Nghiên cứu sự biến động của glycoprotein thời kỳ có chửa và lactogen nhau thai ở trâu đầm lầy Việt Nam (bubalus bubalis) : Luận án TS. Sinh học: 62 42 30 20

định lượng bằng ba hệ thống RIA 72 3.16 Phương trình hồi quy mối tương quan của hàm lượng PAG trong huyết tương trâu được định lượng bằng ba hệ thống RIA 74 3.17 Phương trình hồi quy mối

1 1 Hoạt động sinh sản và mang thai của trâu đầm lầy 5

1.1.2 Chu kỳ sinh sản của trâu đầm lầy 8 1.1.3 Môi trường và biểu hiện động dục trên trâu đầm lầy 10

1.1.5 Tương quan giữa các số đo khác nhau của thai 12 1.1.6 Sự phát triển nhau thai ở động vật nhai lại 14

1.2 Nghiên cứu về glycoprotein thời kỳ có chửa (PAG) 20 1.2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu PAG 20

1.2.3 Biểu hiện của PAG ở các động vật nhai lại 25 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu lactogen nhau thai 27

1.3.3 Biểu hiện của PL ở các động vật nhai lại 32

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.2.3 Gây động dục đồng pha ở trâu trong nông hộ 37 2.2.4 Thu mẫu máu từ trâu trong nông hộ 38

2 3 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radio immunoassay – RIA) 38

2.3.7 Phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) 43

3.1 Phát triển trước sinh của trâu đầm lầy 49

3.1.2 Tương quan giữa chiều dài đầu đuôi với các chỉ số đo khác 53 3.1.3 Tương quan giữa khối lượng thai với các chỉ số đo khác 60 3.2 Thiết lập hệ thống RIA cho việc định lượng PAG trâu đầm lầy 65 3.2.1 Hệ thống RIA với phương pháp có ủ trước kháng thể 66 3.2.2 Hệ thống RIA sử dụng phương pháp không ủ trước kháng thể 68 3.2.3 Hàm lượng PAG trâu đầm lầy khi định lượng bằng ba hệ

định lượng bằng phương pháp ELISA và RIA 90 3.3.3 Định lượng hàm lượng PAG bằng các hệ thống ELISA 98 3.3.4 Chẩn đoán có thai sớm trên trâu bằng phương pháp định

3.4.1 Thiết lập phương pháp định lượng PL ở trâu đầm lầy 101 3.4.2 Hàm lượng PL trong các loại mẫu khác nhau của trâu đầm lầy 104 3.4.3 Tương quan giữa hàm lượng PL với tuổi thai ước lượng 105

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

As (Antiserum) Kháng huyết thanh

Ac-PAG (PAG antibody) Kháng thể kháng PAG

B (Tracer bound) Gắn kết đánh dấu phóng xạ

bCG (Bovine chorionic gonadotrophin) Gonadotrophin nhau thai bò

BNC (Binucleate cell) Tế bào hai nhân

bPL (Bovine placental lactogen) Lactogen nhau thai bò

cPL (Caprine placental lactogen) Lactogen nhau thai dê

oPL (Ovine placental lactogen) Lactogen nhau thai cừu

rbPL (recombination placental lactogen) Lactogen nhau thai tái tổ hợp bò

CRL (Crown rump length) Dài đầu đuôi

DEAE (Diethylaminoethyl) Diethylaminoethyl

FAO (Food associated organization) Tổ chức nông lương thế giới

125I (ioden 125) Iốt phóng xạ 125

MDL (Minimal detection limit) Giới hạn định lượng nhỏ nhất

OD (optical density) Độ hấp thụ

PAG (Pregnancy-associated glycoprotein) Glycoprotein thời kỳ có chửa

boPAG (bovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa bò

caPAG (caprine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa dê

ovPAG (ovine PAG) Glycoprotein thời kỳ có chửa cừu

pI (isoelectric point) Điểm đẳng điện

PSP60 (Pregnancy serum protein 60) Protein huyết thanh giai đoạn có chửa 60 PSPA (Pregnancy specific protein-A) Protein đặc hiệu giai đoạn có chửa A PSPB (Pregnancy specific protein-B) Protein đặc hiệu giai đoạn có chửa B

R (r) (Correlation coefficient) Hệ số tương quan

RIA (Radioimmunoassay) Miễn dịch phóng xạ

ED-20 (20% bound) Vị trí có 20% gắn kết

ED-50 (50% bound) Vị trí có 50% gắn kết

ED-80 (80% bound) Vị trí có 80% gắn kết

SD (Standard deviation) Sai số tuyệt đối

SF (serum free) Huyết thanh động vật không có chửa

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2 Đặc điểm tăng trưởng khối lượng của trâu đầm lầy Việt Nam 8 1.3 Đặc điểm sinh sản của bò, trâu sông và trâu đầm lầy 9 1.4 Sự biểu hiện của các phân tử PAG bò và dê trong hợp bào nhau

2.1 Đường chuẩn của phương pháp RIA không ủ trước kháng thể 42 2.2 Đường chuẩn của phương pháp RIA có ủ trước kháng thể 43 2.3 Phương pháp RIA có và không ủ trước với kháng thể 44 3.1 Trung bình các chỉ số kích thước của phôi/thai trâu đầm lầy giai

3.2 Tương quan hồi quy giữa CRL với chiều dài thai 54 3.3 Tương quan hồi quy giữa CRL với kích thước thân thai 55 3.4 Tương quan hồi quy giữa CRL với bốn chỉ số đo đầu thai 56 3.5 Tương quan hồi quy giữa CRL với chỉ số đo chân thai 57 3.6 Tương quan hồi quy giữa CRL với chu vi cuống rốn 58 3.7 Tương quan hồi quy giữa CRL với khối lượng thai 59 3.8 Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và chiều dài thai 60 3.9 Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và thân thai 61 3.10 Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và số đo đầu thai 62 3.11 Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và kích thước chân 63 3.12 Tương quan hồi quy giữa khối lượng thai và chu vi cuống rốn 64 3.13 Đặc điểm đường chuẩn của bốn hệ thống RIA trong phương pháp

định lượng bằng ba hệ thống RIA 72 3.16 Phương trình hồi quy mối tương quan của hàm lượng PAG trong

huyết tương trâu được định lượng bằng ba hệ thống RIA 74 3.17 Phương trình hồi quy mối tương quan của hàm lượng PAG trong

huyết tương thai được định lượng bằng ba hệ thống RIA 75 3.18 Phương trình hồi quy mối tương quan của hàm lượng PAG trong

dịch niệu được định lượng bằng ba hệ thống RIA 76 3.19 Phương trình hồi quy mối tương quan của hàm lượng PAG trong

dịch ối được định lượng bằng ba hệ thống RIA 77 3.20 Kết quả chẩn đoán có chửa của mẫu huyết tương bò 85 3.21 Phương trình hồi quy mổ tả tương quan của ba hệ thống RIA 86 2.22 Giá trị OD trong thử nghiệm độ pha loảng của biotine và avidine 90 3.23 Giá trị trung bình hàm lượng PAG định lượng bằng RIA và

3.24 Hàm lượng PAG trong các loại mẫu khác nhau khi định lượng

3.25 Tương quan hồi quy của hàm lượng PAG trong huyết tương trâu

được định lượng bằng ELISA và ba hệ thống RIA 94 3.26 Tương quan hồi quy của hàm lượng PAG trong huyết tương thai

được định lượng bằng ELISA và ba hệ thống RIA 95 3.27 Tương quan hồi quy của hàm lượng PAG trong dịch niệu được

định lượng bằng ELISA và ba hệ thống RIA 96 3.28 Tương quan hồi quy của hàm lượng PAG trong dịch ối được định

3.29 Hàm lượng PAG trong các loại mẫu khác nhau khi định lượng

3.30 Tỷ lệ chẩn đoán có chửa trên trâu dựa vào định lượng PAG 99 3.31 Hàm lượng PL trong các loại mẫu khác nhau của trâu đầm lầy 104

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1 4 Sự di trú và phát triển của tế bào đa nhân (Wooding vcs., 1992) 18 1.5 Đồ thị biểu hiện sự tồn tại của các phân tử PAG trên bò trong

suốt quá trình mang thai (Green vcs., 2000) 26

2.6 Biến động của PAG gắn phóng xạ trong các phân đoạn sau khi lọc

2.7 Sơ đồ các bước trong phương pháp Elisa 47 3.1 Biến thiên kích thước trung bình của thai trâu trong suốt quá trình

3.2 Tương quan hồi quy giữa CRL và chiều dài thai theo đường cong 53 3.3 Đồ thị chỉ sự tương quan giữa CRL và kích thước thân thai 54 3.4 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa CRL và bốn chỉ số đo

3.5 Tương quan giữa dài đầu (đầu-mũi) và rộng đầu với CRL trong khoảng quý đầu mang thai trên bò (George và cs, 2008) 56 3.6 Đường tương quan giữa CRL và chỉ số đo kích thước chân của thai 57 3.7 Đường đồ thị thể hiện mối tương quan giữa CRL với chu vi rốn 58 3.8 Đường đồ thị thể hiện mối tương quan giữa CRL với khối lượng thai 59

3.9 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai và

3.10 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai và ba

3.11 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai và bốn

3.12 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai và bốn

3.13 Đường hồi quy mô tả mối tương quan giữa khối lượng thai và chu

3.20 Tương quan giữa hàm lượng PAG trong huyết tương trâu với tuổi

3.21 Tương quan giữa hàm lượng PAG trong huyết tương thai với tuổi

thai ước lượng 80 3.22 Tương quan giữa hàm lượng PAG trong dịch niệu với tuổi thai

3.28 Đặc điểm đường chuẩn của phương pháp ELISA - PAG 87 3.29 Đường chuẩn phương pháp ELISA theo Green và cs., (2005) 88 3.30 So sánh kết quả hàm lượng PAG khi định lượng bằng RIA và

3.31 Tương quan của hàm lượng PAG trong huyết tương trâu khi định

3.32 Tương quan của hàm lượng PAG trong huyết tương thai khi định

3.33 Tương quan của hàm lượng PAG trong dịch niệu khi định lượng

mẫu khác nhau của trâu đầm lầy 102 3.36 Miễn dịch phóng xạ kháng thể đúp lactogen nhau thai (Forsyth,

3.37 Tương quan giữa hàm lượng PL trong huyết tương trâu mẹ với tuổi

3.38 Tương quan giữa hàm lượng PL trong huyết tương thai với tuổi

3.39 Biến động của hàm lượng PL trên bò trong suốt quá trình mang

Trâu là vật nuôi quan trọng tại châu Á Quần thể trâu châu Á hiện tại lên đến 161 triệu con, chiếm 95,83% đàn trâu toàn thế giới Trong đó, trâu đầm lầy chiếm 28% tổng đàn (khoảng 45 triệu con) và phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và một số nước ở khu vực Đông Nam Á [53] Việt Nam, hiện có gần 3 triệu con trâu, phần lớn được nuôi tại các nông hộ ở các vùng nông nghiệp miền núi, trung du và đồng bằng

Công nghệ sinh học sinh sản với các kỹ thuật gây động dục đồng pha

và thụ tinh nhân tạo, gây rụng trứng nhiều, cấy chuyển phôi … đã được nghiên cứu trên trâu đầm lầy Tuy vậy, kỹ thuật thụ tinh nhân tạo, vốn đã được áp dụng rất phổ biến ở bò vẫn chỉ có thể áp dụng hạn chế trên trâu Theo Campanile và cs., (2007) [33] tỉ lệ chết phôi ở trâu sau khi gây động dục đồng pha và thụ tinh nhân tạo dao động từ 22,9 tới 49% Đây là nguyên nhân chính làm cho tỉ lệ sinh sản thấp và khoảng cách giữa hai lứa đẻ ở trâu bị kéo dài

Glycoprotein thời kỳ có chửa (PAG) thuộc về một họ lớn các glycoprotein được tổng hợp trong lớp hợp bào của nhau thai động vật nhai lại

và hàm lượng biến động theo thời điểm mang thai [145] Sự xuất hiện PAG

được xem là tín hiệu của sự phát triển của thai trong tử cung gia súc mẹ Hiện tượng này đã được ứng dụng để chẩn đoán có thai sớm ở bò, cừu, dê và các động vật nhai lại khác, cũng như để nghiên cứu sự phát triển thai trong quá trình mang thai

Hiệu quả của việc ứng dụng định lượng PAG như một kỹ thuật chẩn đoán thai sớm đã được chứng minh Theo Gonzalez và cs., 2004 [63], kỹ thuật này có thể cho phép chẩn đoán sự mang thai ở dê từ ngày thứ 20 sau phối giống với độ chính xác 76,6%, cao hơn nhiều so với khi sử dụng kỹ thuật siêu âm (55,7%); vào thời điểm này phương pháp chẩn đoán sự mang thai bằng định lượng P4 còn chưa thể áp dụng được Ở bò, kỹ thuật định lượng PAG có thể ứng dụng để chẩn đoán có thai từ ngày thứ 28 sau thụ tinh [181] Với các kết quả này, chẩn đoán có thai dựa vào định lượng PAG đã được áp dụng ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ

Lactogen nhau thai (Placental lactogen - PL) là hocmon được tiết ra từ nhau thai ở các loài linh trưởng, gặm nhấm và động vật nhai lại Ở các loài nhai lại, PL được sản xuất bởi các hợp bào đa nhân Mặc dù quá trình điều hòa tổng hợp và tiết vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ, người ta dự đoán PL có chức năng chính như một hocmon sinh trưởng Ngoài ra nó cũng được ghi nhận là loại hocmon đa chức năng Các phản ứng miễn dịch chéo giữa PL của các loài nhai lại khác nhau cũng được bước đầu quan tâm nghiên cứu [55] Ở cừu, quá trình sản xuất PL bắt đầu từ ngày 16 của thai kỳ Nồng độ PL trong máu gia súc mẹ và thai ở các loài rất khác nhau Nồng độ PL trong máu cừu

và dê mẹ cao gấp 100 tới 1000 lần so với bò Mặc dù trâu là đối tượng chăn nuôi quan trọng nhưng cho đến nay vẫn chưa có công bố nào về nồng độ PL ở loài này

Mục tiêu của luận án:

Mục tiêu chung nhất của luận án là đánh giá khả năng áp dụng phương

pháp định lượng nồng độ PAG và PL trên trâu đầm lầy Việt Nam và nghiên cứu sự biến động của những hocmon này trong suốt quá trình mang thai nhằm ứng dụng trong chẩn đoán có thai sớm và đánh giá tình trạng phát triển của thai Kết quả của các nghiên cứu trên các hocmon nhau thai và sự biểu hiện của chúng ở trâu góp phần quan trọng vào việc hình thành cơ sở khoa học về sinh lý sinh sản trâu Áp dụng các kết quả nghiên cứu này để chẩn đoán có thai sớm và gây động dục đồng pha có thể cho phép chúng ta rút ngắn thời gian giữa hai lứa đẻ, qua đó nâng cao hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi trâu Mặt khác, các nghiên cứu này cũng có thể cung cấp cho các bác sỹ thú y và các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực sinh sản những thông tin cần thiết về tình trạng phát triển của thai để từ đó có thể điều chỉnh chế độ dinh dưỡng, điều kiện chăm sóc và đề phòng các triệu chứng bất lợi trong quá trình mang thai

Trong luận án này chúng tôi tập trung nghiên cứu làm rõ các vấn đề sau:

1 Nghiên cứu tương quan giữa chiều dài đầu đuôi và cân nặng với các số đo khác: chiều dài, đường kính đầu, thân và chân … của thai trong suốt quá trình phát triển thai ở trâu đầm lầy

2 Xây dựng phương pháp RIA sử dụng các loại kháng thể khác nhau để định lượng PAG ở trâu và nghiên cứu sự biến động của hàm lượng PAG trong các dịch niệu, dịch ối và huyết tương của trâu mẹ và thai trong quá trình mang thai ở trâu đầm lầy

3 Xây dựng phương pháp ELISA định lượng PAG ở trâu đầm lầy Việt Nam

và đánh giá khả năng ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán có chửa sớm ở trâu

4 Xác định khả năng định lượng PL trâu bằng phương pháp RIA sử dụng kháng thể kháng PL bò và nghiên cứu sự biến động của hàm lượng PL trong huyết tương trâu và thai, dịch ối, dịch niệu và nước tiểu trâu mẹ trong quá trình mang thai ở trâu đầm lầy

Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Theo thống kê gần đây của FAO, quần thể trâu (Bubalus bubalis) trên

thế giới hiện nay vào khoảng 168 triệu con Trong đó châu Á có khoảng 161 triệu con (95,83%); châu Phi có khoảng 3,7 triệu con (2,24%) phần lớn tập trung ở Ai Cập; ở Nam Mỹ có khoảng 3,3 triệu con (1,96%); ở Australia có khoảng 40.000 con (0,02%) và ở châu Âu có khoảng 500.000 con (0,30%) [14]

Trâu nhà – trâu nước (Bubalus bubalis) ở châu Á bao gồm hai dưới loài

là trâu sông và trâu đầm lầy Hai dưới loài này khác nhau về hình thái cũng như đặc điểm di truyền (số lượng NST) Tên “trâu đầm lầy” được sử dụng cho tất cả các giống trâu bản địa ở vùng Đông Nam Á, Nam Trung Quốc và một

số nước khác Tên “trâu sông” được sử dụng cho tất cả các giống trâu phân bố

ở Ấn Độ, các nước vùng Tây Á và Châu Âu [106] Về mặt hình thái, trâu đầm lầy giống trâu hoang dã hơn trâu sông, chúng được sử dụng chủ yếu để cày kéo và cung cấp thịt Về mặt di truyền, trâu sông có 50 nhiễm sắc thể trong đó

5 cặp cân tâm, 20 cặp lệch tâm Trâu đầm lầy có 48 nhiễm sắc thể trong đó 19 cặp cân tâm Sự khác biệt trong số lượng nhiễm sắc thể của bộ lưỡng bội chỉ

là không rõ ràng Thực tế, nhiễm sắc thể lớn số 1 của trâu đầm lầy hình thành

từ sự chuyển đoạn giữa nhiễm sắc thể số 4 (đoạn cuối của cánh p) và số 9 (tâm động) của trâu sông [44] Trong suốt quá trình này, vùng tổ chức hạch nhân (NORs) trong nhiễm sắc thể số 4p của trâu nước đã bị mất đi và tâm động của nhiễm sắc thể số 9 bị bất hoạt [44] Hai phân loài trâu này có thể lai với nhau tạo ra trâu lai với 49 nhiễm sắc thể Hình thái của hai dạng trâu có khác biệt đáng kể Trâu đầm lầy nhẹ cân hơn, trâu đực trưởng thành nặng khoảng từ 325 tới 450 kg, trong khi ở trâu sông con đực trưởng thành nặng từ

450 tới 1000 kg Trâu đầm lầy thường có cấu trúc cơ thể thấp, chắc, sinh sống

ở các vùng đất ẩm ướt, lầy lội, chúng cũng tạo ra một lượng sữa không đáng

kể (khoảng 600 kg sữa một năm) Trâu đầm lầy được sử dụng chủ yếu để cày kéo trên các cánh đồng lúa và chuyên chở hàng, để lấy phân bón và lấy thịt Trâu đầm lầy phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và các nước Đông Nam Á Một phần nhỏ phân bố ở các bang Đông Bắc của Ấn Độ và một số quốc gia khác Trâu sông thường lớn về kích thước, có sừng xoắn, phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, Pakistan, một số nước ở Tây Á và Châu Âu Chúng thích tắm trong nước sạch, được nuôi để lấy sữa, nhưng cũng thường được dùng để cày bừa và lấy thịt Mỗi phân loài trâu lại bao gồm rất nhiều giống khác nhau [26]

1 1 Hoạt động sinh sản và mang thai của trâu đầm lầy

1.1.1 Chăn nuôi trâu ở Việt Nam

Trâu bản địa Việt Nam là trâu đầm lầy Chưa có tài liệu chính thức nào

về phân loại giống trâu ở Việt Nam, nhưng một số tác giả dựa vào hình thái

mà chia thành hai giống: trâu ngố là giống có kích thước lớn và trâu Dé là giống có kích thước nhỏ hơn [105] Nước ta lần đầu tiên nhập nội trâu sông vào năm 1970 gồm 30 trâu thuộc giống trâu Murrah từ Trung Quốc được nuôi

ở Trại thí nghiệm trâu Ngọc Thanh (thuộc Vĩnh Phú cũ) Sau đó, trâu Murrah

đã được nhập khẩu từ Ấn Độ Hiện nay, đàn trâu Murrah ở Việt Nam có khoảng 2000 con, được nuôi chủ yếu ở một số trung tâm nghiên cứu của nhà nước và các hộ nông dân xung quanh các trung tâm này [87] Số lượng và phân bố đàn trâu ở nước ta được thể hiện trong bảng 1.1, chủ yếu tập trung ở vùng núi và cao nguyên phía Bắc (52%) [4; 53; 3; 1]

Bảng 1.1 Phân bố quần thể trâu ở Việt Nam Vùng Số lượng Tỷ lệ trên toàn quốc (%)

Hình 1.2 Hình ảnh trâu cái mẹ và con Trâu đầm lầy ở Việt Nam có ngoại hình tương tự như trâu đầm lầy ở Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Chúng có kích cỡ cơ thể nhỏ, tăng trưởng chậm, trưởng thành sinh dục muộn, khoảng cách giữa hai lứa đẻ dài và sản lượng sữa thấp, nhưng lại có sức đề kháng tốt và thích nghi rất tốt với điều kiện sinh thái địa phương Trâu ở Việt Nam phần lớn có màu đen, chỉ có một số ít có màu trắng Khối lượng sơ sinh của trâu đầm lầy ở Việt Nam dao động từ 20 tới 29 kg Khối lượng bình quân của trâu cái trưởng thành dao động từ 310 tới 500 kg, phụ thuộc vào giống và điều kiện chăn nuôi (Bảng 1.2, Hình 1.1 và 1.2) Nguyễn Đức Thạc (1983) [7] cho biết một chu kỳ sữa của trâu dài khoảng 210 tới 360 ngày với 1,2 tới 3,5 kg sữa trong 1 ngày Tỉ lệ thụ tinh của trâu là khoảng 30% Ở các vùng núi, nơi mà trâu không phải làm việc nhiều, tỉ lệ này có thể lên tới 36%, trong khi chỉ là 20% ở các vùng châu thổ, nơi mà trâu phải làm việc nhiều hơn Lứa đẻ đầu tiên thường xảy ra khi

trâu đạt 48 - 52 tháng tuổi, và khoảng cách giữa 2 lứa đẻ thường là 27 - 30 tháng (810 - 900 ngày) [87]

Bảng 1.2 Đặc điểm tăng trưởng khối lượng của trâu đầm lầy Việt Nam

[4]

1.1.2 Chu kỳ sinh sản của trâu đầm lầy

Các đặc điểm sinh sản của động vật phụ thuộc không chỉ vào giống mà còn vào điều kiện môi trường Không có chế độ dinh dưỡng thích hợp, vật nuôi không thể trưởng thành sinh dục đúng theo quy luật phát triển sinh lý hoặc sẽ không có hoạt động sinh sản đều đặn như mong muốn Trong điều kiện được quản lý tốt và chăm sóc chu đáo, trâu đực có thể trưởng thành sinh dục vào khoảng 18 tháng tuổi, sớm ngang với bò [20] Theo Kamonpatana và cộng sự (1987) [92] trâu đầm lầy thường trưởng thành sinh dục khi được 24 -

25 tháng tuổi và đạt trọng lượng khoảng 300 kg Đối với trâu đầm lầy Việt Nam, tuổi trưởng thành sinh dục thường là 30 - 36 tháng tuổi [106], muộn hơn so với trâu Australia, có tuổi trưởng thành thường là 14 - 19 tháng [25] Tuổi thành thục sinh dục của trâu sông cũng có thể tương đương so với bò Tuổi đẻ lứa đầu của đàn trâu được nuôi dưỡng tốt ở Đại học Ain Shams-Ai

Cập là khoảng 27 tháng 22 ngày [25; 20] Trong khi ở Venezuela, phần lớn trâu cái có thai lần đầu vào 20 - 24 tháng tuổi và đẻ lứa đầu vào khoảng 30 tháng tuổi, có trường hợp trâu đẻ lúc 23 tháng tuổi Khảo sát ở Queensland, Australia và ở Papua New Guinea, các nhà khoa học nhận thấy trong khi bò không thể động dục do điều kiện khí hậu khắc nghiệt và thức ăn không đầy đủ thì các trâu cái (trâu đầm lầy) vẫn động dục thậm chí khi chúng bị giảm cân

So sánh trâu và bò nuôi trong các điều kiện khắc nghiệt, nghé con vẫn có thể trưởng thành sinh dục sớm và trâu cũng có tỉ lệ sinh đẻ cao hơn cũng như khoảng cách giữa các lứa đẻ ngắn hơn bởi vì chúng động dục trở lại sau khi sinh sớm hơn so với bò Tuổi đẻ lứa đầu trung bình của hơn 60 cá thể trâu bị nuôi thiếu dinh dưỡng là 38 tháng [25] Thông tin so sánh một số đặc điểm sinh sản ở bò, trâu sông và trâu đầm lầy được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.3: Đặc điểm sinh sản ở bò, trâu sông và trâu đầm lầy

Chu kỳ động dục (ngày) 21 (14- 29) 21 (18-22) 21 (18 - 22) Thời gian động dục (giờ) 18 (12 - 30) 21 (17-24) 24 (11 - 72)

Thời gian chửa (ngày) 280 (276 - 293) 315 (305 - 330) 330 (322-341) Tuổi đẻ lứa đầu(tháng) 30 (24 - 36) 36 (30 – 45) 42 (36 - 56)

Thời gian co lại của tử cung 45 (32 - 50) 33 (25-58) 35 (16 - 60) Động dục lại lần đầu 30 (10 - 110) 40 (30-60) 75 (35 - 180) Khoảng cách lứa đẻ (tháng) 13 (12 - 14) 15 (12-19) 18 (15 - 30)

[19]

1.1.3 Môi trường và biểu hiện động dục trên trâu đầm lầy

Mặc dù trâu là loài động vật động dục liên tục, nhưng hiệu suất sinh sản của chúng có khác biệt rất lớn vào các thời điểm khác nhau trong năm Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng quá trình động dục, tỉ lệ đậu thai và tỉ lệ đẻ của trâu thay đổi rõ ràng theo mùa Điều này có thể do thời kỳ “nghỉ” kéo dài giữa hai lứa đẻ, bởi vì buồng trứng của trâu đẻ trong khoảng thời gian ngoài mùa sinh sản thường chỉ có thể khởi động hoạt động lại vào mùa sinh sản tiếp theo

Điều kiện môi trường khắc nghiệt cộng với dinh dưỡng không đầy đủ

có thể là nguyên nhân của hiện tượng xuất hiện thời kỳ không động dục theo mùa kéo dài (anoestrus) ở trâu Nghiên cứu hoạt động sinh dục của trâu đầm lầy ở Australia, McCool và cộng sự (1987) [113] nhận thấy tại vùng có khí hậu gió mùa, số lượng trâu có chu kỳ động dục lớn nhất vào cuối mùa mưa và đầu mùa khô (mùa mưa từ tháng 12 tới tháng 3, mùa khô từ tháng 4 tới tháng 11) Trong suốt giai đoạn cuối mùa khô (tháng 8-11), lượng cỏ khô ít, nhiệt

độ ngoài trời cao và trâu có biểu hiện cơ thể không khỏe mạnh; từ đó các tác giả đưa ra giả thuyết rằng tác động tổng hợp của các yếu tố dinh dưỡng, khí hậu có thể là nguyên nhân ức chế hoạt động động dục trong mùa này [56]

Trong khi đó, một số tác giả khác cho rằng hiện tượng mùa sinh sản ở trâu có vẻ không phụ thuộc vào lượng thức ăn, chế độ ăn hay tình trạng sức

khỏe, mà phụ thuộc chủ yếu vào khí hậu, đặc biệt là thời lượng chiếu sáng trong ngày và sự tiết melatonin [122; 30; 50] Melatonin là hocmon tuyến yên, là tín hiệu nội tiết hoạt động theo nhịp ngày - đêm của môi trường và được tiết chủ yếu vào buổi đêm Vai trò của melatonin trong điều chỉnh nhịp sinh học theo chu kỳ ngày và chu kỳ thể hiện rất rõ trong việc điều khiển chu

kỳ rụng trứng ở các động vật sinh sản theo mùa như cừu, dê và ngựa Tuy vậy, vai trò của hocmon này trong quá trình sinh sản ở trâu vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ

Tóm lại, những kết quả nghiên cứu được công bố đến nay đã gợi mở về một mối quan hệ có thể tồn tại giữa các nhân tố môi trường và đặc điểm sinh sản theo mùa ở trâu [19]

1.1.4 Sự phát triển của bào thai

Ghi chép chính xác thời điểm giao phối là điều kiện cần thiết để đánh giá trạng thái phát triển của thai và cung cấp thông tin cho bác sĩ thú y trong điều trị hay những nghiên cứu liên quan Trong trường hợp thời điểm giao phối không được xác định, việc đánh giá tuổi của thai có thể dựa trên kết quả kiểm tra định kỳ kích thước của phôi thai bằng siêu âm [10]

Nghiên cứu đánh giá tuổi thai của trâu sông thông qua kích thước của các số đo bào thai thu từ lò mổ đã được một số tác giả thực hiện ở Ai Cập và

ở Ấn Độ [143; 13] Tuy nhiên, tỉ lệ sai số của tuổi thai thay đổi tuỳ thuộc vào việc sử dụng các số đo khác nhau Các số đo kích thước của phần đầu bào thai cho thấy tốc độ sinh trưởng có sự thay đổi lớn trong suốt quá trình phát triển bào thai Kết quả nghiên cứu cho thấy chiều dài đầu đuôi (crown rump length – CRL) là tiêu chuẩn thích hợp nhất cho việc đánh giá tuổi của bào thai trâu [143; 138; 13; 14]

Sự sinh trưởng của thai có thể được xác định bằng sự gia tăng kích

phát triển bào thai [48] Sự tăng trưởng của các số đo bào thai bị chậm hay

giảm được coi là tín hiệu gia tăng rủi ro cho thai và có thể dẫn đến sự chết

thai [119] Vì vậy mà việc chẩn đoán trước sinh bằng siêu âm nhằm xác định

sự sinh trưởng chậm hay nhanh quá mức của thai và dự đoán tuổi thai là việc

làm cần thiết Siêu âm đã được sử dụng để đo một vài thông số của thai ở

nhiều loài như bò [134], ngựa [114], cừu [72], dê [108] Trái với những

nghiên cứu trên mẫu thu ở lò mổ, chuẩn đoán trước khi sinh bằng siêu âm có

thể cung cấp các thông số ở các giai đoạn phát triển khác nhau của thai một

cách liên tục [15]

Hơn nữa, hiện nay hầu hết các trang trại chăn nuôi vẫn cho trâu giao

phối tự nhiên nên không có thông tin đầy đủ về ngày phối giống cũng như

thời gian mang thai của trâu mẹ và không thể quản lý một cách chính xác thời

điểm trâu có chửa Nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp phần thiết lập một

phương pháp sinh trắc học dựa trên mối tương quan giữa các thông số về kích

thước của các bộ phận, các cơ quan của bào thai với thời gian mang thai làm

cơ sở cho việc đánh giá tuổi thai bằng siêu âm dựa trên các thông số kích

thước này Ngoài ra, việc ứng dụng siêu âm còn có thể chuẩn đoán giới tính

thai và đánh giá trạng thái phát triển của thai [15]

1.1.5 Tương quan giữa các số đo khác nhau của thai

Ở bò, tương quan giữa khối luợng với chiều dài của thai, cũng như với

các thông số khác của thai đã được một số tác giả thông báo Từ năm 1944,

Nichols [113] đã công bố dữ liệu về cân nặng và chiều dài của thai bò Swett

và cộng sự (1948) [152] sự đã bổ sung thêm dữ liệu cho nội dung nghiên cứu

này Winters và cộng sự (1942) [172] đã thông báo kết quả tương quan giữa

khối lượng ở các giai đoạn phát triển khác nhau của thai với các thông số với

các thông số khác Trên cơ sở nghiên cứu các tài liệu đã có, năm 1959

Jakobsen [93] đã xây dựng công thức ước tính tuổi thai bò dựa vào cân nặng,

chiều dài và đặc điểm hình thái của thai Tác giả này còn thông báo công thức

về mối tương quan toán học giữa cân nặng, chiều dài và chu vi đầu của thai Dựa vào số liệu của kích thước thai đã biết chính xác độ tuổi, Thomsen (1975) [155] đã tính được phương trình hồi quy tương quan của các thông số cân nặng và chiều dài với tuổi thai [155; 128] Năm 1996, Sivachelvan và cộng sự [146] cũng đã thông báo kết quả nghiên cứu tuổi thai ước lượng trên

dê và cừu khi dựa vào kích thước thai Suzuki và cộng sự (1991) [151] cũng

đã thông báo về mối liên hệ giữa tuổi thai với kích thước thai trên hươu sao hoang dã Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã thu nhận mẫu vật từ những hươu có chửa sống trong tự nhiên đã bị giết trong mùa săn bắn và nhận thấy với kích thước thai thu được có thể dự đoán thời gian mang thai Gần đây, năm 2008 George và cộng sự [64] đã tiến hành khảo sát tương quan các chỉ số kích thước thai bò ở một phần ba thời gian đầu mang thai Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng CRL là số đo ổn định nhất trong quá trình phát triển thai Ngày nay, quy luật về mối tương quan giữa các thông số về kích thước với tuổi thai đã được thừa nhận và áp dụng rộng rãi

Ở ngựa, bằng sự phân tích hồi quy, Turner và cộng sự (2006) [157] đã xây dựng được một mô hình đường chuẩn sinh trưởng của đường kính hốc mắt qua các giai đoạn phát triển thai Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở giai đoạn sớm và giữa của thai kỳ kích thước các mẫu khá tập trung quanh đường chuẩn tăng trưởng này Nhưng độ biến động của số đo này cao hơn ở giai đoạn sau của thai kỳ Ở giai đoạn sau 240 ngày mang thai, chỉ 6 trong số 96 mẫu quan sát có số đo trùng với đường chuẩn và sau 280 ngày mang thai, không có mẫu nào trùng với đường chuẩn này Hơn nữa, để đánh giá mức độ tương hợp về dữ liệu của ngựa trắng với giống ngựa pony, nhóm nghiên cứu của Turner và cộng sự [152] đã tiến hành theo dõi đường cong sinh trưởng ở mắt bào thai của hai giống ngựa này Tuy nhiên, những dữ liệu thu được ở

giống ngựa pony cho thấy có sự khác biệt với đường chuẩn sinh trưởng được công bố ở giống ngựa trắng Điều này đã củng cố thêm cho giả thuyết của nghiên cứu về hiện tượng kích thước mắt nhỏ hơn ở bào thai giống ngựa pony

so với ngựa trắng [157]

Ở trâu, thời gian hình thành các cơ quan như đầu, thân, và các chi đã được xác định Hình ảnh siêu âm đậm hơn trong khu vực hình thành tủy xương bào thai đã được xem là dấu hiệu bắt đầu sự hoá xương Trong mỗi lần siêu âm, Ali và Fahmy (2008) [10] đều ghi lại đầy đủ các thông số của bào thai như: Chiều dài đầu đuôi (CRL) là một đường thẳng kéo dài giữa đỉnh đầu của bào thai tới gốc đuôi; đường kính của túi màng ối là đường kính rộng nhất của túi ối; đường kính tử cung là đường kính trong của tử cung tại thời điểm

có thai; chiều sâu ngực là khoảng cách từ trên lưng xuống bụng đi qua vị trí của tim; đường kính ở bụng là đường kính lớn tại miền cuống rốn; đường kính cầu mắt là khoảng cách ở giữa mắt rộng nhất và đường kính núm nhau là đường kính lớn nhất trong của núm nhau có tiếp xúc giữa tử cung mẹ và nhau thai [10] Từ những dữ liệu thu được, nhóm tác giả này đã thông báo về mối tương quan giữa chúng với thời gian mang thai

1.1.6 Sự phát triển nhau thai ở động vật nhai lại

Động vật nhai lại bao gồm các loài động vật ăn cỏ bao gồm: bò, trâu, cừu, dê, hươu nai… Phần lớn những loài này có nhau thai dạng núm nhau Một số loài khác ví dụ như lạc đà, mặc dù cũng thuộc nhóm động vật nhai lại nhưng lại có nhau thai dài giống như ở ngựa

Sự làm tổ ở động vật nhai lại là sự gắn kết giữa màng phôi và nội mạc

tử cung của động vật mẹ, tuy nhiên quá trình gắn kết không phá hủy cấu trúc thành tử cung Quá trình làm tổ ở bò bắt đầu ở tuần thứ 5 và ở cừu là 3 tuần sau thụ tinh Nhau thai được hình thành không lâu sau đó Đối với các động

vật có nhau thai dạng núm nhau, thay vì có một khu vực liên kết rộng giữa các hệ thống mạch của mẹ và bào thai, những động vật này có rất nhiều điểm tiếp xúc bằng các núm nhau thai nhỏ

Nhau thai của trâu - bò là dạng mô liên kết - đệm Ngăn cách giữa máu

mẹ và máu thai là 6 lớp tế bào gồm: tế bào màng trong các ống mao mạch của

mẹ, mô liên kết tử cung, biểu mô tử cung, biểu mô đệm, mô liên kết đệm, màng trong của ống mao quản dẫn đệm Lông nhung lá nuôi phôi trên bề mặt của màng đệm được khu trú với số lượng giới hạn tại các khu vực có hình tròn hay hình ovan được gọi là mầm núm nhau Số lượng núm nhau trong một nhau thai bò dao động từ 70 đến 150 cái Các núm nhau nằm phân bố thành 5 dãy bao gồm cả ở sừng tử cung có chứa bào thai và sừng không chứa bào thai (3 dãy ở giữa của sừng và 2 dãy ở phía trước của sừng) Núm nhau ở trâu bò

có dạng lồi và có cuống Khu vực giữa mào của màng trong dạ con chứa tuyến tiết trong suốt thời kỳ mang thai trong khi khu vực mào là không chứa tuyến tiết

Các núm nhau mẹ là phần dày đặc có hình ovan hay hình tròn nằm trong mô của sừng tử cung Các núm nhau mẹ cũng hình thành trong sừng tử cung không chứa bào thai Hơn nữa, chúng là những điểm tiếp xúc duy nhất trong liên kết giữa tử cung và bào thai Sự hình thành các núm nhau mẹ từ những vị trí xác định trên thành tử cung là quá trình phát triển của các tế bào

lá nuôi phôi và hình thành các nhung mao Tại đó các tế bào lá nuôi phôi xâm nhập vào thành tử cung để hình thành các thể hang trong lớp tế bào biểu mô liên kết

Những đặc trưng về mặt hình thái của phần tiếp xúc với màng trong tử cung của núm nhau con ở trâu châu Phi nói chung tương tự như ở bò và trâu nước [116] Sự thay đổi về số lượng và sự phân bố của tế bào có nhung mao ở

2 loài trâu đã được nghiên cứu Kết quả cho thấy tỷ lệ của tế bào có nhung

mao trên bề mặt của biểu mô tử cung ở bò thay đổi từ 1 đến 20 % [139] Mặc

dù không có những mô tả về nhau thai và núm nhau trong giai đoạn sau của quá trình mang thai ở trâu Châu Phi Nhưng Schmidt và cộng sự (2006) [139]

cho thấy độ tương đồng về hình thái nhau thai giữa hai loài trâu S caffer và B

bubalis có lẽ cao hơn khi so sánh hai loài trâu này với bò Đặc điểm tương tự

về mặt hình thái cho thấy mối quan hệ thuộc hệ thống gần loài giữa hai loài trâu; giả thuyết này đã được chứng minh dựa trên kết quả nghiên cứu hình thái cấu trúc xương sọ và những nghiên cứu bằng các kỹ thuật sinh học phân

tử [139]

Hình 3 Thai trâu trong bọng dịch ối Nét đặc trưng nhất của nhau thai động vật nhai lại là sự hiện diện của các tế bào hai nhân hay đa nhân ở ngoại bì Những tế bào này có nguồn gốc từ những tế bào đơn nhân ở màng đệm Chúng có sự phân bào nguyên nhiễm

Núm nhau

Túi ối Thai trâu

của nhân tế bào mà không kèm theo sự phân chia tế bào xảy ra sau đó Những

tế bào hình thành sớm nhất định vị sâu trong lớp lá nuôi phôi và sau đó di cư dần ra vùng ngoài, do vậy trông như chúng hình thành từ bề mặt của núm nhau [174]

Những tế bào hai nhân đầu tiên xuất hiện trước khi phôi làm tổ [164] Chúng có thể được hình thành từ lá nuôi phôi từ ngày thứ 14 sau khi thụ tinh đối với cừu [173] và từ ngày thứ 16- 17 đối với bò Tế bào hai nhân chiếm 15

- 20% tổng số tế bào trong nhau thai thành thục [173; 165] Một phần bảy trong số đó tiếp tục di trú theo hướng biểu mô tử cung tại bất kỳ thời điểm nào trong quá trình mang thai [176] Sự di trú của các tế bào hai nhân đóng vai trò quan trọng trong việc tổ chức lại cấu trúc của nhau thai và phản ứng qua lại với các tế bào biểu mô thành tử cung Những tế bào này tạo thành dạng mô lai ghép của biểu mô nhau thai với biểu mô tử cung (vùng hợp bào) như ở cừu và dê hoặc thành những tế bào lớn (những tế bào ba nhân) thâm nhập vào phần trong biểu mô tử cung như ở bò [177]

Ở bò những tế bào ba nhân có thời gian tồn tại ngắn, chúng được lá nuôi phôi hấp thụ lại sau tự chết Ở cừu quá trình này lại trái ngược, những tế bào hai nhân di trú vào vùng tiếp xúc giữa núm nhau mẹ với núm nhau thai và tạo thành lớp bề mặt chung trong núm nhau Sự di trú này có ý nghĩa quan trọng quan trọng trong quá trình tăng trưởng của nhau thai Đối với nhau thai

bò cái, sự di trú của tế bào hai nhân không có giới hạn [148]

Hình 1.4 Sự di trú và phát triển của tế bào đa nhân [178]

Sự di trú đa nhân (1-3) hình thành những tế bào ba nhân, những tế bào này sẽ

được hấp thụ bởi lá nuôi phôi sau khi tự chết (4-5)

Về cơ bản nhau thai của các động vật nhai lại thuộc dạng biểu mô đệm Nhưng biểu mô tử cung bị thay đổi bởi sự xâm nhập và sự dung hợp của các

tế bào hai nhân Những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc núm nhau của động vật nhai lại cho thấy lớp biểu mô ở thành tử cung dường như bị bào mòn gần hết

và kết quả là lá nuôi phôi gần như tiếp xúc với các mô liên kết của tử cung Ở động vật nhai lại các nhung mao của núm nhau đều có cấu trúc dạng dây chằng [150]

Các tế bào hai nhân có liên quan trực tiếp với quá trình sản xuất progesteron [164; 165; 179], prostaglandins [129], hocmon lactogen nhau thai [161; 178] và glycoprotein thời kỳ có chửa (PAG) [129; 192] Các hoạt chất này được tế bào tạo ra và lưu giữ trong các bóng xuất bào và được tiết trực tiếp vào hệ tuần hoàn của động vật mẹ khi có sự di trú của tế bào hai nhân [175] Thể tích các bóng xuất bào có thể chiếm hơn 50% tế bào chất [150]

1.1.7 Hocmon nhau thai

Ngoài vai trò đảm bảo sự trao đổi chất giữa cơ thể mẹ và bào thai trong suốt quá trình mang thai, nhau thai còn có vai trò như một cơ quan nội tiết Nhau thai tổng hợp một số lượng lớn các loại hocmon và cytokinin có ảnh hưởng chủ yếu tới chức năng sinh lý của bào thai, buồng trứng và tử cung ở động vật có vú Trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung chủ yếu vào hocmon protein được sản xuất bởi nhau thai (PAG và lactogen thuộc nhau thai) Quá trình tổng hợp các hocmon dạng peptide và hocmon dạng proteintrong nhau thai thay đổi tùy theo loài Chúng có ảnh hưởng tới hệ thống nội tiết của mẹ, sự trao đổi chất của bào thai trong giai đoạn mang thai và giai đoạn sơ sinh

Gonadotropin nhau thai: tên hocmon cho thấy những hocmon này có

ảnh hưởng kích thích các tuyến sinh dục, tương tự như gonadotropin thuộc tuyến yên Chỉ các loài linh trưởng và ngựa là có sản xuất gonadotropin từ nhau thai

Loại hocmon này ở người được gọi là gonadotropin nhau thai người (humam chorionic gonadotropin) hay viết tắt là hCG Chúng được sản xuất bởi những tế bào lá nuôi phôi Nó là tín hiệu tác động lên các thụ thể trong các tế bào của thể vàng và có tác dụng ngăn ngừa sự thoái hoá thể vàng Vì vậy, hCG có vai trò như tín hiệu nhận biết sự có chửa Gonadotropin nhau thai ngựa cũng được tạo ra bởi các tế bào lá nuôi phôi

Relaxin: hocmon này có tác động tương hỗ với progesteron để duy trì

sự tồn tại và phát triển của thai Nó cũng có tác động làm giãn dây chằng xương chậu ở giai đoạn cuối của thời kỳ thai ghén và vì vậy được xem là có chức năng trong hỗ trợ qúa trình sinh Ở một số loài relaxin được tạo ra từ nhau thai trong khi ở các loài khác nguồn sản xuất chính là thể vàng Ở một

số loài khác thì relaxin được tạo ra từ cả thể vàng và nhau thai

Lactogen nhau thai: hocmon này có sự tương đồng về cấu trúc phân

tử với hocmon sinh trưởng và tiền lactin Chúng được phát hiện ở hầu hết các loài linh trưởng, động vật nhai lại và gặm nhấm nhưng ở một số loài thuộc nhóm này không thấy có sự tổng hợp loại hocmon này Vai trò của lactogen thuộc nhau thai chưa được nghiên cứu một cách tường tận; có thể chức năng chủ yếu của chúng là tham gia điều chỉnh sự trao đổi chất giữa mẹ và bào thai

và huy động dinh dưỡng cho bào thai Ở một số loài, chúng kích thích chức năng của thể vàng và tham gia vào sự phát triển của tuyến vú trước khi sinh

1.2 Nghiên cứu về glycoprotein thời kỳ có chửa (PAG)

1.2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu PAG

Từ năm 1982, Butler và cộng sự [32] đã phân lập được hai protein đặc hiệu từ nhau thai bò bằng phương pháp tạo các kháng huyết thanh kháng toàn

bộ các protein của nhau thai và sau đó sử dụng mô sinh dưỡng để gắn kết với các kháng huyết thanh được tạo ra Mục đích của việc này là để loại bỏ các kháng thể kháng các protein không đặc hiệu nhau thai và chọn lọc các kháng thể đặc hiệu Một trong số các protein này là protein đặc hiệu giai đoạn mang thai A (pregnancy specific protein- A - PSPA) có phân tử nặng 65-70 kDa, điểm đẳng điện (isoelectric point – PI) khoảng 4.6-4.8, và có phản ứng đặc trưng với α1-fetoprotein của bò trong xét nghiệm khuếch tán miễn dịch Protein thứ hai là protein đặc hiệu mang thai B (PSPB) có khối lượng phân tử 47-53 kDa, và các điểm đẳng điện 4.0-4.4 PSP-B và là một kháng nguyên mới được phát hiện [32]

Vào năm 1988, Beckers và cộng sự [28] công bố công trình tinh sạch từ nhau thai bò một loại gonadotropin mới có khối lượng phân tử vào khoảng 30 kDa; loại gonadotropin này sau đó được xác định thuộc họ các proteinase aspartic: boPAG-2 [182] Sau đó, các tác giả này cũng công bố kết quả phân

lập được một loại protein đặc hiệu trên bò đang mang thai với mức tinh sạch cao hơn và không có chức năng duy trì thể vàng [28] Năm 1990, Zoli và cộng sự [184] thông báo kết quả phân lập từ nhau thai cừu một protein đặc trưng cho giai đoạn mang thai với khối lượng phân tử và điểm đẳng điện của protein tương tự khối lượng phân tử và điểm đẳng điện của PSPB (60 kDa và 5.5) [192] Bằng phương pháp RIA đặc hiệu đánh giá độ tinh sạch của protein

có chửa ở bò đã được Beckers và cộng sự mô tả (1988)[28]

Humblot và cộng sự (1988) [84] phân lập được một protein giai đoạn mang thai giống với protein đã được thông báo bởi Beckers và cộng sự (1988) [28] Protein đặc hiệu có chửa này có khối lượng phân tử nặng 60 kDa và có tên là Protein huyết thanh giai đoạn mang thai 60 (pregnancy serum protein

60 - PSP60) Nó có 39 đầu NH2 trình tự amino acid được xác định dựa trên cDNA của bPAG [176] Hai đầu NH2 của PSP60 phản ứng với asparagine trong cDNA của bPAG không xác định được do chúng có liên kết dạng oligosaccharid Phần lớn những protein bPAG và PSP60 là một trong 5 dạng biểu hiện của PSPB và có khối lượng khác nhau tùy theo cấu trúc phân tử

Zoli và cộng sự cũng thông báo đã tinh sạch được một protein đặc trưng nhau từ thai của thai bò [180] Các tác giả đã sử dụng kháng huyết thanh được tạo ra bởi Beckers và cộng sự (1988) [28] để đánh giá hoạt tính của chúng Sau quá trình tinh sạch qua các bước giải phóng mẫu, xử lý bằng đệm (NH4)2SO4, gắn gel Diethyl Amino Ethyl (DEAE)-cellulose, rửa gel, sắc

ký lỏng cao áp (cột MonoQ và MonoP), các tác giả đã tách được một phân đoạn protein có khối lượng phân tử 67 kDa, và có 4 điểm đẳng điện là 4.4, 4.6, 5.2, 5.4 Nhóm tác giả gọi protein này là glycoprotein thời kỳ có chửa (pregnancy associated glycoprotein - PAG) Theo Zoli và cộng sự (1992) [181], PAG có trình tự đầu NH2 như sau: Arg-Gly-Ser-x-Leu-Thr-Thr-His-Pro-Leu Tuy số lượng điểm đẳng điện, gốc acid sialic và biểu hiện phản ứng

miễn dịch là tương đối giống nhau, nhưng cả bốn đoạn protein này đều có dạng có cấu trúc cơ bản [119; 120]

Năm 1997, Xie và cộng sự [178] đã tinh sạch được bốn dạng PAG có trọng lượng phân tử khác nhau từ môi trường nuôi cấy mô nhau thai cừu ở ngày mang thai thứ 100 Bằng quá trình tinh sạch bao gồm các bước: kết tủa bằng dung dịch (NH4)2SO4, lọc qua gel sepharose blue, tiếp tục lọc qua gel DEAE-Sepharose, lọc phân đoạn bằng sắc ký cao áp lỏng (MonoS) Những PAG này có phản ứng chéo với ba dạng kháng thể kháng PAG-1 Trọng lượng phân tử của những protein này là: 55, 60, 61 và 65 kDa [178]

Vào những năm 1997-1998, Garbayo và cộng sự (1998) [57] đã phân lập và mô tả đặc tính không gian của ba phân tử PAG khác nhau từ nhau thai cừu Quá trình phân lập và kiểm tra bằng RIA bất tương đồng, bao gồm việc hoà tan protein trong dung dịch đệm KH2PO4 có pH trung hoà, kết tủa bằng acidic và (NH4)2SO4, lọc qua gel và cột trao đổi ion Ba PAG này có trình tự acid amin khác nhau và khối lượng phân tử là 55, 59 và 62 kDa Những protein này cũng có biểu hiện một vài dạng cấu trúc khác nhau đối với mỗi mức khối lượng phân tử: PAG55 (pI: 5.3, 5.1, 4.9; trình tự đầu NH2: Ile-Ser-Ser-Pro-Val-Ser-x-Leu-Thr-Ile), PAG59 (pI: 6.2, 5.9, 5.6; trình tự đầu NH2: Arg-Gly-Ser-x-Leu-Thr-Thr-Leu-Pro-Leu) và PAG62 (pI: 5.1, 4.8; trình tự đầu

NH2: Arg-Asp-Ser-x-Val-Thr-Ile-Val-Pro-Leu) [57]

Huang và cộng sự (1999) [82] cũng đã phân lập, tinh sạch và mô tả đặc tính không gian của protein đặc hiệu mang thai từ nhau thai của nai sừng tấm Bắc Mỹ và nai Axet Các tác giả đã sử dụng phương pháp PSPB - RIA để giám sát quá trình tinh sạch (phân lập, acid hoá và kết tủa bằng (NH4)2SO4, lọc gel, trao đổi ion, sắc ký ái lực) Protein từ nhau thai nai sừng tấm Bắc Mỹ

có khối lượng phân tử là 58 và 31 kDa, trong khi đó khối lượng phân tử của protein nhau thai nai Axet là 31, 45 và 57 kDa

Bằng chứng về sự có mặt của PAG-1 trong quá trình mang thai trên bò

zebu (Bos indicus) đã được thông báo bởi Sousa và cộng sự (2000) [142] El

Amiri và cộng sự (2000) [47] đã nghiên cứu phản ứng miễn dịch của dịch

chiết của nhau thai bò Bos taurus taurus và bò Bos taurus indicus bằng

phương pháp khuyếch tán miễn dịch đúp đồng tâm đối với hai kháng thể kháng boPAG-1 và boPAG-2 Nhóm tác giả đã quan sát thấy các dịch chiết cho phản ứng kết tủa giống nhau đối với kháng thể kháng boPAG-1 (2 vạch kết tủa) Trong khi đó, đối với phản ứng kháng kháng thể boPAG-2, các dịch

chiết từ bò Bos taurus taurus cho 2 vạch kết tủa còn các dịch chiết từ bò Bos

taurus indicus chỉ cho 1 vạch kết tủa Tiếp tục tinh sạch các dịch chiết theo phương pháp của Zoli và cộng sự (1991) [180], tác giả đã thu được một loại protein có khối lượng phân tử 67 kDa, và có trình tự amino acid đầu N giống với boPAG-1

El Amiri và cộng sự (2002) [48] cũng đã thông báo kết quả nghiên cứu phân lập và mô tả đặc điểm cấu trúc của PAG từ nhau thai của cừu Sử dụng phương pháp RIA bất tương đồng đối với phản ứng miễn dịch của từng phân đoạn sau khi được phân lập, các tác giả này đã công bố ba dạng PAG ở cừu mang thai là: ovPAG55 (pI: 4.0, 4.3, 4.7, 5.0, 5.9), ovPAG57 (pI: 4.1, 4.5, 5.5),

và ovPAG59 (pI: 4.5, 4.8, 5.0)

Gần đây, phương pháp được sử dụng trong các nghiên cứu tách chiết

PAG thường dùng gel Vicia villosa [97; 98; 99].Do vậy, phương pháp sắc ký hấp phụ lectin-based có thể là công cụ hữu dụng trong việc làm giàu PAG từ quá trình tách chiết từ nhau thai các loài nhai lại [98; 96] kết quả tinh sạch PAG trên trâu được Barbato và cộng sự [18] thông báo lần đầu tiên Vào năm

2003 Đến năm 2005, Singh và cộng sự [140] có thông báo về đặc điểm điện

di của dịch chiết từ nhau trâu Ấn Độ Tuy nhiên trong nghiên cứu này nhóm tác giả đã không nêu phương pháp tinh sạch Năm 2006, Carvalho và cộng sự

(2006) [34] đã sử dụng phương pháp dùng gel Vicia villosa agarose và kỹ

thuật sắc ký hấp thụ để làm giàu các protein PAG từ hợp bào nhau thai trâu sữa Italia Những nghiên cứu này đã dẫn đến giả thuyết phân tử PAG có nhiều dạng biểu hiện khác nhau Năm 2008, Barbato và cộng sự [19] đã thông báo

về kết quả tinh sạch được PAG mới từ nhau thai trâu bằng phương pháp Vicia

villosa agarose sắc k ý hấp phụ

Đối với các loài động vật nhai lại hoang dã, các kháng nguyên huyết thanh giống với PAG hay PSPB đã được tìm thấy trong máu ngoại vi của nhiều loài như hươu la (mule deer) [168], hươu tai trắng [168; 116], dê núi [81], hươu đỏ [69], hươu xạ [130], bò Bison [70], nai [69; 83], hươu sao [164; 165], nai sừng tấm [83; 164], hươu hoang dã [164; 167] và tuần lộc [131; 128] Gần đây việc tinh sạch và mô tả đặc điểm của protein đặc hiệu có chửa mới trên các loài bò bison [96], trâu [19], nai và nai sừng tấm [82] đã được công bố; trình tự cDNA của một vài phân tử PAG (cePAG.1 tới 9) của hươu tai trắng [155] cũng đã được thông báo Các kết quả này sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu mới liên quan đến hàm lượng PAG trong máu ngoại vi, cấu trúc

và hệ thống phát sinh gốc của họ lớn glycoprotein nhau thai biểu hiện aspartic proteinase glycoprotein [145]

1.2.2 Chức năng của PAG

Kết quả nghiên cứu cấu trúc phân tử [68] cho thấy PAG có ranh giới rõ ràng của vị trí kết hợp peptide (peptide-binding cleft) với cấu trúc thích hợp đối với các gắn kết cơ bản liên quan đến các polypeptid kỵ nước Những nghiên cứu cũng dẫn đến giả thiết PAG không hoạt động như dạng enzyme phân huỷ protein

Dựa vào kết quả thông báo trong các nghiên cứu khác nhau của Xie và cộng sự (1991) [176], Roberts và cộng sự (1996) [125] giả thiết rằng PAG có chức năng nội tiết và những protein này có khả năng gắn vào các thụ thể đặc

hiệu của các tế bào đặc hiệu Nó cũng hoạt động giống những kênh truyền tín hiệu độc lập như trường hợp Pepstatin A Bằng cách này, chúng có thể có hoạt động như một kênh vận chuyển các phân tử qua màng tế bào Những gắn kết đặc hiệu của các phân tử PAG khác nhau là khác nhau và có thể làm thay đổi chức năng chính của chúng Roberts và cộng sự (1996) [125] giả thuyết rằng PAG có thể cạnh tranh với phức hệ tương hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex- MHC) trong trình diện peptid của quá trình trình diện kháng nguyên

Vai trò nội tiết của PSPB đã được Austin và cộng sự (1999) [16] đề xuất, nhóm nghiên cứu đã quan sát thấy hàm lượng PSPB tăng lên khi nhau thai giải phóng alpha chemokine vốn được xác định là protein-2 hoá định hướng tế bào hạt (granulocyte chemotactic protein-2) Giống với protein-2 hoá định hướng tế bào hạt, PSPB cũng xuất hiện trong tác động cảm ứng IFN-tau trong giai đoạn sớm của quá trình mang thai Ngoài việc kết hợp với quá trình làm tổ, PAG cũng có thể liên quan đến quá trình co tử cung sau khi sinh

Del Vecchio và cộng sự [90; 91] đã bổ sung PAG-1 vào môi trường nuôi tế bào thể vàng để nghiên cứu tác động của nó lên quá trình tổng hợp progesteron, PGF2alpha, PGE2 và oxytocin Các tác giả đưa ra giả định PSPB không kích thích trực tiếp lên quá trình tạo P4, mà kích thích quá trình tạo PGE2 là một chất có tiềm năng kích thích thể vàng tạo P4 [90] Trong những thí nghiệm khác trên tế bào thể vàng nhóm nghiên cứu nhận thấy xử lý PSPB làm tăng tiết P4 [91], tương tự như thông báo của Weems và cộng sự (1998) [162] về sự tác động của PSPB lên quá trình tạo P4 của thể vàng bò vào giữa thai kỳ Những nghiên cứu này dẫn đến kết luận rằng PSPB không có vai trò trực tiếp trong việc duy trì thể vàng trong suốt quá trình mang thai

1.2.3 Biểu hiện của PAG ở các động vật nhai lại

Nghiên cứu trình tự của PAG đã được thực hiện bởi Green và cộng sự (2000) [65] Các tác giả nhận thấy biểu hiện cấu trúc phân tử của PAG có tính không gian và tính tạm thời trong suốt quá trình mang thai Một vài phân tử PAG có mặt trong lá nuôi, trong khi một số khác được tìm thấy phần lớn trong các tế bào hợp bào (bảng 1.4)

Bảng 1.4 Sự biểu hiện của các phân tử PAG trong hợp bào nhau thai [65] Biểu hiện trong hợp bào nhau thai Biểu hiện thông qua lá nuôi phôi ovPAG-1 boPAG-1 boPAG-14 ovPAG-2 boPAG-2

ovPAG-8 boPAG-9 boPAG-20

boPAG-11 boPAG-10 boPAG-9 boPAG-8 boPAG-7 boPAG-6 boPAG-5 boPAG-4 boPAG-2 boPAG-1

Ngày mang thai Hình 1.5 Đồ thị biểu hiện sự tồn tại của các phân tử PAG trên bò trong suốt quá trình mang thai [65] Khoảng thời gian biểu hiện được thể hiện bằng

đường đậm màu đen, trạng thái mang thai được thể hiện bằng thang thời gian theo ngày phía dưới

Ba phân tử PAG khác nhau đã được tinh sạch từ nhau thai dê và đã được mô tả cấu trúc phân tử [57] Những protein này có trình tự amino acid

và khối lượng phân tử khác nhau [181; 175], và biểu hiện thành một vài dạng cấu trúc pI khác nhau: caPAG55kDa (pI: 5.3, 5.1, 4.9), caPAG59kDa (pI: 6.2, 5.9, 5.6) và caPAG62kDa (pI: 5.1, 4.8) Các phân tử PAG thường có biểu hiện tương đồng cao về trình tự phân tử (giống nhau từ 60 tới 73 %) và có từ 30 tới 81 % trình tự của 21 amino acid đầu giống với các protein họ aspartic proteinase như boPAG.1, ovPAG.1, boPAG.2, SBU-3 pepsinogen F của thỏ và PAG ngựa [57] Garbayo và cộng sự (2000) [58] đã mô tả tổng số 11 trình tự cDNA của phân tử PAG nhau thai dê trong ngân hàng gene (từ caPAG.1 tới caPAG.11) Chín trong số những phân tử này (caPAG.1, caPAG.3 tới caPAG.7 và caPAG.9 tới caPAG.11), có tên chung là nhóm caPAG.1 vì chúng có trình tự giống nhau đến hơn 80% và cùng xuất hiện trong tế bào hợp bào nhau thai Ngược lại, nhóm caPAG.2 (như boPAG.2 và ovPAG.2) được tìm thấy trong hợp bào lá nuôi trong giai đoạn sớm của quá trình mang thai (ngày 18 và ngày 19) PAG này cũng được tìm thấy trên bò caPAG.2 là nhóm được nghiên cứu sớm hơn so với các PAG trong nhóm caPAG.8 mới được nghiên cứu gần đây [145]

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu lactogen nhau thai

1.3.1 Tổng quan tài liệu về PL

Josimovich và MacLaren (1962) [89] đã thông báo về sự tồn tại một protein có phản ứng chéo với kháng thể kháng hocmon tăng trưởng trên người

và sau đó protein này được xác định là lactogen nhau thai người (human placental lactogen -hPL) Trong nhiều tài liệu, hocmon somatomammotropic

nhau thai được sử dụng để mô tả PL, đặc biệt trong ngân hàng gene (e.g GenBank) Hocmon PL đã được định lượng ở các loài linh trưởng, gặm nhấm

và nhai lại, tuy nhiên không có trên một số loài [11]

Ở các loài nhai lại, PL là thành viên của nhóm protein somatotropin Nhóm hocmon dạng prolactin được tổng hợp bởi tế bào hợp bào nhau thai Cấu trúc phân tử và đặc điểm sinh học của nhóm hocmon này đã được nghiên cứu trên bò [182], và trên cừu [29] Đối với các loài động vật nhai lại, khối lượng phân tử của hocmon họ prolactin lớn hơn so với các hocmon protein khác và chúng có sự gắn kết với thụ thể của cả hai loại tế bào tạo sữa và tế bào sinh dưỡng [30] Khối lượng phân tử của PL cừu và dê vào khoảng 23.000 kDa, trong khi PL bò có trọng lượng phân tử lớn hơn (từ 31.000 tới 34.000 kDa)

Nghiên cứu về PL của các loài động vật nhai lại đã được bắt đầu bằng công trình mô tả PL của dê do Buttle và cộng sự [29] thực hiện vào năm

1972 Nghiên cứu tinh sạch và mô tả cấu trúc PL của loài này đã được triển khai vào các năm tiếp theo [22] Từ năm 1990, PL dê đã được tinh sạch thành dạng đồng nhất [37] Hiện nay, trình tự amino acid ban đầu của PL cừu đã được xác định Trình tự PL giữa hai loài này cũng được xác định là có độ tương đồng rất cao

Ở bò, kết quả tinh sạch PL đã dẫn đến việc phát triển hệ thống RIA để định lượng hocmon này [23; 32; 79] Từ những năm 1976, Kelly và cộng sự [95] đã sử dụng phân tích miễn dịch phóng xạ để xác định hàm lượng PL trong suốt quá trình mang thai trên bò sữa và bò thịt [95] Vào các năm tiếp theo, Beckers và cộng sự (1982) [23] lần đầu tiên thông báo kết quả định lượng hàm lượng PL trong máu bò mẹ và thai bằng cách sử dụng RIA tương đồng dựa vào sản phẩm tinh sạch PL tự nhiên (nbPL; dạng glycosylat) Các tác giả này cho thấy ở một vài mẫu bò mang thai (từ ngày thứ 100 đến lúc đẻ),

hàm lượng PL không bao giờ vượt quá 2 ng/ml Mặt khác, bằng cách sử dụng

độ nhạy của phương pháp RIA (5–10 pg/mp), nhóm nghiên cứu này đã xác định được hàm lượng PL trong máu bò mẹ cao hơn so với trong máu thai Hàm lượng PL trong máu bò mẹ giảm từ 25–30 ng/ml ở ngày thứ 90 của thai

kỳ xuống 5–15 ng/ml vào lúc đẻ Kết quả tương tự về hàm lượng bPL trong máu thai cũng được Byatt và cộng sự (1987) [30] thông báo Tuy vậy, theo Alvarez-Oxiley và cộng sự (2007) [12], hoạt tính sinh học của hocmon nhau thai này trong máu mẹ và thai vẫnchưa được nghiên cứu đầy đủ

Hiện nay PL của một số loài nhai lại đã được tổng hợp bằng kĩ thuật tái

tổ hợp Krivi và cộng [100] đã nghiên cứu PL bò tái tổ hợp từ năm 1989 Đến năm 1997, Sakal và cộng sự [132] đã tổng hợp PL cừu tái tổ hợp Việc sản xuất PL tái tổ hợp trong phòng thí nghiệm [132] đã cung cấp một lượng đủ

lớn hocmon này cho các nghiên cứu in vivo ở những động vật lớn, cũng như

đủ để đáp ứng cho các nghiên cứu về cấu trúc phân tử [154] Trong năm

2000, Leibovich và cộng sự [104] đã thông báo kết quả nghiên cứu sự tương đồng trong tác động in vivo của oPL và oGH bằng cách sử dụng hai loại hocmon này trong các thí nghiệm kích thích tăng trưởng và tạo sữa trên cừu [60]

bPL cDNA biểu hiện rất hiệu quả trên chủng Escherichia coli và nhờ

đó bPL tái tổ hợp được tạo ra có độ đồng nhất cao [136] Không như đối với

PL tự nhiên, PL tái tổ hợp không thuộc dạng glycosylat, và có khối lượng phân tử là 27 kDa [136] Dạng deglycosylat của bPL tự nhiên không có tác động kích thích như dạng prolactin, điển hình trong thí nghiệm kích thích sự tăng số lượng tế bào lympho một cách nhanh chóng Trong những thí nghiệm này, dạng deglycosylat của bPL tự nhiên đã bộc lộ tiềm năng kích thích tương ứng với bPRL và oPRL [31] Vashdi và cộng sự [153] cũng nhận thấy

hocmon bPL tái tổ hợp cũng có khả năng gắn kết với thụ thể trung gian tế bào soma 3T3-L1 hay 3T3-F442A tương tự như hGH và oGH [153]

1.3.2 Chức năng PL

Hocmon PL lưu thông cả trong hệ tuần hoàn của mẹ và thai Đối với các loài linh trưởng, PL là hocmon thuộc tuyến yên và duy trì trong suốt quá trình mang thai Chức năng của PL liên quan đến sự tăng trưởng của thai, sự trao đổi chất và kích thích tiết sữa ở cơ thể mẹ [158] Đối với các động vật nhai lại PL đã được xem là có vai trò trung gian trong trao đổi chất, kích thích tăng trưởng của thai, tăng trưởng của tuyến sữa và kích thích tiết và tổng hợp các hocmon steroid từ buồng trứng Mặc dù vậy cho đến nay, vai trò của chúng trong quá trình mang thai vẫn chưa được làm rõ Hàm lượng PL biến động rất lớn ở các cá thể khác nhau nhưng đều không ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sống của thai Hơn nữa, do hàm lượng của chúng rất thấp nên rất khó tinh sạch một lượng hocmon PL tự nhiên đủ lớn để tiến hành các nghiên

cứu kiểm tra hoạt tính sinh học trong điều kiện in vivo đối với loài các loài gia

súc Việc sản xuất được rPL bò [32] và rPL cừu [36] đã tạo ra thuận lợi rất lớn trong các nghiên cứu tìm hiểu chức năng của PL trên các loài nhai lại

Ở giai đoạn mang thai hàm lượng mARN của PL trong huyết thanh và trong núm nhau cừu chiếm tới 80% mARN tổng số trong các loại mẫu này [93] Nghiên cứu tìm hiểu chức năng của oPL trên cừu đã được tiến hành theo một số phương thức như: định lượng oPL trong các điều kiện chăn nuôi bị giới hạn về dinh dưỡng và chăm sóc [28; 21], hoặc nghiên cứu tương quan hàm lượng oPL lưu thông trong máu mẹ và thai [37; 135] Các nghiên cứu trên cho thấy oPL liên quan chặt chẽ với sự phát triển của thai, có tác dụng kích thích thai tăng cường trao đổi chất Mặc dù đây vẫn chưa phải là một kết luận chính thức [13], nhưng nghiên cứu của những tác giả này dẫn đến giả thiết rằng oPL đóng vai trò trung gian trong quá trình phát triển của thai Việc