Xác định một số đường hóa học và chất bảo quản trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Cho đến nay có rất nhiều phương pháp khác nhau để định lượng các đường hóa học và chất bảo quản như phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, điện di

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

**********

BÙI THỊ MINH THÚY

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐƯỜNG HÓA HỌC VÀ CHẤT BẢO QUẢN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH

MÃ SỐ: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Ngọc Mai, Bộ môn Hóa phân tích - Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ths.Vũ Thị Trang, CN Đinh Viết Chiến, ban lãnh đạo và cán bộ Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu đề tài

Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng sau đại học và các thầy giáo, cô giáo Khoa Hóa học - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia

Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nội dung học tập và thực hiện đề tài thuận lợi

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Sở Y tế Thái Bình, Ban lãnh đạo cùng toàn thể các cán bộ Khoa Xét nghiệm - Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Bình

đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên tôi trong hai năm học tập và trong quá trình làm luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên

Bùi Thị Minh Thúy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1 1.Giới thiệu chung về chất bảo quản 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Axit benzoic và Axit sorbic 3

1.2 Giới thiệu chung về đường hóa học 5

1.2.1 Định nghĩa 5

1.2.2 Phân loại: 5

1.2.3 Acesulfam-K, Aspartam, Saccarin 6

1.3 Tình hình sử dụng chất bảo quản, đường hóa học trong thực phẩm hiện nay 8

1.4 Giới hạn tồn dư tối đa hàm lượng các chất trong thực phẩm 10

1.5 Tổng quan về các phương pháp phân tích 11

1.5.1 Các phương pháp trên thế giới 11

1.5.2 Các phương pháp và xu hướng nghiên cứu trong nước 15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng, nội dung và mục tiêu nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 17

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Nguyên tắc chung của HPLC 18

2.2.2 Pha tĩnh trong HPLC 19

2.2.3 Pha động trong HPLC 20

2.2.4 Các loại detector trong HPLC 20

2.2.5 Một số đại lượng đặc trưng của HPLC 22

2.2.6 Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC 23

2.3 Hóa chất và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 24

2.3.1 Hóa chất 24

2.4 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 25

2.4.1 Pha dung dịch chuẩn gốc 25

2.4.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của 5 chất phân tích 100 µg/ml 25

2.4.3 Pha thuốc thử 25

2.4.4 Pha dung dịch đệm 26

2.5 Mẫu phân tích 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 27

3.1.1 Lựa chọn cột tách 27

3.1.2 Xác định bước sóng phát hiện cho các chất phân tích khi sử dụng detector PDA 27

3.1.3 Khảo sát pH của pha động 29

3.1.4 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm của pha động 30

3.1.5 Khảo sát tốc độ pha động 32

3.1.6 Khảo sát thành phần của pha động 34

3.1.7 Khảo sát chương trình gradient của pha động 36

3.2 Tối ưu qui trình xử lý mẫu 39

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân 41

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân 42

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 43

3.3.1 Độ phân giải 43

3.3.2 Lập đường chuẩn 44

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 46

3.3.4 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) 47

3.3.5 Kết quả chương trình thử nghiệm thành thạo đối với 2 chỉ tiêu axit benzoic và axit sorbic 50

3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 50

3.4.1.Kết quả phân tích mẫu (có đánh giá độ thu hồi) 51

3.4.2 Kết quả phân tích các mẫu giám sát 53

KẾT LUẬN 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 62

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thông tin chung về 2 chất bảo quản 4

Bảng 1.2 Thông tin chung về 3 đường hóa học 6

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của pH pha động tới thời gian lưu của chất phân tích 29

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ pha động tới thời gian lưu của chất phân tích 31

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến thời gian lưu của chất phân tích 33

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến độ phân giải 34

Bảng 3.5 Thời gian lưu của một số chất bảo quản và đường hóa học 35

ở các thành phần pha động khác nhau 35

Bảng 3.6.Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân các chất phân tích 41

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thủy phân các chất phân tích 42

Bảng 3.8 Độ phân giải của 2 pic liền kề 44

Bảng 3.9 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ 45

Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất phân tích 47

Bảng 3.11 Diện tích pic của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu 48

ở 3 mức thêm chuẩn khác nhau 48

Bảng 3.12 Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 49

Bảng 3.13 Độ thu hồi các chất trong mẫu nước mắm 51

Bảng 3.14 Độ thu hồi các chất trong mẫu ô mai 52

Bảng 3.15 Độ thu hồi các chất đối với mẫu nước mắm, mẫu ô mai 52

Bảng 3.16 Kết quả phân tích một số mẫu ruốc thịt lợn 53

phát hiện có sử dụng natribenzoat 53

Bảng 3.17 Kết quả phân tích một số mẫu ô mai phát hiện có sử dụng 54

natribenzoat, saccarin 54

MỤC LỤC HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng 18

Hình 2.2 Sơ đồ detector Diode array 21

Hình 3.1 Sắc đồ tách đường hóa học và chất bảo quảnbằng cột Anion, nhiệt độ 400C 27

Hình 3.2 Phổ hấp thụ của Aspartam, Axit benzoic, Axit sorbic, Acesulfam K ,saccarin.28 Hình 3.3 Ảnh hưởng của pH pha động tới thời gian lưu của các chất phân tích 29

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ pha động tới thời gian lưu của các chất phân tích 31

Hình 3.5 Sắc đồ khảo sát 5 chất phân tích với nồng độ pha động NaH2PO4 5mM (pH=8,2) tại bước sóng 210nm 31

Hình 3.6 Sắc đồ khảo sát 5 chất phân tích với tốc độ dòng pha động 32

1,5 ml/phút tại bước sóng 210nm 32

Hình 3.7 Sắc đồ khảo sát 5 chất phân tích với tốc độ dòng pha động 33

1,2 ml/phút tại bước sóng 210nm 33

Hình 3.8 Sắc đồ khảo sát 5 chất phân tích với tốc độ dòng pha động 33

1,0 ml/phút tại bước sóng 210nm 33

Hình 3.9 Sắc đồ khảo sát 5 chất phân tích 20 µg/ml với thành phần pha động đệm NaH2PO4 : ACN = 95:5 tại bước sóng 210nm 35

Hình 3.10 Sắc đồ khảo sát 5 chất phân tíchtheo chương trình gradient 1 36

Hình 3.11 Sắc đồ khảo sát 5 chất phân tíchtheo chương trình gradient 2 37

Hình 3.12 Sắc đồ khảo sát 5 chất phân tíchtheo chương trình gradient 3 37

Hình 3.13 Sắc đồ khảo sát 5 chất phân tíchtheo chương trình gradient 4 38

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 41

Hình 3.15 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thủy phân 42

Hình 3.16 Sắc đồ của hỗn hợp 5 chất 50 µg/ml tại bước sóng 210nm 44

Hình 3.17 Đường chuẩn Aspartam theo diện tích pic 45

Hình 3.18 Đường chuẩn Axit Sorbic theo diện tích pic 45

Hình 3.19 Đường chuẩn Axit Benzoic theo diện tích pic 45

Hình 3.20 Đường chuẩn Acesulfam-K theo diện tích pic 45

Hình 3.21 Đường chuẩn Saccarin theo diện tích pic 46

Hình 3.22 Sắc đồ phân tích mẫu nước mắm thêm 3 dung dịch chuẩn 51

axit sorbic, axit benzoic, acesulfam-K 51

Hình 3.23 Sắc đồ phân tích mẫu ô mai thêm 3 dung dịch chuẩn 52

Aspartam, Acesulfam-K, Saccarin 52

HPLC High-pressure liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao )

UV-VIS Quang phổ hấp thụ phân tử

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm luôn thu hút được sự quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên thế giới Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật mới, hiện đại đã và đang được áp dụng

để tạo ra những sản phẩm mới với chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng Tuy nhiên để tạo ra nhiều sản phẩm phù hợp với sở thích và khẩu

vị của người tiêu dùng mà vẫn giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho đến khi sử dụng, trong quá trình chế biến, nhà sản xuất đã sử dụng các phụ gia thực phẩm để tăng giá trị thương phẩm và kéo dài thời gian sử dụng Do lợi ích từ việc

sử dụng phụ gia trong chế biến thực phẩm đem lại là rất lớn nên việc sử dụng phụ gia trong chế biến, bảo quản thực phẩm là cần thiết Tuy nhiên, nếu sử dụng phụ gia không đúng quy định có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Vì vậy, việc kiểm nghiệm để xác định các hóa chất sử dụng đặc biệt là việc kiểm soát các chất phụ gia nhằm đánh giá xem thực phẩm đó có an toàn hay không là vấn đề rất cấp thiết

Cho đến nay có rất nhiều phương pháp khác nhau để định lượng các đường hóa học và chất bảo quản như phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE)…Tuy nhiên để định lượng được đồng thời cả chất bảo quản và đường hóa học trong thực phẩm, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp có nhiều ưu điểm vượt trội Phương pháp này có độ nhạy, độ chính xác cao, thao tác đơn giản, có thể xác định đồng thời nhiều chất, có tính khả thi đối với hầu hết các phòng kiểm nghiệm ở Việt Nam, đặc biệt là phù hợp với các phòng kiểm nghiệm tuyến tỉnh

Nhằm đưa ra phương pháp xác định được đồng thời một số đường hóa học

và chất bảo quản thường sử dụng trong thực phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

đề tài:“Xác định một số đường hóa học và chất bảo quản trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời một số đường hóa học và chất bảo quản trong thực phẩm

2 Áp dụng phương pháp để xác định một số đường hóa học và chất bảo quản trong một số mẫu thực phẩm

là một hóa chất duy nhất mà cũng có thể trong tổ hợp với nhiều loại hóa chất có các tác dụng khác.[1,12]

1.1.2 Phân loại

Nhóm chất phụ gia bảo quản thực phẩm bao gồm:

* Các chất sát khuẩn (axit acetic, axit sorbic, axit benzoic, natrinitrat ):có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn

* Các chất kháng sinh (Steptomixin, các loại penixilin )

* Các chất chống oxy hóa (axit scorbic, axit citric, axit tactric, dẫn xuất tocopherol ) có tác dụng làm chậm sự biến chất, ôi khét, biến màu của thực phẩm

1.1.3 Axit benzoic và Axit sorbic

1.1.3.1.Thông tin chung

Axit benzoic và axit sorbic là những chất hóa học hiện nay đƣợc các nhà chế biến thực phẩm công nghệ sử dụng nhiều, đƣợc phép sử dụng để bảo quản thực phẩm Axit benzoic và axit sorbic là chất sát trùng mạnh đối với nấm men, các nấm mốc và có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn [12]

Bảng 1.1: Thông tin chung về 2 chất bảo quản [1,12, 32]

Axit benzencarboxylic Axit phenyl carboxylic

Axit sorbic Axit 2,4-hexadienoic, Axit 2-propenylacrylic

Công thức cấu tạo

* Vai trò: Axit sorbic và muối Kali của nó được phát hiện từ năm 1940 với tác dụng kháng khuẩn Chúng được dùng làm chất bảo quản và được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và đồ uống như thực phẩm ngâm dấm, đồ uống có ga, các sản phẩm từ hoa quả như ô mai, rượu vang…

* Tính độc hại: Axit sorbic và sorbat không gây độc với cơ thể con người, khi cho vào sản phẩm thực phẩm không gây ra mùi hay vị lạ và không làm mất mùi

vị tự nhiên của thực phẩm [12, 21,25]

1.2 Giới thiệu chung về đường hóa học

1.2.1 Định nghĩa: Chất ngọt tổng hợp (hay còn gọi là đường hóa học) là những

chất không có trong tự nhiên, vị ngọt rất cao so với đường sacarose (gấp khoảng 160-1300 lần độ ngọt của đường sucrose) và không có giá trị dinh dưỡng, thường được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như: bổ sung vào trong thực phẩm dành cho người ăn kiêng, người bị bệnh tiểu đường, chất tá dược trong thuốc để che mùi vị, chất tạo vị ngọt trong bánh kẹo, nước giải khát…[2,14]

1.2.2 Phân loại: Chất ngọt tổng hợp bao gồm nhiều loại khác nhau, chủ yếu người

ta chia thành 2 loại: chất tạo ngọt không sinh năng lượng và chất tạo ngọt có sinh năng lượng

- Chất tạo ngọt không sinh năng lượng là những chất tạo ra vị ngọt hầu như không được chuyển hóa thành năng lượng cho cơ thể hoạt động (năng lượng nếu có chỉ nhỏ hơn 2% so với lượng đường tạo ra cùng vị ngọt), một số loại được chiết xuất từ các nguyên liệu tự nhiên và một số được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, trong đó các chất thường được sử dụng nhiều nhất là Saccarin (E954), Aspartam (E951), Acesulfam K (E950) và một số khác ít được sử dụng hay đang được nghiên cứu thêm là stevioside, sucralose (E955)

- Chất tạo ngọt sinh năng lượng là những chất tạo ngọt sinh ra năng lượng lớn hơn 2% lượng đường tạo ra cùng vị ngọt, thường được sử dụng gồm fructose, xylitol, sorbiton, mannitol, lactitol, lactulose, maltitol, isomalt…

1.2.3 Acesulfam-K, Aspartam, Saccarin

1.2.3.1.Thông tin chung

Các loại đường hóa học (saccarin, acesulfam K, aspartam) là các loại chất tạo ngọt không sinh năng lượng, được sử dụng phổ biến trong các loại nước uống và thực phẩm dùng trong việc điều trị cho những người bệnh thừa cân hay đái tháo đường Chúng được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới hạn tối đa và

có quy định rõ ràng

Bảng 1.2: Thông tin chung về 3 đường hóa học [2,12]

Tên hóa

học

Potassium 6- 2,2-dioxo-oxathiazin-4-olate

methyl-phenylalanine, 1-methyl este

N-(L-α-Aspartyl)-L-benzothiazol-3-one

* Vai trò: Acesulfam K được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm nhằm tăng cường vị và che dấu những vị khó chịu Thường được dùng phối hợp với các chất ngọt tổng hợp khác như aspartam, cyclamat

*Tính độc hại: Acesulfam K không cung cấp năng lượng cho cơ thể vì nó không tham gia quá trình trao đổi chất và được thải ra ngoài theo nước tiểu mà không có bất kì sự biến đổi hóa học nào Do vậy, acesulfam K không độc, không gây các phản ứng xấu và âm tính đối với cơ thể Không nhận thấy ảnh hưởng xấu đối với người mắc bệnh tiểu đường Tuy nhiên, hàng ngày không nên đưa vào cơ thể một lượng lớn hơn 0,9 mg/kg trọng lượng

b) Aspartam [4,12,14,23]

* Tính chất: Là một dipeptit, màu trắng, không mùi, vị ngọt mạnh (độ ngọt của nó cũng bằng khoảng 180-200 lần độ ngọt của saccaroza), không để lại vị khó chịu, không ổn định ở nhiệt độ và pH cao

Giống như các dipeptit khác, aspartam có chứa năng lượng khoảng 4 Kcal/g (17 kJ/g) Tuy nhiên, chỉ cần một lượng rất nhỏ aspartam đã tạo độ ngọt cần thiết

Do đó năng lượng chúng ta đưa vào cơ thể sẽ không đáng kể, vị ngọt của nó chúng

ta cảm nhận được chậm hơn và kéo dài lâu hơn so với đường

Phân hủy dần trong nước nên nước ngọt có chứa aspartam không giữ được lâu Khi trộn aspartam với saccarin hoặc acesulfam K thì hỗn hợp ngọt hơn và ổn định hơn khi hai chất đứng riêng một mình

* Vai trò: Aspartam được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm, bánh kẹo…nhằm tăng cường vị ngọt và che dấu những vị khó chịu Thường được dùng phối hợp với các chất ngọt tổng hợp khác như acesulfam K, cyclamat Hiện nay aspartam là chất ngọt rất được ưa chuộng Nó được sử dụng rộng rãi trên thế giới với sự hiện diện trong hơn 6000 sản phẩm như: bánh kẹo, đồ uống, đồ ăn ít calo không chứa đường cho người bị bệnh đái tháo đường và người

ăn kiêng, thuốc và vitamin bổ sung (gồm cả những loại cho trẻ nhỏ)…

* Tính độc hại: là một chất không độc song các dạng chuyển hóa của nó lại độc Trong cơ thể, aspartam bị thủy phân thành axit aspartic (40%), phenylalanin

(50%), metanol (10%) Cả ba chất trên và sản phẩm chuyển hóa đều được coi là có vấn đề với sức khỏe con người Axit aspartic là một chất kích thích thần kinh, ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương, gây nên các chứng: nhức đầu, buồn nôn, đau bụng, mệt mỏi, rối loạn giấc ngủ, vấn đề về thị lực, trầm cảm và bệnh suyễn Nếu dư thừa axit aspartic có thể làm rối loạn nội tiết (hormon) và phát sinh vấn đề về thị lực Đối với phenylalanin, khi dư thừa trong máu có thể gây ra bệnh phenylketonuria, làm chậm phát triển trí tuệ nghiêm trọng và làm tổn hại đến hệ thần kinh Metanol khi vào cơ thể được oxy hóa tạo nên formandehit, chất này tiếp tục được oxy hóa tạo nên axit formic gây nên tình trạng toan chuyển hóa (nhiễm axit) và mù lòa.[4]

* Tính độc hại: Trong cơ thể, saccarin qua hệ thống tiêu hóa mà không hề bị hấp thụ Nó không gây ảnh hưởng đến hàm lượng insulin trong máu và cũng không cung cấp năng lượng cho cơ thể Vì thế nó được xếp vào nhóm chất tạo ngọt không calo Ở một số nước có mức sống thấp thiếu dinh dưỡng thường không được phép hoặc hạn chế sử dụng

1.3 Tình hình sử dụng chất bảo quản, đường hóa học trong thực phẩm hiện nay

Việc sử dụng các hóa chất và phụ gia trong chế biến thực phẩm đã và đang trở thành một vấn đề được chú ý ở mọi quốc gia trên thế giởi Một mặt, chúng làm tăng thêm hương vị, màu sắc, tính hấp dẫn và thời hạn bảo quản, mặt khác việc đưa các chất lạ vào cơ thể có thể là tác nhân gây nên các bệnh hiểm nghèo

Trong số các phụ gia thường sử dụng thì chất ngọt nhân tạo, chất bảo quản được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới

acesulfam-K đều được phép sử dụng trong khoảng 90 quốc gia Chất ngọt nhân tạo thường được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, nước giải khát, bánh kẹo và dược phẩm [26,28] Do số lượng người dân mắc bệnh tiểu đường, số lượng người béo phì trên toàn thế giới gia tăng nên chất ngọt nhân tạo ngày càng được sử dụng nhiều Tại Hoa Kỳ, các sản phẩm có chứa natri saccarin phải có nhãn cảnh báo Ở nhiều quốc gia, tất cả các sản phẩm có chứa ASP phải được dán nhãn vì một nhóm nhỏ những người có chứng bệnh di truyền phenylketonuria rất nhạy cảm với phenylalanin, một trong những chất chuyển hóa của ASP

Chất bảo quản phổ biến là axit sorbic và axit benzoic Các chất này góp phần

ức chế chống nấm, nấm men, nấm mốc và vi khuẩn Axit sorbic, axit benzoic thường được sử dụng trong đồ uống như nước giải khát [17]

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO): lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được (ADI) đối với saccarin, aspartam, acesulfam-K, axit benzoic và axit sorbic tương ứng là 0-5 , 0-40 , 0-15, 0-5 và 0-25 mg/kg thể trọng [18,28]

Hiện nay, ở Việt Nam các loại phẩm màu, đường hóa học đang bị lạm dụng trong pha chế nước giải khát, sản xuất bánh kẹo, chế biến thức ăn sẵn như thịt quay giò chả, ô mai…Tình hình sản xuất thức ăn, đồ uống giả, không đảm bảo chất lượng

và không theo đúng thành phần nguyên liệu cũng như qui trình công nghệ đã đăng

ký với cơ quan quản lý đang là nỗi nhức nhối với toàn xã hội Chính vì nhờ độ ngọt cao, giá thành rẻ nên tại các thành phố, nhất là ở các hàng quán vỉa hè, tiểu thương vẫn dùng các loại đường hóa học chế biến thức ăn, luộc bắp hay ngâm trái cây, làm kem, làm nước phở…để tăng vị ngọt

Kết quả giám sát chất lượng thực phẩm năm 2012 đối với hoa quả sấy khô (xí muội, ô mai) có nguồn gốc từ Trung quốc bị nghi ngờ có chứa hóa chất phụ gia gây độc hại có nguy cơ đe dọa sức khỏe người tiêu dùng Theo báo cáo của Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia và Viện Vệ sinh Y tế công cộng

TP Hồ Chí Minh đến tháng 6/2012 đã có 90 mẫu ô mai xí muội được lấy tại các địa phương gồm Hà Giang, Lai Châu, Khánh Hòa, Cà Mau, Tiền Giang, Phú Thọ, Bắc Ninh, Kiên Giang, Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, Bình Định, Hải Phòng, Lâm Đồng Bắc Giang, Quảng Nam Kết quả cụ thể như sau: 65/90 mẫu xét nghiệm có sử dụng đường sarcarin vượt quá giới hạn cho phép, 13/90 mẫu xét nghiệm có sử dụng cyclamat, 23/90 mẫu có sử dụng axit benzoic, 9/90 mẫu xét nghiệm có hàm lượng chì cao hơn giới hạn cho phép, 90/90 mẫu không phát hiện có sử dụng phẩm màu không được phép sử dụng

Đầu tháng 5.2013, cơ quan chức năng tỉnh Tây Ninh đã tiến hành kiểm tra một số cơ sở sản xuất bún, hủ tiếu, bánh canh ở KP.2, P.4, TX.Tây Ninh Tại cơ sở của ông Võ Văn Ánh, đoàn kiểm tra lấy 3 mẫu gồm nước luộc bún, bột đã khuấy trộn, hóa chất thu tại kho nguyên liệu gồm 200 gr màu vàng chanh và 420 gr bột màu trắng đem xét nghiệm Kết quả, chất màu vàng chanh là chất tẩy trắng (huỳnh quang - Tinopal), còn chất bột màu trắng là chất chống mốc (natri benzoat); mẫu nước bột trộn gạo đã khuấy làm bún dương tính với chất tẩy trắng Tại cơ sở của ông Trần Văn Cương, đoàn kiểm tra cũng lấy 3 mẫu gồm nước luộc bún, bột đã khuấy trộn, hóa chất thu tại kho nguyên liệu gồm một bịch bột màu vàng chanh và 2 bịch bột màu trắng Kết quả xét nghiệm chất màu vàng chanh là huỳnh quang, một bịch bột trắng là natri benzoat và bịch còn lại là hàn the (natri tetraborat); mẫu nước bột trộn gạo đã khuấy làm bún dương tính với chất tẩy trắng

1.4 Giới hạn tồn dư tối đa hàm lượng các chất trong thực phẩm

nước về lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm, Bộ Y tế đã ban hành thông tư 27/2012/TT-BYT ngày 30 tháng 11 năm 2012 hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm (thay thế cho Quy định danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31 tháng 8 năm 2001 và Quy định về điều kiện bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm trong sản xuất, kinh doanh, sử dụng phụ gia thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 928/2002/QĐ-BYT ngày 21 tháng 3 năm 2002 của Bộ trưởng Bộ Y tế) Thông tư

này qui định hàm lượng tối đa của từng chất phụ gia (gồm 400 chất phụ gia) trong từng sản phẩm cụ thể trong đó có qui định rõ ràng đối với Axit benzoic, Axit sorbic,

hai chất bảo quản (Axit benzoic, Axit sorbic) và 3 loại đường hóa học (Acesulfam K, Aspartam, Saccarin) vẫn được phép sử dụng trong thực phẩm

với liều lượng khác nhau Trong 15 nhóm sản phẩm thực phẩm, liều lượng đối với axit benzoic từ 200 - 5000mg/kg sản phẩm, axit sorbic từ 100 - 3000mg/kg sản phẩm, acesulfam K từ 110 - 5000mg/kg sản phẩm, aspartam từ 200 - 6000mg/kg sản phẩm, saccarin từ 80 - 2500mg/kg sản phẩm.[3]

1.5 Tổng quan về các phương pháp phân tích

1.5.1 Các phương pháp trên thế giới

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích đã được triển khai và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm bao gồm các phương pháp xác định riêng chất bảo quản cũng như đường hóa học, các phương pháp xác định đồng thời cả đường hóa học và chất bảo quản như phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và điện di mao quản

1.5.1.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử dựa trên việc đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch chất phân tích khi được chiếu bởi chùm sáng phù hợp Phương pháp được áp dụng để phân tích các chất vô cơ, hữu cơ trong thực phẩm, dược phẩm…

Tác giả Natalia E Llamas và cộng sự [24] đã sử dụng phương pháp UV-VIS

0.2M) pH =1,3 Bước sóng phát hiện saccarin là 206nm, acesulfam-K là 226 nm

Độ thu hồi đối với cả hai chất phân tích trên nền mẫu thực trong khoảng 93,5÷105,1%, sai số tương đối <5%

Tác giả Fatma Turak [19] và cộng sự đã tiến hành xác định đồng thời 3 chất

pháp PLS-UV Các chất phân tích được chiết bằng dung dịch n- butanol và được đo

ở bước sóng từ 190-300 nm Tác giả đã sử dụng 27 dung dịch chuẩn của Aspartam, Acesulfam-K và Saccarin ở ba mức nồng độ và đo mẫu với dung dịch H3PO4 0,1 N Đường chuẩn của aspartam từ 7-9 µg/mL, acesulfam- K từ 1-3 µg/mL, saccarin từ 2-4 µg/mL Phương pháp này được áp dụng cho đồ uống thương mại, đồ uống có màu (dạng bột và chất lỏng)

1.5.1.2 Phương pháp điện di mao quản (CE)

Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường Do độ linh động điện di của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Ứng dụng phương pháp này, tác giả Ana Beatriz Bergamo, José Alberto Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus [16] đã xác định đồng thời aspartam, cyclamat, saccarin và acesulfam-K trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao quản với detector độ dẫn Phương pháp sử dụng hỗn hợp đệm tris

với thời gian phân tích là 6 phút, hiệu suất thu hồi các chất trong khoảng từ 94% đến 108%, độ lêch chuẩn tương đối (RSD) nằm trong khoảng 1,5 ÷ 6,5%

Tác giả Richard A Frazier và các cộng sự [27] đã xác định đồng thời các chất ngọt nhân tạo acesulfam-K, aspartam and saccarin, chất bảo quản axit benzoic

ponceau 4R, brilliant blue FCF, green S và black PN trong mẫu nước giải khát bằng phương pháp điện di mao quản Phương pháp sử dụng chế độ sắc ký điện động học mixen, dung dịch đệm cacbonat 20 mM ở pH 9.5 với dung dịch natri dodecyl sulfat

62 mM trong vòng 15 phút Kết quả cho thấy giới hạn định lượng đối với tất cả các chất là 0,01 mg/ml

1.5.1.3 Phương pháp sắc ký lỏng (HPLC)

Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng-rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách

từ 93,31 và 102,63 % Khoảng tuyến tính của acesulfam là 0,125-50 µg/ml với LOD là 0,08 µg/ml và LOQ là 0,25 µg/ml Độ thu hồi của acesulfam trong khoảng 94,34÷103,21 % Độ lệch chuẩn tương đối (n = 8) cho tất cả các phép phân tích là nhỏ hơn 0,72%

Tác giả N Dossi và các cộng sự đã sử dụng phương pháp RP-LC để xác

nhân tạo (acesulfam, saccarin, aspartam); chất bảo quản (axit benzoic, axit sorbic)

và phẩm màu (Ponceau 4R, sunset yellow, tartrazin) được tách trên cột LiChrosorb RP18 Pha động sử dụng là dung dịch đệm photphat 0,1 M (pH 4.0) và metanol với tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thời gian phân tích trong khoảng 20 phút với độ chính xác

đạt yêu cầu Bằng kỹ thuật chuyển đổi bước sóng, giới hạn phát hiện của các chất phân tích trong khoảng 0,1-3,0 mg/l Phương pháp được áp dụng để xác định một số mẫu nước ngọt như Light Cola, nước uống vị cam, nước uống vị chanh …

Tác giả Li Xiu-Qin và cộng sự đã tiến hành xác định đồng thời 10 chất bảo

rửa giải gradient Khoảng tuyến tính của 10 chất phân tích (axit benzoic; axit sorbic; axit dehydroacetic; methylparaben; ethylparaben; propylparaben; isopropylparaben; butylparaben; isobutylparaben; heptylparaben) từ 0,100÷20µg/ml với hệ số tương quan > 0,999, RSD ở 3 mức nồng độ trong khoảng 0,11÷5,75% Độ thu hồi ở 3 mức nồng độ từ 88,7-99,0% [21]

ngọt nhân tạo (aspartam, acesulfam-K, natri saccarin, natri cyclamat) trong đồ uống

và các sản phẩm dinh dưỡng đặc biệt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD Phương pháp đầu tiên là tách aspartam, acesulfam K và natri saccarin trên cột C18 , pha động gồm 15 % acetonitril và 75 % đệm photphat (KH2PO4 0.0125 mol/l ở pH 3.5) với chế độ đẳng dòng Phương pháp thứ hai được

sử dụng để xác định natri cyclamat trên cột C18 với pha động là 85% methanol và 15% nước với chế độ đẳng dòng Giới hạn định lượng đối với acesulfam-K là 0,3 mg/l; natri saccarin là 0,4 mg/l; aspartam và natri cyclamat là 0,5 mg/l

tích (acesulfam-K (ACS-K), aspartam (ASP), alitam (ALI), cyclamat (CYC), dulcin (DUL), neohesperidin dihydrochalcone (NHDC), neotam (NEO), saccarin (SAC) và sucralose (SCL)) được tách bằng chế độ rửa giải gradient trên cột C18 và phát hiện trên detector khối phổ Các chất cần xác định đã được định lượng bằng cách sử dụng một bộ phận ghi nhận phát hiện các mảnh có ion hóa chọn lọc đối với ACS-K, SAC và CYC tại m/z=162, 182 và 178; IS và ASP tại m/z=192 và 293; SCL(m/z=395); DUL (m/z=225); ALI (m/z=330); NHDC (m/z=611); NEO

(m/z=377) Giới hạn phát hiện của phương pháp (tương ứng với tỷ lệ S/N=3) là dưới 0,25 µg/ml (µg/g), trong khi các giới hạn định lượng (tương ứng với tỷ lệ S/N=10) là dưới 2,5 µg/ml (µg/g) Độ thu hồi ở nồng độ thử nghiệm (50%, 100% và 125% liều có thể sử dụng tối đa) cho tất cả các chất làm ngọt là trong khoảng 84,2÷106,7% với với độ lệch chuẩn tương đối <10% (không phụ thuộc vào nền mẫu

và mức độ thêm chuẩn) Phương pháp đã được áp dụng để xác định 9 chất ngọt nhân tạo trong đồ uống, sữa chua và các sản phẩm cá

1.5.2 Các phương pháp và xu hướng nghiên cứu trong nước

Cho đến nay ở Việt Nam, có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định chất bảo quản và đường hóa học Tuy nhiên, tùy thuộc vào điều kiện cơ sở vật chất

mà các phòng thí nghiệm tiến hành phân tích các chất theo các phương pháp khác nhau Một số phương pháp phổ biến có thể kể đến như phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, điện di mao quản CE…

Tiêu chuẩn Việt Nam 6428-2007 [8] qui định phương pháp xác định hàm lượng axit benzoic trong rau quả và sản phẩm rau quả bằng phương pháp quang phổ trên nguyên tắc: Sau khi đồng hóa, mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng như nước ép quả, sản phẩm dạng lỏng có thịt quả, sirô; sản phẩm dạng sệt như mứt quả; Sản phẩm dạng rắn như quả, rau; sản phẩm lạnh đông hoặc lạnh đông sâu)được pha loãng và axit hóa phần mẫu thử Axit benzoic được chiết bằng dietyl ete, rồi được chiết tiếp bằng kiềm và tinh chế bằng kali dicromat đã axit hóa Hòa tan axit benzoic sau khi sạch trong dietyl ete và được xác định bằng cách đo quang phổ ở bước sóng 272

nm Sau khi dựng đường chuẩn ở các mức nồng độ 10, 15, 20, 30 và 40 mg/l axit benzoic, tiến hành xác định hàm lượng axit benzoic dựa trên đường chuẩn

Phương pháp xác định hàm lượng acid benzoic, axit sorbic trong sản phẩm rau quả bằng phương pháp HPLC theo TCVN 8122:2009 dựa trên nguyên tắc: Chiết axit benzoic và/hoặc axit sorbic từ phần mẫu thử bằng hỗn hợp dung dịch đệm amoni axetat và metanol trong môi trường axit Sau đó, bơm dung dịch chuẩn và dịch lọc của mẫu cần phân tích vào máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) sử dụng cột sắc

ký pha đảo với detector UV Dựa vào diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch

mẫu thu được ta sẽ tính được nồng độ của axit benzoic, axit sorbic trong mẫu Điều

độ dòng: 1,2 ml/phút; Thể tích bơm: 10µl Pha động: dung dịch amoni axetat và metanol Detector UV – Vis, λ = 235 nm.[9]

Tiêu chuẩn Quốc Gia TCVN 8471:2010 [10] qui định phương pháp định

cao Các chất ngọt tổng hợp trong mẫu được chiết hoặc được pha loãng với nước Dung dịch mẫu có nồng độ chất tạo ngọt cao được làm sạch trên cột chiết pha rắn hoặc bằng thuốc thử Carrez, nếu cần Các chất tạo ngọt có trong dung dịch mẫu thử được tách trên cột sắc kí pha đảo và được xác định bằng phương pháp HPLC ở

aspartam và saccarin trong các sản phẩm chất lỏng trong (ví dụ: nước chanh, nước cola, các loại đồ uống), các sản phẩm dạng đục (ví dụ như nước quả, đồ uống từ sữa

có hương vị), mứt, mứt quả, mứt cam và các sản phẩm liên quan (trừ các loại quả vón cục), sản phẩm rắn và nửa rắn (ví dụ như sản phẩm phomat tráng miệng, các sản phẩm sữa chua, các món salat chế biến sẵn, trừ bột làm bánh trứng sữa), bột làm bánh trứng sữa

Ngoài những phương pháp kể trên, cũng đã có nhiều nghiên cứu được phát triển để định lượng đường hóa học cũng như các chất bảo quản trong các loại thực phẩm khác nhau [6] Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu hiện nay dựa trên kĩ thuật HPLC và thực tế các kết quả phân tích đã chỉ ra rằng đây là phương pháp hoàn toàn phù hợp cho việc tách và định lượng hàm lượng các chất phân tích Do vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi cũng chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột sắc ký anion (thay cho cột sắc ký pha đảo) với detector PDA (có thể đo được ở nhiều bước sóng khác nhau) để xác định đồng thời hàm lượng các chất bảo quản và đường hóa học, tối ưu hóa các điều kiện cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm hiện có với qui trình phân tích mẫu phù hợp sao cho vừa tiết kiệm thời gian lại vừa giảm được giá thành phân tích

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, nội dung và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Trong luận văn này, hướng nghiên cứu tập trung vào phân tích Axit benzoic, Axit sorbic, Acesulfam K, Aspartam, Saccarin có trong thực phẩm, cụ thể là các mẫu thực phẩm: nước mắm, ô mai, ruốc thịt lợn

Mục tiêu của đề tài là xây dựng phương pháp xác định đồng thời Axit benzoic, Axit sorbic, Acesulfam K, Aspartam, Saccarin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Từ đó áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng Axit benzoic, Axit sorbic, Acesulfam K, Aspartam, Saccarin có trong thực phẩm

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

* Nghiên cứu các điều kiện để xác định đồng thời Axit benzoic, Axit sorbic, Acesulfam K, Aspartam, Saccarin

 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Ảnh hưởng của pH

- Pha động, chương trình gradient

 Tối ưu quy trình xử lý mẫu

- Khảo sát nhiệt độ thủy phân

- Khảo sát thời gian thủy phân

 Thẩm định phương pháp phân tích

- Độ phân giải

- Lập đường chuẩn

- Giới hạn phát hiện(LOD) và giới hạn định lượng(LOQ)

- Độ lặp lại và độ thu hồi

- Đánh giá kết quả phân tích thông qua chương trình thử nghiệm thành thạo

* Phân tích mẫu thực tế: Áp dụng qui trình phân tích một số mẫu thực phẩm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Chúng tôi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với cột sắc ký trao đổi anion, detector PDA để phát hiện và định lượng 3 loại đường hóa học (aspartam, acesulfam K, saccarin) và 2 chất bảo quản (axit benzoic, axit sorbic) Cơ

sở lý thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây:

2.2.1 Nguyên tắc chung của HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng-rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách

ra khỏi nhau

Cấu tạo của hệ thống HPLC, gồm 3 phần chính:

- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và chất phân tích

- Phần tách: phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm: cột tách, đôi khi có cả cột phụ trợ

- Phần phát hiện và xử lý số liệu: gồm các detector, phần khuyếch đại tín hiệu, computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu

* Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng:

Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống sắc ký lỏng

2.2.2 Pha tĩnh trong HPLC [7]

Trong HPLC, pha tĩnh (station phase) chính là chất nhồi cột, làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3-7µm Trong sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất trao đổi ion

Có thể chia các loại chất trao đổi ion thành hai loại cơ bản theo nền của chất trao đổi ion:

- Các hạt polime xốp truyền thống (nhựa trao đổi ion – nhựa ionit)

- Các hạt Silic có phủ lớp trao đổi ion và các hạt silic xốp có gắn các nhóm trao đổi ion trên bề mặt

Các hạt nhựa ionit là polime xốp được dùng rộng rãi để tách các ion, aminoaxit, các chất béo, các chất cacbonhidrat Người ta chế tạo các hạt nhồi có đường kính khoảng 10µm trên cơ sở trùng hợp styrene và divinylbenzen (DVB) hoặc acrylic với DVB, sau đó gắn các nhóm chức khác nhau để thu được các ionit

polime, còn để điều chế các anionit, người ta gắn các amin bậc khác nhau Các chất nhồi này có ưu điểm là khả năng hấp thụ tốt nhất trong các loại ionit Tuy nhiên nhược điểm lớn của ionit loại này là sự khuyếch tán chậm, hiệu lực tách của cột giảm

Các hạt Silic có phủ lớp trao đổi ion được chế tạo tương tự như chất nhồi làm pha tĩnh (như đã mô tả ở trên) Hạt Silic được làm nền cho các loại pha tĩnh khác nhau Chất nhồi này có khả năng trao đổi tốt và chịu áp suất tốt (do hạt nhân Silic rất cứng), do vậy làm tăng hiệu lực tách của cột ionit Tuy nhiên nhược điểm của chất nhồi này là khoảng pH làm việc thu hẹp so với phương pháp dùng ionit truyền thống

Thông thường, cationit giữ các cation chất phân tích, cationit chứa nhóm

có nhóm amin gắn trên mạng lưới cao phân tử nên anionit mang tính bazơ Độ bazơ

phụ thuộc vào độ bazơ của nhóm amin (amin thẳng > ammoniac > amin thơm; amin bậc 4> amin bậc 3 > amin bậc 2 > amin bậc 1) Anionit phổ biến thường chứa amin bậc 4

2.2.3 Pha động trong HPLC [7 ]

Pha động trong sắc ký lỏng đóng góp một phần quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhất

Có thể chia pha động làm 2 loại:

- Pha động có độ phân cực cao: thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực

- Pha động có độ phân cực thấp: thành phần gồm các dung môi ít phân cực như xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisunfua

Trên thực tế, có những hỗn hợp nhiều cấu tử, rất khác nhau về tính chất nào

đó như: khối lượng phân tử, khả năng liên kết hóa học, nhiệt độ sôi…Khi tách các hỗn hợp này, nếu ta thiết lập một pha động tách tốt được các cấu tử cuối dãy thì phải mất rất nhiều thời gian mới tách được các cấu tử ở cuối dãy, thậm chí không tách được Ngược lại, nếu ta chú ý tới các cấu tử ở cuối dãy thì chắc chắn ta không thể tách được các cấu tử ở đầu dãy Hơn nữa, tính chất của dãy các cấu tử đôi khi biến đổi không đều đặn, có nghĩa là ở các đoạn nào đó trong dãy chúng biến đổi nhanh hơn hoặc chậm hơn, thậm chí không biến đổi Kết quả là dùng pha động đẳng nồng độ ở đây là không phù hợp Do vậy, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng

độ

2.2.4 Các loại detector trong HPLC

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Tùy thuộc bản chất lí hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp Các loại

detector thường sử dụng là detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS), detector huỳnh quang (RF), detector độ dẫn…

Hiện nay, các detector hiện đại ngày càng được cải tiến như: diot-aray, MS làm tăng độ nhạy của phương pháp và giúp người phân tích xác định chính xác chất phân tích

Loại detector này thực chất là detector UV-VIS sử dụng photodiode array Nguồn sáng của detector là đèn Xenon hoặc Deuterium (D2) phát ánh sáng vùng

UV và đèn phát sáng vùng khả kiến là Tungsten (W) Vị trí của cuvet chứa mẫu đặt ngay sau hệ thấu kính chuẩn trực Phần phân giải phổ (cách tử) được đặt sau cuvet

và tiếp theo là hệ diode array Mỗi photodiot đo một dải hẹp các bước sóng trong quang phổ, như vậy nó là bộ thu nhận số liệu song song, nghĩa là tất cả các điểm được đo đồng thời

Hình 2.2 : Sơ đồ detector Diode array

SPD-M20A của hãng Shimazu, với 512 điot, có thể sử dụng cho các chất phân tích với các bước sóng trong phạm vi 190-800 nm

2.2.5 Một số đại lượng đặc trưng của HPLC

2.2.5.1.Thời gian lưu

Khi được nạp vào cột sắc ký, các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong một khoảng thời gian nhất định Đó chính là thời gian lưu của nó, tính từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại

tRi=to + t’Ri (1)

2.2.5.2 Độ phân giải R

Độ phân giải R nói lên mức độ tách ra khỏi nhau của hai chất A và B:

B A

RB RA

W W

t t R





Trong đó:

Theo qui luật phân bố của Gauxo và Rayley, điều kiện tối thiểu để cho hai chất A và B tách ra khỏi nhau thì cực tiểu của pic A nằm gần nhất vị trí cực đại của

B, và để tách hoàn toàn rõ ràng thì cực tiểu của pic phía sau B phải kề với cực tiểu

Theo lý thuyết phân tích ta, nếu độ phân giải R=1 thì các chất đã tách ra khỏi nhau đạt 95%, còn với R=1,5 thì các chất đã tách khỏi nhau 99,8%.[5]

2.2.6 Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC [7]

2.2.6.1 Phân tích định tính

Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một

hệ pha đã chọn là thời gian lưu của các chất, nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau

và cố định

Vì vậy, sau khi tiến hành ghi sắc đồ của mẫu phân tích và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất trong sắc đồ, so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất chuẩn sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào

2.2.6.2 Phân tích định lượng

Trong HPLC, tùy thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích

có thể dùng một trong hai phương pháp là phương pháp đường chuẩn hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn Cả hai phương pháp đều dựa trên mối quan hệ tuyến tính giữa chiều cao pic (H) hoặc diện tích pic (S) và nồng độ chất (C)

Hi = k1.Ci (3)

Si = k2.Ci (4) Trong đó:

Phương pháp đường chuẩn có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng một đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền, thành phần hóa học và vật lý dễ mắc sai số Trong trường hợp này để loại trừ ảnh hưởng của nền, người ta dùng phương pháp thêm tiêu chuẩn

2.3 Hóa chất và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

2.3.1 Hóa chất

- Các chất chuẩn: Aspartam, Saccarin, Acesulfam-K, Axit sorbic, Axit benzoic (PA,Merck, Đức)

- Natri hydroxyt (NaOH), (PA, Merck, Đức)

- Acetonitril (ACN), (PA, Merck, Đức)

2.4 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

2.4.1 Pha dung dịch chuẩn gốc

Đường hóa học (Aspartam, Saccarin, Acesulfam-K) được pha trong nước Chất bảo quản (Axit sorbic, Axit benzoic) hòa tan trong Acetonitril Cụ thể:

- Đường hóa học (Aspartam, Saccarin, Acesulfam-K): Cân chính xác 0,1 g mỗi loại chuẩn trên cho vào cốc có mỏ 50ml, hòa tan bằng nước cất, chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất tới vạch, sau đó đem rung siêu âm

30 phút thu được các dung dịch gốc có nồng độ 1000 µg/ml

- Chất bảo quản (Axit sorbic, Axit benzoic): Cân chính xác 0,1 g mỗi loại chuẩn trên cho vào cốc có mỏ 50ml, hòa tan trong 10 ml acetonitril cho đến khi tan hoàn toàn Chuyển vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc và định mức bằng nước cất tới vạch thu được các dung dịch gốc có nồng độ 1000 µg/ml

C) trong 3 tháng

Dung dịch chuẩn trước khi sử dụng phải lắc đều và đem rung siêu âm trong vòng 15 phút Tiến hành chạy lại dung dịch chuẩn trên máy sắc ký để xác định lại thời gian lưu trước mỗi ngày làm việc khác nhau

2.4.2 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của 5 chất phân tích 100 µg/ml

Hút chính xác 10 ml chuẩn gốc tương ứng lần lượt của mỗi chất phân tích

1000 µg/ml cho vào bình định mức 100 ml và định mức đến vạch bằng nước cất

+ Các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc, sử dụng trong ngày

2.4.3 Pha thuốc thử

cất

2.4.4 Pha dung dịch đệm

* Dung dịch đệm Natri dihydrophotphat 5 mM có pH=7,5; pH=8,0; pH=8,2; pH=9,0; pH=9,5

- Cân 1 lượng tùy theo thể tích cần pha

- Pha trong khoảng 80% thể tích nước; điều chỉnh về pH=7,5; pH=8,0; pH=8,2; pH=9,0; pH=9,5 bằng NaOH 0,5M trên máy đo pH rồi thêm nước đủ đến vạch

* Các dung dịch đệm Natri dihydrophosphat 1mM; 2,5mM; 7,5mM; 10mM (pH=8,2) cũng được pha tương tự

Tất cả các dung dịch đều được lọc qua màng lọc 0,2µm, rung siêu âm loại khí trước khi sử dụng và đều được kiểm tra độ pH trước khi sử dụng

2.5 Mẫu phân tích

Các mẫu phân tích được lấy từ tủ lưu mẫu của Viện Kiểm nghiệm An toàn

Vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

3.1.1 Lựa chọn cột tách

Cột tách đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định quá trình tách có độ phân giải tốt hay không Để chọn loại pha tĩnh phù hợp cần căn cứ vào cấu trúc phân tử và độ phân cực của chất phân tích Dựa trên những đặc điểm về nhóm chất khảo sát là những chất có khả năng phân ly thành ion trong dung dịch, chúng tôi sử dụng cột sắc ký Anion (150mm x 4,6 mm x 10µm)

bước khảo sát tiếp theo

3.1.2 Xác định bước sóng phát hiện cho các chất phân tích khi sử dụng detector PDA

Detector là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động từ cột sắc

ký chảy ra một cách liên tục Nó là một dụng cụ thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất dựa theo một tính chất nào đó của chất phân tích Các chất phân tích đều

có tính hấp thụ quang tốt trong vùng UV nên detector PDA (Photo Diode Array) rất thuận lợi cho việc định tính và định lượng aspartam, axit sorbic, axit benzoic, acesufalm-K, saccarin

Trong quá trình chạy mẫu chúng tôi có thể kiểm tra ngay các pic chạy ra

10 20 30 40 50 60 mAU

10 20 30 40 50 60 mAU

50 75 100 125 150 175

Từ kết quả trên phổ của hình 3.2, chúng tôi chọn bước sóng phát hiện chất

phân tích đối với Aspartam, Saccarin là 210 nm ; Axit benzoic và Acesulfam K là

225 nm; Axit sorbic là 254 nm

3.1.3 Khảo sát pH của pha động

Sau khi tham khảo tài liệu, chúng tôi sử dụng pha động là dung dịch

pH=9,0; pH=9,5 bằng dung dịch NaOH 0,5M trên máy đo pH, sau đó tiến hành

5mM với tốc độ dòng là 1,5 ml/phút, chuẩn hỗn hợp 5 chất có nồng độ 20 µg/ml, thể tích bơm mẫu là 20µl

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của pH pha động tới thời gian lưu của chất phân tích

pH

Thời gian lưu (phút)