngăn cục máu đông có sẵn lớn hơn nữa trong hệ tuần hoàn Thuốc chống đông máu đường uống nhóm AVK được sử dụng từ những năm

1940, có một số nhóm thuốc chống đông máu nhóm AVK như: warfarin, acenocoumarol và phenprocoumon [54]

Hiện nay, ở Việt Nam acenocoumarol (Sintrom) được sử dụng rộng rãi để điều trị hơn warfarin Tuy nhiên, trở ngại cho bệnh nhân và các thầy thuốc là khoảng an toàn của thuốc chống đông máu nhóm AVK rất hẹp, nên việc xác định liều lượng

đủ hiệu lực điều trị nhưng tránh được nguy cơ gây chảy máu là rất khó khăn [56] Nếu dùng liều thuốc chống đông thấp thì không đạt hiẹ u quả kháng đông, nhu ng nếu quá liều s gây biến chứng chảy máu đe dọa tính mạng bệnh nhân Trên lâm sàng, các bác sĩ thường dò liều điều trị dựa vào kinh nghiệm, lứa tuổi và xét nghiệm chức năng gan, thận của bệnh nhân và đặc biệt là theo dõi chặt ch chỉ số INR (International Normalized Ratio - chỉ số bình thường hóa quốc tế) của từng bệnh

nhân [63] Trong các yếu tố kể trên, di truyền học là một trong các yếu tố quan trọng đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt được khoảng INR mong muốn [62] Hơn 30 gen đã được tìm thấy s tham gia vào các hoạt động trao đổi chất của thuốc chống đông máu họ Coumarinic dạng uống (COA), trong đó gen

CYP2C9 (gen mã hóa cho họ enzym chuyển hóa thuốc cytochrome P450) và gen VKORC1 (gen mã hóa cho enzym đích của thuốc) là quan trọng nhất [20][35][37]

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng khoảng 30% của phương sai liều phụ thuộc

vào đa hình đơn nucleotide (SNP) của gen VKORC1 và khoảng 12% phụ thuộc vào hai SNP CYP2C9*2, CYP2C9*3 [33] Trong bối cảnh của Việt Nam hiện nay, chưa

có thông tin về mặt di truyền học liên quan tới việc chỉ định liều acenocoumarol sử

dụng cho bệnh nhân do đó chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Khảo sát đa hình

gen CYP2C9*3 và VKORC1 trên bệnh nhân thay van tim sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol”

Đề tài được tiến hành với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng đƣợc quy trình phân tích kiểu gen SNP CYP2C9*3 và SNP

rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

2 Khảo sát đƣợc tần số phân bố alen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1 ở quần thể bệnh nhân thay van

tim sử dụng thuốc chống đông Acenocoumarol tại Bệnh Viện Tim Hà Nội

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Bệnh lý van tim và thay van tim

Bệnh lý van tim là một bệnh phổ biến tại Việt Nam trong cơ cấu bệnh lý tim mạch nói chung Nguyên nhân gây tổn thương van tim phần lớn là do di chứng của bệnh lý thấp tim [2] Bệnh nhân có tiền sử thấp khớp từ nhỏ hoặc bị tấn công bởi liên cầu khuẩn gây thấp tim nhưng không có triệu chứng Bệnh thấp tim gây suy tim

và đe dọa tính mạng người bệnh [7][8][14]

Tim người bình thường có 4 buồng tim, 2 tâm nhĩ (nhĩ phải, nhĩ trái) và 2 tâm thất (thất phải, thất trái) Ngăn cách giữa các buồng tim là các van tim, van 2 lá giữa nhĩ trái và thất trái, van 3 lá giữa nhĩ phải và thất phải Có 2 đại động mạch đi ra từ tim là động mạch chủ và động mạch phổi Ngăn cách giữa tim với 2 đại động mạch này là van động mạch chủ và van động mạch phổi [1] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Buồng tim và vị trí các van tim [2]

Tổn thương van tim có 2 dạng chính là hở van tim hoặc hẹp van tim Với tổn thương do bệnh lý thấp tim thường có cả 2 dạng tổn thương trên kết hợp Khi tổn thương hẹp hoặc hở van tim ở mức nặng s làm suy giảm chức năng tim và gây ra những triệu chứng khó chịu cho người bệnh [14]

Kỹ thuật sửa và thay van tim đã cứu sống được hàng triệu bệnh nhân mắc bệnh van tim và trả lại cho họ cuộc sống bình thường [39] Năm 1923, Elliot Cuttler

đã thực hiện tách van tim kín bằng dụng cụ [43].Năm 1925, Henry Souttar đã tách van tim kín bằng tay [26] Đến năm 1948, Wright Harken và Charler Bailey đã hoàn thiện kỹ thuật tách van hai lá bằng tay [66] Năm 1959, Nina Braunwald đã thực hiện ca thay van tim nhân tạo đầu tiên trên thế giới, kể từ đó hàng năm có hàng trăm ngàn bệnh nhân mắc bệnh van tim được thay van tim nhân tạo [64] Tại các nước Bắc Mỹ, hàng năm có khoảng 100.000 trường hợp bệnh nhân phải thay van tim với

bệnh lý chủ yếu là tổn thương van tim do thấp tim [28]

1.2 Sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim

Sau thay van tim bệnh nhân có thể gặp một số biến chứng như: liên quan đến sau phẫu thuật, do hoạt động của van nhân tạo, nhưng biến chứng hay gặp nhất là

do việc sử dụng các thuốc chống đông máu sau thay van tim Có thể nói thay van

tim là thay một “bệnh van tim” bằng một “bệnh van tim nhân tạo” Nguyên nhân là

do van tim mới được cơ thể người nhận biết như một “yếu tố lạ”, sau khi tiếp xúc với dòng máu trong cơ thể s kích thích quá trình đông máu nội sinh Bên cạnh đó,

sự rối loạn dòng chảy của máu quanh van cơ học (dòng chảy rối, rối loạn dòng chảy) cũng là một yếu tố góp phần hình thành cục máu đông [62][63] Do vậy, tất

cả bệnh nhân sau thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông máu (thuốc loãng máu) trong một thời gian dài hoặc cả đời để dự phòng việc hình thành cục máu đông gây các biến chứng tắc mạch cho bệnh nhân Hiện tại, ở Việt Nam các dạng thuốc chống đông máu được bác sĩ chỉ định cho bệnh nhân dùng sau thay van tim phần lớn đều thuộc nhóm AVK Thuốc chống đông máu nhóm AVK đã được sử dụng từ rất lâu (từ những năm 1940) [17] Hai dạng thuốc chống đông máu nhóm AVK thường gặp là: Sintrom (hoạt chất: acenocoumarol) và Coumadine (warfarin)

Cơ chế tác dụng của nhóm thuốc này: làm giảm quá trình sản xuất các yếu tố đông máu như II, VII, IX và X, ngăn ngừa hình thành cục máu đông và ngăn cục máu đông có sẵn lớn hơn nữa trong hệ tuần hoàn [54] Tuy được dùng từ lâu và rộng rãi nhưng việc sử dụng thuốc chống đông máu nhóm AVK hiệu quả lại có nhiều khó khăn cho người bệnh do khoảng tác dụng của loại thuốc này hẹp, liều dùng thuốc ở

mỗi bệnh nhân phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cơ địa bệnh nhân, chế độ dinh dưỡng, ảnh hưởng của các loại thuốc khác kèm theo, các bệnh khác đi kèm Vì vậy khi bệnh nhân sử dụng thuốc chống đông máu nhóm AVK thì bệnh nhân phải được

sự chỉ định liều dùng của bác sĩ điều trị, phải thường xuyên theo dõi và xét nghiệm thời gian đông máu prothrombin (PT) và chỉ số INR [56][63]

INR (International normalized radio), đu ợc xây dựng bởi tổ chức y tế thế giới

và uỷ ban quốc gia về chứng huyết khối và cầm máu với nhiệm vụ báo cáo các kết quả kiểm tra sự đông máu Tất cả các kết quả đu ợc tiêu chuẩn hoá bằng việc sử dụng các chỉ số quốc tế cho thuốc thử đông máu thông thu ờng và các thiết bị thống nhất để thực hiện việc kiểm tra [30][46][73 Ví dụ một ngu ời đang uống thuốc chống đông máu có thể có chỉ số INR từ 2 - 3, thì bất kể phòng thí nghiệm nào kiểm tra INR kết quả cần phải nhu nhau dù dùng thuốc loại gì và dụng cụ gì để kiểm tra Ngu ời ta sử dụng chỉ số INR để thăm dò toàn bộ yếu tố đông máu ngoại sinh (yếu

tố II, V, VII và X) [73] Chỉ số INR đu ợc tính bằng công thức:

INR = [PT bệnh nhân/PT chứng]ISI Việc kiểm soát và điều chỉnh liều lu ợng dùng thuốc đu ợc thực hiện bằng cách kiểm tra và theo d i chỉ số INR của một ngu ời đang uống thuốc chống đông thường xuyên Khi INR tre n 6,0 xuất hiện nguy co xuất huyết ở người bệnh Các loại thuốc chống đông máu giúp ngăn chặn sự đông và vón cục của máu [30], đu ợc kê dùng dài ngày cho những bệnh nhân có các triệu chứng đông máu không bình thu ờng, bao gồm: các bệnh nhân tim, đột quỵ hoặc tắc ngh n mạch và đu ợc dùng cho từng giai đoạn ngắn đối với bệnh nhân đã điều trị qua phẫu thuật thay van tim Chất chống đông máu cần đu ợc kiểm soát cẩn thận để giữ đu ợc cân bằng giữa việc chống đông máu với việc gây nên biến chứng chảy máu quá mức X t nghiẹ m chỉ số INR không phức tạp, bệnh nhân thu ờng lấy máu vào buổi sáng, lấy khoảng 4,5 ml máu 0,5 ml Citrate để làm x t nghiệm [36][56] Bệnh nhân cần đo chỉ số INR mỗi 1 - 2 ngày trong 2 tuần đầu sau khi sử dụng đến khi INR đạt mục tiêu 2 lần liên tiếp, khi INR ổn định bệnh nhân nên đo INR mỗi 2 - 4 tuần 1 lần Ngoài ra mỗi lần tái khám bệnh nhân cũng phải đo INR để đánh giá hiệu quả liều thuốc dùng và điều chỉnh liều thuốc:

+ INR mục tiêu: mỗi bệnh nhân tuỳ theo tình trạng bệnh lý cụ thể mà phân loại INR mục tiêu Bệnh nhân thay van 2 lá cơ học, INR mục tiêu = 2,5 - 3,5 Bệnh nhân thay van cơ học kèm tiền sử kẹt van thì INR mục tiêu = 3,5 - 4,5 Bệnh nhân lớn tuổi, có nguy cơ xuất huyết cao thì INR mục tiêu = 2,0 [11]

+ INR thấp: không đạt mục tiêu điều trị, dễ tạo cục máu đông gây kẹt van tim hay những biến chứng gây tắc mạch khác [11]

+ INR cao: gây biến chứng xuất huyết như bầm dưới da, chảy máu chân răng, chảy máu cam, tiểu máu, nặng nhất là chảy máu não [11]

1.3 Dƣợc di truyền học của acenocoumarol

Thuốc chống đông máu nhóm AVK thông dụng như: warfarin, acenocoumarol

và phenprocoumon là những loại thuốc thường được kê đơn nhiều nhất cho việc xử

lý các vấn đề liên quan đến chống đông máu ở bệnh nhân: rung nhĩ (AF), thay van tim (HVR), huyết khối tĩnh mạch (DVT), phổi thuyên tắc, tăng áp động mạch phổi

và với những bệnh nhân đã trải qua phẫu thuật chỉnh hình [18] Ở Việt Nam, acenocoumarol được sử dụng rộng rãi trong điều trị các vấn đề về huyết khối của bệnh nhân sau thay van tim hơn warfarin [24]

Cấu trúc hoá học của acenocoumarol được đặc trưng bởi nhóm nitro ở vị trí para của vòng phenyl và tồn tại ở hai dạng đồng phân R(+) và S(-), trong đó R( ) acenocoumarol có tác dụng chống đông mạnh hơn so với acenocoumarol S(-) Acenocoumarol ức chế quá trình khử vitamin K, qua đó ngăn ngừa phản ứng carboxyl hóa đuôi axit amin glutamic của các yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin

K Sự carboxyl hóa rất quan trọng cho sự tương tác giữa các yếu tố đông máu và canxi Nếu không có sự tương tác này, quá trình đông máu không thể xảy ra Cả yếu

tố bên ngoài thông qua yếu tố VII, X và II [21][32][34]

Acenocoumarol được hấp thu nhanh chóng qua đường uống và đạt nồng độ tối đa (Cmax = 0,3 ± 0,05 mcg/ml) trong 2 - 3 giờ Acenocoumarol trong huyết tương đa phần ở dạng liên kết với protein chỉ 1,52% tồn tại ở trạng thái tự do Sau khi uống, nồng độ thuốc trung bình đạt được trong huyết tương và thời gian bán thải của thuốc lần lượt là 3,9 ± 0,7 mcg ml/giờ và 10,9 ± 1,5 mcg ml/giờ Thời

gian để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc làm tăng thời gian PT là từ 24 - 30 giờ [21] Acenocoumarol là thuốc có thời gian bán thải ngắn, do vậy nó được đào thải

ra ngoài một cách nhanh chóng Do đó, việc xác định liều lượng sử dụng cho từng bệnh nhân một cách ổn định là điều hết sức có ý nghĩa Vì nếu bệnh nhân sử dụng liều thấp có thể gây giảm hiệu quả chống đông của thuốc, còn sử dụng liều cao có thể gây nguy cơ biến chứng chảy máu Quan trọng hơn, giai đoạn đầu của điều trị rất dễ bị các biến chứng lâm sàng liên quan tới việc sử dụng trên hoặc dưới liều Trong những tuần đầu điều trị, giá trị INR thường rối loạn và có nguy cơ chảy máu nhiều hơn Để tránh nguy cơ này bác sĩ nên có những tính toán cho liều dung nạp thuốc đầu tiên và duy trì liều sau đó đối với thuốc [36] Liều thuốc acenocoumarol cũng tùy thuộc vào mỗi cá thể và phụ thuộc vào chỉ số INR Liều dùng thường vào ngày thứ nhất từ 8 - 12 mg, trong ngày thứ hai là từ 4 - 8 mg Liều duy trì từ 1 - 10 mg hàng ngày Uống acenocoumarol vào cùng thời điểm hàng ngày [35][61]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của acenocoumarol [21]

Hình 1.3 Ảnh hưởng của gen CYP2C9 và gen VKORC1 tới acenocoumarol

[53][69][76]

Trong tất cả các yếu tố có nguy cơ gây ảnh hưởng đến liều dùng thuốc

acenocoumarol của bệnh nhân như trên thì yếu tố di truyền học là một yếu tố được

đánh giá là rất quan trọng và đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt

được khoảng INR mong muốn [37] Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng gen

VKORC1, gen CYP2C9 và gen CYP4F2 là các yếu tố di truyền chủ yếu chịu trách

nhiệm cho sự thay đổi liều dùng thuốc chống đông nhóm AVK ở bệnh nhân da

trắng và trong đó các SNP của gen VKORC1 (gen mã hóa cho enzym đích của

thuốc) và gen CYP2C9 (gen mã hóa cho siêu họ enzym chuyển hóa thuốc

cytochrome P450) có vai trò quan trọng nhất [20][54][70] Xét về sự ảnh hưởng đến

liều dùng thuốc acenocoumarol, gen VKORC1 được cho là có ảnh hưởng hơn gen

CYP2C9 trong một số nghiên cứu gần đây [17][24][25][33] Vì vậy, trong những

năm gần đây, các nhà khoa học đã nỗ lực nghiên cứu để phát triển các thuật toán

hướng dẫn liều sử dụng acenocoumarol dựa trên các yếu tố di truyền cũng như lâm

sàng [22] Điều này cho thấy dược di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc

hướng dẫn liều điều trị cho các thuốc chống đông máu thuộc nhóm AVK Theo

nghiên cứu của tác giả Verde và cs (2010) đã chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình di

truyền gen VKORC1, gen CYP4F2 và gen CYP2C9*2*3 với liều thuốc

acenocoumarol sử dụng cho bệnh nhân sau thay van tim [76] Một nghiên cứu khác của tác giả Van Schie và cs (2011) cũng công bố chi tiết về các thuật toán tiên lượng liều sử dụng cho acenocoumarol và phenprocoumon có sự khác biệt đáng kể

so với thuật toán tiên lượng liều sử dụng cho warfarin [60]

1.4 Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C9*3 và gen VKORC1

1.4.1 Khái niệm về đa hình đơn nucleotide

Đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism-SNP, đọc là “snip”)

là những vị trí nằm trong hệ gen của người, mà ở những cá thể khác nhau lại xuất hiện một loại nucleotide khác nhau (A, T, G hoặc C) Mỗi vị trí được coi là một SNP chỉ khi tần số ít nhất xuất hiện một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1% Mỗi gen

là một đoạn ngắn trong chuỗi xoắn kép DNA, tạo nên một bộ gen của con người Đoạn ngắn đó lại là một chuỗi rất nhiều các nucleotide, các biến động về một gen giữa các cá thể chỉ do sự khác nhau của một nucleotide trong gen đang x t, đó chính

là tính đa hình đơn nucleotide [17]

Hình 1.4 Mô tả Single nucleotide polymorphisms [17]

Mặc dù về lý thuyết, có thể xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotide, song thông thường SNP lại chỉ xuất hiện 2 loại alen Nguyên nhân là do SNP bắt nguồn từ một đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotide này sang một nucleotide khác [15] Nếu đột biến được xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì s có các thế hệ sau ra đời mang đột biến này và qua nhiều thế hệ s hình thành SNP trong

quần thể Nhưng chỉ có 2 alen - một alen gốc và một alen đột biến Nếu muốn có alen thứ 3, s cần có một đột biến mới xảy ra ở đúng vị trí trước đó trong hệ gen và

cá thể mang đột biến phải di truyền lại được cho các thế hệ sau Điều này vẫn có thể xảy ra nhưng rất hiếm, do đó phần lớn SNP chỉ có 2 alen [15] Đa hình thái được gọi là đột biến khi có tỉ lệ <1% trong quần thể [58] Các trường hợp có thể xảy ra khi

đột biến tại 1 nucleotide:

- Ở đoạn trình tự mã hóa, SNP có thể dẫn đến thay đổi trình tự axit amin, độ dài chuỗi polypeptide nếu một bộ ba nucleotide (codon) kết thúc bị biến đổi

- Ở các vị trí không thuộc các trình tự mã hóa nhưng vẫn có thể chi phối đến mức độ biểu hiện của gen, SNP ảnh hưởng đến sự biểu hiện của sản phẩm protein

- Nhiều SNP thuộc các vùng mã hóa hay không mã hóa các gen không gây ảnh hưởng đến cấu trúc hay sự biểu hiện hoạt động của các gen

Biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA của con người là các SNP Mỗi SNP lại có thể liên kết với các SNP khác trên cùng một nhiễm sắc thể Các SNP liên kết đó thường có xu hướng tạo thành một tập hợp di truyền cùng nhau vì ít khả năng trao đổi chéo tạo ra những tập hợp mới, và được gọi là haplotype Trong tiến hóa, dĩ nhiên các haplotype cũng có thể bị thay đổi do trao đổi chéo tạo thành các haplotype mới [26] Tính đến thời điểm này, có hơn bốn triệu SNP trong hệ gen của con người đã được xác định Các SNP xảy ra khi một cặp nucleotide bị thay thế Do

đó, các SNP là sự khác biệt duy nhất, cơ sở tồn tại giữa các cá nhân [15]

Hình 1.5 Mô tả Haplotype [26]

Với tần suất lớn và sự phân bố khắp hệ gen người, mặc dù hầu hết các SNP không gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người, nhưng chúng lại là những công

cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền Ví dụ như SNP là cơ sở cho phương pháp GWAS, cho phép các nhà nghiên cứu xác định vùng gen quan trọng với tiến triển bệnh tật Nhiều SNP có thể giúp dự đoán đáp ứng của từng cá nhân với các loại thuốc điều trị, tính nhạy cảm với các yếu tố môi trường và nguy cơ mắc một số bệnh, cũng như theo d i các bệnh lý di truyền theo gia đình [51] Việc xác định các đột biến gây bệnh cũng là bước đầu tiên quan trọng trong liệu pháp điều trị, từ đó có lời khuyên thích hợp trong vấn đề phòng bệnh đối với từng cá thể [51]

1.4.2 Vị trí, cấu trúc gen CYP2C9 và mối liên quan tới liều thuốc acenocoumarol

Cytochrome P450 (CYP) là siêu họ enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa

phần lớn các thuốc được sử dụng trong lâm sàng hiện nay như: thuốc chống ngưng tập tiểu cầu (clopidogrel), thuốc chống động kinh (mephenytoin, diazepam) và các

thuốc an thần Enzym CYP bao gồm: CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP1A2 và CYP2E1 [57] Trong đó, CYP2C9 là enzym đóng vai trò quan trọng

trong việc oxy hoá các hợp chất nội sinh và ngoại sinh đồng thời cũng chính là enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc acenocoumarol [69]

Hàng trăm loại thuốc điều trị các loại bệnh khác nhau được chuyển hóa bởi

CYP2C9 tại gan, bao gồm cả các loại thuốc chống đông máu có chỉ định điều trị hẹp

như: acenocoumarol, warfarin và phenytoin và các loại thuốc điều trị thường xuyên theo chỉ định khác như: tolbutamide, losartan, glipizide cũng như một số loại thuốc

chống viêm không steroid Không chỉ ở gan, CYP2C9 còn tham gia chuyển hóa các

hợp chất nội sinh quan trọng như 5-hydroxytryptamine thành epoxygenase hoạt động, hay các axit béo không bão hòa thành một loạt các sản phẩm có hoạt tính sinh học [45][47]

Gen CYP2C9 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người (10q23.33), từ

cặp nucleotide 94,762,624 đến 94,853,260 [26]

Hình 1.6 Vị trí nhiễm sắc thế số 10 trong bộ NST Người [26]

Hình 1.7 Vị trí gen CYP2C9 trên nhiễm sắc thể số 10 [26]

Quá trình chuyển hóa thuốc trải qua hai giai đoạn: pha I và pha II Pha I: xảy

ra các phản ứng sinh hóa như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng chủ yếu là phản ứng oxy hóa có sự tham gia của enzym cytochrome P450 [52] Pha II: các phản ứng ở pha II đều là các phản ứng liên hợp: một phân tử nội sinh (acid glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) s ghép với một nhóm hóa học của thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trong nước Thông thường, các phản ứng

ở pha I s tạo ra các nhóm chức cần thiết cho các phản ứng ở pha II, đó là các nhóm: -OH, -COOH, -NH2, -S [27][50][58] Phản ứng được thực hiện theo nhiều bước (Hình 1.8) [19][28]:

1 Thuốc (drug) phản ứng với dạng oxy hóa của Cytochrome P450 (Fe3+) tạo thành phức hợp Drug-P450 (Fe3+)

2 Phức hợp Drug- P450 (Fe3+) nhận 1 electron từ NADPH, bị khử thành Drug - P450 (Fe2+)

3 Sau đó, phức hợp Drug- P450 (Fe2+) phản ứng với 1 phân tử oxy để tạo thành phức hợp oxy hoạt hóa

4 Cuối cùng, 1 nguyên tử oxy được giải phóng, tạo H2O Còn nguyên tử oxy thứ 2 s oxy hóa thuốc: Drug  Drug-OH, và Cyt P450 (Fe3+) được tái tạo Kết quả của quá trình chuyển hóa làm thuốc không có hoạt tính trở thành chất

có hoạt tính

Hình 1.8 Vai trò của Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc [19][28]

Gen CYP2C9 có tính đa hình cao, hơn 50 nucleotide polymorphisms (SNPs)

đã được tìm thấy trên vùng mã hóa của gen CYP2C9 [26] Một số SNP đã được

chứng minh là có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính khử của enzym so với dạng kiểu dại Theo kết quả nghiên cứu của Saraevaf và cs (2007) đã xác định được gen

CYP2C9 là enzym chuyển hóa acenocoumarol, trong đó alen CYP2C9*3 có vai trò

quan trọng trong quyết định liều lượng sử dụng acenocoumarol [58] Một nghiên

cứu khác của Tassies và cs (2002) cũng cho rằng người mang alen CYP2C9*2, CYP2C9*3 chỉ cần liều thuốc acenocoumarol thấp hơn từ 16 - 27% [24]

Bảng 1.1 Mối liên quan giữa đa hình gen CYP2C9 với liều dùng acenocoumarol

Nghiên cứu

mô tả

Giảm liều: *1*2: 16%,*1*3: 36%, *2*2: 1%, *2*3: 27% Schalekamp và

mô tả Nguy cơ chảy máu: 1,83

Alen đa hình của gen CYP2C9 được chứng minh có liên quan tới việc gia tăng

gấp đôi nguy cơ chảy máu Mặc dù có ít công bố về mối liên quan giữa đa hình di

truyền gen CYP2C9 với liều thuốc acenocoumarol, một số các nghiên cứu cũng chỉ

ra mối liên quan giữa kiểu gen CYP2C9 và nguy cơ chảy máu gây ra bởi acenocoumarol [45] Sự hiện diện của một alen CYP2C9*3 làm giảm sự chuyển hóa

bình thường của dạng S-acenocoumarol, dạng có tác dụng lâm sàng và do đó làm tăng thời gian bán hủy của enantiomer này [45] Có nghĩa là liều thuốc acenocoumarol cần thiết ở người mang alen *3 thấp hơn ở người mang alen kiểu dại khoảng 27 - 36% [35] và thấp hơn người mang alen *2 khoảng 13 - 15% [24][44] Tuy nhiên, theo nghiên cứu của tác giả Schalekamp và cs (2004) vẫn chứng minh

nên giảm 20% liều điều trị cho bệnh nhân mang alen CYP2C9*3 đa hình khi dùng

thuốc chống đông máu acenocoumarol [65]

Alen CYP2C9*3 (kí hiệu rs1057910) trên gen CYP2C9:

Alen CYP2C9*3 có kí hiệu rs1057910 nằm ở vị trí c.1075A>C Đây là đột

biến đồng hoán A thay thế bằng C Đột biến này làm khung đọc mRNA bị cắt

ngắn hơn bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính [68] Alen CYP2C9*3 là dạng alen mã hoá cho enzym CYP2C9 phổ biến nhất [75]

1.4.3 Vị trí, cấu trúc gen VKORC1 và mối liên quan tới liều dùng thuốc acenocoumarol

Gen VKORC1 là gen mã hóa cho protein cùng tên VKORC1 (vitamin K

epoxide reductase complex subunit 1), đây là một protein xuyên màng có kích

thước nhỏ của lưới nội chất Protein VKORC1 rất cần thiết cho chu trình chuyển hóa vitamin K và nó là protein đích tác dụng của thuốc acenocoumarol [17]

Gen VKORC1 nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 16 ở người (16p11.2), từ

cặp nucleotide 31,090,842 đến cặp nucleotide 31,095,980 [17]

Hình 1.9 Vị trí nhiễm sắc thể số 16 trong bộ NST Người [17]

Hình 1.10 Vị trí gen VKORC1 trên nhiễm sắc thể số 16 [17]

Hình 1.11 Gen VKORC1 [17]

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng liều lượng sử dụng acenocoumarol cũng chịu

ảnh hưởng bởi kiểu gen VKORC1 Theo nghiên cứu của tác giả Reitsma và cs

(2005) thực hiện khảo sát trên 330 bệnh nhân người Hà Lan và kết quả là những bệnh nhân mang một hoặc hai alen -1173T cần giảm liều tương ứng là 28% và 47%

so với bệnh nhân không mang alen này [53] Trong khi đó, theo một nghiên cứu khác của tác giả Markatos và cs (2008) tiến hành trên 98 bệnh nhân người Hy Lạp, cho thấy kết quả: bệnh nhân mang một alen -1173T cần liều thuốc acenocoumarol thấp hơn khoảng 19% so với bệnh nhân không mang alen này và với bệnh nhân mang hai alen -1173T cần liều thuốc acenocoumarol thấp hơn 63% so với bệnh nhân không mang alen này [23]

Bảng 1.2 Mối liên hệ giữa kiểu gen VKORC1 với liều thuốc acenocoumarol

Tài liệu tham

mô tả Giảm liều AG: 34%, AA: 50%

Nghiên cứu của Reitsma và cs (2005) cho thấy sự gia tăng nguy cơ chảy máu

ở người mang một alen 1173T của gen VKORC1 [53] Trong một nghiên cứu khác

của tác giả Montes và cs (2008) nguy cơ xuất huyết tiêu hóa được tăng lên ở những

người sử dụng acenocoumarol mang từ một alen 1173T của gen VKORC1 [59]

Trong một nghiên cứu gần đây hơn, nguy cơ chảy máu cũng được thấy đã tăng lên ở

người sử dụng acenocoumarol mang một hoặc hai alen 1173T của gen VKORC1 (tỷ

lệ 4,9% cho kiểu gen AA; 2,3% ở AG và 0,47% ở những bệnh nhân mang kiểu gen GG) [42] Tuy nhiên, mức tăng này nằm trong khoảng giới hạn ở những tháng đầu tiên điều trị [68]

1.4.3.1 SNP rs9923231 trên gen VKORC1

Vị trí SNP rs9923231 trên gen VKORC1: là một đa hình trong vùng promoter của gen VKORC1 được cho là nguyên nhân đa hình đơn nucleotide cho kiểu hình liều thấp Sự đa hình này làm thay đổi vị trí gắn kết nhân tố phiên mã VKORC1 và

các xét nghiệm luciferase cho thấy hoạt động của alen G tăng 44% so với hoạt động

của alen A Ngoài ra, phân tích VKORC1 mRNA phân lập từ mẫu gan người cho

thấy rằng những người mang alen A ở vị trí c.1639 G>A có lượng mRNA giảm hơn

so với những ngày không mang alen này [17] Thay đổi trong sự biểu hiện gen dẫn đến giảm các bản sao của protein VKORC1 trưởng thành, đây chính là enzym kiểm soát trong chu trình vitamin K [17]

Đa hình rs9923231 trên gen VKORC1 đã được phân tích tại nhiều quần thể

khác nhau Đa hình này có tần số khác nhau ở các quần thể, chủng tộc người khác nhau Alen rs9923231 xuất hiện với tần số cao ở quần thể người Châu Á (khoảng 90%) còn với quần thể người da trắng thì chỉ xuất hiện khoảng 40% [31]

1.4.3.2 SNP rs9934438 trên gen VKORC1

Vị trí SNP rs9934438 trên gen VKORC1: c.1173C>T SNP rs9934438 là SNP trong intron đầu tiên của gen VKORC1 [29]. Nó nằm gần đoạn liên kết với rs9923231 rs9934438 là đa hình đầu tiên có liên quan đến kiểu hình AVK liều thấp

[7] Mặc dù nó thường được coi là bị trơ về mặt chức năng, tuy nhiên rs9934438

vẫn thường được sử dụng làm đa hình marker cho rs9923231 và cho các halotypes chứa biến thể này Đa hình này có tần số khác nhau ở các quần thể, chủng tộc người

khác nhau Alen rs9934438 xuất hiện với tần số cao ở quần thể người Châu Á

(khoảng 80 - 90%) [31]

1.4.4 Các phương pháp phân tích xác định kiểu gen của SNP CYP2C9*3 và SNP rs9923231, SNP rs9934438 trên gen VKORC1

1.4.4.1 Phương pháp PCR - giải trình tự gen

 Phương pháp PCR

PCR (polymerase chain reaction) được dùng để khuếch đại một chuỗi DNA (DNA đích) Trong quá trình sao chép, các sợi DNA tách nhau ra và mỗi sợi của phân tử DNA bố mẹ lại làm khuôn để tổng hợp lên các sợi DNA con theo nguyên tắc bổ sung Quá trình sao chép hoàn toàn dựa trên nguyên tắc Watson và Crick: A

bổ sung với T; G bổ sung với C và luôn đảm bảo tính bảo tồn cao, ít sai sót [12] Nguyên tắc của phương pháp PCR là dựa trên sự thay đổi nhiệt độ ở 3 giai đoạn khác nhau của quá trình phản ứng:

+ Giai đoạn 1 là giai đoạn biến tính

+ Giai đoạn 2 là giai đoạn gắn mồi và giai đoạn kéo dài chuỗi

+ Giai đoạn 3 là kết thúc

Quá trình PCR chỉ sử dụng những thành phần cơ bản của toàn bộ hệ thống sao chép phức tạp trong tự nhiên để sao chép một phân đoạn ngắn DNA trong ống nghiệm [12] Các cặp oligonucleotid mồi gắn đặc hiệu với một đoạn của chuỗi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung Hai chuỗi xoắn kép trong phân tử DNA khuôn được tách rời nhau bởi nhiệt độ Nhiệt độ cao phá vỡ các liên kết hydro giữa các đôi base Quá trình này gọi là quá trình biến tính Các cặp mồi sau đó liên kết bổ sung với chuỗi DNA khuôn và enzym DNA polymerase bắt đầu quá trình gắn các đươn vị deoxynucleotid vào vị trí 3'-OH của mồi để tạo thành các phân tử kẹp đôi mới Các mồi lại gắn vào khuôn theo nguyên tắc bổ sung và quá trình kéo dài sợi tiếp tục diễn ra Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân thành hai bản sao, và nếu chu kỳ được lặp lại liên tục 25 - 35 lần thì từ một DNA đích s được khuếch đại lên 225 đến 235 bản sao, tức là hàng tỷ bản sao [5][12][13]

 Phương pháp giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp

của các nucleotid trong phần tử DNA [72] Giải trình tự gen sử dụng máy giải trình

tự tự động [72]:

Máy giải trình tự gen tự động hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP Máy bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu Các vạch điện di trong mao quản s đi qua một chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu s ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G [72]

Ưu điểm của phương pháp xác định kiểu gen của SNP phương pháp bằng giải trình tự gen: kết quả chính xác, rõ nét, không cần thực hiện nhiều các thao tác kĩ thuật, quy trình kĩ thuật hiện đại do sử dụng hệ thống máy tự động

Hình 1.12 Giải trình tự gen bằng máy tự động [72]

1.4.4.2 Phương pháp cắt bằng enzym giới hạn (RFLP - Restriction fragment length polymorphism)

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzym giới hạn (Restriction Enzym, RE) Khi ủ DNA với enzym giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp với pH, nhiệt độ thích hợp s tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ

gen [12][70] Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các RE đối với

vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể s tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau [70]

 Trình tự nhận biết của enzym giới hạn (RE)

Mỗi một enzym giới hạn nhận biết một đoạn nucleotide khác nhau rất đặc hiệu đối với nó và được gọi là trình tự nhận biết (chuỗi đích) hay đoạn đọc ngược xuôi Enzym giới hạn mang tính đặc hiệu cao, mỗi enzym chỉ có thể nhận biết một đoạn trình tự đặc thù các cặp bazơ trên DNA Đoạn nhận biết phổ biến nhất có chiều dài

4 - 5 hoặc 6 nucleotide tương ứng với khoảng 44 = 256 cặp bazơ, 45 = 1024 cặp bazơ, hoặc 46 = 4096 cặp bazơ có khả năng lặp lại một lần trong cấu trúc chung của DNA Như vậy, RE nhận biết đoạn trình tự nucleotide s cắt phân tử DNA ngắn hơn các RE nhận biết đoạn trình tự 5 hoặc 6 nucleotide [9][12]

 Các kiểu cắt của RE

Hình 1.13 Enzym cắt tạo đầu dính và cắt tạo bằng [110]

Cắt tạo ra đầu bằng (blunt ends) (Hình 1.13): enzym giới hạn cắt đầu bằng

không tự nối các đoạn DNA lại với nhau Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa palindromic Để nối các đoạn DNA sau khi cắt cần sử dụng enzym nối ligase và các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzym [74]

Cắt tạo ra đầu dính (cohesive ends) (Hình 1.13): enzym giới hạn cắt đầu so le

tạo đầu dính Sau khi cắt chúng có thể tự nối lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung Đây là cơ sở của phương pháp tạo dòng gen, một phương pháp thúc đẩy sự phát triển của công nghệ di truyền [74]

 Ưu điểm của phương pháp RFLP

Phân tích RFLP dựa trên nguyên tắc đa hình vị trí giới hạn trong các phân đoạn DNA được nhân bản bởi kỹ thuật PCR Những phân đoạn như vậy có thể được phân tách bằng cách chạy điện di trên gel agarose, nhờ nhuộm màu gel bằng ethidium bromide, tính đặc thù của các đoạn này có thể được quan sát trực tiếp hoặc chụp ảnh qua máy soi DNA Số lượng và kích thước của các phân đoạn s phản ánh sự phân bố của những vị trí cắt trong phân tử DNA Sự hiện diện của các đoạn cắt này mang tính đặc trưng cho từng tổ hợp DNA/RE Người ta có thể sử dụng phương pháp xác định kiểu gen RFLP để đánh giá trực tiếp tính biến dị di truyền của sinh vật [74]

Phương pháp RFLP có ưu điểm: kỹ thuật đơn giản, kết quả rõ ràng, nhanh, tiết kiệm chi phí và độ tin cậy cao Kỹ thuật RFLP là công cụ hữu hiệu trong trường hợp cần xác định sự có mặt của đột biến tạo ra trong phản ứng PCR, mà đột biến này cấu thành vị trí cắt của enzym là sợi DNA khuôn ban đầu không có [74]

1.5 Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa di truyền học và liều thuốc acenocoumarol trên thế giới và trong nước

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Do khi hoạt động van tim nhân tạo được cơ thể nhận biết như một yếu tố lạ, do

đó s kích thích quá trình đông máu nội sinh gây việc hình thành nên các cục máu đông có nguy cơ gây tắc mạch và huyết khối Chính vì vậy, tất cả bệnh nhân sau thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông nhằm ngăn ngừa hình thành các cục máu đông, tránh nguy cơ gây tắc mạch hoặc huyết khối [1] Thuốc chống đông máu nhóm AVK có khoảng an toàn rất hẹp, nếu dùng liều thấp thì không đạt hiệu quả kháng đông, nhưng nếu quá liều s gây biến chứng chảy máu đe dọa tính mạng bệnh nhân [38]

Đã có nhiều nghiên cứu và hướng dẫn việc sử dụng thuốc chống đông sau thay van tim Theo nghiên cứu của Bourguignon và cs (2011) theo dõi 505 bệnh nhân thay van tim cơ học trong thời gian 8 năm thấy biến chứng gặp nhiều nhất

là tắc mạch và chảy máu có liên quan đến hoạt động của van [67] Tác giả Abhijit Trailokya và cs (2016) khuyến cáo liều sử dụng thuốc acenocoumarol từ:

4 - 8 mg/ngày từ ngày thứ hai và duy trì mức INR từ 3 - 4 là an toàn và hiệu quả [25] Nghiên cứu của Alec Vahanian và cs (2010) đã đưa ra được những chỉ định rất cụ thể về sử dụng thuốc chống đông sau mổ thay van và đề xuất mức INR cho bệnh nhân thay van tim cơ học từ 2,5 - 4 [71] Nghiên cứu của tác giả Nashimura

và cs (2014) trên 650 bệnh nhân thay van tim thấy có: 0,62% có tắc mạch và 0,95% chảy máu, dùng thuốc chống đông nhóm AVK liều từ: 1 - 2,5 mg/ngày có thể hạn chế được tắc mạch [89] Còn theo nghiên cứu của tác giả Isthyak Ashmed Mir (2015) thực hiện trên 127 bệnh nhân sử dụng thuốc chống đông máu acenocoumarol sau khi thay van tim cho thấy nếu bệnh nhân duy trì được mức INR hợp lý (thường từ 2,5 - 3,5) thì s không có nguy cơ tắc mạch và chảy máu [55] Một nghiên cứu khác Elbardissi và cs (2007) khảo sát trên 861 bệnh nhân thay van động mạch chủ cho thấy nếu sử dụng sớm thuốc chống đông máu thì dường như không thấy xuất hiện biến chứng tai biến huyết khối tắc mạch sau thay van [16]

Gen CYP2C9 nằm trên nhiễm sắc thể số 10 trong bộ nhiễm sắc thể người và nằm ở vị trí 10q23,33 Gen CYP2C9 có tính đa hình cao, một số SNP đa hình của gen CYP2C9 đã được chứng minh là có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính của enzym Sự phân bố tần số các alen của gen CYP2C9 phụ thuộc nhiều vào từng

chủng tộc [38]

Bảng 1.3 Tần số phân bố alen của gen CYP2C9 ở các quần thể người [38][67]

Châu Á (%)

Người da trắng (%)

Năm 1970 người ta phát hiện enzym Vitamin K epoxide reductase được mã

hóa bởi gen VKORC1 [17] Vitamin K epoxide reductase chịu trách nhiệm chuyển

hóa vitamin K epoxide reductase thành vitamin K tham gia vào quá trình đông máu

Một số đột biến trên VKORC1 có liên quan tới hiện tượng tăng nhạy cảm với

acenocoumarol Tần số phân bố alen của rs9923231 và rs9934438 trên gen

VKORC1 khác nhau ở các chủng tộc người khác nhau [23]

Bảng 1.4 Tần số phân bố alen của gen VKORC1 ở các quần thể người [23]

Trong một nghiên cứu gần đây, kết quả đã thấy có sự khác biệt trong liều đáp ứng của thuốc chống đông máu acenocoumarol liên quan tới đột biến -1639G>A ở quần thể người da trắng [48] Từ kết quả nghiên cứu này, người ta khuyến cáo, đối với bệnh nhân người da trắng mang một alen -1639A cần giảm 25% liều dùng thuốc acenocoumarol so với bệnh nhân không mang alen này, còn đối với bệnh nhân người da trắng mang hai alen -1639A cần giảm 50% liều dùng acencocoumarol so

với bệnh nhân không mang alen này [52] Đột biến -1639G>A liên kết chặt với đột

biến -1173C>T có liên quan tới biểu hiện hoạt tính enzym khác nhau ở các chủng tộc người khác nhau [48]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, kể từ ca thay van tim nhân tạo đầu tiên được thực hiện tại Bệnh viện Việt Đức vào năm 1979, cho đến nay, mỗi năm có hàng ngàn bệnh nhân được thay van tim tại nhiều bệnh viện/trung tâm tim mạch trên cả nước Tại Bệnh viện Tim Hà Nội, trong thời gian từ tháng 01/2006 đến tháng 12/2007 đã có 1.335 bệnh nhân được thay van tim Tại trung tâm Tim mạch Bệnh viện E, hàng năm thay van tim cho khoảng 1.000 bệnh nhân Viện Tim mạch Bệnh viện Bạch Mai cũng thực hiện gần 1.000 ca thay van tim mỗi năm Cũng giống như tại các nước trên thế giới, bệnh nhân sau khi thay van tim tại các trung tâm tim mạch của Việt Nam thường gặp nhiều các biến chứng sau thay van tim như kẹt van tim, hư van, nhưng phổ biến

và nguy hiểm nhất là huyết khối, tắc mạch do các cục máu đông hình thành trong quá trình hoạt động van tim nhân tạo [5][7]

Năm 2008, Hội tim mạch học Việt Nam đã đưa ra khuyến các về chuẩn đoán

và điều trị các bệnh van tim đã đưa ra các chỉ định điều trị ngoại khoa các bệnh van tim cũng như chiến lược điều trị sau thay van tim [6] Để hạn chế biến chứng của bệnh nhân sau phẫu thuật thay van tim bệnh nhân bắt buộc phải sử dụng thuốc chống đông máu cả đời Tại các trung tâm tim mạch của Việt Nam, thuốc chống đông máu nhóm AVK thường được sử dụng hiện nay có 2 loại: warfarin (Coumadin

2 mg) và acenocoumarol (Sintrom 4 mg) Tuy nhiên, acenocoumarol được dùng phổ biến hơn (ngoài sự lựa chọn của bệnh nhân và thầy thuốc còn do chế độ Bảo hiểm y

tế) Do khoảng an toàn của thuốc chống đông máu nhóm AVK rất hẹp, nên khi điều trị phải dò liều an toàn, đảm bảo đạt hiệu lực nhưng tránh được biến chứng chảy máu do quá liều vì vậy bệnh nhân phải theo dõi chỉ số INR thường xuyên để điều chỉnh liều dưới sự tư vấn của bác sĩ [30][50].

Tuy nhiên, hiện nay tỉ lệ bệnh nhân được theo dõi và INR đạt đích điều trị chỉ

có 21 - 44,8% Nguyễn Quốc Kính và Tạ Mạnh Cường (2011) nghiên cứu trên 200 bệnh nhân thay van tim cơ học tại Bệnh viện Tim Hà Nội thấy có 5 bệnh nhân tử vong, 8 bệnh nhân kẹt van và 5 - 7,5% bệnh nhân bị huyết khối, 18 - 23,6% bệnh nhân có biến chứng chảy máu, tỉ lệ đạt đích INR chuẩn hóa (INR: 2,5 - 3,5) chỉ đạt

30 - 33% Việc hướng dẫn dùng thuốc chống đông chưa được tốt với 27,3% bệnh nhân cho là không cần xét nghiệm đông máu và có tới 21,8% bệnh nhân không biết cần điều chỉnh liều thuốc chống đông theo giá trị INR Chỉ có 67,3% bệnh nhân ý thức được phạm vi đích điều trị INR nhưng 10% trong số đó hiểu sai giá trị đích INR [8]

Nghiên cứu của Hồ Thị Thiên Nga (2009) tại bệnh viện Việt Đức, trong số

180 bệnh nhân thì 40% không biết đích INR cần đạt [10] Hoàng Quốc Toàn và cs (2010) nghiên cứu trên 168 bệnh nhân sau thay van tim tại bệnh viện 108: có 60,1% bệnh nhân thay van hai lá và 25,6% thay van hai lá và van động mạch chủ Liều Sintrom cho bệnh nhân sau thay van từ 1/8 đến ¾ viên/ngày, trong đó có 42,9% bệnh nhân dùng liều 3/8 viên và 29,8% bệnh nhân dùng liều ¼ và 3/8 viên xen k Tác giả gặp: 20,2% bệnh nhân có biến chứng liên quan đến thuốc chống đông sau thay van tim trong đó xuất huyết là 19% và huyết khối gây kẹt van là 1,2%, vị trí xuất huyết nhiều nhất là xuất huyết dưới da (31,3%), chảy máu mũi miệng (37,5%)

và có 12,5% xuất huyết não Yếu tố liên quan đến biến chứng do thuốc chống đông là: bệnh nhân không uống thuốc thường xuyên và không kiểm tra định kì (đánh giá INR) [11]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân mắc bệnh van tim có chỉ định thay van tim:

+ Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân theo khuyến cáo của Hội Tim mạch học Việt Nam [6] và hướng dẫn điều trị bệnh van tim của Hội Tim mạch Hoa Kỳ [18]

+ Hồ sơ bệnh nhân gồm: lối sống và tiền sử dùng thuốc Thông tin thu thập bao gồm: các chỉ định điều trị, điều kiện kèm theo, loại thuốc, các hoạt động thể chất và đặc biệt là khẩu phần ăn các loại thực phẩm giàu vitamin K trong 1 tuần + Chỉ số đông máu INR được duy trì trong khoảng giới hạn mong muốn để đạt được liều điều trị acenocoumarol

- Kiểm tra khi tái khám:

+ Lâm sàng: kiểm tra xem bệnh nhân có triệu chứng quá liều hoặc chưa đạt liều hay không

+ Cận lâm sàng: cho bệnh nhân kiểm tra chỉ số INR Khi INR nằm trong giới hạn mong muốn tức là đã “đạt liều” thuốc chống đông

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng

- Bệnh nhân huyết động không ổn định

- Bệnh nhân tai biến mạch não dưới 3 tháng

- Bệnh nhân mới phẫu thuật dưới 1 tuần

- Bệnh nhân suy thận, suy gan giai đoạn cuối

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2017 đến tháng 2/2018

- Địa điểm lấy mẫu: Bệnh viện Tim Hà Nội

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội + Bệnh viện Tim Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang

- Cỡ mẫu nghiên cứu: trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện Đối tượng nghiên cứu được lựa chọn liên tiếp, thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân (mục 2.1.1) tại địa điểm được chọn là Bệnh viện Tim Hà Nội Những bệnh nhân này tự nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu

Số lu ợng bẹ nh nhân tối thiểu cần cho nghiên cứu đu ợc xác định bằng côngthức:

- Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT- Mỹ

- Lambda DNA/HindIII Marker, code: SM0103, hãng: Fermentas

- 6 X DNA loading dye, code: R0611, hãng: Thermo Scientific

- GeneRuler: Marker 100-4 kb Plus DNA (Lonza)

- dNTPs 2 mM each, code: R0241, hãng: Thermo Scientific

- Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) code:15701500GM, Affymetrix

- Nước khử ion (DDW), code: 16500100, hãng: Invitrogen

p(1-p)

d2

- Tris base, code: TB0196, hãng: Bio basic.

- Acid acetic, code: 100056, hãng: Merck

- Phusion DNA polymerase, hãng: Neb (New England Biolabs)

- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code : D3392, hãng: Omega-Biotek

- GeneJET PCR Kit, hãng: Thermo Fisher Scientific

2.3.2 Thiết bị

- Máy PCR Prime Thermal Cycler (code: 5PRIME/02, Anh)

- Máy khuếch đại DNA có gradient nhiệt, Mastercycler pro S, Eppendorf , Đức

- Máy ly tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen, Code: D78532, Đức

-Tủ an toàn sinh học cấp II, Model: AC2-4E8, ESCO 2016-113443, Indonesia

- Máy quang phổ thể tích nano, Nano Photometer-implen NP80, Đức

- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ

- Tủ ấm (Lab.Incubator, Digisystem Laboratory Instruments Inc.), Đài Loan

- Hệ thống điện di MultiSub Choice, Cleaver Scientific, Bỉ

- Máy chụp ảnh gel và xử lý hình ảnh điện di có màn hình, GelDoc-it2-UVP, Mỹ

- Tủ lạnh lưu mẫu sinh phẩm -300C, MDF-U334, Nhật

- Máy cô DNA, Model: CVE2200, Nhật Bản

2.3.4 Mẫu nghiên cứu

- Mẫu máu bệnh nhân được bảo quản trong chất chống đông EDTA ở -300C

- Áp dụng các biện pháp an toàn chung khi xử lý mẫu và thực hiện xét nghiệm theo quy trình về an toàn xét nghiệm