Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacillus amyloliqueciens CP16.04

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ VI KHUẨN Ba

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ

VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TỪ

VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens CP16.04

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRỊNH THÀNH TRUNG

TS TRẦN THỊ THANH HUYỀN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn cao học này, tôi xin chân thành cảm ơn TS Trịnh Thành Trung và TS Trần Thị Thanh Huyền đã động viên, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trính học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị đang làm việc tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học nói riêng và Khoa Sinh học nói chung đã dạy dỗ tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, hỗ trợ để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 05 năm 2016

Học viên

Nguyễn Phương Liên

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

1 Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Vi khuẩn Bacillus 3

1.1.1 Giới thiệu chung về chi vi khuẩn Bacillus 3

1.1.2 Hệ thống phân loại chi vi khuẩn Bacillus 4

1.1.3 Hệ thống phân loại Bacillus hiện đại 5

1.1.4 Phương pháp phân lập và phân loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus 7

1.2 Chất kháng sinh từ vi khuẩn Bacillus 12

1.2.1 Lipopeptide mạch vòng mang điện tích dương 13

1.2.2 Lipopeptide mạch vòng không mang điện tích dương 15

1.2.3 Lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương 17

1.3 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus 18

1.4 Mục đích nghiên cứu 19

2 Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Chủng vi sinh vật 20

2.1.2 Môi trường nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Xác định khả năng sinh chất kháng nấm và chất kháng khuẩn 22

2.2.2 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào 22

2.2.3 Xác định khả năng phân giải phosphate khó tan 23

2.2.4 Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 23

2.2.5 Dấu vân tay rep-PCR và phân tích tính tương đồng kiểu gen 23

2.2.6 Phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại 24

2.2.7 Tách chiết chất kháng nấm và kháng khuẩn 24

2.2.8 Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn 25

2.2.9 Xác định đặc tính sinh hóa lý của chất kháng nấm và kháng khuẩn 26

2.2.10 Thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và kháng khuẩn 27

3 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Lựa chọn chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum và đánh giá các đặc tính sinh học của chủng nghiên cứu 28

3.1.1 B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập tại các vùng sinh thái khác nhau của Việt Nam 28

3.1.2 Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn 28

3.1.3 Enzyme ngoại bào 32

3.1.4 Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 33

3.2 Phân tích đa dạng kiểu gen của các chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum 34

3.2.1 Phân tích dấu vân tay rep-PCR 34

3.2.2 Phân tích trình tự đa gen 36

3.3 Tách chiết, tinh sạch và xác định bản chất sinh học của chất kháng nấm và

chất kháng khuẩn từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 39

3.3.1 So sánh hiệu quả tách chiết chất kháng nấm và chất kháng khuẩn 39

3.3.2 Tinh sạch chất kháng nấm và kháng khuẩn 40

3.3.3 Xác định các tính chất của chất kháng nấm và kháng khuẩn 41

3.4 Thử nghiệm tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn 46

3.4.1 Thử nghiệm nẩy mầm hạt 47

3.4.2 Thử nghiệm khả năng sinh trưởng của cây 47

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thông tin cơ bản của 15 chủng B amyloliquefaciens subsp

plantarum

Bảng 3.2 Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn

Bảng 3.3 Khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào

Bảng 3.4 Khả năng phân giải phosphate khó tan và sinh chất kích thích sinh

trưởng IAA

Bảng 3.5 Hoạt tính kháng nấm và vi khuẩn của dịch chiết thô

Bảng 3.6 Khả năng bền nhiệt của chất kháng nấm và kháng khuẩn

Bảng 3.7 Khả năng bền pH của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn

Bảng 3.8 Khả năng bền với các enzyme thủy phân

Bảng 3.9 Khả năng nẩy mầm của hạt khi xử lý với chất kháng sinh

Bảng 3.10 Khả năng sinh trưởng của cây non khi xử lý với chất kháng sinh

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại của các loài Bacillus nhóm

lớn

Hình 1.2 Kết quả phân loại vi khuẩn Bacillus trên phần mềm ApiwebTM

Hình 1.3 Cấu trúc chuỗi peptide của chất kháng sinh polymyxin

Hình 1.4 Cấu trúc chất kháng sinh iturin

Hình 1.5 Cấu trúc nhóm kháng sinh fengysin

Hình 1.6 Cấu trúc lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương ceraxin

Hình 3.1 Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu

vân tay rep - PCR sử dụng mồi ERIC

Hình 3.2 Sơ đồ cây về mối tương đồng kiểu gen xây dựng bằng kỹ thuật dấu

vân tay rep - PCR sử dụng mồi GTG5

Hình 3.3 Mối quan hệ giữa chủng SP 1901 và CP 1604 trên cây phát sinh chủng

loại và các loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis

Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn tinh sạch

từ dịch nuôi cấy chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP

1604

Hình 3.5 Khối phổ phân đoạn chất có hoạt tính kháng nấm và phân đoạn chất

có hoạt tính kháng khuẩn

Hình 3.6 Hoạt tính của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn khi xử lý nhiệt ở

các nhiệt độ khác nhau

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

API: Thanh định danh API (Anatical Profile Index)

D: Đường kính ( Diameter)

Da: Daton

Dab: 2,4 - diaminobutyric acid

GTTB: Giá trị trung bình

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IAA: Hóc môn thực vật IAA (Indole-3-Acetic Acid)

KBT: Khoảng biến thiên

MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration) MS: Khối phổ (Mass Spectrometry)

NA: Thạch dinh dưỡng (Nutrient Agar)

NRPSs: Enzyme sinh tổng hợp peptide không phụ thuộc ribosome

(NonRibosomal Peptide Synthetases) PCR: Phản ứng khuếch đại ADN

PDA: Thạch khoai tây (Potato Dextrose Agar)

MỞ ĐẦU

Chi Bacillus là một nhóm các loài vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que, phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái Bacillus có khả năng sinh nội bào tử, một

dạng nghỉ của tế bào để giúp vi khuẩn có thể chống chịu và tồn tại trước các điều kiện bất lợi của môi trường như khô hạn và thiếu dinh dưỡng Theo hệ thống phân

loại hiện nay, chi Bacillus có khoảng gần 300 loài và các loài phụ dưới loài Trong

số đó, Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum (hay còn gọi là B velezensis, B

methylotrophicus và B oryzicola) là một trong tám loài vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis Đây là những loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính quý có lợi cho

cây trồng như khả năng sinh các chất kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh các enzyme thủy phân và có khả năng tăng cường tính miễn dịch của cây chống lại sự xâm nhiễm của các loại vi

sinh vật gây bệnh Do sở hữu các đặc tính quý, vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ở mọi cấp độ từ

giải mã hệ genome đến nghiên cứu các chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên

cứu ứng dụng trong nhà kính và ngoài thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B

amyloliquefaciens subsp plantarum đã được phân lập, đánh giá các đặc tính có lợi

và ứng dụng trong đấu tranh sinh học để phòng ngừa các loại dịch bệnh hại cây

trồng Một số chủng như B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 cũng đã

được sản xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học và chế phẩm phòng

trừ bệnh cây Nhiều báo cáo đã công bố hiệu quả sử dụng các chủng B

amyloliquefaciens subsp plantarum trong phòng trừ và làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh

cũng như mức độ nhiễm bệnh của cây do vi khuẩn và nấm gây bệnh cây gây ra Sản

lượng nông sản thu hoạch cũng tăng lên đáng kể khi bổ sung chủng B

amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 vào phân bón

B amyloliquefaciens subsp plantarum sản sinh ra nhiều loại chất trao đổi

bậc hai có hoạt tính kháng nấm và kháng vi khuẩn gây bệnh cây Các chất trao đổi

đó bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore và protein kháng khuẩn

Đa số các chất này được tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized

peptide) nhờ sự có mặt của nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) Nhiều chất trong số này đã được nghiên cứu tỉ mỉ về cấu trúc hóa học, đặc tính sinh học cũng như tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và y - dược học

Nhằm tìm kiếm, đánh giá và lựa chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp xanh và bền vững, trong luận văn này, chúng tôi

trọng tâm nghiên cứu các đặc tính có lợi cho cây trồng từ các chủng vi khuẩn B

amyloliquefaciens subsp plantarum có trong bộ sưu tầm vi khuẩn Bacillus thu thập

tại các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam Bên cạnh việc tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy thích hợp, chúng tôi còn tiến hành tách chiết, tinh sạch và xác định đặc tính sinh học cũng như tính an toàn của chất kháng nấm và chất kháng khuẩn sinh ra

từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604

1 Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Vi khuẩn Bacillus

1.1.1 Giới thiệu chung về chi vi khuẩn Bacillus

Định nghĩa khái quát

Bacillus là nhóm vi khuẩn khá quen thuộc, hay được nhắc đến trong các tài

liệu vi sinh vật học Trước kia, Bacillus được biết đến như những vi khuẩn hình

que, bắt màu thuốc nhuộm Gram (+), sinh nội bào tử, sống hiếu khí hoặc kỵ khí

không bắt buộc Tuy nhiên, khái niệm đó giờ đây bao quát cho cả Bacillus nhóm lớn (Bacillus sensu lato) gồm ít nhất 37 chi thuộc 3 họ Bacillaceae, Paenibacillaceae

và Alicyclobacillaceae Chi Bacillus chỉ là một chi trong Bacillus nhóm lớn và thường được gọi là Bacillus nhóm nhỏ (Bacillus sensu stricto)

Môi trường phân bố

Vi khuẩn Bacillus phân bố ở mọi nơi trong sinh quyển Chúng ta có thể bắt

gặp các loài vi khuẩn này trong bất kỳ công bố nào về đa dạng vi sinh vật ở các khu

hệ sinh thái, từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn, từ vùng ven bờ

đến đáy các Đại Dương [14, 48] Trong các hệ sinh thái trên cạn, vi khuẩn Bacillus

có thể phân bố ở các vùng đất chua, đất kiềm hay đất trung tính Một số loài có thể tìm thấy trong các loại đất nhiễm kim loại nặng hay nhiễm asen Một số loài có khả

năng sống ký sinh và gây bệnh cho người, động vật và côn trùng như B cereus, B

anthracis và B thuringiensis Một số loài là vi sinh vật vùng rễ hay sống cộng sinh

trong rễ của một số loại thực vật Gần đây, một số loài vi khuẩn mới thuộc chi

Bacillus còn được tìm thấy ở độ cao từ 24 đến 41 km trong tầng bình lưu của khí

quyển [44]

Các đặc điểm phân loại đặc trưng của chi Bacillus

Bacillus là vi khuẩn hình que, bắt màu thuốc nhuộm Gram (+), sinh nội bào

tử, có thể di động bằng tiêm mao, đa số sống hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Abriouel, H., C M Franz, N Ben Omar and A Galvez (2011), "Diversity and

applications of Bacillus bacteriocins", FEMS Microbiol Rev, 35, pp 201-232

2 Arguelles-Arias, A., M Ongena, B Halimi, Y Lara, A Brans, B Joris and P Fickers (2009), "Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plant pathogens",

Microb Cell Fact, 8, pp 63

3 Ash, C., F J.A.E., A Wallbank and S M D Collin (1991), "Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of

small-subunit-ribosomal RNA sequences", Letters in Applied Microbiology, 13, pp

202-206

4 Borriss, R., X H Chen, C Rueckert, J Blom, A Becker, B Baumgarth, B Fan, R Pukall, P Schumann, C Sproer, H Junge, J Vater, A Puhler, and H P

Klenk (2011), "Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens subsp nov and Bacillus amyloliquefaciens subsp

plantarum subsp nov based on complete genome sequence comparisons", Int J

Syst Evol Microbiol, 61, pp 1786-1801

5 Chakraborty, K., B Thilakan, and V K Raola (2014), "Polyketide family of novel antibacterial 7-O-Methyl-5′-hydroxy-3′-heptenoate-macrolactin from

seaweed-associated Bacillus subtilis MTCC 10403", J Agric Food Chem, 62,

pp 12194-12208

6 Chen, X H., J Vater, J Piel, P Franke, R Scholz, K Schneider, A Koumoutsi, G Hitzeroth, N Grammel, A W Strittmatter, G Gottschalk, R D Sussmuth, and R Borriss (2006), "Structural and functional chracterization of

three polyketide systhase gene clusters in Bacillus amyloliquefaciens FZB42", J

Bacteriol, 188, pp 4024-4036

7 Chen, D., X Liu, C Li, W Tian, Q Shen, and B Shen (2014), "Isolation of

Bacillus amyloliquefaciens S20 and its application in control of eggplant

bacterial wilt", J Environ Manage, 137, pp 120-127

8 Chowdhury, S P., A Hartmann, X Gao, and R Borriss (2015), "Biocontrol

mechanism by root-associated Bacillus amyloliquefaciens FZB42 - a review",

Front Microbiol, 6, pp 780

9 Chun, J., J H Lee, Y Jung, M Kim, S Kim, B K Kim and Y W Lim (2007),

"EzTaxon: a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S

ribosomal RNA gene sequences", Int J Syst Evol Microbiol, 57(Pt 10), pp

2259-2261

10 Chung, E J., M T Hossain, A Khan, K H Kim, C O Jeon, and Y R Chung

(2015), "Bacillus oryzicola sp nov., an Endophytic Bacterium Isolated from the

Roots of Rice with Antimicrobial, Plant Growth Promoting, and Systemic

Resistance Inducing Activities in Rice", Plant Pathol J, 31, pp 152-164

11 Cochrance, S A and J C Vederas (2014), "Lipopeptides from Bacillus and

Paenibacillus spp.: A golden mine of antibiotic cadidates", Med Res Rev, 36,

pp 4-31

12 Copping L G and J J Mann (2000), "Biopesticides: a review of their action,

applications and efficacy", Pest Mag Sci, 56, pp 651-676

13 Dunlap, C A., S J Kim, S W Kwon, and A P Rooney (2015), "Bacillus

velezensis is not a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus methylotrophicus, Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum and

'Bacillus oryzicola' are later heterotypic synonyms of Bacillus velezensis based

on phylogenomics", Int J Syst Evol Microbiol

14 Dworkin, M., S Falkow, E Rosenberg, K H Schleifer and E Stackebrandt (2006), "The Prokaryotes"

15 Freitas D B., M P Reis, C I Lima-Bittencourt, P S Costa, P S Assis, E Chartone-Souza, and A M Nascimento (2008), "Genotypic and phenotypic