Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích paraquat trong huyết tương và ứng dụng phục vụ chẩn đoán, điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp paraquat: Luận án TS. Khoa học vật chất: 94401

Nghiên cứu định lượng paraquat trong huyết tương người bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc CE - C4 D .... So sánh kết quả phân tích nồng độ paraquat

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Vũ Anh Phương

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PARAQUAT TRONG HUYẾT TƯƠNG VÀ ỨNG DỤNG PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Vũ Anh Phương

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PARAQUAT TRONG HUYẾT TƯƠNG VÀ ỨNG DỤNG PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Vũ Anh Phương

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và PGS.TS Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc - Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hường, PGS.TS Mai Thanh Đức, ThS Đỗ Thị Trang, ThS BSNT Đoàn Thu Hà đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn công ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/) đã cung cấp thiết bị CE-C4D để thực hiện nghiên cứu này, cảm ơn các bạn trong nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di mao quản CE-C4D của Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã phối hợp và hỗ trợ tôi hoàn thành nghiên cứu này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, ngày 08 tháng 01 năm 2019

Học viên

Vũ Anh Phương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 5

1.1 T ng quan về paraquat 5

1.1.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa học của paraquat 5

1.1.2 Thực trạng sử dụng paraquat hiện nay 6

1.1.3 Độc tính của paraquat 7

1.1.4 Dược động học paraquat 9

1.2 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương 10

1.3 Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương 16

1.3.1 Phương pháp quang ph hấp thụ phân tử (UV - Vis) 16

1.3.2 Các phương pháp sắc ký 17

1.3.2.1 Phương pháp sắc ký khí 17

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng 20

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản (CE) 23

1.3.3.1 Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector UV (CE - UV) 25

1.3.3.2 Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn

Chương 2: THỰC NGHIỆM 40

2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 40

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 40

2.1.2 Chất chuẩn 41

2.1.3 Hóa chất, dung môi 42

2.1.4 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 43

2.2 Đối tượng nghiên cứu 44

2.2.1 Bệnh nhân 44

2.2.2 Mẫu nghiên cứu 44

2.3 Phương pháp nghiên cứu 46

2.3.1 Phương pháp định tính PQ trong nước tiểu 46

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu và tiền xử lý mẫu huyết tương 46

2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector DAD

(HPLC/ DAD) 47

2.3.3.1 Phương pháp khảo sát điều kiện tối ưu quá trình phân tích PQ

trên nền mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn 47

2.3.3.2 Phương pháp tối ưu quy trình xử lý mẫu huyết tương huyết tương phân tích bằng phương pháp HPLC/DAD 48

2.3.4 Phương pháp điện di mao quản (CE - C4D) 49

2.3.4.1 Phương pháp khảo sát điều kiện tối ưu phân tích dung dịch

PQ chuẩn 49

2.3.4.2 Phương pháp tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu huyết tương phân tích bằng phương pháp CE - C 4 D 50

2.3.5 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích 53

2.3.5.1 Tính chọn lọc 53

2.3.5.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 54

2.3.5.3 Độ chụm của phương pháp 54

2.3.5.4 Độ đúng của phương pháp phân tích 54

2.3.5.5 Độ ổn định của phương pháp 55

2.3.6 Ước lượng độ không đảm bảo đo 55

2.4 Áp dụng trong chẩn đoán, tiên lượng và điều trị ngộ độc cấp PQ 56

2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 58

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59

3.1 Phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC/DAD) định lượng paraquat trong huyết tương 59

3.1.1 Lựa chọn các điều kiện phù hợp của hệ thống phân tích HPLC/DAD 59

3.1.1.1 Xác định bước sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD 59

3.1.1.2 Ảnh hưởng của thể tích vòng mẫu 59

3.1.1.3 Lựa chọn loại pha động 61

3.1.1.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần pha động 62

3.1.1.5 hảo sát ảnh hưởng của pH pha động 64

3.1.1.6 hảo sát nồng độ các cấu tử trong pha động 65

3.1.1.7 hảo sát ảnh hưởng của tốc độ d ng 70

3.1.2 hảo sát phương pháp xử l mẫu huyết tương phân tích PQ 71

3.1.2.1 hảo sát nồng độ dung dịch CA 72

3.1.2.2 hảo sát th i gian lắc xoáy 73

3.1.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp HPLC 75

3.1.3.1 ính đặc hiệu 75

3.1.3.2 Đư ng chuẩn giới hạn phát hiện v giới hạn định lượng 76

3.1.3.3 Đánh giá độ chính xác của phương pháp phân tích 78

3.1.3.4 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại của phương pháp phân tích 81

3.2 Nghiên cứu định lượng paraquat trong huyết tương người bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE - C4 D) 88

3.2.1 Tìm điều kiện tối ưu phân tích paraquat bằng phương pháp CE - C4 D 88

3.2.1.1 Ảnh hưởng của loại đệm 89

3.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của th i gian bơm mẫu 95

3.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thế tách 96

3.3 So sánh kết quả phân tích nồng độ paraquat trong huyết tương của các

bệnh nhân ngộ độc paraquat bằng phương pháp CE - C4D và phương pháp HPLC/DAD 128

3.4 Nghiên cứu áp dụng kết quả định lượng nồng độ paraquat huyết tương

phục vụ chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp PQ 132

3.4.1 Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu 133

3.4.1.1 Đặc điểm về tuổi 133

3.4.1.2 Đặc điểm về giới 133

3.4.1.3 Nguyên nhân ngộ độc 134

3.4.1.4 Th i gian vào viện 134

3.4.2 ngh a định lượng paraquat huyết tương trong chẩn đoán mức độ nặng

và tiên lượng bệnh nhân 135

3.4.2.1 Tỷ lệ tử vong của các bệnh nhân ngộ độc cấp PQ 135

3.4.2.2 Nồng độ paraquat huyết tương ở hai nhóm sống và tử vong 136

3.4.2.3 Giá trị tiên lượng tử vong của nồng độ PQ huyết tương và

điểm SIPP 137

3.4.3 ngh a định lượng PQ huyết tương trong điều trị ngộ độc PQ

(đánh giá hiệu quả và hướng dẫn lọc máu hấp phụ) 138

3.4.3.1 Các biện pháp điều trị được áp dụng 138

3.4.3.2 Điều trị lọc máu hấp phụ 139

3.4.3.3 Khảo sát giá trị nồng độ PQ sau mỗi lần lọc 140

3.4.3.4 Xác định số cuộc lọc cần thiết dựa vào nồng độ PQ 141

ẾT LUẬN 144

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN

ĐẾN LUẬN ÁN 146

TÀI LIỆU THAM KHẢO 147

PHỤ LỤC 160

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức hóa học của paraquat 5

Hình 1.2 Cơ chế gây độc của paraquat 7

Hình 1.3 Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml),

thời gian sau uống, và khả năng sống 12

Hình 1.4 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản 24

Hình 1.5 Sơ đồ thiết kế của C4D 26

Hình 1.6 Quy trình chung xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn 34

Hình 2.1 Quy trình định tính PQ trong nước tiểu người 46

Hình 3.1 Ph hấp thụ UV của PQ 59

Hình 3.2 Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu 60

Hình 3.3 Sắc đồ phân tích PQ trong huyết tương với các hệ dung môi khác nhau 61

Hình 3.4 Sắc đồ khảo sát t lệ pha động ACN: dung dịch đệm (pH = 2,5) v/v 63

Hình 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH 64

Hình 3.6 Sắc đồ khảo sát nồng độ của natriheptanesulfonate trong đệm pH 2,5 66

Hình 3.7 Sắc đồ của PQ khi thay đ i nồng độ của Cl trong pha động 68

Hình 3.8 Sắc đồ của PQ khi thay đ i nồng độ của PEG trong pha động 69

Hình 3.9 Sắc đồ khảo sát tốc độ d ng 70

Hình 3.10 Hiệu quả loại bỏ protein trong huyết tương khi sử dụng TCA 72

Hình 3.11 Sơ đồ quy trình xử lý PQ trong mẫu huyết tương 74

Hình 3.12 Sắc đồ PQ trong huyết tương chuẩn áp dụng quy trình xử l

mẫu hình 3.11 75

Hình 3.18 Điện di đồ sự ảnh hưởng của nồng độ đệm điện di đến khả năng

phân tách PQ 94

Hình 3.19 Điện di đồ về sự ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu 96

Hình 3.20 Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của điện thế tách đến thời gian

di chuyển và sự phân tách pic 97

Hình 3.21 Điện di đồ sự ảnh hưởng của các cation đến tín hiệu PQ 99

Hình 3.22 Điện di đồ chiết tách PQ bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng sử dụng chất tạo cặp ion BTB ở pH = 6,5 101

Hình 3.23 Điện di đồ chiết tách PQ bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng sử dụng chất tạo cặp ion sodium 1-heptane sulfonate ở pH = 3,0 101

Hình 3.24 Điện di đồ phân tích mẫu huyết tương thêm chuẩn PQ 5 µg/ml

sử dụng cột WCX và cột C18 102

Hình 3.25 Điện di đồ minh chứng sự loại bỏ cation Na+ 140 mM của cột C18 103

Hình 3.26 Điện di đồ minh chứng sự loại bỏ cation Ca2+ 5 mM của cột C18 104

Hình 3.27 Điện di đồ minh chứng hiệu quả sử dụng của EDTA đến sự

phân tách PQ 105

Hình 3.28 Điện di đồ ảnh hưởng của nồng độ EDTA đến sự phân tách PQ 107

Hình 3.29 Điện di đồ phân tích mẫu chiết pha rắn ở các điều kiện pH

khác nhau 108

Hình 3.30 Điện di đồ về sự ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt (HĐBM)

trong quá trình SPE đến khả năng tách PQ 109

Hình 3.31 Kết quả phân tích điện di sau khi chiết pha rắn sử dụng các loại

dung dịch rửa tạp khác nhau 111

Hình 3.32 Điện di đồ sự ảnh hưởng của t lệ dung dịch rửa tạp đến khả năng

phân tách PQ 112

Hình 3.33 Điện di đồ về ảnh hưởng của thành phần dung dịch rửa tạp

đến khả năng tách PQ trên cột C18 114

Hình 3.34 Ảnh hưởng của HCl trong dung dịch rửa giải đến tín hiệu PQ 115

Hình 3.35 Sự phụ thuộc diện tích pic PQ vào thể tích HCl thêm vào trong

dung dịch rửa giải 115

Hình 3.36 Điện di đồ thể hiện sự ảnh hưởng của t lệ acetic acid trong dung dịch

rửa giải đến PQ 116

Hình 3.37 Quy trình chiết dung dịch mẫu huyết tương trên cột C18 sử dụng chất tạo cặp ion 117

Hình 3.38 Quy trình chiết cột C18 không sử dụng chất tạo cặp ion (QT2) 118

Hình 3.39 Độ chọn lọc của phương pháp CE - C4D 119

Hình 3.40 Đường chuẩn của dung dịch PQ chuẩn và mẫu huyết tương

thêm chuẩn PQ 122

Hình 3.41 Tương quan nồng độ PQ huyết tương khi định lượng bằng CE - C4D

và HPLC (n=118) 131

Hình 3.42 Phân bố tu i của nhóm bệnh nhân nghiên cứu 133

Hình 3.43 Tỷ lệ tử vong do ngộ độc PQ 135

Hình 3.44 Nồng độ Paraquat huyết tương ở hai nhóm sống và tử vong 136

Hình 3.45 Giá trị tiên lượng tử vong của nồng độ PQ huyết tương và

điểm SIPP 137

Hình 3.46 Nồng độ PQ huyết tương khi vào viện và sau mỗi cuộc lọc

bằng phương pháp HPLC và CE - C4D 140

Hình 3.47 Ước lượng số cuộc lọc theo nồng độ PQ huyết tương lúc vào viện 141

Hình 3.48 Tỷ lệ tử vong ở nhóm lọc máu và nhóm không lọc máu 142

Hình 3.49 Điện di đồ đường chuẩn PQ trong huyết tương 171

Hình 3.50 Điện di đồ kết quả phân tích nồng độ PQ vào viện của một số

bệnh nhân điển hình 171

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định PQ bằng phương pháp sắc ký khí 19

Bảng 1.2 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định paraquat trong dịch sinh học

bằng phương pháp HPLC 21

Bảng 1.3 Tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối ph để định lượng PQ 23

Bảng 1.4 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định paraquat bằng phương pháp điện di mao quản 28

Bảng 1.5 Tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng quy trình chiết pha rắn nhằm

chiết tách paraquat 36

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của t lệ pha động tới độ phân cực, thời gian lưu,

hệ số đối xứng pic 63

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của pH tới thời gian lưu, hệ số đối xứng pic 65

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ PEG đến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic 69

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ TCA đến hiệu quả chiết PQ ra khỏi

huyết tương 73

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian lắc xoay đến quá trình chiết 74

Bảng 3.6 Nồng độ và diện tích pic trung bình của PQ 76

Bảng 3.7 Kết quả phân tích lặp lại các mẫu huyết tương thêm chuẩn 79

Bảng 3.8 Các đại lượng thống kê 79

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ thu hồi đối với phương pháp phân tích PQ 80

Bảng 3.10 Độ lặp lại về thời gian lưu và diện tích pic của các chất 81

Bảng 3.11 Kết quả hàm lượng PQ tìm lại được bằng phương pháp thêm chuẩn

của 3 kỹ thuật viên khác nhau 82

Bảng 3.12 Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích tiến hành bởi ba KTV khác nhau 83

Bảng 3.13 Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp của phương pháp phân tích 84

Bảng 3.14 ết quả xác định độ n định trong ngày 84

Bảng 3.15 ết quả xác định độ n định khác ngày 85

Bảng 3.16 Cách dựng đường chuẩn trên nền mẫu huyết tương và

độ không đảm bảo đo 87

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến điện tích pic (Spic)

và thời gian di chuyển (tdc) của PQ chuẩn 90

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm điện di

đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của PQ chuẩn 92

Bảng 3.19 Sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc )

của PQ vào nồng độ dung dịch đệm điện di 94

Bảng 3.20 Sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc)

của PQ vào thời gian bơm mẫu 95

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của điện thế tách (E) đến thời gian di chuyển (tdc)

và diện tích pic (Spic ) của chất phân tích 97

Bảng 3.22 Điều kiện tối ưu cho phân tích PQ bằng phương pháp CE - C4D 100

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ EDTA đến hiệu suất thu hồi PQ

trong huyết tương 106

Bảng 3.24 Kết quả hiệu suất thu hồi PQ ở các pH khác nhau 108

Bảng 3.25 Hiệu suất thu hồi PQ khi sử dụng chất hoạt động bề mặt khác nhau trong SPE 110

Bảng 3.26 Kết quả hiệu suất thu hồi PQ khi sử dụng các loại dung dịch rửa tạp khác nhau 111

Bảng 3.27 Kết quả hiệu suất thu hồi PQ ở các t lệ dung dịch rửa tạp khác nhau 113

Bảng 3.28 Kết quả hiệu suất thu hồi PQ khi sử dụng các dung dịch rửa giải

Bảng 3.34 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp chiết pha rắn

trong định lượng PQ trong huyết tương trên nền mẫu thực 125

Bảng 3.35 Kết quả xác định độ tái lặp của phương pháp 126

Bảng 3.36 Cách dựng đường chuẩn và độ không đảm bảo đo của điểm chuẩn

trong dung dịch chuẩn trên nền mẫu huyết tương 127

Bảng 3.37 So sánh nồng độ PQ lúc vào viện của 30 bệnh nhân điển hình

bằng phương pháp CE - C4D và phương pháp HPLC 129

Bảng 3.38 Thời gian xuất hiện triệu chứng, vào viện tuyến cơ sở

và Trung tâm Chống độc 134

Bảng 3.39 Các yếu tố tiên lượng tử vong 138

Bảng 3.40 Các biện pháp điều trị được áp dụng 139

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

% RSD % Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

% RSDR % Reproducibility standard

deviation

% Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối

ATP Adenosin Triphosphate Adenosin Triphosphat

CE - C4D

Capillary electrophoresiss with capacitively couple contactless conductivity detection

Điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc

CZE Capillary zone electrophoresiss Điện di mao quản vùng CTAB Cetyltrimetylamonium bromide Cetyltrimetylamoni bromid DAD Diode-array detector Detector mảng diode

DDAB Didecyldimethyl amonium

bromide

Didecyldimetyl amoni bromid

HPLC

High performance liquid Chromatography Sắc k lỏng hiệu năng cao

LC - MS Liquid Chromatography - Mass

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

MCX Medium cation-exchange column Cột trao đ i cation

trung bình

Mes Acid 2- (N-morpholino)

etansulfonic

Axit 2-(N-morpholino) etansunfonic

R Relative coefficient Hệ số tương quan

ROC Receiver operating characteristics Đường cong ROC

RP-HPLC Reverse phase-HPLC Sắc k lỏng pha đảo

SIPP Severity Index of Paraquat

Poisoning

Ch số độ nặng của ngộ độc paraquat

TCA Trichloroacetic acid Axit tricloaxetic

TTCĐ Poison control center Trung tâm Chống độc UV-VIS Ultraviolet-Visible Vùng tử ngoại khả kiến WCX Weak cation-exchange column Cột trao đ i cation yếu

*Ghi chú: Tên hóa chất viết theo nguyên gốc tiếng Anh

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết, mục tiêu và nội dung của luận án

Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) thuộc nhóm hợp chất amin

bậc 4, được t ng hợp đầu tiên vào năm 1882 Paraquat (PQ) ứng dụng trong nông nghiệp làm hóa chất trừ cỏ từ những năm 1950 [109] với giá thành rẻ, hiệu quả diệt cỏ dại nhanh chóng, ít ảnh hưởng tới môi trường Do đó, PQ hiện đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau Tuy nhiên,

PQ lại là một chất hóa học vô cùng độc với người Liều tử vong của PQ ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20% Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ độc PQ đã được báo cáo [22], [69], [107] Tại Trung tâm Chống độc - Bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng T lệ tử vong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80 % [82],[ 96] Trước thực tế đó, rất nhiều quốc gia (32 quốc gia) cấm lưu hành và sử dụng PQ Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã ban hành thông tư về việc loại bỏ PQ ra khỏi danh mục các hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được phép sử dụng ngày 08/02/2017 [1] Mặc dù vậy, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ và đến cấp cứu tại TTCĐ có suy giảm nhưng không đáng kể do lượng hóa chất diệt cỏ chứa thành phần PQ vẫn còn tồn dư rất nhiều trên thị trường

Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ trong huyết tương đóng vai tr đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều

Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới từ lâu đã áp dụng phương pháp quang ph hấp thụ phân tử [62], [66], [89], phương pháp sắc ký khí khối ph (GC-MS) [13], [33], [76], [79], điện di mao quản (CE) [73], [80], [86], [88], sắc ký lỏng với các detector khác nhau [39], [59], [81], [118] Mặc dù việc định lượng sớm nồng độ PQ trong huyết tương để xác định mức độ nặng và tiên lượng khả năng sống cũng như tiến hành lọc máu hấp phụ từ tuyến trung ương đến địa phương là rất quan trọng nhưng ngay cả tại Trung tâm Chống độc - Bệnh viện Bạch Mai dù có thiết bị HPLC nhưng mới ch áp dụng để định lượng một số loại thuốc tân dược (gardenal, paracetamol, …) trong huyết tương mà chưa đưa vào áp dụng thường qui quy trình định lượng PQ Trong khi đó hầu hết bệnh viện tuyến địa phương chưa được trang bị thiết bị HPLC (do giá thành trang thiết bị cao) nên việc định lượng độc chất còn hoàn toàn bỏ ngỏ Do vậy, với mong muốn có thể tiến hành định lượng sớm nồng độ PQ huyết tương bệnh nhân tại các bệnh viện tuyến trung ương và ngay tại tuyến cơ sở, hỗ

trợ hiệu quả chẩn đoán và điều trị, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng

phương pháp phân tích paraquat trong huyết tương và áp dụng phục vụ chẩn đoán, điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp paraquat” với ba mục tiêu:

1 Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích paraquat trong huyết tương ngư i bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD (HPLC/DAD) nhằm xây dựng phương pháp tiêu chuẩn cho phòng xét nghiệm tuyến trung ương v l m phương pháp tham chiếu xây dựng phương pháp phân tích mới

2 Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích mới điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE - C 4 D) hướng đến phân tích paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngay tại các phòng xét nghiệm tuyến địa phương

3 Áp dụng định lượng paraquat trong mẫu huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat tại bệnh viện tuyến trung ương bằng hai phương pháp từ đó đánh giá hiệu quả phục vụ điều trị ngộ độc cấp PQ dựa vào nồng độ PQ trong huyết tương

Với các mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

- Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích PQ bằng phương pháp HPLC/DAD: tìm các điều kiện tối ưu để phân tích PQ trên thiết bị HPLC, nghiên cứu quy trình chiết PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

- Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích PQ bằng phương pháp CE -

C4D: tìm các điều kiện tối ưu để phân tích PQ trên thiết bị CE - C4D, nghiên cứu quy trình chiết PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích

- Áp dụng phân tích PQ trong huyết tương của bệnh nhân ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc - Bệnh viện Bạch Mai bằng cả hai phương pháp, so sánh kết quả phân tích bằng phương pháp CE - C4D với kết quả phân tích bằng sắc k lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định độ tin cậy của phương pháp phân tích CE - C4

 Về mặt thực tiễn

- Kết quả định lượng PQ trong 364 mẫu huyết tương của 199 bệnh nhân ngộ độc cấp PQ tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai đã giúp bác s xác định mức độ ngộ độc, tiên lượng nguy cơ tử vong, đánh giá hiệu quả điều trị lọc máu hấp phụ và xây dựng được phác đồ lọc máu hấp phụ cho bệnh nhân dựa trên nồng độ PQ huyết tương

- Phương pháp CE - C4D với các ưu điểm về hệ thiết bị gọn nhẹ, giá thành thấp, ngày càng được ứng dụng rộng rãi, phù hợp với hoàn cảnh, điều kiện kinh tế, xã hội ở Việt Nam Các quy trình phân tích xây dựng trong luận án đơn giản, dễ thực hiện, có độ chính xác cao, rất phù hợp để áp dụng phân tích

PQ trong huyết tương, đáp ứng đầy đủ điều kiện từ các bệnh viện tuyến cơ sở đến trung ương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về paraquat

1.1.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa học của paraquat

 Công thức hóa học

Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là

1,1'-dimethyl-4,4' bipyridilium PQ có khối lượng mol phân tử là 186,2 g/mol, có công thức hóa học như hình 1.1:

Hình 1.1 Công thức hóa học của paraquat

 ính chất lý hóa học của paraquat

PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20oC là 1,240 - 1,260, điểm chảy 175 - 180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong nước 6,5 - 7,5 PQ thường ở dạng dimethylsulphate hoặc dichloride Dạng dichloride tinh thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa PQ n định trong dung dịch môi trường axít hoặc trung tính và không n định trong môi trường kiềm PQ

1.1.2 Thực trạng sử dụng paraquat hiện nay

Paraquat thuộc nhóm trừ cỏ dại Bipyridylium được tập đoàn ICI phát minh

năm 1955, được thương mại hóa và sử dụng năm 1962 [77] Hiện nay, ngoài công

ty Syngenta (Thụy Sỹ), Sundat (Singapore) và United Phosphorus (Ấn Độ) thì hơn

15 doanh nghiệp thuốc BVTV Trung Quốc sản xuất và đưa ra thị trường thế giới một lượng lớn thuốc trừ cỏ PQ với tên gọi thường gặp như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen [109] Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là Syngenta hay c n gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc nhưng trên đất nước họ đã cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước thứ ba [113]

PQ được sản xuất và sử dụng chủ yếu ở 2 dạng chế phẩm SG (hạt tan trong nước) và SL (dung dịch đậm đặc), PQ và thành phẩm chứa PQ thuộc nhóm độc loại

II, không tồn tại lâu trong môi trường sống, tan nhanh trong nước Hiện tại, có hơn

90 quốc gia đăng k và sử dụng PQ (với mức độ sử dụng khác nhau), trong đó có nhiều nước có nền nông nghiệp phát triển Tuy nhiên, với thực trạng ngộ độc và tử vong do PQ trên thế giới, rất nhiều quốc gia phải xem xét lại công tác quản lý thuốc trừ cỏ PQ, rà soát lại mức độ sử dụng, thậm chí có thể hạn chế, cấm sử dụng

Trong danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng ở Việt Nam (ban hành kèm theo thông tư số 21/2013/TT-BNNPTNT) ngày 16/4/2013 của Bộ trưởng Bộ

NN & PTNT) có 45 tên thương phẩm thuốc PQ, trong đó 41 thành phẩm dạng dung dịch chất lỏng tan trong nước (SL), 3 thành phẩm dạng dung dịch nước (AS) và 1 thành phẩm dạng thuốc bột hòa nước (WP) T ng số hóa chất PQ được nhập vào

VN năm 2012 là 10699,374 lít (tăng 15% so sới năm 2011) và năm 2013 là 9953,223 lít (giảm 7% so với năm 2012) T ng cộng số lượng PQ thành phẩm 20% được nhập khẩu và sử dụng ở Việt Nam trong 3 năm (2011-2013) là 27548,295 lít (lượng dùng trung bình từ 1,5 - 2,0 l/ha) Trong số này 17% lượng nhập khẩu từ Syngenta, 70% từ các công ty Trung quốc, số còn lại từ Singapore và Ấn Độ Lượng thuốc trừ cỏ chứa thành phần PQ vẫn được nước ta ưu tiên sử dụng hàng đầu trong việc diệt cỏ Bên cạnh việc bị nhiễm độc trong qúa trình sử dụng thì cũng có

rất nhiều người dân sử dụng để tự tử Hàng năm, Trung tâm Chống độc - Bệnh viện Bạch Mai đã tiếp nhận rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ và t lệ tử vong rất cao Năm 2011 t lệ tử vong đối với các bệnh nhân ngộ độc PQ là 72,9% Số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ tiếp tục gia tăng trong những năm gần đây Trước thực trạng đó, ngày 08/02/2017 Bộ NN & PTNT đã ra quyết định số 278/QĐ- BNN-BVTV loại bỏ

PQ cùng với 2,4-D ra khỏi danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng tại Việt Nam Theo quyết định này PQ ch được sản xuất và nhập khẩu tối đa 1 năm, được buôn bán, sử dụng tối đa 2 năm kể từ ngày ký quyết định Tuy nhiên, với lượng PQ đã nhập những năm trước (theo thống kê trên) thì PQ vẫn còn tồn dư rất nhiều, có thể được sử dụng bất hợp pháp trong một thời gian khá dài nữa Do vậy, nguy cơ người dân dùng PQ tự tử vẫn có khả năng cao

Diquat cũng là một hóa chất diệt cỏ nhanh và hiệu quả Diquat có tính chất khá giống với PQ, trong điều kiện thích hợp diquat có thể chuyển thành PQ và ngược lại [31] Tuy nhiên, diquat không có trong danh mục hóa chất bảo vệ thực vật

và cũng không có bất kỳ hãng nào thương mại sản phẩm này tại Việt Nam

1.1.3 Độc tính của paraquat

Cơ chế gây độc của PQ được mô tả trong hình 1.2:

Trong giai đoạn đầu của chu trình này, ion PQ2+

cùng với NADPH tạo ra ion paraquat bị khử (PQ2+.) và NADP+ PQ2+. phản ứng hầu như ngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ2+ và gốc superoxide Có sẵn NADPH và oxy, chu trình oxy hoá

- khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và không ngừng tạo ra gốc superoxide Gốc tự do superoxide sau đó phản ứng với bản thân nó để tạo ra hydro peroxide (H2O2), và H2O2 cùng với sắt để tạo thành gốc tự do hydroxyl [69],[ 90] Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào Chu trình oxy hoá - khử tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm t n thương tế bào, gây phản ứng với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [25], [113],[ 115] Các thử nghiệm điều trị nhằm vào việc thay đ i các gốc tự do bằng các chất như desferioxamin, superoxide dismutase, α-tocopherol và vitamin C cùng với bài niệu cưỡng bức Tuy nhiên, cho đến hiện nay không có chất nào trong số này được khuyến cáo dùng [35], [37], [110]

PQ có tính ăn m n và gây t n thương giống như kiềm khi tiếp xúc với da, mắt

và các niêm mạc Khi tiếp xúc với PQ qua đường hô hấp, lượng PQ hấp thu không đến mức gây nhiễm độc vì kích thước các hạt chứa PQ lớn (hầu hết trên 100 m) làm cho PQ không đi sâu xuống đường hô hấp để hấp thu [24] Mắt tiếp xúc với PQ sẽ bị

t n thương, nhưng không đủ để gây nhiễm độc toàn thân

Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc PQ là đường tiêu hoá, thận, gan và

ph i Dạ dày, ruột bị t n thương nặng nề do tác dụng ăn m n trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ tự tử với nồng độ cao Thận là cơ quan đào thải PQ và có nồng độ

PQ cao hơn so với các cơ quan khác Riêng ở ph i, PQ vào các tế bào phế nang týp

I và II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo cơ chế vận chuyển tích cực Nhìn chung PQ gây t n thương hầu hết các cơ quan trong cơ thể vì liên quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp thu nhiều PQ hoặc tham gia thải trừ PQ thì t n thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong, như t n thương ph i gây suy hô hấp, suy thận cấp, viêm gan nhiễm độc, loét niêm mạc đường tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [14],[ 29],[ 106]

Tiếp xúc với lượng PQ ít hơn gây tử vong chậm do xơ ph i tiến triển và suy thận [97] Một số nghiên cứu gần đây c n cho thấy phơi nhiễm PQ có liên quan với hội chứng Parkinson [72]

Trong ngộ độc cấp PQ, có thể tiên lượng bệnh dựa trên nồng độ PQ trong huyết tương Một số báo cáo cho thấy nồng độ PQ huyết tương vượt qua 2 µg/ml thì hầu hết tử vong, tuy nhiên một vài trường hợp bệnh nhân vẫn hồi phục khi nồng độ trong máu cao hơn 2 µg/ml [15],[ 22],[ 75]

1.1.4 Dược động học paraquat

PQ được hấp thu rất nhanh qua đường tiêu hóa (chủ yếu ở ruột non) nhưng ít (5-10%) Khi dạ dày ruột bị t n thương lan rộng, số lượng PQ được hấp thu sẽ tăng lên PQ không gắn với protein huyết tương Nồng độ đ nh của PQ trong huyết tương đạt được trong vòng 2 giờ sau uống [14], [106]

Sau khi uống, PQ phân bố nhanh chóng tới tất cả các cơ quan chính như

ph i, thận, gan và cơ, đặc biệt là ph i, PQ sẽ bị khử thành dạng gốc tự do hoạt tính cao [17],[ 75]

PQ đạt được nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong ph i, nồng độ trong ph i

có thể cao hơn so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần Sau uống 5-7 giờ, nồng độ

PQ trong mô ph i đạt cao nhất Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cũng cần đạt đến một ngưỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở ph i diễn ra [24]

PQ qua được nhau thai Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và máu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần Không có bào thai nào

1.2 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương

 Tiên lượng bệnh nhân ngộ độc PQ

Ngộ độc PQ là một trong số ít ngộ độc có thể tiên lượng mức độ nặng và kết cục dựa vào các xét nghiệm, bệnh sử và biểu hiện lâm sàng Tiên lượng tốt có thể tránh áp dụng các biện pháp điều trị can thiệp tích cực, đắt tiền ở các bệnh nhân rất nhẹ không cần can thiệp hoặc ngược lại, ở những bệnh nhân không còn

hy vọng sống [19], [40] Các yếu tố tiên lượng đã được đề cập đến trong nhiều nghiên cứu bao gồm: nồng độ dung dịch PQ bệnh nhân uống, công thức sản phẩm thương mại (có thêm các chất gây nôn không…), lượng PQ uống, sau uống có nôn không, điều trị đã được áp dụng đặc biệt là các biện pháp ngăn ngừa hấp thu, nồng

độ PQ nước tiểu và huyết tương [18], [19], [42], [49], [84], [85], [95] Ngộ độc do

tự tử thường nặng hơn là ngộ độc không cố ý (tai nạn, uống nhầm) vì lượng PQ thường nhiều Khám lâm sàng có thể thấy t n thương niêm mạc miệng họng, nội soi có thể thấy thêm loét thực quản, dạ dày trong vòng 24 giờ đầu và đây là một yếu tố tiên lượng xấu [20] Sự tiến triển suy thận cấp cho thấy ngộ độc nặng và tiên lượng xấu [108], [16], [58], [91] Hầu hết bệnh nhân suy thận đều tiến triển

t n thương ph i đáng kể, tuy nhiên th nh thoảng có báo cáo bệnh nhân suy thận

mà không tiến triển t n thương ph i nặng [27] Định lượng nồng độ PQ huyết tương là phương pháp đáng tin cậy nhất để đánh giá mức độ nặng và tiên lượng bệnh nhân vì mức độ nặng và tốc độ tiến triển các dấu hiệu ngộ độc phụ thuộc vào lượng PQ hấp thụ vào cơ thể Bệnh nhân bị nhiễm độc cần được theo dõi và điều trị cho đến khi PQ huyết tương âm tính Nhiễm độc PQ đã được báo cáo ở trẻ em

từ khá sớm [74] Cách tiếp cận lâm sàng cho trẻ em bị ngộ độc PQ không khác biệt với người lớn

 Xét nghiệm PQ trong các mẫu sinh học

Xét nghiệm định tính PQ trong nước tiểu cho kết quả nhanh là xét nghiệm được làm đầu tiên khi bệnh nhân nhập viện để chẩn đoán xác định bệnh nhân bị ngộ độc PQ Xét nghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cho kết quả sau đó giúp

đánh giá mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng khả năng sống và đặc biệt là hướng dẫn cho bác s thực hiện liệu trình lọc máu hấp phụ PQ có thể được phát hiện hoặc định lượng trong một số các mẫu dịch sinh học và mô, và trong một số mẫu vật (dung dịch hóa chất BVTV không có tên…) nghi ngờ là nguồn PQ uống hoặc tiếp xúc Trong các tình huống cấp cứu, PQ có thể được định tính trong nước tiểu, dịch

dạ dày, định lượng trong huyết tương và trong một số nghiên cứu định lượng nồng

độ trong dịch lọc (từ máy lọc máu) Trong pháp y, PQ có thể được định lượng trong một số mô hoặc máu toàn phần

Tiên lượng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào biến đ i nồng độ PQ huyết tương theo thời gian Nồng độ PQ phải được xác định trước khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm giảm nồng độ PQ (lọc máu hấp phụ…) Biểu đồ tiên lượng khả năng sống từ kết quả định lượng nồng độ PQ huyết tương tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân lần đầu tiên được Proudfoot [85] đề cập đến Những BN sống có nồng độ PQ trong huyết tương dưới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l ở thời điểm 4, 6, 10, 16, và 24 giờ tương ứng sau uống PQ Sau đó, biểu đồ này được Hart và cộng sự [42] tinh ch nh lại bằng cách đánh giá nồng độ PQ huyết tương từ một nhóm bệnh nhân lớn hơn (n = 218) (Hình 1.3) trong đó tính đến xác suất 10, 20, 30, 50, 70 và 90% khả năng bệnh nhân sống sót [42] và nồng

độ trong vòng 3 giờ đầu khó đánh giá tiên lượng Ở một nghiên cứu khác, Schermann và cộng sự [95] đã mở rộng đường cong tiên lượng BN này lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc và nhận thấy những BN có nồng độ PQ huyết tương trên

được đánh giá trong v ng 24 h sau uống PQ Mặc dù đồ thị hình 1.3 đã giúp xác định mức độ nặng và tiên lượng tử vong nếu định lượng được PQ ngay lập tức nhưng cũng đôi khi tiên đoán sai Nguyên nhân là do ước tính thời gian từ khi uống PQ dễ sai, đặc biệt trong vài giờ đầu tiên nồng độ PQ huyết tương giảm nhanh, sai số về thời gian thậm chí 0,5 đến 1h có thể thay đ i hoàn toàn mối quan

hệ nồng độ và tiên lượng

Hình 1.3 Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml),

thời gian sau uống, và khả năng sống

Năm 1988 Sawada và cộng sự [93] báo cáo ch số tiên lượng ngộ độc PQ dựa trên nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BN

sống Ch số độ nặng của ngộ độc PQ (SIPP: Severity Index of Paraquat Poisoning)

tính bằng thời gian từ khi uống (giờ) cho đến khi bắt đầu điều trị bệnh nhân với nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml) khi vào viện

SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)]× [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)]

hi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tử vong muộn do suy hô hấp (10 < SIPP < 50) với tử vong sớm do suy tuần hoàn (SIPP >

50) Sau đó, Yamamoto và cộng sự [114] nghiên cứu trên 43 bệnh nhân cho thấy ngộ độc PQ được đặc trưng bởi mức tiêu thụ O2 cao với chiết xuất O2 từ máu cao và mức độ rối loạn tương ứng điểm SIPP Các tác giả cũng cho rằng sự mất cân bằng

rõ rệt giữa nhu cầu O2 tăng và giảm cung cấp O2, do ức chế cơ tim, có thể là nguyên nhân gây tử vong vì suy tuần hoàn Tuy nhiên, Suzuki và cộng sự [105] đã so sánh SIPP với đồ thị tiên lượng sống trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sau uống

PQ Các kết cục của BN dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1 trường hợp

tử vong và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10 trường hợp tử vong Những khác biệt này có ngh a thống kê, và tác giả kết luận rằng dựa trên nồng độ PQ trong 24h đầu sau uống, đồ thị của Proudfoot tiên lượng chính xác hơn SIPP [104]

Ikebuchi và cộng sự [49] phân tích đa biến trên 128 bệnh nhân đã lần đầu công bố một công thức để đánh giá mức độ nặng của ngộ độc PQ Tác giả đưa ra

ch số độc tính của PQ (TIP - Toxicological Index of PQ) Tuy nhiên, nghiên cứu

này ch có 21 bệnh nhân sống Điểm phân biệt (D) > 0,1 dự đoán sống sót, còn D < 0,1 dự đoán tử vong D được tính như sau:

D = 1,3114−0,1617 (lnT) −0,5408 (ln [ln (C × 1000)]) trong đó T là thời gian từ khi uống (h) và C là nồng độ PQ huyết tương (µg/ ml)

Sau đó, xác suất sống được Jones và cộng sự [53] tính bằng cách lập biểu đồ tương quan logarit của nồng độ PQ huyết tương (mg/l) với logarit của thời gian kể

từ khi uống Xác suất sống được tính theo tỷ lệ sau:

Huang và cộng sự [46],[ 47] đã thành công trong việc áp dụng bảng điểm

đánh giá độ nặng thường dùng trong hồi sức cấp cứu là APACHE II (Acute

Physiology and Chronic Health Evaluation II - Bảng điểm đánh giá mức độ nặng

dựa trên các biểu hiện cấp tính và tiền sử bệnh mạn tính phiên bản II) [60] trong

dự đoán tử vong tại bệnh viện của 64 bệnh nhân ngộ độc PQ cấp tính trong vòng

12 năm Nghiên cứu đã chứng minh điểm APACHE II có tương quan thuận với nồng độ PQ huyết tương và với lượng PQ uống Các tác giả kết luận rằng điểm

số APACHE II là một công cụ thực tiễn để đánh giá mức độ nặng của ngộ độc

PQ cấp

 Tiên lượng kết cục dựa vào nồng độ bán định lượng PQ nước tiểu

Mặc dù nồng độ PQ huyết tương có giá trị tiên lượng tốt, kết quả bán định lượng PQ nước tiểu giúp đánh giá nhanh tiên lượng [95] Xét nghiệm bán định lượng PQ nước tiểu rất dễ thực hiện, và có mối tương quan tốt với nồng độ dung dịch PQ uống Màu xanh càng sẫm thì tiên lượng càng nặng [95] Xét nghiệm cần làm theo dõi trong 24 giờ sau khi uống Tuy nhiên, phân tích kết quả cần thận trọng, bởi vì xét nghiệm bán định lượng nước tiểu sớm có thể đánh giá thấp lượng PQ được hấp thụ Scherrmann và cộng sự [95] định lượng nồng độ PQ nước tiểu ở 53 bệnh nhân, so sánh kết quả với xét nghiệm bán định lượng nước tiểu Hầu như tất cả bệnh nhân có nồng độ PQ niệu dưới 1µg/ml, trong vòng 24 giờ sau uống đều sống Bệnh nhân có kết quả bán định lượng nước tiểu nhiều hơn ++ (xanh rõ, > 10µg/ml) trong vòng 24 giờ sau uống có xác suất tử vong cao Ngược lại, bệnh nhân có ít hơn

± (xanh nhạt, < 1µg/l) có thể sống sót [95] Tuy nhiên, cũng cần phiên giải kết quả thận trọng vì suy thận cấp do PQ có thể ảnh hưởng đến bài tiết PQ và có thể dẫn đến kết quả âm tính giả

 Tiên lượng dựa vào các biểu hiện lâm sàng và xét nghiệm khác

Mặc dù nồng độ huyết tương là yếu tố tiên lượng đáng tin cậy nhất trong ngộ độc PQ, nhưng thực tế xét nghiệm này lại không có ở hầu hết các bệnh viện Do đó, điều trị can thiệp tích cực thường phải thực hiện mà không có kết quả nồng độ PQ

huyết tương Tuy nhiên, ph ng xét nghiệm của các bệnh viện có thể thực hiện các xét nghiệm thông thường, như công thức máu, sinh hóa máu và khí máu động mạch Một số xét nghiệm có kết quả nhanh ngay sau khi nhập viện, như khí máu

ch cần vài phút Lee và cộng sự [64] phân tích hồi quy đa biến trên 602 bệnh nhân ngộ độc PQ đã cho thấy tương quan giữa tử vong và một số kết quả bất thường trên xét nghiệm thông thường khi nhập viện Các tác giả kết luận rằng bên cạnh uống dung dịch PQ nồng độ thấp, các yếu tố tiên lượng tốt khác là tu i trẻ, không tăng bạch cầu và nhiễm toan (BN tử vong có HCO3- thấp hơn và do đó pH máu thấp hơn), và không có suy thận, gan và tụy khi nhập viện Nhịp tim, nhịp thở, hemoglobin, urê, creatinin, AST, ALT, bilirubin toàn phần, amylase và glucose cũng thấp hơn đáng kể ở những BN sống Do đó, các tác giả kết luận rằng sự bất thường ít hơn có thể phản ánh mức độ tiếp xúc hoặc hấp thụ PQ thấp hơn hoặc cơ thể chịu đựng tốt hơn đối với PQ Điều này hỗ trợ cho giả thuyết rằng tiên lượng còn bị ảnh hưởng bởi sự khác biệt giữa các cá nhân [42] Tăng aminotransferase, bilirubin hoặc amylase huyết thanh ở những bệnh nhân bị nhiễm độc nặng cũng thấy trong nghiên cứu của Bismuth và cộng sự [20] Xét nghiệm nhập viện ch ra rằng tiên lượng bệnh nhân ngộ độc PQ cấp phụ thuộc vào chức năng thận và cân bằng acid-base [20], [50] Tăng bạch cầu khi nhập viện cũng là một ch số dự đoán

tử vong trong ngộ độc PQ bởi Kaojarern và Ongphiphadhanakul [55] Các nghiên cứu gần đây trên số lượng bệnh nhân khá lớn tại Trung Quốc cho thấy hạ kali máu, tình trạng toan chuyển hóa, t n thương thận, gan, tăng amylase, tăng acid uric máu, điểm APACHE II là những yếu tố tiên lượng tử vong [54], [45], [121],

1.3 Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương

1.3.1 Phương ph p quang ph hấp thụ phân tử (UV - Vis)

Phương pháp UV - Vis dựa trên việc đo ph PQ trong vùng UV hoặc sự khử ion PQ trong môi trường kiềm để tạo ra một dung dịch có màu xanh và tiến hành đo

độ hấp thụ quang trong vùng Vis là phương pháp được ứng dụng rất rộng rãi để định lượng PQ trong huyết tương [56], [27], [28], [45] PQ được khử bằng các chất khử như NaBH4 [89] hoặc tetrabromophenolphthalein ethyl ester (TBPE) [62] hay

Na2S2O4 10% [66]

Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH4 là độ nhạy cao, với các điều kiện khử PQ là nhiệt độ 35 - 40°C, pH 10 - 11 thì màu có độ n định lên đến 12h và không cần đệm để n định màu, khoảng nồng độ 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo định luật Lambert - Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml Trong khi đó, phương pháp sử dụng TBPE thì mẫu được phép để tối đa trong 20 phút Cả 2 phương pháp này đều bị ảnh hưởng bởi DQ (do DQ có cấu trúc gần giống với

PQ), trong khi Rai M.K [30] loại bỏ DQ thì Kato K [62] lại định lượng đồng thời

cả PQ và DQ

Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được ảnh hưởng của các thuốc trừ sâu thông thường và các ion kim loại khác Các ion kim loại như Fe3+

và Al3+, có thể ảnh hưởng do làm kết tủa hydroxide, được loại bỏ khi thêm 1 ml

Na2H2Y 5 trước khi thêm dung dịch NaOH [89] Theo Kato K [62], DQ cũng

có thể chiết được với TBPE trong dichloromethane cũng giống như PQ nhưng PQ-TBPE có quang ph hấp thụ hơi khác với DQ - TBPE Độ hấp phụ của PQ được ở bước sóng 603 nm & DQ ở bước sóng 608 nm trong khoảng tuyến tính 4,5 - 45,0×10-7 M

Phương pháp định lượng PQ, sử dụng tác nhân khử NaBH4 đã được ứng dụng để định lượng PQ trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân như máu, nước tiểu, sữa

mẹ cũng như các mẫu thực phẩm và các mẫu trong môi trường

Với phương pháp đo quang vùng UV, không phát hiện được PQ tại bước

sóng 257 nm, nên Chang bin Li và cộng sự [66] đã định lượng nồng độ PQ trong

huyết tương dựa trên việc đo quang ph dẫn xuất PQ (tuân theo định luật Lambert

Beer với r=0,996) Dung dịch nước chuẩn PQ 10 μg/ml được quét bước sóng từ 200

đến 300 nm, với mẫu trắng là nước cất Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (t lệ 6:1, v/v) Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút Lấy dịch trong phần trên đi đo trong khoảng bước sóng từ 200 đến 300 nm Trước khi đo, 400 μl mẫu được lắc trộn nhẹ nhàng

và hoàn toàn với 100 μl hỗn hợp đồng thể tích Na2S2O4 10% và NaOH 5M Làm tương tự với mẫu huyết tương trắng đối chiếu và đo độ hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng bước sóng Δλ=0,5 nm), từ đó dẫn xuất của

PQ có thể được tính toán theo công thức Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bước sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [66]

silicagel, than hoạt tính, một số polyme hoặc chất vô cơ có khả năng hấp phụ cao Nếu pha t nh ở thể lỏng, ta có sắc kí khí - lỏng Chất lỏng bao bọc quanh bề mặt một chất rắn trơ tạo nên một lớp phim mỏng Cơ sở cho sự tách chính là sự phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng này Do khả năng h a tan các chất của chất khí rất kém nên d ng khí (pha động) trong GC không đóng vai tr của một pha động thực sự trong hệ sắc ký mà ch làm nhiệm vụ lôi cuốn các chất trong pha hơi di chuyển dọc theo pha t nh để chúng có thể tương tác với các lớp pha t nh khác nhau Đóng vai tr đẩy các chất ra khỏi pha t nh chính là nhiệt độ Các chất có nhiệt độ sôi khác nhau sẽ bị lưu giữ bởi pha t nh hay bị lôi cuốn bởi dòng khí mang khác nhau, từ đó các chất sẽ tách khỏi nhau và được phát hiện ở

bộ phận thu nhận tín hiệu [2], [8], [10]

Sắc k khí là phương pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao, từ lâu đã được sử dụng để định lượng PQ trong dịch sinh học [5], [32], [16], [79] Trong các nghiên cứu, hầu hết các tác giả sử dụng kỹ thuật ghi ph là chế độ chọn lọc ion (selected ion monitoring - SIM) để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm ethyl paraquat (EPQ) làm chất nội chuẩn, khí He được dùng như là khí mang để đưa chất phân tích vào cột Dung dịch mẫu phân tích đều được khử bằng NaBH4 trước khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau, từ đó giới hạn phát hiện PQ trong các nghiên cứu lại có sự khác nhau Bảng 1.1 tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký khí xác định PQ trong một số loại mẫu khác nhau

Bảng 1.1 Tóm tắt một số nghiên cứu x c định PQ bằng phương ph p sắc ký khí

Chất nội

Tài liệu tham khảo

x 0,25mm, 0,1µm)

192

Ethyl paraquat (EPQ)

196

Ethyl paraquat (EPQ)

186

Ethyl paraquat (EPQ)

Máu:

0,0472 ppm;

nước tiểu:

0,0076

[76]

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng

 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC dựa trên nguyên lý sắc ký nói chung, là kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha: pha t nh rắn và pha động lỏng Quá trình tách theo các cơ chế phân bố, hấp phụ hay trao đ i ion tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích và pha t nh sử dụng Đặc trưng của kỹ thuật là cột được nhồi với các tiểu phân có kích thước nhỏ (thường từ 3 - 10µm), quá trình rửa giải dung môi diễn ra dưới áp suất cao và đạt hiệu quả tách tốt hơn so với sắc ký lỏng thông thường, vì vậy kỹ thuật được gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiệu năng cao [10] Pha t nh (chất rắn hoặc chất lỏng) hấp phụ chất cần phân tích, lưu giữ lại trên cột, c n pha động (gồm một chất hoặc hỗn hợp nhiều chất lỏng) lại hòa tan, đẩy chất phân tích di chuyển ra khỏi cột sắc ký Các chất cần phân tích khác nhau, sẽ có sự tương tác khác nhau đối với cả pha t nh và pha động, do vậy chúng di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và sẽ tách nhau khi ra khỏi cột sắc ký [2], [23], [67], [92]

So với phương pháp sắc ký khí thì phân tích PQ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ph biến hơn và cho hiệu quả cao hơn Có rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp HPLC/ DAD để định lượng PQ trong dịch sinh học [15],[ 41],[ 81], [21],[ 41],[ 68],[ 101],[ 117] với pha động và điều kiện phân tích khác nhau nên giới hạn phát hiện đạt được cũng khác nhau Bên cạnh đó, một

số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC kết hợp với detector UV và MS để phân tích PQ nhưng lại cho hiệu quả không tốt, giới hạn phát hiện ở ngưỡng khá cao [39],[ 81] Bảng 1.2 tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC để phân tích PQ trong một số loại mẫu sinh học khác nhau

Bảng 1.2 Tóm tắt một số nghiên cứu x c định paraquat trong dịch sinh học bằng phương ph p HPLC

3 Huyết tương UV - VIS

Kênh A: 1 - octanesulphonic acid 3,0 mM;

orthophosphoric acid 0,1 M trong 900 ml nước khử khoáng điều ch nh pH đến 3,0 bằng diethylamine; kênh B:

acetonitrile nồng độ 10% (v/v)

4 Huyết tương DAD Methanol, 200 mM phosphoric acid với diethylamine 50 ppb [41]

Trên thế giới, các nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC/DAD để phân tích PQ với LOD cỡ ppm trong huyết tương, huyết thanh hầu hết đều sử dụng cột pha đảo C8 hoặc C18 và pha động với thành phần là acetonitrile và dung dịch đệm phosphate (pH =2,0-3,0) Do đó, PQ2+ phải được tạo liên hợp ion với chất tạo cặp ion là sodium 1-heptane sulphonate Các yếu tố khác cần nghiên cứu, tối ưu hóa sao cho pic PQ cân đối và tách hoàn toàn ra khỏi nền mẫu huyết tương

Tại Việt Nam, hiện đã có TCVN 8667 - 2011 về định lượng PQ trong thực phẩm sử dụng phương pháp HPLC/ UV Trong tiêu chuẩn này, PQ được phát hiện ở bước sóng 256 nm với thành phần pha động bao gồm: diethylamine, sodium 1-heptane sulphonate, sodium perchlorate, potassium dihydrophosphate, perchloric acid (pH = 2,0) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào định lượng PQ trong huyết tương sử dụng phương pháp HPLC

Trong luận án, để ứng dụng phương pháp HPLC trong định lượng PQ trong huyết tương, chúng tôi cũng dựa trên tham khảo TCVN và các công trình khoa học trên thế giới, cải tiến một số thành phần pha động nhưng vẫn giữ nguyên cơ chế là sử dụng chất tạo cặp ion ở pH= 2,0-3,0 Các yếu tố khác như sự có mặt của môi trường chất điện ly mạnh (diethylamine, triethylamine), chất phân tán… giúp tăng hiệu quả quá trình tạo cặp cũng như pic cân đối và tách khỏi nền mẫu

 Phương pháp sắc ký lỏng khối ph (LC - MS)

Phương pháp sắc ký lỏng khối ph có ưu điểm độ nhạy cao nên được dùng

ph biến để định lượng PQ trong dịch sinh học [51], [82],[ 120] với cột tách HILIC, pha động sử dụng chủ yếu là ammonium formate (pH = 3,7) /acetonitrile theo chế

độ gradient Detector sử dụng là khối ph (MS) hoặc 2 lần khối ph (MS/MS), sử dụng chất nội chuẩn là ethyl viologen dibromide (EV) Tuy nhiên, điều kiện tiến hành sắc k cũng như kích thước cột tách khác nhau dẫn tới giới hạn phát hiện của

PQ trong dịch sinh học khác nhau (cỡ ppb) Tuy nhiên, do thiết bị rất đắt tiền nên hiện các phương pháp này chủ yếu được ứng dụng trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu

Bảng 1.3 tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng khối ph để định lượng PQ

Bảng 1.3 Tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng phương ph p sắc ký lỏng khối ph

LOD

Tài liệu tham khảo

1.3.3 Phương ph p điện di mao quản (CE)

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất

Hình 1.4 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản

Mẫu được bơm vào mao quản theo một trong ba phương thức: Kỹ thuật thủy động lực học dùng áp suất, kỹ thuật thủy động lực học kiểu xi phông và kỹ thuật điện động học [12] Mao quản thường làm bằng vật liệu silic gọi là mao quản silica, phủ bên ngoài bởi một lớp polyme có độ dày từ 200 -350 µm, đường kính ngoài (OD) 365 μm, đường kính trong (ID) từ 10 - 150 μm (ph biến là 50 μm), chiều dài mao quản có thể từ 10 -100 cm (ph biến là 60 cm) Hai đầu mao quản được đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di Một nguồn thế cao từ 5-30 kV sẽ sinh ra điện trường (E) cho quá trình điện di xảy ra Các kết quả thực nghiệm cho thấy với mao quản silica, bề mặt mao quản thường tích điện âm, khi đó sẽ xuất hiện một lớp điện kép làm cho thành mao quản có một điện thế nhất định (thế Zeta) [12]

Các yếu tố ảnh hưởng tới phương pháp phân tích điện di bao gồm: pH và thành phần dung dịch đệm, thế tách, chiều cao và thời gian bơm mẫu, kích thước mao quản

Gần đây, phương pháp điện di mao quản (CE) được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Thiết