Tổng hợp các alkyl cacboxylat của naphthol as; as-ol; as-ca làm cơ chất nhuộm esterase đặc hiệu tế bào bạch cầu dòng mono

Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu phương pháp mới nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm đặc hiệu dòng monoxit tế bào bạch cầ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu hợp chất Naphtol AS-thế cacboxylat 3

1.2 Tổng hợp este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat 4

1.3 Tính chất của các alkyl cacboxylat của 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxthế)carbamoyl]naphtalen-2-ylat 7

1.3.1 Tính chất vật lý 7

1.3.2 Tính chất phổ 8

1.3.3 Tính chất hóa học 8

1.4 Ứng dụng để nhuộm esteraza bạch cầu người 10

1.4.1 Bệnh bạch cầu cấp và phân loại thể bệnh 10

1.4.2 Giới thiệu về esteraza 11

1.4.3 Cơ chất dùng trong nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người 16

CHƯƠNG 2 - THỰC NGHIỆM 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3 Hóa chất và thiết bị 19

2.3.1 Hóa chất 19

2.3.2 Các dụng cụ và thiết bị 19

2.4 Các phần mềm sử dụng 21

2.5 Sơ đồ phản ứng chung và các quy trình thực nghiệm 21

2.6 Thực nghiệm 22

2.6.1 Tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA 22

2.6.2 Quy trình thực nghiệm tối ưu hóa phản ứng nhuộm enzym 25

3.1 Tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL và AS-CA bằng phương pháp truyền thống [5, 7] 29

3.2 Nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng nhuộm esteraza 43

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của cơ chất đến kết quả nhuộm 47

KẾT LUẬN 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các hợp 3-( N-phenyl thế)naphtalen-2-yl cacboxylat đã được thương mại

hóa 4

Bảng 1.2 Bảng phân loại bệnh ung thư máu dòng mono theo FAB bổ sung Marker và di truyền [8] 14

Bảng 2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất của phản ứng 22

Bảng 2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất tham gia phản ứng đến hiệu suất của phản ứng 23

Bảng 2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng 23

Bảng 2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất 24

Bảng 2.5 Các nhân tố và mức được xét trong mô hình thực nghiệm 26

Bảng 2.6 Bảng ma trận mô hình mẫu nhân tố thực nghiệm 27

Bảng 3.1 Bảng kết quả tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA 35

Bảng 3.2 Kết quả số liệu phổ IR và ESI-MS của các naphtol AS-thế cacboxylat 37

Bảng 3.3 Kết quả dữ liệu phổ 1H-NMR của 3-(N-thế-cacbamoyl) naphtalen-2-yl cacboxylat 38

Bảng 3.4 Kết quả nhuộm theo phương pháp nhân tố thực nghiệm 43

Bảng 3.5 Hiệu suất thu được ở vùng tối ưu 45

Bảng 3.6 Độ nhạy và độ đặc hiệu của các cơ chất 3-[(N-phenyl thế) cacbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat tổng hợp được 49

Bảng 3.7 Điểm nhuộm của các naphtol AS thế cacboxylat 49

DANH MỤC HÌNH

Sơ đồ 1.1 4

Sơ đồ 1.2 4

Sơ đồ 1.3 5

Sơ đồ 1.4 5

Sơ đồ 1.5 6

Sơ đồ 1.6 6

Sơ đồ 1.7 7

Sơ đồ 1.8 7

Sơ đồ 1.9 9

Sơ đồ 1.10 9

Sơ đồ 1.11 10

Sơ đồ 1.12 16

Sơ đồ 1.13 17

Sơ đồ 1.14 17

Sơ đồ 2.1 .21

Sơ đồ 3.1 29

Sơ đồ 3.2 30

Sơ đồ 3.3 30

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của bản chất dung môi đến hiệu suất của phản ứng 31

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ tác nhân tham gia phản ứng đến hiệu suất của phản ứng 32

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng 33

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất của sản phẩm 34

Hình 3.5 Ảnh chụp sắc ký bản mỏng của Naphtol AS-OL butanoat tổng hợp theo phương pháp truyền thống (ảnh trái) và phương pháp cải tiến (ảnh phải) 36

Hình 3.6 Phổ IR của Naphtol AS-OL butanoat 40

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR của Naphtol AS-OL butanoat 41

Hình 3.8 Phổ ESI - MS của Naphtol AS-OL butanoat 41

Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân mảnh của hợp chất Naphtol AS-OL butanoat (3b3) 42

Hình 3.9 Đồ thị Pareto các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất nhuộm esteraza dòng mono 44

Hình 3.10 Ảnh nhuộm naphtol AS propanoat 50

Hình 3.11 Ảnh nhuộm naphtol AS-CA axetat 50

Hình 3.12 Ảnh nhuộm naphtol AS axetat không có chất ức chế NaF 50

Hình 3.13 Ảnh nhuộm naphtol AS axetat có chất ức chế NaF 50

DMSO Dimethyl sulfoxide

EC Uỷ ban Enzym (The enzyme commission )

NSE Nhuộm Esteraza không đặc hiệu (Esteraza)

NSE+NaF Nhuộm Esteraza không đặc hiệu với chất ức chế là NaF

FAB Hội các nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ (French-American-British) IUB Hiệp hội Hóa sinh quốc tế (International Union of Biochemistry) L1 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho đã biệt hóa (Acute lymphoblastic) L2 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho chưa biệt hóa (Acute

lymphoblastic) L3 Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại Burkitt (Acute

lymphoblastic) M0 Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ biệt hóa tối thiểu (Minimally

differentiated acute myeloid)

M1 Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ không có tế bào trưởng thành (Acute

myeloblastic without maturation)

M2 Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ có tế bào trưởng thành (Acute

myeloblastic with maturation)

M3 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tuỷ (Acute promyelocytic)

M4 Bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ-monoxit (Acute myelomonocytic)

M5 Bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit (Acute monocytic)

M6 Bệnh bạch cầu cấp dòng hồng cầu (Erythroleukemia) M7 Bệnh bạch cầu cấp dòng tiểu cầu (Acute megakaryoblastic) NaOH Sodium hydroxide

EGME ethylene glycol monomethyl ether

NaOH Sodium hydroxid

NaF Sodium fluorid

NAS Naphtol AS (Naphthol AS)

NASD Naphtol AS-D (Naphthol AS-D)

NASDCl Nhuộm esteraza đặc hiệu (Naphthol AS-D chloroaxetat) Tnc Nhiệt độ nóng chảy

Ts Nhiệt độ sôi

WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)

MỞ ĐẦU

Bệnh bạch cầu cấp hay còn gọi là bệnh ung thư máu là một nhóm bệnh của

cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% các bệnh về máu [1] Cũng như các bệnh ung thư khác, bệnh có xu hướng ngày càng tăng do môi trường ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất da cam đioxin do chiến tranh để lại [2] Theo thống kê của tổ chức sức khỏe thế giới WHO năm 2018, ở Việt Nam, tỉ lệ ca mắc mới bệnh ung thư máu chiếm 3.99% và đứng thứ 7 và tỉ lệ người chết chiếm 4.55%, đứng thứ 5 trong các bệnh ung thư [24] Đặc trưng của bệnh là sự tăng sinh quá mức của các tế bào non ác tính lấn át các tế bào tủy và xuất hiện ở máu ngoại vi Đặc điểm của các tế bào này là có sự rối loạn về protein và cấu trúc tế bào

Bệnh gồm nhiều thể loại khác nhau, theo tiêu chuẩn của các nhà khoa học Pháp, Mỹ và Anh (gọi tắt là tiêu chuẩn FAB) được ký hiệu từ M0 đến M7 và L1 đến L3 [22] Việc xác định đúng, nhanh chóng thể bệnh có vai trò quyết định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụng các phác đồ điều trị có hiệu quả cho người bệnh Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào ung thư máu theo tiêu chuẩn FAB chủ yếu dựa trên kết quả của ba phương pháp: miễn dịch, di truyền và nhuộm hóa học tế bào Phương pháp miễn dịch và di truyền được làm trên các máy móc hiện đại nên độ chính xác cao, nhưng giá thành đắt, khó tiếp cận đối với bệnh nhân nghèo Do dễ thao tác, giá thành thấp hơn so với hai phương pháp trên, nên nhuộm hóa học tế bào vẫn được dùng rộng rãi trong nhiều bệnh viện và cơ sở nghiên cứu ở Việt Nam

Nhuộm hóa học tế bào gồm nhiều kỹ thuật, trong đó nhuộm esteraza không đặc hiệu dùng cơ chất naphtol AS axetat ức chế bằng NaF được sử dụng để phân loại tế bào monoxit với dòng tủy Bình thường, phản ứng nhuộm esteraza lên dương tính ở tất cả các dòng tế bào vì thế được gọi là kỹ thuật nhuộm không đặc hiệu, khi

sử dụng NaF làm chất ức chế thì chỉ có dòng tế bào monoxit bị ức chế hoàn toàn Dựa vào đặc tính này để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit với các dòng tế bào khác Kỹ thuật phát hiện enzyme esteraza chịu sự tác động của rất nhiều yếu tố như: nhiệt độ, thời gian nhuộm, nồng độ cơ chất, tác dụng của chất ức chế và

hoạt hóa, dễ dẫn đến kết quả sai khác so với yêu cầu của phân loại bạch cầu của FAB dẫn tới nhận định sai kết quả, ảnh hưởng đến hiệu quả khám chữa bệnh và gây tốn kém cho người bệnh

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono” là một đề tài có

ý nghĩa khoa học, thực tiễn và xã hội sâu sắc

Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu phương pháp mới nhằm nâng cao hiệu

suất tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm đặc hiệu dòng monoxit tế bào bạch cầu người phục vụ việc khám và điều trị bệnh ung thư máu

Nội dung của nghiên cứu:

1 Nghiên cứu phương pháp tổng hợp cơ chất alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA;

2 Xác định cấu trúc của các hợp chất tổng hợp bằng các phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (IR, ESI-MS và 1H-NMR);

3 Sử dụng hợp chất tổng hợp được làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng monoxit bạch cầu người phục vụ phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hợp chất Naphtol AS-thế cacboxylat

Naphtol AS-thế cacboxylat có cấu trúc như sau [7]:

4 3

NH

6' 1'

Trong đó: R: nhóm ankyl; X là nhóm thế thường ở vị trí octo- hoặc para-

Các dẫn xuất Naphtol AS-thế cacboxylat được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn Vai trò quan trọng nhất của hợp chất này là được sử dụng làm cơ chất cho kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu tế bào bạch cầu người Trong khuôn khổ tổng quan này chỉ đề cập đến các tính chất hóa lý cơ bản, những phương pháp tổng hợp quan trọng và một số ứng dụng phổ biến liên quan đến họ hợp chất này

Về cấu tạo, các Naphtol AS-thế carboxylat có hai nhóm chức là amit và este, đây là hai trung tâm phản ứng chính của hợp chất Enzym esteraza trong nguyên sinh chất cả bạch cầu có thể xúc tác phản ứng thủy phân nhóm monoeste cacboxylat của các alkyl cacboxylat Sau phản ứng thủy phân, các naphtol AS-thế mới sinh sẽ tác dụng với muối diazo tạo thành phẩm màu azo có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học Thông qua sự xuất hiện màu azo trên các vùng nguyên sinh chất của bạch cầu gián tiếp chỉ ra sự có mặt của enzyme esteraza trên bạch cầu

Hiện nay có một số este thuộc dãy Naphtol AS-thế cacboxylat đã được sản xuất thươngh mại dùng trong y học để xác định các enzym esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu bạch cầu người

Bảng 1.1 Các hợp 3-( N-phenyl thế)naphtalen-2-yl cacboxylat đã được thương

mại hóa

phân tử Công thức cấu tạo

1.2 Tổng hợp este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat

Các hợp chất naphtol AS thế cacboxylat được tổng hợp đi từ tiền chất là các naphtol AS-thế (tên khoa học là 3-hiđroxi-(N-phenyl thế) naphtalen-2-cacboxamit) Các naphtol AS thế có thể được điều chế bằng phương pháp trực tiếp một giai đoạn trong lò vi sóng hoặc hai giai đoạn từ axit 3-hidroxi-2-naphtoic và amin theo sơ đồ 1.1, 1.2 [7]:

Sơ đồ 1.1

OH

O OH

COCl

OH

OH

CONH OH

(60%)

Anilin -HCl

Phản ứng este hóa trực tiếp các Naphtol AS thế với các axit cacboxylic thường cho hiệu suất thấp (40-50%) [7] Vì vậy, các este của naphtol AS thế cacboxylat thường tiến hành theo phương pháp Schotten- Baumann, bằng cách cho dẫn xuất naphtol tác dụng với clorua axit hoặc anhidrit axit hữu cơ trong môi trường kiềm hoặc pridin như mô tả trên sơ đồ 1.3 [7, 27]

Sơ đồ 1.3

NH O

OH

NH O

O R O

X RCOCl

X

NH O

OH

NH O

O R O

(RCO)2O

H+

Trong đó: R = alkyl; X = o-CH3, o-OCH3, -Cl, …

Tổng hợp các naphtol AS thế cacboxylat đã được Burstone [5] điều chế lần đầu tiên trên cơ sở phản ứng của naphtol AS-D với cloaxetyl clorua có mặt bazơ NaOH trong dung môi THF Phản ứng xảy ra theo sơ đồ 1.4

Sơ đồ 1.4

NH O

1 NaOH

NH O

Về nguyên tắc, quá trình este hóa chia làm hai giai đoạn: Ở giai đoạn 1, trong môi trường kiềm, nhóm hidroxyl của naphtol AS-D sẽ chuyển hóa thành muối

naphtolat, ở giai đoạn 2, muối naphtolat natri sẽ tác dụng với axetyl clorua tạo thành sản phẩm este 3-[(2-methylphenyl)carbamoyl]naphtalen-2-yl axetat (sơ đồ 1.5)

Sơ đồ 1.5 Giai đoạn 1:

NH O

OH

CH3

NH O

ONa

CH3 + CH3COCl

NH O

O O C

H3

CH3

Đây là phản ứng thế nucleophin Phản ứng đƣợc bắt đầu từ sự tấn công nucleophin của anion naphtolat vào cacbon nhóm cacbonyl của alkanoyl clorua Sản phẩm naphtol AS-thế cacboxylat đƣợc tạo thành trong quá trình cộng tách nhƣ sơ

đồ 1.6

Sơ đồ 1.6

NH O

O

O– R Cl NH

Trong đó: X: H, CH3, OCH3, Cl,…

Tuy nhiên theo một số tác giả, đây là một phản ứng phức tạp, bởi trong phân

tử có nhiều trung tâm hoạt động Khi tiến hành phản ứng tương tự giữa

2-hiđroxi-N-(octo-toluidin)benzamit với cloaxetyl clorua, Herbst W và c.s đã không thu được

dẫn xuất cloaxetat như mong muốn, mà là sản phẩm axyl hóa nhóm amit Phản ứng xảy ra như sơ đồ 1.7 [9]

Sơ đồ 1.8

NH O

biệt các hợp chất này rất dễ phân hủy ở nhiệt độ lớn hơn -20oC nên vấn đề bảo quản chúng phải được thực hiện nghiêm ngặt [25]

1.3.2 Tính chất phổ

Do trong phân tử có hai nhóm chức chính là amit và monoester nên các hợp chất các alkyl cacboxylat của Naphtol AS thế có các phổ đặc trưng như sau [7]:

Phổ IR: Các este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat có

các dao động hóa trị đặc trưng có cường độ mạnh là: dao động hóa trị của nhóm C=O este ở vùng 1715-1780 cm-1 với cường độ mạnh, dao động hóa trị của nhóm

NH ở gần vùng 3300 cm-1 và C=O amit cường độ hấp thụ trung bình nằm ở khoảng 1648-1692 cm-1 và dao động biến dạng N-H hấp thụ ở vùng 1570-1515 cm-1 Ngoài

ra còn có các băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động biến dạng của vòng benzen thế trong vùng 600-800 cm-1.

Phổ 1 H-NMR: Xuất hiện tín hiệu cộng hưởng ở proton của nhóm amit NH~

10ppm ở vùng trường yếu; và các nhân phenyl và naphtyl ở 7,16-8,42 ppm Tại vùng trường mạnh thì tùy theo nhóm thế vào vòng benzen (X,Y) và gốc axit (R) mà este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat cho tín hiệu cộng hưởng proton ở giá trị ppm khác nhau Thông thường khi R là các alkyl sẽ cho các tín hiệu cộng hưởng của proton trong vùng 0-3 ppm

Phổ MS: Các este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat có

cấu trúc kém bền ở điều kiện bình thường, nên các chất thường được ghi phổ

ESI-MS Dưới tác dụng của chùm điện tử, xác suất phân mảnh cao nhất sẽ xảy ra tại liên kết este (O=CO) và phân tử sẽ tạo thành hai gốc chính, sau đó tiếp tục phân hủy tạo

thành những mảnh nhỏ hơn [26]

1.3.3 Tính chất hóa học

Các phân tử Naphtol AS thế cacboxylat có chứa hai nhóm chức chính là

CO-NH amit và C=O este Do phân tử có nhiều trung tâm phản ứng, chúng có thể tham gia các chuyển hóa khác nhau Ngoài các tính chất chung, nhóm các hợp chất này rất dễ tham gia vào phản ứng thủy phân liên kết este vì thế các hợp chất này thường

ứng thủy phân nhờ xúc tác bởi esteraza tạo thành naphtol tương ứng và sau đó ghép đôi với muối điazo hóa tạo thành phẩm màu azo [25] (sơ đồ 1.9)

O R

+

NH O O

Phản ứng thủy phân xúc tác bởi enzym esteraza trong môi trường nước:

esteraza xúc tác cho quá trình thủy phân các este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat thành axit cacboxylic và ancol Đây là phản ứng phổ biến trong mọi tế bào, đặc biệt trong chuyển hóa các chất nội và ngoại sinh

Cơ chế của phản ứng thủy phân các Naphtol AS thế cacboxylat này dưới tác dụng của esteraza bạch cầu người xảy ra như sơ đồ 1.10 [23]

Sơ đồ 1.10

NH O

OCOR

Esterase/H2O -RCOOH

NH O

OH

X Y

X Y

Trong điều kiện nhiệt độ cao, môi trường axit hoặc kiềm, nhóm chức amit bị thủy phân tạo thành axit và amin tương ứng (Sơ đồ 1.11)

Sơ đồ 1.11

NH O

OCOR

X Y

X Y

1.4 Ứng dụng để nhuộm esteraza bạch cầu người

Hiện nay, dãy các chất naphtol AS thế cacboxylat được dùng phổ biến làm

cơ chất nhuộm esteraza trong phương pháp nhuộm hóa học tế bào để phân loại thể bệnh trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn của Hội các nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ

1.4.1 Bệnh bạch cầu cấp và phân loại thể bệnh

Bệnh bạch cầu cấp hay còn gọi là bệnh ung thư máu là một bệnh ác tính của

tế bào tạo máu Tế bào ác tính mất khả năng biệt hóa để tạo thành các tế bào máu bình thường trưởng thành Những tế bào này tăng sinh một cách không kiểm soát và lấn át các tế bào bình thường trong tủy xương và ở máu ngoại vi Cũng như các bệnh ung thư khác, bệnh có xu hướng ngày càng tăng do môi trường ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất da cam đioxin do chiến tranh để lại [2] Các bệnh bạch cầu sau khi tiếp xúc với các chất độc hay hóa trị có thể có những bất thường ở một số nhiễm sắc thể, tuy vậy nhiều trường hợp vẫn không tìm thấy bất cứ một đột biến nào vì thế vai trò thật sự của đột biến di truyền trong bệnh sinh vẫn còn chưa rõ

Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp là phát hiện các tế bào non dạng blast thâm nhiễm trong tủy xương hoặc các tế bào ung thư ở máu ngoại vi Trong một số trường hợp có thể gặp di căn đến các cơ quan như da, đường dạ dày-ruột, màng não

Bệnh bạch cầu cấp gồm nhiều thể bệnh Việc chẩn đoán đúng thể bệnh có vai trò quyết định trong việc điều trị Phân loại bạch cầu cấp hiện nay chủ yếu dựa vào tiêu chuẩn của Hội các nhà Huyết học Anh-Pháp-Mỹ (FAB) Năm 2001, WHO đã

đưa ra bảng xếp loại riêng, nhưng phương pháp xếp loại FAB vẫn được dùng phổ biến trong các cơ sở nghiên cứu và chữa bệnh Tiêu chuẩn FAB đã đưa ra cách phân loại ung thư máu dựa trên những đặc điểm về hình thái, hóa tế bào, miễn dịch (marker) và di truyền

Phương pháp marker dựa vào việc phát hiện các dấu ấn miễn dịch trên tế bào bạch cầu như CD4, CD8, CD34 có tính đặc hiệu cao đặc biệt khi gắn với kỹ thuật phân tích dòng chảy đã nâng cao rõ rệt về độ nhạy Phương pháp di truyền phát hiện các kết quả đột biến hoặc đảo đoạn của các nhiễm sắc thể Phân tích đột biến dựa trên kỹ thuật PCR và giải trình tự gen cũng cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Phương pháp nhuộm hóa học tế bào gồm 6 kỹ thuật: Nhuộm esteraza đặc hiệu (EST) và không đặc hiệu với chất ức chế (NSE+NaF), PAS, Sudan B (SD), Peroxydaza (PER), Photphataza axít (P.A) Hai kỹ thuật nhuộm PAS và nhuộm Sudan dùng để phát hiện glucozit và lipit, bốn kỹ thuật còn lại là nhuộm phát hiện enzym Trong đó nhuộm esteraza bạch cầu là một kỹ thuật quan trọng dựa trên nguyên lý kỹ thuật hình thành phẩm màu azo tại vùng enzym

1.4.2 Giới thiệu về esteraza

Theo phân loại của tiểu ban enzym (EC) thuộc Hội Hóa sinh quốc tế (IUB), esteraza là một enzym hiđrolaza thuộc nhóm cacboxylesteraza (E.C.3.1.1.1) [24] xúc tác các phản ứng thủy phân este cacboxylat thành axit và ancol, trong môi trường nước được gọi là sự thủy phân:

Este cacboxylat + H2O ancol + axit cacboxylic Esteraza có mặt ở hầu hết các mô trong cơ thể Hàm lượng cao nhất là trong các tế bào thực bào, sau đó đến tế bào gan, ruột, dạ dày, phổi, tiền liệt tuyến, tụy và

ít nhất là trong tế bào não Trong tế bào, esteraza thường phân bố chủ yếu trong lưới nội nguyên sinh chất, máy golgi, lysosom và màng tế bào [12,19,23] Về cấu tạo esteraza là một enzym serin có tâm hoạt động được cấu tạo bởi axit amin Ser đóng vai trò nucleophin, His đóng vai trò bazơ và một axit amin thứ 3, đóng vai trò axit là Asp, ở một số isoenzym thì Asp được thay thế bằng Glu và vì thế esteraza không

đặc hiệu còn được gọi là enzym có tâm hoạt động theo cơ chế Ser-His-Asp/Glu [20] hình 1

Hình 1 Tâm hoạt động của esteraza không đặc hiệu

Esteraza là nhóm enzym không đồng nhất về mặt cấu trúc [21] Các công trình công bố gần đây cho thấy trong các tổ chức khác nhau thì esteraza không đặc hiệu có cấu trúc khác nhau Trọng lượng phân tử từ 19.500-180.000 dalton (Da) [13] Kích thước của enzym vào khoảng 2-3 Ǻ Bằng kỹ thuật sắc ký cột sephadex Kaphalia và c.s đã xác định được esteraza gồm 2 chuỗi có trọng lượng phân tử là 60kDa và phần kia là 180 kDa Phần 180 kDa là một trimer và bị ức chế bởi diisopropyl flophotphat trong các phản ứng nhuộm, tức nó thuộc loại B esteraza (bị

ức chế bởi hợp chất florua - NSE) [10-12]

Về mặt điện tích thì esteraza là một enzym mang điện tích âm và các isoenzym nằm trong vùng đẳng điện (pI) từ 5,5-6,1 [17] Nhiều isoenzym có tính đặc hiệu khá cao cho từng dòng tế bào và có thể coi nó như một giá trị tham chiếu

để nhận dạng dòng tế bào SM Gignac và c.s [5] bằng phương pháp điện di đã tìm ra

5 isoenzym khác nhau của esteraza trong các tế bào máu, là esteraza mono 1/mono

2 tìm thấy trong các tế bào bạch cầu mono (NSE); My 1/My 2 dòng tủy (esteraza đặc hiệu), bệnh đa u tủy, dòng hồng cầu, dòng tiểu cầu; Lym 1/Lym 2 trong tế bào lympho và cuối cùng là Unc trong tế bào chưa biệt hóa Như vậy có thể khẳng định esteraza là một tập hợp gồm nhiều isoenzym không đồng nhất Bằng phương pháp

dòng tủy và tìm ra hai isoenzym của esteraza không đặc hiệu A và B Hai isoenzym này thường có mặt trong các bào quan của cả hai dòng bạch cầu đoạn và bạch cầu mono Nhiều công trình nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hai isozym này khác nhau về sự ức chế bởi nhiệt độ và NaF [2, 3, 16]

Trong tế bào bạch cầu người, esteraza được chia làm hai nhóm là esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu Esteraza đặc hiệu chủ yếu phân bổ trong các tế bào dòng tủy, xuất hiện từ tiền tủy bào đến bạch cầu đoạn trưởng thành Nhuộm esteraza đặc hiệu chủ yếu dùng các este napthol AS thế 2-clo cacboxylat như: Naphtol AS-D cloaxetat, naphtol AS-D clopropanoat Esteraza không đặc hiệu (NSE) được nhuộm bằng các este napthol AS thế cacboxylat không có nguyên tử clo ở vị trí 

như: Naphtol AS axetat, napthol AS-MX butanoat Sở dĩ được gọi là esteraza không đặc hiệu vì nó có trong hầu hết các dòng tế bào Khi nhuộm bằng các cơ chất trên với chất ức chế bằng NaF thì chỉ có NSE trong bạch cầu mono bị ức chế hoàn toàn, không hiện màu trong phản ứng nhuộm màu Dựa vào tính chất khác nhau trong quá trình nhuộm NSE này để phân biệt thể bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit với các dòng tế bào khác theo tiêu chuẩn FAB (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Bảng phân loại bệnh ung thư máu dòng mono theo FAB bổ sung Marker và di truyền [8]

M4

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) 30-80% SLTBT là tế bào dòng tủy đã bao gồm cả blasts;

4) 20-80% SLTBT là bạch cầu monoxít;

5) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất;

6) Số lượng bạch cầu monoxít trong máu >5.109 hoặc

<5.109 kèm tăng lysozym trong huyết tương

Peroxidaza, Sudan B, esteraza đặc hiệu dòng tủy, esteraza không đặc hiệu có và không

có chất ức chế NaF dương tính

1) CD (+): 13,

14, 15, 33;

2) HLA-DR (+)

t(9; 11) (p22; q23)

M4eo

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) 30-80% SLTBT là tế bào dòng tủy đã bao gồm cả blasts;

4) 20-80% SLTBT là bạch cầu monoxít;

5) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất;

6) ≥5% tế bào không phải dòng hồng cầu là bạch cầu ưa

axít và gặp các tế bào ưa axít bất thường;

7) Số lượng bạch cầu monoxít trong máu >5.109 hoặc

Peroxidaza, Sudan B, esteraza đặc hiệu dòng tủy, esteraza không đặc hiệu có và không

có chất ức chế NaF dương tính

1) CD (+): 13,

14, 15, 33;

2) HLA-DR (+)

t(16; 16) inv(16)

Hình thái học và số lượng tế bào tủy Hóa học tế bào Marker CD Di truyền

M5a

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) ≥80% tế bào không phải dòng hồng cầu là monoxít;

4) ≥80% tế bào monoxít là monoblast;

5) Hiếm khi xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất

1) Peroxidaza, Sudan B

âm tính hoặc dương tính yếu;

2) Esteraza đặc hiệu dòng tủy âm tính;

3) Esteraza không đặc hiệu dương tính mạnh và bị ức chế bởi NaF

1) CD (+): 13,

14, 15, 33;

2) HLA-DR (+)

t(9; 11) (p22:q23)

M5b

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;

2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;

3) ≥80% tế bào không phải dòng hồng cầu trong tủy là

monoxít;

4) <80% tế bào monoxít là monoblast;

5) Hiếm khi xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất

1) Peroxidaza, Sudan B

âm tính hoặc dương tính yếu;

2) Esteraza đặc hiệu dòng tủy âm tính;

3) Esteraza không đặc hiệu dương tính mạnh và bị ức chế bởi NaF

1) CD (+): 13,

14, 15, 33;

2) HLA-DR (+)

t(8; 16) (p11:p13)

Như vậy, trong các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào thì kỹ thuật nhuộm phát hiện NSE là một xét nghiệm quan trọng giúp phân biệt ung thư máu thể M4 và thể M5 với các thể khác Đó là các thể ung thư hỗn hợp dòng tủy – monoxit (M4) và dòng monoxit (M5) Ở các thể này NSE dương tính rất mạnh nhưng ở thể M5 thì bị

ức chế hoàn toàn bởi NaF [18] và đây là cơ sở để phân biệt bạch cầu cấp dòng monoxit với các dòng tế bào khác

1.4.3 Cơ chất dùng trong nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người

Hiện nay, nhiều hợp chất được sử dụng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm NSE bạch cầu người, trong đó phổ biến nhất là naphtol AS axetat Cơ chế của phản ứng nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người xảy ra qua hai giai đoạn [3,14,15]

Bước 1: Nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người

Giai đoạn 1: Enzym esteraza thuỷ phân các dẫn xuất este 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat thành Naphtol ban đầu (Sơ đồ 1.12)

Sơ đồ 1.12

Trong đó: X, Y: các nhóm thế trên vòng benzen; R: nhóm alkyl

Nó có thể tồn tại dưới 3 dạng cân bằng hỗ biến tùy thuộc vào pH của môi trường Trong môi trường trung tính nó tồn tại dưới dạng naphtol, trong môi trường kiềm chuyển dần sang naphtolat và dạng quinoid như miêu tả trong sơ đồ 1.13

tử cơ chất (este) phải phù hợp với tâm hoạt động của enzym như “ổ khóa và chìa khóa” thì phản ứng mới diễn ra thuận lợi

Bước 2: Ức chế bằng NaF thì tế bào dòng monoxit bị mất hoạt tính

Tiến hành nhuộm giống như bước 1 nhưng bổ sung thêm NaF với nồng độ 5 mg/1ml dung dịch nhuộm thì nếu là bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit thể M4 đặc biệt là M5 sẽ bị ức chế hoàn toàn Như vậy, do phải tiến hành qua hai bước như trên nên thời gian nhuộm thường kéo dài, ảnh hưởng thời gian phục vụ chẩn đoán và theo dõi bệnh

Tóm lại, sử dụng cơ chất trên cơ sở các dẫn xuất của napthol AS thế cacboxylat để nhuộm esteraza là một kỹ thuật quan trọng giúp phân loại dòng tế bào bạch cầu người trong bệnh bạch cầu cấp Các cơ chất thương mại hiện nay ở Việt Nam đều phải nhập ngoại với giá thành cao (7.000.000 đ/1 g), cơ chất lại dễ bị phân hủy, nhuộm không đặc hiệu vì vậy "Nghiên cứu tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono" là một đề tài có ý nghĩa khoa học và xã hội sâu sắc

CHƯƠNG 2 - THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tổng hợp và sử dụng các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL; AS-CA làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono

2.2 Phương pháp nghiên cứu

 Phương pháp tổng hợp hữu cơ;

 Phương pháp vật lý và hóa lý xác định cấu trúc;

 Phương pháp nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào;

 Axeton 99,5 %, loại ACS, sản phẩm của sigma Aldrich;

 NaOH; Axetonitrin; n- Hexan; Etyl axetat; Axit xitric; Natri xitrat, Natri clorua loại P, sản phẩm của Trung Quốc;

 Muối điazo: Fast red violet LB salt, sản phẩm của Acros;

 Na2HPO4 99%, KH2PO4 99%, Etylenglycol loại PA của Merck;

2.3.2 Các dụng cụ và thiết bị

 Tủ thực hiện phản ứng tổng hợp: Tủ ẩm lạnh MIR-154, hãng Panasonic

Healcare, Nhật Bản tại Bệnh viện 19-8;

 Đo nhiệt độ nóng chảy: Đo điểm nóng chảy trên máy Omega MPS40, Anh

Quốc, phòng thí nghiệm Hóa dược, khoa Hóa học, trường đại học ĐHQGHN;

KHTN- Cân các mẫu bằng cân phân tích Sartorius độ chính xác 10-4, tại Bệnh viện 19-8;

 Sắc ký bản mỏng: được thực hiện với bản mỏng làm từ silicagel 60 F254

tráng trên lá nhôm của hãng Merck (Đức), được hiện thị bằng máy soi UV Gelogic

200 của Mỹ tại Bệnh viện 19-8;

 Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy:

+ GX của hãng PerkinElmer (Mỹ) tại khoa Hóa học, trường Đại học ĐHQGHN; 400-10.000cm-1; mẫu được ép viên với KBr;

KHTN-+ SIGNA của hãng Nicolet, Viện Hóa học – Viện KH&CN Việt Nam;

600-4000 cm -1; mẫu được ép viên với KBr

 Phổ khối lượng (MS) được ghi trên máy:

+ GC-MS phân giải cao (EI, 70ev) của hãng Micromass Waters, Khoa Hóa

học, trường Đại học KHTN-ĐHQGHN;

+ LC-MSD-Trap-SL của hãng Agilent Technologies (Mỹ), Viện Hóa học –

Viện KH&CN Việt Nam

 Phổ cộng hưởng từ ghi trên máy:

+ ADVANCE Spectrometer (Bruker 500Mv), tần số 500MHz, tại Viện Hóa học -Viện KH&CN Việt Nam; dung môi DMSO-d6; chất chuẩn nội TMS;

+ BRUKER, tần số 500 MHz, tại khoa Hóa học, trường Đại học

KHTN-ĐHQGHN; dung môi DMSO, chất chuẩn nội TMS

 Thử nghiệm hoạt tính sinh học:

+ Ủ nhiệt tiêu bản nhuộm bằng máy điều nhiệt CW-20GS (0-500C) tại nhiệt

độ 370

C của Hàn Quốc, độ chính xác ±0,10C, tại Bệnh viện 19-8;

+ Soi tiêu bản bằng kính hiển vi hai mắt Nikon với độ phóng đại 1.000 lần có gắn máy chụp ảnh, tại Bệnh viện 19-8;

+ Đo pH dung dịch bằng máy InoLab pH 730, CHLB Đức, độ chính xác 10-3, tại Bệnh viện 19-8;

+ Pipet tự động của hãng Thermo kèm đầu côn 0,2; 1,0 và 10 ml của hãng Gilson

2.4 Các phần mềm sử dụng

 Phần mềm thống kê minitab 18;

 ACD Lab 12.0;

 Chembio draw ultra view 12.0

2.5 Sơ đồ phản ứng chung và các quy trình thực nghiệm

Sơ đồ 2.1

NH O

Tạo phẩm màu azo trong tế bào mono

NH O

OH N

- Phản ứng 2: Phản ứng thủy phân este hóa trên nguyên sinh chất tế bào mono của các cơ chất tổng hợp đƣợc về Naphtol ban đầu;

- Phản ứng 3: Phản ứng ghép đôi muối Fast red violet LB salt với Naphtol AS thế đƣợc tạo thành

2.6 Thực nghiệm

2.6.1 Tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA

a Tổng hợp theo phương pháp truyền thống [7]

Hòa tan 1g (0,00343 mol) naphtol AS-OL vào trong 10 ml THF Nhỏ từ từ 0,648 ml dung dịch NaOH 5M vào dung dịch trên và duy trì nhiệt độ phản ứng ở

0oC Sau đó tiếp tục nhỏ từ từ 0,343 ml butanoyl clorua lạnh 98% d= 1,026 (g/ml) vào dung dịch trên và khuấy trong thời gian 1 h Kết thúc phản ứng, thêm nước lạnh vào lọc thu sản phẩm thô Kết tinh sản phẩm trong dung môi axeton và etanol (tỉ lệ 3:1 v/v), tinh thể được hình thành sau 48h Sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,69

dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7 v/v), Tnc: 94-96o

C (94-95 oC [7]) Hiệu suất đạt 52% Hiệu suất thu được sau phản ứng chưa cao do đó đã tiến hành khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng: Nhiệt độ, dung môi, tỉ lệ chất tham gia

và thời gian phản ứng

b Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp: dẫn suất este phenyl)nahthalen-2-yl cacboxylat

3-(N-b.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi

Giữ nguyên điều kiện phản ứng ở nhiệt độ 0oC, tỉ lệ tỷ lệ Naphtol AS-OL: butanoyl clorua = 1: 1,1, thời gian phản ứng 1 giờ; thay đổi dung môi hòa tan NaOH trước khi nhỏ vào phản ứng bằng các dung môi khảo sát: THF, axeton; acetonitrin, DMF, DMSO và etylenglycol monometyl ete (EGME) Các dung môi được sử dụng khảo sát đều được làm khan trước khi tiến hành thí nghiệm Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự phương pháp truyền thống (mục 2.6.1.a) Kết quả khảo sát được trình bày trên bảng 2.1

Bảng 2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất của phản ứng

Dung môi

phản ứng

Khi sử dụng dung môi EGME cho hiệu suất cao nhất, do đó yếu tố này là cố định để khảo sát các yếu tố khác ảnh hưởng đến phản ứng

b.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ chất tham gia phản ứng

Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự phương pháp truyền thống (mục 2.6.1.a), nhiệt độ phản ứng 00C, dung môi etylenglycol monnometyl ete, tỷ lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua thay đổi như sau: 1:1,1; 1:1,2; 1: 1,3; 1 : 1,5 và 1 : 2 Kết quả khảo sát được trình bày trên bảng 2.2

Bảng 2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất tham gia phản ứng đến

hiệu suất của phản ứng

b.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hiệu suất phản ứng

Do cơ chất rất không bền ở nhiệt độ trên >-20o

C [24], do đó đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất sản phẩm Phản ứng được thực hiện trong tủ ẩm lạnh MIR-154 để duy trì nhiệt độ ổn định tròn suốt quá trình Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện dung môi etylenglycol monnometyl ete, tỷ

lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua = 1:1,3, thời gian phản ứng 1 giờ, nhiệt độ khảo sát ở 10, 5, 0, -5 và -10oC Sau khi xử lý hiệu suất sản phẩm 3b3 được trình bày

b.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Giữ nguyên điều kiện phản ứng ở nhiệt độ 0oC, dung môi sử dụng etylenglycol monnometyl ete, tỷ lệ chất tham gia phản ứng: Naphtol :cacboxyl clorua = 1: 1,3; thời gian phản ứng thay đổi từ 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng được thể trình bày trên bảng 2.4

Bảng 2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất

Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, đã tìm được điều kiện

thích hợp để sản phẩm Naphtol AS-OL butanoat (3b3) đạt hiệu suất cao nhất (80%) là: + Dung môi etylenglycol mono metyl ete;

+ Tỷ lệ chất tham gia phản ứng: Naphtol : cacboxyl clorua = 1:1,3;

hexan:etylaxetat = 3:7) (3a2) chất mới;

 3-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl butanoat, hiệu suất 72% (NaOH 5M); Tnc = 146-1470C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,61 dung môi n-

hexan:etylaxetat = 3:7) (3a3);

 3-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl pentanoat, hiệu suất 67% (NaOH 5M); Tnc = 135-1360C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,65 dung môi n-

hexan:etylaxetat = 3:7) (3a4);

 3-[(2-Methoxylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl axetat, hiệu suất 65% (NaOH 5M); Tnc = 130-1310C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,63

dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3b1);

 3-[(2-Methoxylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl propanoat, hiệu suất 71 % (NaOH 5M); Tnc = 107-1090C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,65

dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3b2);

 3-[(2-Methoxylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl butanoate, hiệu suất 80% (NaOH 5M); Tnc = 95-960C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,69 dung

0,60 dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3c1) chất mới;

 3-[(5-chloro-2-methoxyphenyl)carbamoyl]naphthalen-2-yl butanoat, hiệu suất 68%, (NaOH 5M); Tnc = 141-1430C; Sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,63 dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3c2);

2.6.2 Quy trình thực nghiệm tối ưu hóa phản ứng nhuộm enzym

a Chuẩn bị dung dịch nhuộm

+ Dung dịch cơ chất pha trong DMF

+ Dung dịch fast red violet LB salt

+ Dung dịch đệm

b Quy trình nhuộm chung:

Bước 1: Cố định tiêu bản trong dung dịch cố định trong thời gian 10 giây;

Bước 2: Phủ dung dịch nhuộm lên tiêu bản, sau đó để tiêu bản dưới vòi nước

chảy trong 5 phút;

Bước 3: Nhuộm nhân và nền bằng Hematoxylin trong thời gian 5 phút, sau đó

để tiêu bản dưới vòi nước chảy trong 5 phút; để khô và đánh giá kết quả

Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng thông qua phản ứng dương tính hoặc âm tính đối với tế bào bạch cầu mono: dương tính khi xuất hiện các hạt bắt màu đỏ trên nền nguyên sinh chất tế bào, nhân tế bào bắt màu xanh; ngược lại không có màu đỏ

là âm tính

Đánh giá độ nhạy và mức độ dương tính theo kỹ thuật của hãng Sigma

Độ 0: Không có hạt bắt màu thuốc nhuộm;

Độ 1: Ít hạt trên nguyên sinh chất, hạt mịn nhỏ, chiếm ≤ 1/3 bào tương của tế bào;

Độ 2: Số hạt bắt màu trên nguyên sinh chất, hạt trung bình, chiếm > 1/3 đến < ¾ bào tương của tế bào;

Độ 3: Số hạt bắt màu trên nguyên sinh chất, hạt to, chiếm hết bào tương của tế bào;

Độ 4: Nhiều hạt phủ kín nguyên sinh chất và nhân, hạt to

Điểm nhuộm được tính theo công thức:

∑Y (điểm) = Y0 x 0 + Y1 x 1 + Y2 x 2 + Y3 x 3 + Y4 x 4

Sử dụng cơ chất Naphtol AS propanoat làm cơ chất thực nghiệm Tiến hành khảo sát nghiên cứu trên 5 yếu tố: thời gian nhuộm, pH dung dịch đệm, nồng độ cơ chất, hàm lượng DMF và nhiệt độ theo bảng 2.5 và 2.6

Bảng 2.5 Các nhân tố và mức được xét trong mô hình thực nghiệm

Bảng 2.6 Bảng ma trận mô hình mẫu nhân tố thực nghiệm

TT pH dung dịch

đệm Hàm lƣợng DMF – mL

Nồng độ cơ chất - mg Nhiệt độ - o

C

Thời gian nhuộm - phút

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Như đã đề cập trong phần tổng quan, 3-[(N-phenyl 2-yl cacboxylat là tên khoa học của các chất có tên thương mai là Naphtol AS-thế cacboxylat [25] có công thức cấu tạo chung như sau:

NH

1' 6'

2' 5'

monophenyl (o,p-X-Aryl) Cơ chất nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người

được thương mại hóa nhiều nhất là naphtol AS axetat (R = CH3, X = Y = H) Tuy nhiên kết quả nhuộm esteraza dòng mono không đặc hiệu bạch cầu người gồm 2 kỹ thuật nhuộm có và không có chất ức chế NaF vẫn được triển khai rộng rãi, khi sử dụng cơ chất này cùng với các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào khác thời gian nhuộm kéo dài và khi phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

có sự chênh lệch so với phương pháp di truyền và phương pháp đánh dấu đến 29,7% [7] Nguyên nhân có thể là do độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào trong đó có kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu với việc sử dụng cơ chất naphtol AS axetat chưa cao Độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người phụ thuộc vào cấu trúc của cơ chất

sử dụng và điều kiện tiến hành nhuộm Một trong những nguyên nhân lệch chuẩn có

lẽ vì việc nghiên cứu chưa có hệ thống; một mặt, các nhà nghiên cứu quá tập trung chú ý vào một số dẫn xuất phổ biến, riêng lẻ dùng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm; mặt khác, do chưa tìm được phương pháp có hiệu quả kinh tế cao để tổng hợp cơ chất

Do tầm quan trọng của các hợp chất này đối với thực tiễn, để tài xây dựng phương pháp mới để nâng cao hiệu suất tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL và AS-CA làm nguyên liệu, nghiên cứu ảnh hưởng của một số nhân tố ảnh hưởng đến kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono bạch cầu người

3.1 Tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS; AS-OL và AS-CA bằng phương pháp truyền thống [5, 7]

Đề tài được bắt đầu từ nghiên cứu tổng hợp các 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat bằng phương pháp truyền thống Naphtol AS-thế cacboxylat được tổng hợp theo phương pháp 2 giai đoạn,

Giai đoạn 1: 3-hidroxyl-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen 2-cacboxamit phản ứng với NaOH theo tỷ lệ 1:1 tạo thành muối naphtolat

Giai đoạn 2: muối naphtolat thu được tác dụng với axetyl clorua thu phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat

3-[(N-Phản ứng tổng hợp este giữa naphtol AS thế với dẫn suất alkanoyl clorua đi qua hai giai đoạn hai giai đoạn như sơ đồ 3.1 [7]

Sơ đồ 3.1 Giai đoạn 1:

NH O

OH

X

Y

NH O

X Y

Cơ chế của phản ứng có thể được miêu tả trong sơ đồ 3.2 như sau:

Sơ đồ 3.2

Phản ứng được thực hiện ở 00C, tuy nhiên theo cách này hiệu suất sản phẩm thu được không cao khoảng 40-50% Điều này có thể được giải thích do trong dung môi phản ứng có nước trong giai đoạn tạo muối phenolat nên khi bổ sung thêm alkanoyl clorua ở bước 2, chất này dễ bị thủy phân (sơ đồ 3.3) do tác dụng với nước tạo thành axit đặc biệt trong môi trường kiềm:

Sơ đồ 3.3

R O

Mặt khác sản phẩm tạo thành kém bền nhiệt, vì vậy nhiệt độ phản ứng, thời gian

xử lý sau phản ứng cũng là một trong những nguyên nhân gây nên hiệu suất thấp

Như vậy có thể thấy hiệu suất phản ứng phụ thuộc chủ yếu vào ba yếu tố: một là, tỷ lệ các tác nhân tham gia phản ứng; hai là, nhiệt độ; ba là bản chất dung môi Để nâng cao hiệu suất sản phẩm, đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên phản ứng Đối tượng khảo sát được chọn là N-(2-methoxylphenyl)-3-hiđroxinaphtalen-2-cacboxamit (Naphtol AS-OL) : butanoyl clorua; mỗi điều kiện