Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty thể trên bệnh nhân cơ não người Việt Nam

não giậ ơ ăng a id a i v gi tai biến mạch MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres ộng kinh giậ ơ với các s i ỏ xé rách MIDD Maternally inherited diabetes and deafness bệnh tiể

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH H C

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA H C:

1 PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa

2 PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội, 2013

L I C M ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa, người thầy tâm huyết đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án Người thầy đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất, luôn dành cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt quá trình làm nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi đến Thầy lời tri ân nhất về những điều mà Thầy đã dành cho tôi

i in ày tỏ lòng c ơn tới PGS Nguy n hị ân nh, đã ch ẫn và giúp đỡ t i trong qu tr nh thực hiện luận án

i in chân thành c ơn đến GS.TS Nguy n hanh Liê , Gi đốc Bệnh viện Nhi rung ương cùng c c B c sĩ Phạm Thị ân nh, B c sĩ rịnh Thúy Ngọc

đã nhiệt t nh giúp đỡ, cung cấp và chia sẽ thông tin về bệnh nhân trong quá trình thu thập mẫu nghiên cứu

Tôi xin chân thành c ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, rường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành c ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh –K NN, rường Đại học Quy Nhơn, c c thầy, cô giáo, các anh chị bạn è đồng nghiệp trong Khoa Sinh học, các thành viên trong nhóm nghiên cứu Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng Thí nghiệm trọng điể

ng nghệ n y và Prot in, rường Đại học Khoa học ự nhiên

i in gửi lời c ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng au Đại học, Ban hủ nhiệm Khoa Sinh học và c c Phòng chức năng của rường Đại học Khoa học ự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều iện cho t i học tập, hoàn thành c c thủ t c cần thiết của một nghiên cứu sinh

Luận n đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài NAFOSTED 106.06.123.09 và b n thân t i cũng đã được hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với tư cách là một nghiên cứu sinh của đề tài

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới c c ậc ố, chồng con, gia đ nh, những người đã lu n ên t i, cổ vũ, động viên và tạo điều iện thuận lợi nhất cho tôi

có thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận n

NCS Trương Thị Huệ

MỤC LỤC

Trang

LỜI M O N i

LỜI M N ii

M L iii

NH M K HI U V H VIẾT TẮT vi

NH M NG viii

NH M H NH V TH ix

MỞ ẦU 1

HƯ NG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U 5

1.1 CẤU TRÚC VÀ CHỨ NĂNG ỦA TY THỂ NGƯỜI 5

1.1.1 Cấu trúc của ty thể 5

1.1.2 Chứ năng ủa ty thể 7

1.2 H GEN TY THỂ VÀ SỰ DI TRUYỀN CỦA CÁC GEN TY THỂ 12

1.2.1 Hệ gen ty thể 12

1.2.2 Sự di truyền theo mẹ và thuyế “nú ổ chai di truyền” 16

1.2.3 Tính chấ h ng ồng nhấ v ngưỡng biểu hiện của ột biến 18

1.2.4 Tố ộ ột biến của DNA ty thể 20

1 3 T BIẾN TRONG H GEN TY THỂ NGƯỜI VÀ CÁC B NH LIÊN QUAN 21

1 3 1 ột biến iểm DNA ty thể 22

1 3 2 ột biến khác trên DNA ty thể 29

1.3.3 Các bệnh i n an ến rối loạn ty thể d ột biến gen nhân 33

1 4 PHƯ NG PH P PH T HI N T BIẾN GEN TY THỂ 35

1 4 1 ặ iểm chung của bệnh d ột biến gen ty thể 35

1 4 2 Ph n í h ột biến iểm DNA ty thể bằng PCR kết h p với RFLP 38

1 4 3 Ph n í h ột biến iểm bằng x ịnh trình tự gen 39

1 4 4 Ph n í h ột biến gen ty thể bằng một số phương ph p h 39

HƯ NG 2 NGUYÊN LI U V PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU 43

2.1 NGUYÊN LI U 43

2.1.1 Mẫu máu 43

2.1.2 Các hoá chất, nguyên liệu khác 43

2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT B 43

2 3 PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU 44

2 3 1 T h hiế N ổng số t mẫu máu 44

2.3.2 Tách chiết DNA plasmid 44

2.3.3 Kiể a v ịnh ư ng DNA tách chiết 45

2.3.4 Nhân b n ạn gen ty thể chứa ột biến bằng kỹ thuật PCR 46

2.3.5 Kỹ thuật PCR kết h p với kỹ thuậ a h nh hiề d i ạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) 46

2.3.6 Nhân dòng trực tiếp ạn gen chứa ột biến vào vector pGEM- T 47

2 3 7 Gi i nh ự ạn g n hứa ột biến 48

2 3 8 iện di DNA trên gel agarose 50

2 3 9 iện di DNA trên gel polyacrylamide 51

2 3 10 ịnh ư ng ột biến A3243G bằng kỹ thuật real-time PCR 52

2 3 11 ịnh ư ng acid lactic trong máu 56

HƯ NG 3 KẾT QU VÀ TH O LUẬN 57

3.1 PHÂN TÍCH Ặ TRƯNG ỦA B NH NHÂN CH N NGHIÊN CỨU T BIẾN GEN TY THỂ 57

3 1 1 ặ iểm về bệnh lý: 57

3 1 2 ặ iểm về tuổi và giới tính: 59

3.2 XÂY DỰNG CÁCH THỨC PHÁT HI N M T S T BIẾN IỂM TRONG H GEN TY THỂ 60

3.2.1 Tách chiết DNA t mẫ v nh gi ộ tinh sạch 60

3.2.2 Thiết kế các cặp mồi ặc hiệu và lựa chọn enzyme cắt cho kỹ thuật PCR-RFLP dùng ể phát hiện ột biến iểm trong hệ gen ty thể 61

3 2 3 X ịnh iều kiện thích h p cho phân tích PCR-RFLP 66

3 2 4 X y dựng ch thức phát hiện ột biến iểm trong DNA ty thể 72

3.3 SÀNG L S T BIẾN GEN TY THỂ Ở B NH NHÂN

NÃO 73

3.3.1 Sàng lọ ột biến A3243G bằng PCR-RFLP 73

3.3.2 Sàng lọ ột biến A8344G / mấ ạn 9 bp bằng PCR-RFLP 77

3.3.3 Sàng lọ ột biến T14728C bằng PCR-RFLP 82

3.4 SỰ BIỂU HI N CỦ T BIẾN GEN TY THỂ Ở MỨ GI NH 88

3.4.1 Nghiên cứ ột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS 88

3.4.2 Sự di truyền phân tử của ột biến mấ ạn 9 bp (nucleotide 8272-8280) 101

3.4.3 Sự di truyền phân tử của ột biến T14727C thuộc hội chứng ơ n 105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH 111

M T S ÔNG TR NH Ã ÔNG LIÊN QU N ẾN LUẬN ÁN 112

TÀI LI U THAM KH O 113

DANH MỤC C C HIỆU V CHỮ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulfate

Amp Ampicillin

ANT Adenine nucleotide translocase

bp Base pair (cặp azơ)

BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ hu nh quang)

COII Cyt c oxidase II

CoQ Coenzyme Q

CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia

(liệt mắ ơ ng i iến triển kinh niên)

ddH2O Deionized distilled H2O (nước cất loại ion, khử trùng)

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

EtBr Ethidium bromide

FAD+ Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng khử)

(liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber)

LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa)

MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes

(não giậ ơ ăng a id a i v gi tai biến mạch)

MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres

( ộng kinh giậ ơ với các s i ỏ xé rách)

MIDD Maternally inherited diabetes and deafness

(bệnh tiể ường v iếc di truyền theo mẹ)

MRI Magnetic resonance image

(hình nh chụp cộng hưởng t )

mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể)

nDNA Nuclear DNA (DNA nhân)

NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng khử)

NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos

(hội chứng gây liệt, mất sự iều hòa và viêm võng mạc

OD Optical density (mậ ộ quang học)

PCR Polymerase chain reaction (ph n ứng chuỗi polymerase)

PEO Progressive external ophthalmoplegia (liệ ơ ắt ngoài tiến triển) RFLP Restriction fragment length polymorphism

(sự a h nh ạn phân cắt giới hạn)

ROS Reactive oxygen species (dạng oxy ph n ứng)

SDS Sodium dodecylsulphate

TAE Tris -Acetate-EDTA

TBE Tris -Borate-EDTA

TEMED N N N’ N’- Tetramethyl-Ethylenediamine

Tm Melting temperature (nhiệ ộ nóng ch y)

X-gal 5-Bromo-4 chloro-3-indolyl--D galactopyranoside

DANH MỤC CÁC B NG

B ng 1.1 Các gen trong hệ gen ty thể 14

ng 2 1 Thành phần trong b n gel polyacrylamide 51

B ng 2.2 Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR 54

B ng 3.1 ặ iểm lâm sàng và tỷ lệ bệnh nhân bị ộng 57

B ng 3.2 Trình tự mồi và chế ộ nhiệt cho PCR 63

B ng 3.3 Enzyme giới hạn dùng ng ph n í h ột biến 69

B ng 3.4 Một số ột biến trong hệ gen ty thể ư c phát hiện ở bệnh nh n ơ n .86

B ng 3.5 Tỷ lệ ột biến A3243G của bệnh nh n v người thân trong các gia nh 94

B ng 3.6 Triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ ột biến A3243G của người con trong gia nh 98

DANH MỤC C C H NH

Hình 1 1 Các hình dạng khác nhau của ty thể 5

Hình 1 2 Cấu trúc của ty thể 6

Hình 1.3 Cấu trúc màng trong ty thể 7

Hình 1.4 Ty thể v nh a ổi năng ư ng trong tế bào 9

H nh 1 5 ơ hế của sự lão hoá theo thuyết ty thể 10

Hình 1.6 Sự tổng h p và nh hưởng của ROS trong ty thể 10

Hình 1.7 Hệ gen ty thể người 13

Hình 1.8 Thuyết nút cổ chai di truyền 17

Hình 2.1 Cấu trúc của nucleotide c i biến dạng LNA 53

Hình 2.2 Nguyên lý hoạ ộng của mẫu dò Taqman 54

Hình 2.3 Biểu ồ mộ ường biểu diễn khuế h ại (A) và biể ồ chuẩn về mối quan hệ giữa số b n N í h ó ng ẫu chuẩn và chu k ngưỡng ương ứng (B) 55

Hình 3.1.Tỷ lệ các nhóm tuổi của bệnh nhân 59

H nh 3 2 iện di s n phẩm DNA tổng số t mẫu máu của các bệnh nhân 60

H nh 3 3 iện di s n phẩ P R nh n ạn gen chứa ột biến t mẫu máu của bệnh nhân 67

H nh 3 4 iện di s n phẩm PCR - RFLP ạn gen chứa ột biến của các bệnh nhân 71

H nh 3 5 iện di s n phẩ P R nh n ạn gen 3134-3331 trong hệ gen ty thể của các bệnh nhân 73

H nh 3 6 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) của một số bệnh nhân nghi bị ột biến A3243G 73

H nh 3 7 iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi pUC19-Fw/pUC19-Rv (A) và cặp mồi MAG (B) của ột biến A3243G 75

H nh 3 8 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) kiểm tra s n phẩm

biến nạp chứa ột biến A3243G t khuẩn lạc trắng 75

Hình 3.9 So sánh trình tự n id ạn gen 3134-3331 của ty thể bệnh nhân 76

Hình 3.10 Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể chứa ột biến A3243G của ệnh nh n N4 76

H nh 3 11 iện di s n phẩ P R nh n ạn gen 8155-8366 trong hệ gen ty thể của các bệnh nhân 77

H nh 3 12 iện di s n phẩ P R ư c cắt bằng BanII của một số bệnh nhân 78

Hình 3.13 iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi

pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi MRAG (B) 79

Hình 3.14 So sánh trình tự n id ạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân (mẫu BN2, phụ lụ 2) nghi ang ột biến mấ ạn với trình tự gen chuẩn 80

Hình 3.15 Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể (8155-8366) 80

H nh 3 16 iện di s n phẩ P R ư c cắt bằng BanII của một số bệnh nhân 81

Hình 3.17 So sánh trình tự n id ạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân

(mẫu BN22, phụ lụ 2) nghi ang ột biến với trình tự gen chuẩn 82

Hình 3.18 Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể (8155-8366) chứa ột biến G8251A 82

H nh 3 19 iện di s n phẩm PCR nhân nh n ạn gen 14601-14753 trong hệ gen ty thể của các bệnh nh n 83

H nh 3 20 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng DraI) của một số bệnh nhân nghi bị ột biến T14728C 83

H nh 3 21 iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi ETC-Fw/ETC-Rv (B) 84

Hình 3.22 So sánh trình tự nucleotid ạn gen 14601-14753 của ty thể bệnh nhân (mẫu BN7, phụ lụ 2) nghi ang ột biến T14728C với trình tự gen chuẩn 85

Hình 3.23 Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể (14601-14753) chứa ột biến T14727 ở ệnh nh n N7 85

Hình 3.24 Ph hệ các gia nh ang ột biến A3243G 89

H nh 3 25 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) ạn g n ang ột biến A3243G của h nh vi n ng gia nh ệnh nhân 90

Hình 3.26 So sánh trình tự ạn gen chứa ột biến A3243G t các thành viên của gia nh N42 ( ) v gia nh N58 ( ) 91 Hình 3.27 Biể ồ khuế h ại ằng a - i P R ạn gen ty thể ang ột biến 3243G ử dụng N h h nh vi n ủa 5 gia nh ệnh nh n v p a id ang ạn g n ở nồng ộ h nha 95

H nh 3 28 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng BanII) ạn g n ang ột biến

mấ ạn của h nh vi n ng gia nh ệnh nh n ang ột biến 102 Hình 3.29 So sánh trình tự ạn gen chứa mất ạn 9 bp t các thành viên của gia nh N15 102 Hình 3.30 Ph hệ của hai gia nh ệnh nh n ang ột biến T14727C 105

H nh 3 31 iện di s n phẩm PCR-RFLP ạn g n ang ột biến T14727C của các

h nh vi n ng hai gia nh ệnh nhân 106 Hình 3.32 So sánh trình tự ạn gen chứa ột biến T14727C t các thành viên của gia nh N7 ( ) v gia nh N50 ( ) 107 Hình 3.33 Cấu trúc bậc 2 của RNA vận chuyển acid glutamic ở ty thể người và vị

í ột biến T14727C 108

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ty hể bào quan ó ặ ng hầu hết ế nhân chuẩn với chứ năng chính là s n xuấ năng ư ng dưới dạng ATP cho tế bào Ty thể tạo ra năng ư ng bằng cách oxy hóa các acid hữ ơ v a id é thông qua quá trình phosphoryl hóa oxy hóa x y ra bên trong ty thể ATP là nguồn năng ư ng lớn ư c sử dụng cho tất

c nh a ổi chất cần thiết bên trong tế bào

Ty thể có hệ gen riêng, có cấu trúc s i i, DNA mạch vòng với í h hước 16.569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide của chuỗi vận chuyển iện

tử, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA) khác nhau liên quan

ến hoạ ộng chứ năng ủa y hể So với DNA của nhân tế bào thì DNA của ty thể dễ bị tổn hương d ty thể là một i ường giàu chất oxy ph n ứng và do thiếu

ơ hế sửa chữa hiệu qu dẫn ến nhiề ột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể Nă

1988, Wallace và tập thể ng ố ột biến iể ầu tiên trên hệ gen ty thể người gây bệnh i n an ến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (L ’ h di a y optic neuropathy - LHON) Sự mấ ạn N ũng ư c tìm thấy ở ơ ủa bệnh nhân liệ ơ ắt ngoài tiến triển mãn tính (chronic progressive external ophthalmoplegia - CPEO) và hội chứng Kearns-Sayre (KSS) ũng ư c phát hiện vào cùng nă 1988 h ến nay hơn 300 ột biến khác nhau trong hệ gen ty thể người ư x ịnh, trong ó ó hơn 200 ột biến có kh năng g y ệnh và kèm theo nhiều hội chứng khác nhau

Gần như ất c các tế ều dựa vào nguồn năng ư ng ổn ịnh do ty thể cung cấp, d ó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn a

hệ thống nh hưởng ến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và tổ chức Các bệnh do

ột biến gen ty thể có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi với diễn biến khác nhau Mứ ộ nghiêm trọng của bệnh ty thể ăng h ộ tuổi và tỷ lệ DNA ty thể (mtDNA) ột biến có mặt trong các mô bị ộng Biểu hiện lâm sàng do các rối loạn ty thể thay

ổi rất lớn, có thể i n an ến nhiề ơ an phức tạp hoặ ặ ưng h ng mô Các triệu chứng lâm sàng hay thấy ở n ơ ắt và giác quan Các triệu chứng ó

có thể kết h p với nhau trong các hội chứng riêng biệ như hội chứng KSS, hội chứng não giậ ơ è h i ơ ỏ xé rách (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres – MERRF), hội chứng não giậ ơ ăng a id a i v gi tai biến mạch (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes – MELAS) hoặc viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh (hội chứng Leigh) Tuy nhiên các triệu chứng ó ũng ó hể không nằm trong một bệnh c nh cụ thể nào, mộ v i ột biến thể hiện kiể h nh ương ự nhau làm cho việc chẩn n ệnh dựa trên lâm sàng trở nên rấ hó hăn Vì vậy bệnh d ột biến gen ty thể hó ó ư c những chẩn n chính xác nếu chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng và các chỉ tiêu cận lâm sàng Hiện nay, phân tích DNA là những phương ph p hiện ại nhất cho phép phát hiện nhanh v hính x ột biến gen gây bệnh Nghiên cứ ột biến trong hệ gen ty thể cho phép phát hiện ra nguyên nhân của nhiều bệnh khác nhau

Hiện nay, trên thế giới ó nhiều công trình nghiên cứu về bệnh d ột biến gen ty thể Tuy nhiên, do tính phức tạp ng ộng lâm sàng, mô bệnh học,

ơ hế phát sinh và biểu hiện bệnh nên sự sai sót trong hệ gen ty thể ở nhiều bệnh nhân vẫn hưa ư c phát hiện v h ng ó phương ph p iều trị hiệu qu

Ở Việt Nam, bệnh d ột biến gen ty thể òn í ư c nghiên cứu, h ến nay chỉ mới có một vài công trình mang tính chất khởi ầu trong phát hiện bệnh ty thể ở mứ ộ gen và protein ặc biệ hưa ó ng nh n i nghi n ứu

mứ ộ h ng ồng nhất (heteroplasmy) của ột biến gen ty thể ũng như ự liên quan giữa mứ ộ h ng ồng nhất với triệu chứng lâm sàng của bệnh

ề tài luận án của húng i ư ặt ra với mục tiêu áp dụng và thiết lập phương ph p phân tích chính xác v x ịnh mứ ộ h ng ồng nhất một số ột biến gen ty thể ở các bệnh nh n người Việt Nam nhằm góp phần vào công tác khám

và iều trị các bệnh do rối loạn hệ gen ty thể

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Xây dựng ư c cách thức phát hiện một số ột biến gen ty thể phổ biến và sàng lọc ột biến gen ty thể này ở bệnh nh n ơ n (encephalomyopathy)

- Thiết lập ư c phương ph p x ịnh mứ ộ h ng ồng nhấ của một loại ột biến gen ty thể (MELAS) ể ướ ầu tìm hiểu mối liên quan giữa ứ ộ

h ng ồng nhấ và tình trạng bệnh lý

3 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu của đề tài:

Các bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể ến h v iều trị tại Bệnh viện Nhi T ng ương

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Thu thập mẫu bệnh phẩm và tách chiết DNA tổng số t các bệnh nhân nghi

bị bệnh do rối loạn ty thể ến h v iều trị tại Bệnh viện Nhi T ng ương

- Thiết kế mồi ặc hiệu và lựa chọn enzyme giới hạn phù h p cho việc sàng lọc phát hiện ột biến gen ty thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP

- Xây dựng cách thức phát hiện một số ột biến gen ty thể phổ biến và áp dụng cách thức thiết lập ư c ể sàng lọ ột biến này ở người Việt Nam, nghiên cứ ột biến gen ty thể ở mứ ộ gia nh

- ịnh ư ng số b n a ang ột biến bằng phương ph p a -time PCR sử dụng mẫu dò hu nh quang c i tiến, tìm hiểu sự liên quan giữa mứ ộ h ng ồng nhất và tình trạng bệnh lý của một loại ột biến gen ty thể

4 Địa điểm thực hiện đề tài

Các nghiên cứu của luận n ư c thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng iểm Công nghệ Enzy v P in T ường ại học Khoa học Tự nhi n ại học Quốc gia Hà Nội

5 Đóng góp mới của đề tài

- ã thiết lập ư c cách thức phát hiện 15 loại ột biến iểm trong hệ gen ty thể ở người Việt Nam bao gồm: các ột biến T3271C và T3291C (hội chứng MELAS); A8344G và T8356C (hội chứng MERRF); G11778A, G3460A và T14484C (hội chứng LHON); T8993G/C và T9176G (hội chứng Leigh), A1555G (hội chứng iếc) v ột biến G4298A, T10010C, T14727C, T14728C và

T14709C (hội chứng ơ n nói h ng)

- Thiế ập ư phương ph p ph hiện v ịnh ư ng ứ ộ h ng ồng nhấ ủa ộ iến 3243G h ộ hội hứng MEL S v ướ ầ h hấy ối liên quan giữa mứ ộ h ng ồng nhấ và tình trạng bệnh lý

- L ng nh ầu tiên phát hiện thấy ột biến mới T14727C trên gen MTTE mã hóa cho tRNAGlu ở bệnh nh n ơ n

6 Ứng dụng thực tiễn của đề tài

Cách thức phát hiện các ột biến gen ty thể ư c tạo ra trong nghiên cứu này có thể dễ dàng phát triển h nh y nh ể áp dụng vào việc xét nghiệm bệnh do rối loạn ty thể ở các bệnh viện

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CẤU TRÚC V CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƯ I

1.1.1 Cấu trúc của ty thể

Ty thể là bào quan có ở hầu hết các tế bào nhân thật, bắ ầ ư c nghiên cứu t giữa thế kỷ XIX Nă 1857, nhà gi i phẫu họ người Thụy Sĩ K i ần

ầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế ơ Hơn a ươi nă a (1890), nhà

mô họ người ức, Richard Altmann, bằng phương ph p nh ộm fuchsine an sát ư c ty thể ở nhiều tế h nha dưới kính hiển vi quang học

Hình dạng ặ ưng ủa ty thể là thon dài với ường kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm (hình 1.1 A) Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào, ty thể có hình dạng v í h hước khác nhau (hình 1.1 B, C) Ty thể có kh năng hay ổi

í h hước, hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấ ú d i hơn h ặc phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn Ng i a, ty thể có kh năng di h yển ể

ph n ứng với những hay ổi sinh lý trong tế bào [30]

Hình 1 1 Các hình dạng khác nhau của ty thể [30]

A: Dạng thon dài, B và C: Dạng biến ổi Trong tế bào, ty thể nằm r i rác ở nguyên sinh chấ nhưng ũng ó hể nằm tập trung ở khu vực cần nhiề năng ư ng như i ủa tinh trùng Số ư ng của ty thể ở một tế ũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng ư ng của tế ó ó thể t vài ty thể ở tế da h ến vài nghìn ty thể ở tế ơ [30]

Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong, ương ự như màng sinh chất Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong, khoang giữa hai ng ư c gọi là xoang gian màng Màng trong ty thể ăn v chất nền tạo thành các ăng ư c [16, 38]

Hình 1 2 Cấu trúc của ty thể

[http://micro.magnet.fsu.edu/cells/mitochondria/mitochondria.html]

Màng ngoài ty thể ó ộ d y 6 n ng ó p in hiếm kho ng 60% và lipid chiếm kho ng 40% Màng có nhiều protein lỗ (porin), kênh ion cho phép các chất với khối ư ng phân tử lớn ến 10 kDa và các ion di chuyển tự do t ngoài nguyên sinh chấ v x ang gian ng v ngư c lại Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase [16] Màng trong của ty thể ũng ng ip p in ó ộ dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và mộ ư ng nhỏ cholesterol Tỷ lệ giữa cholesterol/phospholipid là 1/53 Màng trong ăn v hất nền tạo nên các ăng ư c Cấ ú “ ” ăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần

so với màng ngoài và iề n y i n an ến chứ năng của nó là ăng ường vận chuyển iện tử và tổng h p ATP Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ ộng ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và

H+ M ng ng nơi ủa 5 phức h p thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển iện tử (phức h p I-IV), ATP synthase (phức h p V, còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine nucleotide translocase (ANT) [16, 38]

hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trong quá trình tự chết của tế bào (apoptosis)

Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty thể Như vậy, ở tế bào ộng vật, thực vậ v người ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen

tế bào chất nằm trong ty thể [16, 38]

Khi ạ í h hước lớn tối a y hể tiến h nh ph n i tạo ra hai ty thể mới

T ước tiên, hệ gen ty thể ư c sao chép ể ăng ố ư ng b n a Sa ó ng trong thắt lại rồi ến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra Tuy nhiên, nhiều ty thể h ng ph n i v ị phân hủy ng yz h ơ hế tự tiêu (autophagy)

ơ hế này giúp duy trì số ư ng ty thể ặ ưng ng ột tế bào [30]

1.1.2 Chức năng của ty thể

1.1.2.1 y thể và qu tr nh trao đổi năng lượng trong tế ào

Ty thể là bào quan s n xuấ năng ư ng cho tế bào bằng cách oxy hóa các

h p chất hữ ơ tạo ra CO2, H2O và gi i phóng toàn bộ năng ư ng (hình 1.4) Các

ph n ứng n y ư c xúc tác bởi các phức h p của chuỗi hô hấp I, II, III và IV nằm ở màng trong của ty thể [36, 61] Nguồn tạ a năng ư ng trong ty thể là

carbohydrate, chất béo và protein ư c lấy t thứ ăn ng ó hủ yếu là carbohydrate Các h p chấ n y ư c oxy hóa ể tạo ra các chất khử gi năng

ư ng a ó ương ư ng khử ư c chuyển h nh năng ư ng dự trữ ở dạng liên kế ph pha a năng ng TP thông qua n ường hóa thẩm Có hai giai

ạn tạo ra ATP ở ty thể ó h nh K diễn ra trong chất nền và quá trình phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển iện tử nằm ở màng trong ty thể với sự xúc tác của các phức hệ enzyme

Các h p chất carbohydrate, chủ yếu là glucose ư c phân cắt và biến ổi qua

nh ường phân (glycolysis) tạo thành s n phẩm cuối cùng là pyruvate, một ít năng ư ng ATP và chất khử NADH Pyruvate sau khi ư ưa v y hể thì bị oxy hóa decarboxyl hóa ể tạo thành acetyl-CoA (acetyl-CoA có thể t quá trình oxy hóa acid béo) và tiếp tụ ư c oxy hóa hoàn toàn trong chu trình Krebs ể tạo thành CO2, H2O và năng ư ng gi i phóng chủ yếu ư c tích trữ dưới dạng ATP Trong quá trình oxy hóa các h p chất thông qua h nh K iện tử và proton

H+ ư c tách ra và chuyển ến các phân tử nhận iện tử là NAD+

và FAD trong chuỗi vận chuyển iện tử ể tạo thành NADH và FADH2 Chuỗi vận chuyển iện tử gồm 4 phức h p bao gồm nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase (NADH-CoQ reductase) (phức hệ I), succinate CoQ reductase (phức hệ II),

ubiquinol cytochrome b reductase (phức hệ III), cytochrome c oxidase (phức hệ IV)

và hai phân tử vận chuyển iện tử giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ)

và Cyt c Phức hệ I và II xúc tác cho sự nhận iện tử của CoQ t NADH và succinate Phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển iện tử t Q ến Cyt c Cuối cùng phức hệ IV xúc tác sự vận chuyển iện tử t Cyt c tới chất nhận cuối cùng là

oxy phân tử Ở mỗi ước, iện tử i a phức hệ năng ư ng ư c gi i phóng

ra kèm theo việc ơ các proton (H+) t chất nền qua màng trong ra xoang gian màng và làm xuất hiện iện thế màng Nhờ thế, hệ thống ATP synthase hoạ ộng

và tổng h p ATP t ADP và ph pha v ơ (Pi)

ATP là nguồn năng ư ng lớn ư c sử dụng cho tất c nh a ổi chất cần thiết bên trong tế bào [37, 73] ó khi ty thể bị tổn hương quá trình

s n inh a năng ư ng ể cung cấp cho tế v ơ hể bị chậm lại, thậm chí bị

ng ng lại hoàn toàn

Hình 1.4 Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [100]

Gần như ấ ế ề dựa v ng ồn năng ư ng ổn ịnh d y hể

ng ấp d ó ự ổn hương ủa y hể ó hể g y a ự ối ạn a hệ hống, nh hưởng ến nhiề ại ế nhiề ại v ơ an T iệ hứng ủa ệnh y hể

h ng giống nha ởi v người ệnh ó hể ó ộ hỗn h p y hể nh hường ẫn

y hể ộ iến với ự ph n ố i ng ng ơ hể i hi ố y hể nh hường ủ

ể ù ắp h những y hể ị ộ iến [38]

1.1.2.2 Ty thể và quá trình lão hóa

Lão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, x y ra tất yế ng ơ hể sinh

vậ v h ng i n an ến ơ hế tế bào chết h hương nh (apoptosis)

Thuyết gốc tự d i n an ến lão hoá lần ầu tiên ư ề xuất bởi Harman

v nă 1956 Thuyết này cho rằng ty thể là nguồn gốc của phần lớn các dạng oxy

ph n ứng ROS (reactive oxygen species,hình 1.5) Theo thuyết này, những tổn hương í h ỹ theo tuổi ng N ng y n nh n i è với những rối loạn chứ năng y hể, dẫn tới việc s n xuất nhiều ROS và phá huỷ mtDNA Kh năng ạ năng ư ng ATP của ty thể gi v ăng nh xy h hư hại cấu thành tế bào [38, 63, 84]

Hình 1.5 Cơ chế của sự lão hoá theo thuyết ty thể [54]

Hô hấp tế bào là nguyên nhân sinh ra các gốc tự do gắn liền với b n chất của

sự sống Sự hô hấp tế bào về b n chất là sự chuyển iện tử t chấ dinh dưỡng ến oxy phân tử thông qua phức hệ các enzyme vận chuyển iện tử trong ty thể Hơn 95%

O2 ư c tiêu thụ bởi ty thể và biến ổi ể tạo thành H2O ở cytochrome oxidase(phức hệ IV của chuỗi hô hấp) Kho ng 2-4% O2 nhận iện tử ở các mức khác nhau

và trực tiếp tạo ra các gốc tự do oxy ph n ứng (gốc superoxide – O.-2, peroxide hydro – H2O2 và gốc hydroxyl ph n ứng – OH-,hình 1.6) Các gốc tự do có hại khi

có mặt mộ ư ng lớn v h ng ư c trung hòa bởi các chất chống oxy hóa Các gốc tự do này có thể làm tổn hương màng tế bào, DNA và các enzyme của quá trình phosphoryl hóa oxy hóa [38]

Hình 1.6 Sự tổng hợp và ảnh hưởng của ROS trong ty thể [15]

Trong số ROS h ộc hại nhất là gốc HO*, vì nó là gốc tự d iển hình

có kh năng h ạ ộng khá mạnh ROS có thể tác dụng lên các chất có khối ư ng phân tử lớn theo cách liên ứng, chúng lần ư t tạo ra các gốc tự do t các phân tử bị tấn công nối tiếp nhau, gốc tự d a ư c tạo thành t các phân tử ước và khuế h ại tác dụng tấn ng an ầu

Gốc tự do có thể phá rách màng tế bào khiến chấ dinh dưỡng thất thoát, tế

h ng ăng ưởng h ng ư c sửa chữa và chết ROS phá hủy hoặ ngăn n

sự tổng h p p in ipid ường, tinh bột, enzyme trong tế bào, làm cho collagen, elastin mấ ính n hồi khiến da nhăn nh ơ hớp cứng nhắc

ROS và các gốc tự do g y a ột biến gen, ăng ự h nh h nh v í h ũy

ột biến DNA ty thể ở các mô trong quá trình lão hóa ồng thời các gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại việc loại th i chất bã và tiếp nhận chất dinh dưỡng; ROS tấn công ty thể, lạp thể khác và phá vỡ nguồn cung cấp năng ư ng, các gốc tự do làm gi m kh năng iều hòa và hoạt tính xúc tác của enzyme dẫn ến

ơ hể h ng ăng ưởng ư Gốc tự do là nguyên nhân của sự tự huỷ hoại, sự lão hoá ở cấp ộ tế bào [38, 42, 63]

mtDNA ịnh vị ở màng trong ty thể ư c xem là thuận l i cho quá trình hô hấp nhưng ại rất gần với bộ phận s n sinh ra ROS Gốc tự do superoxide tấn công trực tiếp vào DNA của tế bào hoặc làm xuất hiện các gốc tự do thứ phát có kh năng ấn công DNA và protein Theo thuyết ty thể về lão hoá, việc tích luỹ những tổn hương ở các thành phần bên trong ty thể bao gồm mtDNA, protein, lipid làm

nh hưởng ến chứ năng của ty thể Nói chung, những tổn hương của mtDNA trong phạm vi rộng với thời gian dài dẫn ến ty thể bị rối loạn, thậm chí ng ng hoạt ộng là nguyên nhân làm cho tế bào chế v ơ hể bị lão hoá

1.2.2.3 Ty thể và quá trình tự chết của tế bào (apoptosis)

Ty thể óng vai ò h n hốt trong quá trình tự chết của tế bào y là một

quá trình quan trọng trong sự phát triển v iều hành mô của sinh vậ a

Chết tế h hương nh ó i n an ến 1.500 gen phân bố trong nhân và ty thể [76, 103] Tuy nhiên, vai trò của ty thể ng “ hế h hương nh”

rất phức tạp và hưa ư c biế ến ầy ủ; có thể quá trình tạ năng ư ng của ty thể có liên quan tới “ hế h hương nh”; có thể do chuỗi hô hấp của ty thể tạo

ra s n phẩm phụ là các dạng ROS và d ơ hế sửa chữa của hệ gen ty thể kém nên

1967 ến nă 1981 nd n ng ố nh ự v ấ ú ủa hệ g n y hể

người [9, 16]

mtDNA người tồn tại ở dạng mạch vòng, s i i ó í h hước 16.569 bp, bao gồm 37 gen (b ng 1.1) mã hóa cho 2 phân tử rRNA, 22 phân tử tRNA và 13

phân tử protein là thành phần cần thiết trong các phức h p của chuỗi hô hấp

ND1-ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu ơn vị của phức hệ I (NADH–ubiquinone

oxidoreductase), cytochrome b (Cyt b) là tiể ơn vị của phức hệ III chỉ ư c mã hóa bởi mtDNA (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX1-3 (COI-COIII)

mã hóa cho 3 tiể ơn vị của phức hệ IV (cytochrome c oxidase-COX), các gen

ATP 6 và ATP 8 mã hóa cho 2 tiể ơn vị của phức hệ V, chính làATP synthase

(hình 1.7) Các phân tử protein còn lại của chuỗi hô hấp ư c mã hóa bởi gen nhân,

ư c dịch mã trong tế bào chất a ó ư c vận chuyển vào bên trong ty thể [56]

ặc biệt, hệ gen ty thể chứa ít trình tự không mã hóa xen kẽ giữa các vùng mã hóa D-loop nằm giữa gen tRNAPhe (MTTF) và tRNAPro (MTTP), dài kho ng 1,1 kb là

vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng iều hòa quá trình sao chép

và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng (chuỗi H), chuỗi nhẹ (chuỗi L) và chứa iểm khởi ầu của quá trình tái b n Có một số

ạn ngắn và cặp base của hệ gen ty thể không liên quan trực tiếp ến sự mã hóa cho RNA hoặc protein (chẳng hạn như n id ad nin ở vị trí 7517 và trình tự 5

bp t 5580–5586 giữa gen mã hóa tRNA vận chuyển Trp và tRNA vận chuyển Ala) D-loop chứa 3 ạn ngắn HVS-I, HVS-II và HVS-III ương ứng với HVR1, HVR2

và HVR3 ở một vài loài Chứ năng ủa vùng n y hưa ư c biế ầy ủ nhưng dường như húng an ọng ối với quá trình tái b n và phiên mã của hệ gen Hai gen mã hóa cho rRNA (rRNA 12S và 16S) và 22 gen mã hóa h 22 RN ư c nằm giữa các gen mã hóa cho protein Các gen này cung cấp các RNA cần thiết cho

sự tổng h p protein bên trong ty thể a ố h ng in ư c mã hóa trên chuỗi nặng, gồm các gen mã hóa cho 2 rRNA, 14 tRNA và 12 chuỗi polypeptide Các gen trên chuỗi nhẹ mã hóa cho 8 tRNA và 1 chuỗi polypetide

Hình 1.7 Hệ gen ty thể người

Các gen mã hóa các tiể ơn vị của phức I (ND1-ND6 và ND4L) có màu xanh, Cyt c oxydase (COI-COIII) ó ỏ, Cyt c của phức hệ III có màu xám và các tiể dơn vị của ATPase synthase (ATPase 6 và 8) có màu vàng; 2 rRNA (rRNA 12S và 16S) có màu tím

v 22 RN ó n [100]

Bảng 1.1 Các gen trong hệ gen ty thể [16]

MTATP6 8527–9207 ATPase 6 của ATP synthase (phức h p V)

MTATP8 8366–8572 ATPase 8 của ATP synthase (phức h p V)

MTCO1 5904–7445 Tiể ơn vị I của Cyt c oxidase (phức h p IV)

MTCO2 7586–8269 Tiể ơn vị II của Cyt c oxidase (phức h p IV)

MTCO3 9207–9990 Tiể ơn vị III của Cyt c oxidase (phức h p IV)

MTCYB 14747–15887 Apocytochrome b subunit of ubiquinol (phức h p III)

MTND1 3307–4262 ND1 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND2 4470–5511 ND2 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND3 10059–10404 ND3 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND4 10760–12137 ND4 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND4L 10470–10766 ND4L của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND5 12337–14148 ND5 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND6 14149–14673 ND6 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

Khác với DNA nhân (nDNA), mtDNA không liên kết với protein histone, iều này làm cho mtDNA giống DNA của vi khuẩn DNA ty thể không có intron (ngoại tr một số nucleotide không mã hóa ở giữa một vài gen) và có các gen nằm gối lên nhau

Hệ g n y hể a hép ộ ập với hệ g n nh n ằng ộ hệ hống i ng trong ty hể nhưng enzyme cho quá trình i n ại d hệ g n nh n hóa Q

nh phi n v dị h ủa N ư iề hiển ởi g n nh n Hệ g n y hể

ư phi n ộ iể hởi ầ nằm trên vùng D-loop, n phi n a ó

ư nd n a ph n ắ ể h nh h nh n n ph n ử RN rRNA 12S và 16S, RNA thông tin (mRNA) iền h n Ph n ử RN h n hiện ủa y hể h ng

ư gắn ũ nhưng ư gắn i p y [9]

iểm khởi ầu sao chép (origin) ở hai mạch H và L là khác nhau và duy nhất Quá trình sao chép của ty thể vẫn là một vấn ề ang ư c nghiên cứu và bàn luận

T ng ó hai h nh hiế ư hế là tái b n chuyển vị (displacment replication),

ng ó ạch mới bổ sung với mạ h H ư c tổng h p gần hoàn thiện thì mạch mới

bổ sung với mạch L mới bắ ầu tổng h p; tái b n đồng thời (symmetric

p i a i n) ng ó hai ạch mới ư c tổng h p ồng thời [23]

Ty thể người có hệ thống dịch mã riêng với các mã di truyền ặc biệt là mã khởi ầu và mã kết thúc có nhiề iểm khác biệt so với các mã di truyền của hệ gen nhân Ở N người, bộ ba UGA chỉ mã hóa cho tryptophan mà không ph i là bộ

ba kết thúc, AUA mã hóa cho methionine mà không mã hóa cho isoleucine, AGA

và AGG là các bộ ba kết thúc, AUA và AUG là các bộ ba khởi ầu Gen COI và

URF6 có mã kết thúc là AGA và AGG hay gen ATP6 có mã khởi ầu là GUG [9]

C 22 phân tử tRNA do hệ gen ty thể hóa ều tham gia vào quá trình tổng h p các protein Ở người, các nhà nghiên cứu không tìm thấy hiện ư ng phân tử tRNA

do hệ g n nh n hóa i nguyên sinh chất vào ty thể ể tham gia tổng h p protein [49] Tuy nhiên, ở một số ối ư ng h như nấm men, hiện ư ng này có

x y a v hướng nghiên cứ ơ hế vận chuyển tRNA t tế bào chất vào ty thể ở ối

ư ng trên mở ường h phương ph p ưa RN nh hường vào ty thể của người ể iều trị các bệnh i n an ến ột biến trên gen tRNA của ty thể [89]

Các tế người có thể chứa hàng ngàn b n sao mtDNA trong một tế bào và

có số ư ng da ộng tùy thuộc vào nhu cầu sử dụng năng ư ng của t ng loại tế

bào Số b n sao mtDNA gi m nhiều lần trong quá trình tạ inh ùng nhưng dường như ăng ột ngột trong quá trình tạo trứng Số ư ng b n sao N hay ổi rất lớn ở h nha v ư c kiểm soát nghiêm ngặt trong thời k ầu của quá trình phát triển của ộng vật Số b n sao N ăng hi nh a ổi chất ăng [16]

1.2.2 Sự di truyền theo mẹ và thuyết “nút cổ chai di truyền”

Sự di yền ủa các gen trên N ự di yền a ế hấ ối với

g n nằ ng nh n ủa ế inh vậ nh n h ẩn húng n h y

ậ h ạ ộng ủa nhiễ ắ hể ng ơ hế ph n Nhưng hệ g n y hể ại

h ng n h những y ậ ó ính ạng d húng x ịnh ó những

iể di yền i ng ặ ưng h húng Giống như ấ N ng i nh n

N ư di yền h ẹ Người ẹ yền hệ g n y hể h người n

và hỉ ó những người con gái ới yền hệ g n ó h hế hệ iếp h o

Ở người ế ứng ó ấ nhiề y hể h ng hơn 100 000 n a ng

hi ó inh ùng hỉ hứa h ng 100-1.500 n a ập ng ở i inh ùng Khi hụ inh nh n inh ùng i v ứng òn i inh ùng ụng a ế inh ùng hỉ óng góp hệ g n nh n h ế ứng hứ h ng óng góp hệ g n y hể

ó gần như h ng ó y hể ủa inh ùng i v ng ứng nhưng nế ó h

ế ứng ó ơ hế i diệ y hể n y V vậy y hể ng h p ử ới ạ thành hoàn toàn là ủa ế ứng v ấ ính ạng ư hóa n hệ g n

y hể ư di yền ẹ ang n [16] Tuy nhiên, ối ạn ủa N

h ng ph i n n ư di yền h ẹ Mộ v i ộ iến iể x ấ hiện ở

ứ ộ hể v hỉ ở ộ ố Mấ ạn với í h hướ ớn ng N hường x y a ngẫ nhi n v h ng ư ph hiện ở người ẹ h ặ hế hệ con cái [92] Th hống h ng 2/3 ệnh i n an N hứa ộ iến ư di yền h ẹ òn 1/3 ối ạn ở dạng ngẫ nhiên [22]

ột biến N ư c truyền t mẹ sang con nhưng ỷ lệ số b n sao mang

ột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang ột biến trong một ph hệ gia nh ũng ó ự hay ổi về tần suấ ột biến vì vậy mứ ộ biểu hiện bệnh ở mẹ và các con có thể rất khác nhau Sự hay ổi tỷ lệ ột biến trong số các con của mộ người phụ nữ ư x ịnh ở giai ạn ầu trong quá trình tạo trứng ở người mẹ ước

hi h nh h nh n n ầu tiên Các nghiên cứu ở nhiều ph hệ cho rằng ơ hế

ương ự ũng h ạt ộng trong quá trình truyền ột biến mtDNA gây bệnh [23] Một nghiên cứ x ịnh tỷ lệ ột biến ở 82 n n ơ ấp t buồng trứng ắt bỏ của mộ người phụ nữ ang ột biến A3243G cho thấy tần suất phân bố của ư ng

ột biến ng n n như dự n h “ h yết nút cổ hai” ó nhiều noãn bào có tỷ lệ ột biến lớn hơn tỷ lệ trung bình và nhiều noãn bào có tỷ lệ ột biến nhỏ hơn (tỷ lệ ột biến A3243G trung bình trong nghiên cứu này là 12%) iều này chứng tỏ rằng tỷ lệ ột biến 3243G ng n n ơ ấp của người n

n y ư c quyế ịnh bởi sự di truyền ngẫu nhiên qua “nút cổ chai di truyền” x y ra

ở giai ạn ầu trong quá trình phát triển ở tử cung [22]

Trứng của người phụ nữ ư c hình thành ở giai ạn rất sớm trong quá trình phát triển Tế bào tiền thân phân chia thành nhiều trứng, vì thế ty thể t tế ó

ư c phân phối ngẫu nhiên thông qua các trứng này và chỉ có mộ ư ng nhỏ phân

tử mtDNA t người mẹ ư c truyền cho thế hệ sau Các trứng khác nhau có thể chứa mộ ư ng N ột biến h nha iều này quyế ịnh ư ng nguyên liệu

di truyền ột biến ư c truyền cho thế hệ sau Sự khác nhau này có thể gi i thích sự khác nhau về mứ ộ nghiêm trọng của bệnh giữa người con [80, 96]

Các nghiên cứ n hứng tỏ sự tồn tại nút cổ chai di truyền trong sự di truyền của DNA ty thể nghĩa hỉ có mộ ư ng nhỏ phân tử mtDNA t người mẹ

ư c truyền cho thế hệ sau (hình 1.8)

Hình 1.8 Thuyết nút cổ chai di truyền [100]

1.2.3 Tính chất không đồng nhất và ngƣỡng biểu hiện của đột biến

Các tế bào chứa nhiều b n sao mtDNA Vì vậy, khi xuất hiện ột biến thì trong cùng một mô có thể có c N nh hường và mtDNA ột biến, hiện

ư ng n y ư c gọi là ính h ng ồng nhất (heteroplasmy) của mtDNA, còn nếu tất c các b n sao của mtDNA giống nhau thì gọi là ính ồng nhất (homoplasmy) [35, 70, 91]

Lư ng N ột biến trong một tế ư c gọi là mứ ộ h ng ồng nhất, là một nhân tố quan trọng quyế ịnh mứ ộ nghiêm trọng của bệnh a ố

ột biến mtDA gây bệnh ều tồn tại ở dạng h ng ồng nhất Tỷ lệ N ột biến có thể hay ổi rất lớn giữa người mẹ và các con, giữa ơ an v ngay

c các tế bào trong cùng một cá thể Do tế bào có chứa số ư ng ty thể khác nhau

n n ột biến trong hệ gen ty thể có những ặ ưng i ng ơ hể ang ột biến

có thể có c b n a ó ột biến và b n a h ng ó ột biến Hiện ư ng dị ột biến ó vai ò y ịnh mứ ộ biểu hiện của bệnh ột biến gây nên [36, 70]

Các tế bào có kh năng “ hị ựng” ỷ lệ N ột biến cao (70-90%) ước khi chuỗi hô hấp tổn hương v ư c gọi ngưỡng biểu hiện của ột biến Tỷ

lệ ty thể ột biến ph i ạ ến ngưỡng thì mới gây ra kiểu hình lâm sàng Ngưỡng biểu hiện của ột biến hay ổi tùy thuộc t ng loại ột biến và t ng loại mô [34, 88] Nói chung, ở h ng ph n hia như ơ v hần kinh chứa tỷ lệ mtDNA

ột biến a ng hi ó ở ph n hia nhanh như ạch cầu máu chứa tỷ lệ

N ột biến thấp Tuy nhiên, tỷ lệ N ột biến a ũng ư c phát hiện ở biể ường tiết niệu, y là loại ăng inh ất nhanh Các mô cần nhiề năng

ư ng như ơ i n ó ngưỡng biểu hiện của ột biến thấp và dễ bị tổn hương

hi ó ột biến mtDNA [22]

Kiểu hình của một dòng tế bào có thể hay ổi trong quá trình phân chia tế bào do ty thể phân bố một cách ngẫu nhiên giữa các tế bào nữ giới Vì vậy, trong một tế bào nếu cùng tồn tại N nh hường v N ột biến thì trong quá trình phân chia sẽ có ba kiểu hình khác nhau có thể tồn tại: ồng nhất một b n sao

N nh hường hay N ột biến và tồn tại ồng thời hai loại mtDNA này

Vì vậy kiểu hình của loại mang ty thể dạng h ng ồng nhất sẽ phụ thuộc vào tỷ lệ

N ột biến Nếu số phân tử mtDNA ang ột biến ương ối thấp thì có sự bù

ắp của N nh hường nên không thấy sự ộng của ột biến Khi mtDNA

ột biến vư a ngưỡng thì nó sẽ biểu hiện kiểu hình gây bệnh (hiệu ứng ngưỡng) Nếu quá trình tổng h p TP dưới mức tối thiểu cần thiết cho chứ năng ủa mô thì bệnh sẽ xuất hiện Ở mỗi ơ an h nha thì số phân tử mtDNA là khác nhau phụ thuộc vào nhu cầ năng ư ng cần thiết của mỗi mô Vì vậy các mô cần nhiề năng ư ng như hệ thần inh ng ương ơ i ụy, thận và gan rất dễ

bị ộng [94]

Khi tế bào phân chia, tỷ lệ N ột biến ở các tế bào ở nữ giới có thể hay ổi Nếu tỷ lệ ột biến vư a ngưỡng biểu hiện của t ng mô thì kiểu hình có thể hay ổi Vì vậy bệnh nh n ang ột biến gây bệnh dạng h ng ồng nhất sẽ có ộng ng hay ổi theo thời gian [91] ó 2 ơ hế có thể dẫn ến sự thay

ổi ư ng ột biến ở các tế người ó i) quá trình tái b n ộc lập (relaxed replication) x y ra không phụ thuộc vào chu k tế ng hi ó ư ng mtDNA tổng số vẫn h ng ổi, các phân tử mtDNA dường như ư c chọn lọc một cách ngẫu nhiên cho sự thoái hóa và tái b n nên trong một tế bào quá trình này có thể dẫn

ến sự hay ổi tỷ lệ phân tử N ột biến v h ng ột biến và ii) sự phân chia nguyên phân nhưng v ự phân chia không bằng nhau mtDN ột biến và mtDNA

h ng ột biến x y ra trong suốt quá trình phân chia tế bào nên ũng ó hể dẫn ến

sự hay ổi tỷ lệ mtDNA ột biến v h ng ột biến ở ăng inh

Các tế bào chứa h ư ng N ột biến n ngưỡng sẽ biểu hiện khiếm khuyết về năng ư ng, có thể ơ hể sẽ có sự chọn lọc thích nghi, kết qu là mất

N ột biến t quần thể tế bào qua thời gian iề n y ư c quan sát ở các mẫu máu lấy t các bệnh nhân mắc bệnh ty thể ối với nhiều mô ở người v ặc biệt trong suốt quá trình phát triển của n người, c quá trình tái b n ặ ưng và

sự ph n hia ng y n ph n ều dẫn ến sự hay ổi mứ ộ h ng ồng nhất Nếu

mộ ột biến x y ra bên trong tế bào mầm hoặ ng ơ hể ang ph iển thì số

ư ng phân tử ột biến có thể ăng a ở các cá thể ó h ặc tham gia vào các tế bào mầm và có mặt ở các thế hệ tiếp theo [23]

Nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa tỷ lệ N ột biến phổ biến A3243G, A8344G, T8993G/C với kiểu hình lâm sàng cho thấy rằng ư ng mtDNA

ột biến ở ó i n an ương ứng với mứ ộ nghiêm trọng của bệnh và dường như ũng ó ối liên quan giữa ư ng ột biến của người mẹ và tần suất tác ộng ến người n ối với nhiề ột biến, chỉ có thể ư vấn di truyền cho bệnh nh n v người nhà khi hiể ầy ủ về ơ hế di truyền, sự phân chia trong nguyên phân và sự biểu hiện của ột biến mtDNA vì những ộng phức tạp của mtDNA trong suốt quá trình phát triển và những hay ổi của ư ng ột biến trong máu và ơ ng ời sống cá thể [22]

Mứ ộ khiếm khuyế d ột biến mtDNA phụ thuộc vào loại ột biến,

ư ng N ột biến có mặt trong tế v ngưỡng biểu hiện của Ngưỡng biểu hiện của mô phụ thuộc vào mứ ộ khiếm khuyết của chuỗi hô hấp và nhu cầu năng ư ng của ó hệ thần inh ng ương nhạy c m nhất với sự khiếm khuyết của ty thể a ó ơ i hệ nội tiết và thận [36]

Người ta cho rằng các nhân tố di truyền trong nhân có thể hay ổi mứ ộ

h ng ồng nhất của ột biến mtDNA iều này rất quan trọng bởi vì nó nh hưởng

ến sự di truyền các khiếm khuyết của mtDNA dạng h ng ồng nhất v ũng ó thể nh hưởng ến sự tiến hóa của mtDNA ở mứ ộ quần thể [23]

1.2.4 Tốc độ đột biến của DNA ty thể

Hệ gen ty thể người ó ặ iểm là di truyền theo mẹ, chị ộng của hiệu

ứng ngưỡng, mứ ộ h ng ồng nhất và tố ộ ột biến cao

mtDNA có tốc ộ ột biến cao gấp 10-20 lần so với nDNA, do hệ gen ty thể

ở dạng trần (không liên kết với protein b o vệ kiể hi n như hệ gen nhân), không chứa các trình tự không mã hóa, hệ gen ty thể dễ dàng tiếp xúc với các gốc tự do,

s n phẩm của quá trình oxy hóa các h p chất hữ ơ v ó tác dụng gây ra ột biến Ngoài ra, ty thể h ng ó ơ hế sữa chữa DNA hiệu qu , mtDNA không có kh năng ự phục hồi dễ d ng như n N Sự hay ổi trình tự giữa các cá thể trong cùng một loài rất lớn, kho ng 770 nucleotide và trong một cá thể thì sẽ có một

ư ng nhỏ mtDNA hay ổi ư c tạ a ng ời sống cá thể [66, 94] h ến nay,

hơn 300 ột biến trong hệ gen ty thể người ư c phát hiện, ng ó ó hơn 200

ột biến gây bệnh, chủ yếu tập ng v ơ hần kinh, chứ năng h yển hoá của

mẹ sang con [23]

Wallace và tập thể [104] là những người ầu tiên công bố ột biến iểm trong hệ gen ty thể gây bệnh ở người (hội chứng LHON) Sự mấ ạn mtDNA ũng ư c tìm thấy ở ơ của bệnh nhân CPEO và hội chứng Kearns Sayre vào

nă 1988 v ột biến iể N ư c tìm thấy ở các bệnh nhân MELAS

v nă 1990 h ến nay, hơn 200 ột biến iểm và mấ ạn khác nhau có kh năng g y ệnh ư c báo cáo ột biến trong hệ gen ty thể gây ra sự khiếm khuyết trong chuỗi hô hấp do nh hưởng ến quá trình tổng h p protein nói chung Một số rối loạn ty thể chỉ nh hưởng ến mộ ơ an nhưng ũng ó những rối loạn nh hưởng ến rất nhiề ơ an v hường có những ặ iểm nổi trội ặc biệ ộng mạnh ến hệ thần kinh- ơ Những rối loạn ty thể có thể x y ra ở bất

k lứa tuổi nào Hầu hế ột biến gen ty thể ều làm suy gi m chứ năng ủa ty thể, t ó g y n n hội chứng bệnh khác nhau tập trung chủ yếu ở ơ thần kinh

và chứ năng h yển hóa của ơ hể

ột biến mtDNA có kh năng g y ệnh tập trung vào 2 nhóm: sắp xếp lại mtDNA (chủ yếu là mấ ạn) v ột biến iểm ó ũng ó hể chia những

bệnh do DNA ty thể gây ra thành hai dạng hính ó ệnh do sự sắp xếp lại mtDNA và các bệnh d ột biến iểm mtDNA [23]

1.3.1 ột biến iểm DNA ty thể

ột biến iểm là ột biến (thay thế, mất hoặc thêm) x y ra trong cấu trúc của

gen tại mộ iểm (thay thế, mất hoặc thêm một nucleotide) trên phân tử DNA Các

ột biến iểm có thể x y ra ở g n i n an ến sự tổng h p protein (gen mã hóa cho tRNA hoặc rRNA) hoặc gen mã hóa cho protein (một trong 13 gen mã hóa cho các tiể ơn vị của các thành phần trong chuỗi hô hấp) T ng ó, ột biến iểm trên các gen mã hóa cho tRNA của ty thể là nguyên nhân phổ biến nhất của bệnh ty thể ặc biệt, nhiề ột biến ư c báo cáo ở gen mã hóa cho tRNALeu iều này

hỉ ra rằng vùng n y iểm nóng x y a ột biến [92]

1.3.1.1 Các loại đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA và các hội chứng ty thể

Hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and

stroke-like episodes) là hội chứng não giậ ơ ăng acid lactic máu và gi tai biến mạch, là bệnh ơ n phổ biến nhất và ư c di truyền theo mẹ [1, 2, 3] y hội chứng iển hình trong các hội chứng i n an ến ty thể Sự biểu hiện của bệnh rất

a dạng, phụ thuộc nhiề ến các yếu tố như ỷ lệ ột biến ng ơ hể, những mô

có chứa ột biến và mứ ộ ph n ứng của mỗi mô với sự gi m sút quá trình chuyển hóa

Ng y n nh n d ộ ng ại ộ iến A3243G, T3271C, T3291C,

A3252G, A3260G, C3256T trên gen MTTL1 mã hóa cho tRNALeu; ộ iến

G13513A, A12770G và A13514G trên gen MTND5 mã hóa cho ND5 ubiquinone oxidoreductase ủa phứ h p I, G583A trên gen MTTF mã hóa cho tRNAPhe,

G1642A trên gen MTTV mã hóa cho tRNAVal, A5814G trên gen MTTC mã hóa cho

tRNACys T ng ó ộ iến 3243G hiế 80% ố a ang hội hứng MEL S, iếp theo ộ iến T3271C x y a h ng 7 5% MEL S ó hể g y a ởi ộ

iến iể N ở g n h như COXIII, ND1, ND5 hoặc gen mã hóa

tRNAPhe, tRNAVal, tRNACys, rRNA hoặc mấ ạn với í h hước ngắn Tuy nhiên,

ột biến trên tRNALeu vẫn ột biến phổ biến nhấ i n an ến kiểu hình MELAS [33, 40, 55, 58, 97] T ng ố ó ộ iến A3243G ư ầ i n trên gen mã hóa cho tRNALeu v ộ iến phổ iến nhấ ở ấ hủng ộ [67] Như vậy ộ iến 3243G ộ hỉ i an ọng ể hẩn n hội hứng MEL S ng i iể a ng

ột biến 3243G ột biến trên hệ gen ty thể, A thay thế G ở vị trí 3243,

ột biến nằm trên gen MTTL1, mã hóa cho phân tử RNA vận chuyển leucine (UUR)

(tRNALeu(UUR)) Ở mứ ộ phân tử ột biến hay ổi cấu trúc, rối loạn chức năng ủa tRNALeu(UUR gây ra gi m sút quá trình tổng h p protein, làm hỏng sự kết thúc phiên mã và biến ổi bộ a ối mã Ở mứ ộ tế ột biến tồn tại dạng

h ng ồng nhất và các bằng chứng về hình thái họ iển h nh như i ơ ỏ xé rách Ở mứ ộ ơ an ột biến gây ra bệnh ơ ệnh n ăng a id a i máu và dịch não tủy, ngoài ra còn có các kiểu hình khác [58]

Nă 1990 G v ập thể công bố ột biến A3243G lần ầu tiên ở các bệnh nhân có hội chứng MEL S v y ũng hội chứng rõ nét nhấ i n an ến ột biến A3243G [34] Ngoài ra, ột biến A3243G ũng ư c phát hiện ở các bệnh nhân tiể ường type 2 v nă 1998 [47] Bệnh tiể ường d ột biến A3243G

ư c phát hiện ở mộ gia nh người Trung Quốc với 4 thế hệ ều bị bệnh tiểu ường h ến nay ơ hế gây bệnh của ột biến vẫn òn ư c tiếp tục nghiên cứu [57]

Nghiên cứu về chứ năng ủa tRNA trong ty thể ở in vitro chứng tỏ rằng ột

biến 3243G gi m kh năng i n ết giữa tRNA với acid amin t 12-25 lần

so với g n h ng ột biến [16] ột biến A3243G có thể dẫn ến nhiều biểu hiện lâm sàng và hội chứng bao gồm MELAS, tiể ường và iếc, bệnh ơ hần phân liệt, bệnh tim, co giật, bệnh thận, hội chứng CPEO hay MERRF T ng ó ộng lâm sàng phổ biến nhất của ột biến này là MELAS [26, 40, 58, 72] Thực ra, kho ng 40% bệnh nhân ang ột biến A3243G có kiể h nh MEL S ầy ủ ơ chế biểu hiện a dạng ặ iể ng hưa ư c hiể ầy ủ, có lẽ liên quan

ến mứ ộ h ng ồng nhất, ngưỡng biểu hiện của ột biến, sự phân bố của

mtDNA ở các mô, yếu tố di truyền của gia nh v hể, nhân tố i ường và tuổi tác [20, 26, 58]

Nă 1975 hội hứng MELAS ần ầ i n ư è h gi ai iến

ạ h ăng a id a i v ơi ơ ỏ xé rách n ạnh ặ iể này phổ

ng MEL S ó hể hay ổi ấ ộng iể hiện h ó hể vó người nhỏ

bé ấ h năng ngh ệnh im [26, 40] T ộng ng iển h nh nhấ ủa ệnh nh n MEL S như ơ a ầ n n ửa hường x y n hờ hẫn iế v

ấ í iến iển ộng ướ ổi 15 v x ấ hiện iệ hứng ng giống

ộ ỵ ướ ổi 40 Khi inh hiế ơ ó ự hay ổi về í h hướ ủa i ơ

v i ơ ỏ xé h hi nh ộ G i i h ở ấ ệnh nh n Khi nghi n ứ về enzyme h ạ ính enzyme phứ hệ I, III ng y hể ủa ơ xương

gi ng ể ở ấ ệnh nh n ó ộ iến n y Tuy nhiên, h ạ ính enzyme

ủa phứ hệ II, III và succinate dehydrogenase (SDH) ng giới hạn nh hường

òn h ạ ính enzyme phứ hệ IV nh hường h ặ ó gi chút í T ng hội hứng MEL S ộng inh iể hiện ng h phổ iến ặ iệ hể ộng inh ng giậ ơ iến iển ế h p với i ơ ỏ xé rách ư ng hội hứng MERRF ó ần hẩn n ph n iệ 2 hội hứng MEL S v MERRF T ộng ng ủa MEL S hường x y a ở ẻ với iệ hứng dần dần xấ i ặ iể ng hay ổi ấ ớn giữa ệnh nh n ặ iể phổ iến nhấ ủa hội hứng MEL S a ầ ng ơn è h n n ửa iệ hứng n y n n ó ặ ở ấ ệnh nh n giậ x y a ở phần ớn ệnh

ở tất c các mô của bệnh nh n v ư ng N ột biến khác nhau ở các mô [91]

Tỷ lệ của ột biến 3243G ng í hơn ng ơ T y nhi n inh hiế ơ

mộ phương ph p g y hương ổn cho bệnh nhân, không thể thực hiện một cách thông dụng trong chẩn n ệnh ty thể Vì vậy phát hiện ột biến A3243G trong máu là một phương ph p iện l i trong sàng lọc bệnh ty thể [58]

Hội chứng MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội

chứng ơ n y hể ư c di truyền theo mẹ ó ặ iểm là ộng kinh giậ ơ với

các s i ơ ỏ xé rách Ngoài ặ iể iển hình trên, có thể kèm theo mất trí,

iếc, bệnh ơ d y hần kinh thị giác, tổn hương hô hấp và tim Hội chứng lần

ầ i n ư c mô t d ột biến A8344G trên gen mã hóa cho tRNALys của ty thể [18] Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là d ột biến A8344G,

T8356C và G8363A nằm trên gen MTTK mã hóa cho tRNALys gây ra Tất c ột biến ều tồn tại ở dạng h ng ồng nhất [36, 94] ột biến A8344G là phổ biến nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [16] MERRF ũng ư c mô t

ở bệnh nhân bị mấ ạn mtDNA Các hội chứng gối nhau với ặ iểm MELAS/MERRF ư c báo cáo ở ột biến T7572C và T8356C trên tRNASer [36]

ộ tuổi ộng hay ổi rất lớn, có thể t lúc nhỏ ến 50 tuổi Bệnh biểu hiện sớ hường i n an ến triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng dẫn ến chết ở tuổi ưởng thành Triệu chứng của bệnh là co giật, mấ iều hòa tiểu não, liệ ơ

n ơn ộng inh ấ h năng ngh ăng a id a i i ơ ỏ xé rách [40] ột biến gây ra sự khiếm khuyết các phức hệ enzyme của chuỗi hô hấp a ố

i n an ến NADH-CoQ reductase và cytochrome c oxidase Mặc dầ ột biến

ư c di truyền theo mẹ nhưng iể h nh ng hay ổi rất lớn trong một ph hệ gia nh iều này phù h p với ột biến tồn tại ở dạng h ng ồng nhất [18]

ộ tuổi ộng và mứ ộ nghiêm trọng của MERRF ó i n an ến tỷ lệ

N ột biến[98] Tuy nhiên, có những ường h p ệnh nặng nhưng ơ ính với y xida h ặ h ng ó i ơ ỏ xé h hi inh hiế Những

dữ iệ n y ở ộng giới hạn iể h nh ủa MERRF Vì vậy việ ph n í h mtDNA an ọng ở nhiề ường h p ó ự ối ạn hệ hống h ng õ ng

Hội chứng CPEO (chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội

chứng liệt ơ ắt ngoài tiến triển, triệu chứng iển hình của bệnh là liệ ơ ắt, sa

mí mắt, rối loạn tâm thần v ột tử

Ng y n nh n ủa CPEO d ộ iến 3243G nằ n g n hóa tRNALeu(UUR) v ộ iến T4274 nằ n g n hóa tRNAIle Ng i ặ iể

a í ắt, PEO òn iể hiện ấ í ộng kinh, giậ ơ v gi tai iến ạ h ệnh nh n PEO ó hể ang ộ iến ấ ạn hay ộ iến iể nhiề ộ iến

iể ư ở PEO a gồ ộ iến n RN Leu

, tRNAIle và tRNAAsp

ng ó ó ộ iến iểm 3243G g y hội hứng MEL S [36]

Ng i a ấ nhiề ộ iến iể h n g n mã hóa cho tRNA có liên

an ến ộ ố hội hứng như hội hứng ơ n ( n pha y pa hy) d ộ iến T10010 G4298 T14728 T14709C, G1606 ; ệnh ơ iến iển hậ d 12320G; ệnh ơ i ( a di y pa hy) d ộ iến 4269G 3243G G8363A; ệnh iể ường v iế di yền h ẹ ( aternally inherited diabetes and deafness - MI ) i n an ến ộ iến 12258 3243G [81]

1.3.1.2 c đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein và các hội chứng liên quan

Hội chứng Leigh (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)/NARP

(neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos)

Triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh lần ầu tiên ư c phát hiện vào

nă 1951 bởi Dennish Leigh, là sự thoái hóa thần kinh tiến triển ở trẻ, có thể dẫn

ến cái chết trong vài tháng hoặ v i nă ột biến gây ra hội chứng L igh ư c tìm thấy ở c nDNA và mtDNA Phần lớn ường h p Leigh do khiếm khuyết của gen nhân [95]

Hầu hế ột biến gen ty thể gây ra hội chứng L igh ư c báo cáo là trên

các gen MTATP6, MTND3 và MTND5, mộ v i ột biến ư x ịnh trên các gen

MTND2, MTND6 và MTND4 Ngoài ra, còn có ường h p trên gen liên quan ến

quá trình tổng h p protein ó gen MTTV mã hóa cho tRNAVal, gen MTTL1 mã

hóa cho tRNALeu, gen MTTW mã hóa cho tRNATrp và gen MTTK mã hóa cho

tRNALys T ng ường h p của hội chứng L igh a ố ột biến nằm trên

gen MTATP6 ặc biệt tại vị trí T8993G hoặc T9176C Sự biến ổi T thành G tại

8993 ng N người là một ng ột biến ty thể kèm theo hội chứng

L igh ư c mô t nhiều nhấ ột biến này thay thế leucine thành arginine tại vị trí

156 trên ATPase 6 của ty thể, một trong hai tiể ơn vị của tiểu phần Fo của phức

hệ ATPase (phức hệ V), làm cho quá trình tổng h p ATP bị lỗi, tạo ra nhiều gốc oxy tự do, gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau [68]

ột biến iểm T8993G trên gen ATPase6 lần ầ i n ư c mô t ở một người lớn bị yế ơ ấ iều hòa vận ộng và hỏng sắc tố võng mạc, y ũng các biểu hiện lâm sàng phổ biến của hội chứng Kho ng 20% bệnh nhân mang hội chứng Leigh có sự biến ổi T thành G hoặc T thành C tại vị trí 8993 trên gen ATPase 6 ở phức hệ V của chuỗi hô hấp Mứ ộ nghiêm trọng của bệnh có mối ương an in cậy với tỷ lệ ột biến Bệnh nhân Leigh có tỷ lệ ột biến rất cao, hơn 90% ột biến, kèm theo các triệu chứng lâm sàng rất nghiêm trọng hoặc chết Khi

ư ng ột biến t 60-90% thì thể hiện triệu chứng lâm sàng của hội chứng NARP

ó ối loạn thần kinh, mấ iều hòa vận ộng và viêm võng mạc, ng hi ó

ư ng ột biến í hơn 60% nói h ng h ng è h iệu chứng lâm sàng hoặc

bị ộng nhẹ [36, 96]

Một số nghiên cứu chứng tỏ rằng tỷ lệ ột biến T8993G giống nhau ở các mô khác nhau, khác với ột biến n g n RN ư ng ột biến h nha ng

kể ở các mô khác nhau Vì vậy, việc nghiên cứu ở mứ ộ phân tử ột biến T8993G

v ặc biệt việc chẩn n ướ inh ư c xem là tin cậy hơn với ột biến mtDNA khác chẳng hạn như ột biến trên gen tRNA [40]

Hội chứng Leigh còn liên an ến sự biến ổi T12706C của gen ND5, dẫn

ến thay thế phenylalanine bằng leucine ở vị trí 124 ND5 là gen chứ năng gồm

1812 bp (t vị trí 12337 tới 14148) ư c mã hóa bởi chuỗi nặng của mtDNA S n

phẩm của gen ND5 là một thành phần của phức hệ NADH-ubiquinon oxidoreductase S n phẩm của gen ND5 nằm ở phần kỵ nước của phức hệ I Protein

này là một trong 7 tiểu phần ư c mã hóa bởi mtDNA trong số 42 tiểu phần của

phức hệ I của chuỗi hô hấp ột biến trên gen ND5 có liên quan tới nhiều bệnh

t ng ó ó LHON L igh v MEL S [99]

Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy) là hội chứng liệt

thần kinh thị giác di truyền theo Leber, ộng hủ yế ến võng ạ g y hội hứng d y hần inh hị gi ấ h năng nh n hấy ở hai ắ ệnh có